WO2008144792A1 - Verfahren zur herstellung von ascorbinsäure unter verwendung von pectobacterium cypripedii - Google Patents

Verfahren zur herstellung von ascorbinsäure unter verwendung von pectobacterium cypripedii Download PDF

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Klaus D. Kulbe
Eva Steiner
Günter REMBART
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C12P7/60—2-Ketogulonic acid

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing ascorbic acid, in which in a first step, a carbon source is fermentatively converted to 2,5-diketo-D-gluconic acid, which then in a second step enzymatically with 2,5-diketo-D-gluconic acid Corynebacterium glutamicum reductase is converted to 2-keto-L-gulonic acid.
  • Ascorbic acid is used in the pharmaceutical and food industries as a vitamin and antioxidant.
  • L-ascorbic acid is currently produced predominantly according to the process developed by Reichstein (1934). After this manufacturing process of Reichstein obtained vitamin C from D-glucose in a chemical-biocatalytic process. The glucose is first reduced to sorbitol and then oxidized with sorbose bacteria to the carbohydrate L-sorbose. The sorbose is further oxidized with the addition of acetone, wherein after the subsequent cleavage of the acetone and dehydration, the vitamin C is formed.
  • the Reichstein synthesis requires not only high energy and chemical expenditure, but also sophisticated wastewater treatment in order to avoid the release of lindane-like by-products. Furthermore, this process provides only a yield of about 50%.
  • Sonoyama et al. U.S. Patent 4,879,229, Shionogi & Co., Ltd., Japan, 1989 disclose the use of facultative anaerobic strains of the genus Pectobacter to produce 2,5-DKG.
  • a 2,5-DKG-producing microorganism of the genus Pectobacter or any ingredient thereof (such as enzyme extracts) or immobilized cells is brought into contact with D-glucose.
  • EP 1141368B1 (Genencor International, Inc., California, 2006) describes the biocatalytic production of 2-KLG from a carbon source, wherein the co-factor required for the reaction is regenerated.
  • An alternative method is disclosed, for example, in U.S. Patent 4,757,012 (Genentech Inc. California) which discloses the purification and recombinant production of 2,5-diketo-gluconic acid (2,5-DKG) reductase and their use in the reductive conversion of 2,5-diketo-gluconic acid in 2-keto-L-gulonic acid (2-KLG).
  • the invention is therefore based on the object to provide a method of the type mentioned above, which on the one hand represents an economical alternative to the biotechnological methods described so far and on the other hand overcomes the disadvantages of the Reichstein process.
  • the invention is achieved in that the carbon source is glucose and the conversion of glucose into 2,5-diketo-D-gluconic acid by the Pectobacter cypripedii strain HEPOl (DSMZ 12393) directly.
  • the advantage of the present invention is that the invention Pectobacter cypripedii strain HEPOl can convert glucose directly into 2,5-diketo-D-gluconic acid (2.5 DKG) and thus represents a further development of the prior art. So far, it was by means of Pectobacter spp. it is only possible to ferment gluconic acid, which is considerably more expensive than glucose (gluconic acid costs about twice the amount of glucose), into the intermediate 2.5-DKG.
  • the new Pectobacter strain HEPO1 differs from the previous strain described in the prior art (DSMZ 30182) in that it is capable of nitrate reduction, of growth on malonic acid or of acid formation from L-rhamnose and D-maltose on the basis of physiological and biochemical characteristics is and also has a urease activity.
  • strain HEPO1 (DSMZ 12393) does not have starch hydrolysis activity.
  • the air supply in the first step, can be reduced or adjusted until anaerobic conditions in the nutrient solution are reached, if the formation of the 2,5-diketo-D-gluconic acid from the intermediate 2-keto-D-gluconic acid fails , This ensures that substantially all of the 2-keto-D-gluconic acid is converted to 2,5-diketo-D-gluconic acid, which is the starting substrate for subsequent reduction to 2-keto-L-gulonic acid, giving a higher total Product yield can be achieved.
  • the air supply can be controlled via an oxygen probe.
  • an oxygen probe By monitoring the oxygen content in the nutrient solution using an oxygen probe, it is achieved that, on the one hand, the oxygen content in the nutrient solution corresponds to the particular optimum of the microorganism used, and, on the other hand, that required for complete conversion of 2-keto-D-gluconic acid into 2,5-diketone. Controlled D-gluconic acid necessary anaerobic conditions.
  • the pH may be monitored and / or controlled during the fermentation of the first step.
  • the formation of gluconic acid leads to a lowering of the pH, whereby the growth of the microorganisms is suppressed.
  • By controlling the pH it is ensured that the pH of the nutrient solution is always within the optimal range for the growth of the nutrient solution Microorganisms and thus the healthy growth of microorganisms is maintained.
  • the first step of the method can be carried out in batch mode.
  • all ingredients are introduced into the fermenter and fermented in a conventional manner by the microorganisms.
  • the first step of the process can be carried out in fed-batch mode.
  • fed-batch operation a controlled substrate feed avoids an excessive lowering of the educt concentration, so that the microorganisms are always in the exponential growth phase.
  • the coenzyme NADPH required in the second step is regenerated by the glucose dehydrogenase (GDH), which converts glucose to gluconic acid, whereby the gluconic acid formed by the regeneration and optionally remaining glucose and / or or 2,5-diketo-D-gluconic acid of the process according to the invention is returned to the first step.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • Continuous regeneration of the coenzyme NADPH may result in a lower coenzyme concentration than would be necessary for complete conversion of 2,5-DKG to 2-KLG without coenzyme regeneration.
  • Na citrate or Na acetate may be used as the buffer.
  • the Na citrate or Na acetate buffer not only the costs for the buffer system could be lowered, but also the enzyme activity could be increased compared to the Bis-Tris system described in the literature.
  • the gluconic acid and optionally glucose and / or 2,5-diketo-D-gluconic acid prior to recycling by chromatographic separation methods, such as ion exchange chromatography, from the 2- Keto-L-gulonic acid product stream are separated.
  • chromatographic separation methods such as ion exchange chromatography
  • the 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase from Corynebacterium glutamicum can be produced recombinantly in E. coli using a pET vector.
  • CglakrPETF and CglakrPETR and the plasmid pPCl may be used as templates for the preparation of the insert DNA as primers for the PCR, the amplified fragment being inserted into the expression vector pET-21d.
  • coli BL21 (DE3) strain transformed with pET-21d can be incubated in a minimal medium MPC-Gly which contains in one liter 10 g peptone from casein, 10 g glycerol, 0.1 ml IM CaCl 2 , 1M MgSO 4 .7H 2 O and 200 ml MPC-Gly salts, with the MPC-Gly saline solution in one liter of water containing 15 g KH 2 PO 4 , 2.5 g NaCl and 5 g NH 4 Cl.
  • MPC-Gly which contains in one liter 10 g peptone from casein, 10 g glycerol, 0.1 ml IM CaCl 2 , 1M MgSO 4 .7H 2 O and 200 ml MPC-Gly salts, with the MPC-Gly saline solution in one liter of water containing 15 g KH 2 PO 4 , 2.5 g NaCl and 5 g NH 4 Cl.
  • reaction mixture is separated into a product stream and a biocatalyst stream by a membrane separation process. This ensures that the enzymes can be performed in the process cycle without major losses.
  • NADP + are retained by a charged ultrafiltration membrane.
  • the separation of the product stream and the biocatalyst stream through an ultrafiltration membrane causes the enzymes or cofactors to remain intact throughout the process
  • Enzyme reactor are present, and need not be constantly replaced by new enzymes or cofactors.
  • the production of ascorbic acid by the process of the present invention is carried out in a two-stage process.
  • glucose is fermentatively converted to 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG).
  • HEPOI Pectobacter cypripedii strain
  • TSA tryptone Soy Agar
  • the pH of the medium was adjusted to 7.02 using caustic soda (100 g / L). Then the medium was brought to a total volume of 250 ml with tap water.
  • 300 ml Erlenmeyer flasks each case 1.25 g of CaCO 3 were weighed and added to 50 ml of the above-described medium and sterilized for 20 minutes at 121 0 C. After cooling, the Erlenmeyer flasks were in each case inoculated by means of a loop with the Pectobacter cypripedii strain of the TSA plates. The Erlenmeyer flasks were then incubated for 16 hours on a shaking incubator at 200 rpm at 28 ° C. The resulting preculture is used for the subsequent fermentation.
  • the fermentation itself was carried out in a stirred tank fermenter with a total volume of 10 liters, which is equipped with a pH, ⁇ 2 , temperature and fermentation oil selector and associated measuring and control electronics. Furthermore, the CO 2 and O 2 content in the exhaust air of the fermenter was monitored.
  • Both batch and fed-batch fermentation were analyzed by conventional methods. These include the determination of the optical density, the enzymatic determination of glucose and gluconic acid and HPLC.
  • the optical density 1 ml of sample was admixed with 8 ml of citric acid monohydrate solution (40 g / l) and made up to 10 ml. The optical density was measured at 600 nm.
  • the glucose and gluconic acid were each treated with a commercially available enzyme assay determined photometrically at 340 nm (Boehringer, order numbers 716251 and 428191, respectively).
  • the fermentation can be carried out both as a batch fermentation and as a fed-batch fermentation.
  • a batch fermentation will be described.
  • mineral solution A 192.2 g of CSL (Com Steep Liquor), 1.35 g of MgSO 4 .7H 2 O and 8.96 g of K 2 HPO 4 were dissolved in 2503 g of tap water and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes.
  • the preparation of the mineral solution B was carried out by slurry of 182.0 g of CaCO 3 in 1499.8 g of tap water and subsequent sterilization at 121 0 C for 20 minutes.
  • the sterile media (glucose solution, mineral solutions A and B) were introduced via a sterile funnel into the fermenter and the weight determined by reweighing.
  • the pH of the medium in the fermenter was adjusted to pH 7.0 by the addition of a NaOH solution (300 g / L).
  • the fermenter was inoculated with the contents of two pre-culture Erlenmeyer flasks obtained as described above.
  • the following parameters were set and kept as constant as possible during the entire fermentation period, with the exception of the amount of air, as described later:
  • the fermentation for the production of 2,5-DKG was carried out in another experiment than fed-batch process, which essentially corresponds to the batch process described above, but with the following changes.
  • the fermentation medium does not contain 200 g / l glucose but only 100 g / l glucose.
  • the sterilized stirred tank was filled with 5.5 liters (without inoculum) medium as described above and inoculated with Pectobacter cypripedii (2 preculture Erlenmeyer flasks).
  • the feed (feed, 50% glucose solution) was started when the CO 2 content in the exhaust air is above 1% by volume.
  • the feed rate of the feed solution is controlled by the CO 2 content in the exhaust air, with only so much glucose solution is supplied that the CO 2 content does not drop significantly below 1%.
  • the purified 2,5-DKG is enzymatically converted to 2-KLG by 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase.
  • the 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase from Corynebacterium glutamicum (DMSZ 20301) was isolated and amplified by PCR.
  • PCR reaction all relevant components were combined in a master mix for the amplification reaction whose composition is shown in Table 1 and then aliquoted into PCR tubes.
  • the primers used for the PCR have the following sequences:
  • Taq DNA polymerase (5 U / ⁇ l) 0.25
  • thermocycler T3, Biometra (Göttingen, Germany)
  • amplified under the following conditions (Table 2).
  • the amplified PCR product was purified using methods known in the art. After purification, the DNA insert was digested by the restriction enzymes BamHI and Xhol and cloned into the appropriately pretreated pET 21d vector (Novagen, Darmstadt, Germany) using the Topo TA Cloning Kit (Invitrogen).
  • the pET vectors are based on the T7 expression system, which is characterized by a very high transcription efficiency.
  • the system is derived from bacteriophage T7, which is produced by its strong promoters derived from the phage T7.
  • RNA polymerase successfully competes with the transcriptional machinery of the host.
  • the prepared vector (pET-21d) was transformed by heat shock transformation into E.
  • the E. coli strain BL21 (DE3) is particularly suitable for the expression of recombinant proteins in pET systems.
  • the T7 RNA polymerase is expressed after EPTG addition and subsequently the genes under the control of the T7 promoter are transcribed.
  • the pET system was therefore selected because it adds a C-terminal His tag to the desired DNA insert and thus makes very simple purification of the DNA insert possible by means of nickel chelate affinity chromatography.
  • the recombinant cells are then resuspended in a modified minimal medium (MPC-Gly medium) containing in one liter 10 g peptone from casein, 10 g glycerol, 0.1 ml IM CaCl 2 , 1 M MgSO 4 .7H 2 O, and 200 ml of MPC-Gly contains salts, the MPC-Gly saline solution in one liter of water containing 15 g KH 2 PO 4 , 2.5 g NaCl and 5 g NH 4 Cl. After the recombinant cells were cultured in said medium at 37 ° C.
  • MPC-Gly medium modified minimal medium containing in one liter 10 g peptone from casein, 10 g glycerol, 0.1 ml IM CaCl 2 , 1 M MgSO 4 .7H 2 O, and 200 ml of MPC-Gly contains salts, the MPC-Gly saline solution in one liter of water
  • the expression of the heterologous gene is induced by the addition of 5 g / l lactose and the cells are allowed to reach 25 0 C, pH 7.0 and pO 2 20% to grow until an optical density of 8.0 has been reached.
  • the recombinant cells were pelleted by centrifugation (15,000 g) for 20 minutes and then mechanically disrupted by homogenizer (Homogenizer Invensis APV-2000, 1000 bar) or French Pressure Cell (70 bar).
  • homogenizer Homogenizer Invensis APV-2000, 1000 bar
  • French Pressure Cell 70 bar
  • the medium is first charged with a transition metal ion (Ni 2+ ) to form a chelate before use.
  • the proteins bind to the medium, depending on the presence of surface histindin residues that have an affinity for the chelated metal ions. The bond strength is always determined by the metal ion and the pH of the buffer.
  • the bound protein can be eluted by competitive elution with imidazole.
  • the iminodiacetic acid ligand is coupled to the chelating sepharose and thus allows the exchange of immobilized metal ions.
  • the 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase (DKR) thus prepared has an activity of about 200 U / l culture.
  • the DKR is used in soluble form.
  • 250 mM (58 g / l) 2,5-DKG, 2 U / ml DKR, 250 mM (45 g / l) glucose, 2 U / ml glucose dehydrogenase (GDH) are added to a 21 reaction vessel. and 0.26 mM (0.21 g / L) of NADP + added.
  • the volume in the batch reactor was 500 or 1000 mL.
  • This reaction gives under the conditions mentioned 56.0 g of 2-keto-L-gulonic acid / l reaction solution (ie buffer, either Na acetate or Na citrate or bis-Tris) (yield 96.7%) and 42.1 g Gluconic acid / 1 reaction solution (ie buffer, either Na acetate or Na citrate or Bis-Tris) (yield 93.5%).
  • the 2-keto-L-gulonic acid is subsequently separated from the gluconic acid, glucose and 2,5-DKG by an ion exchanger and used for further reaction in ascorbic acid.
  • the gluconic acid, glucose and 2,5-DKG are recycled in the first reaction step (fermentation of Pectobacter cypripedii).
  • the above-described two-stage process which proceeds in two spatially separate and non-interconnected reaction vessels, can be combined into a so-called hybrid process.
  • the stirred tank in which the fermentation of Pectobacter cypripedii HEPO1 and the concomitant conversion of glucose into 2,5-diketo-D-gluconic acid (steps 1 of the above method) expires
  • the enzyme reactor in which by the 2, 5-diketo-D-gluconic acid reductase catalyzed reaction takes place, directly connected via connecting lines.
  • An advantage of the hybrid method according to the invention is that continuous 2.5-DKG is formed in the fermenter which, after the microorganisms have been separated from the liquid stream of the fermenter by filtration, is passed into the enzyme reactor.
  • the enzymes necessary for continuous process control, DKR and GDH, and the coenzymes NADPH and NAPD + are retained in the enzyme reactor, while the unused substrates 2,5-diketo-D-glucose and glucose and the products gluconic acid and 2-keto-L- Gulonic acid can pass through the membrane unhindered.
  • the enzymes (DKR and GDH) are retained by the ultrafiltration membrane due to their size, whereas the coenzymes (NADPH and NADP + ) due to their negative charge on the passage are prevented.
  • the product of the process according to the invention must be 2-keto-L- Gulonic acid are separated from the product stream.
  • the ion exchange chromatography strongly basic AIEX was used to separate the 2-keto-L-gulonic acid from the glucose or gluconic acid.
  • the biocatalyst system (DKR, GDH and NADPH) remains through the ultrafiltration membrane in the enzyme reactor.
  • the vessels used for the hybrid method according to the invention are known in the prior art and are on the one hand a conventional stirred tank having the necessary measuring and control electronics such as pH electrode, pO 2 electrode, etc., and on the other hand, an enzyme reactor, the semipermeable membrane having.
  • the semipermeable membrane used is a charged ultrafiltration membrane (NTR-7430, Nitto Electric Industrial Co. (Japan)).
  • NTR-7430 Nitto Electric Industrial Co. (Japan)
  • the stirred tank the fermentative conversion of gluconic acid into 2,5-DKG by means of Pectobacter cypripedii HEPOl takes place, while in the enzyme reactor, the biocatalytic reaction of 2,5-DKG in 2-KLG proceeds with simultaneous regeneration of the coenzyme NADPH.
  • the sterile stirred tank with a reactor volume of 10 liters was filled with medium, which is described above for the fed-batch fermentation, and inoculated the stirred tank with the contents of two precultivation Erlenmeyer flasks of Pectobacter cypripedii HEPO1 strain.
  • the Pectobacter cypripedii strain (HEPOl) was added at 28 0 C, pH 7 or 5.6, as described above, is fermented at a dissolved oxygen concentration of 10%, yielding 137 g / l product. A portion of the culture suspension is removed from the stirred tank, filtered, and the supernatant is introduced into the enzyme reactor.
  • the reaction reaction in the enzyme reactor takes place at 25 ° C (since, as mentioned above, two reactors connected to each other, different temperatures can be used) and a pH value of 6.4, which is kept constant with ammonia ,
  • the product of this fermentation, 2,5-diketo-D-gluconic acid was added with the addition of 2 U / ml of DKR, 2 U / ml and 106 g of glucose / 1 buffer (either Na acetate or Na citrate) in the enzyme reactor in converted the immediate precursor of ascorbic acid, 2-keto-L-gluconic acid with a yield of 132 g / l.
  • the volume in the enzyme reactor is also 10 L.
  • the enzymes (DKR and GDH) and the coenzymes are retained by the ultrafiltration membrane in the enzyme reactor while the product stream (glucose, gluconic acid and 2-keto-L-gulonic acid) is withdrawn from the enzyme reactor via an ion exchange chromatography column (Column material Amberlite FPA90, Rohm and Haas) and eluted with various eluents (H 2 O, methanol and H 2 SO 4 ) to separate the product stream into its individual components, thereby making it possible to remove glucose and gluconic acid from the 2- Keto-L-gulonic acid, wherein the 2-keto-L-gulonic acid is eluted as methyl ester KLG.
  • ion exchange chromatography column Cold material Amberlite FPA90, Rohm and Haas
  • the yield of 2-keto-L-gulonic acid was 132 g / l.
  • the glucose or gluconic acid (99 g / l) are returned to the stirred tank and metabolized there by the Pectobacter cypripedii strain HEPO1 to form further 2,5-diketo-D-gluconic acid.
  • the hybrid method described forms a closed circuit in order to achieve the highest possible product yields (2-keto-L-gulonic acid) with simultaneous use of the originally added enzymes or coenzymes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Ascorbinsäure, bei welchem in einem ersten Schritt eine Kohlenstoffquelle fermentativ in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure umgewandelt wird, welche dann in einem zweiten Schritt enzymatisch mit 2,5-Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase aus Corynebacterium glutamicum zu 2-Keto-L-Gulonsäure umgesetzt wird. Zwecks höheren Produktausbeuten ist die Kohlenstoffquelle Glucose und die Umwandlung von Glucose in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure erfolgt durch den Pectobacter cypripedii Stamm HEPOl (DSMZ 12393) direkt.

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON ASCORBINSÄURE UNTER VERWENDUNG VON PECTOBACTERIUM CYPRIPEDII
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Ascorbinsäure, bei welchem in einem ersten Schritt eine Kohlenstoffquelle fermentativ in 2,5-Diketo-D- Gluconsäure umgewandelt wird, welche dann in einem zweiten Schritt enzymatisch mit 2,5- Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase aus Corynebacterium glutamicum zu 2-Keto-L- Gulonsäure umgesetzt wird.
Ascorbinsäure findet in der Pharma- und Nahrungsmittelindustrie als Vitamin und Antioxidanz Anwendung. L-Ascorbinsäure wird derzeit überwiegend nach dem von Reichstein (1934) entwickelten Verfahren hergestellt. Nach diesem Herstellungsverfahren von Reichstein erhält man Vitamin C aus D-Glucose in einem chemisch-biokatalytischen Verfahren. Die Glucose wird zunächst zu Sorbit reduziert und anschließend mit Sorbose- Bakterien zu dem Kohlenhydrat L-Sorbose oxidiert. Die Sorbose wird unter Zugabe von Aceton weiter oxidiert, wobei nach der anschließenden Abspaltung des Acetons und einer Wasserabspaltung das Vitamin C entsteht. Die Reichstein-Synthese erfordert neben hohem Energie- und Chemikalienaufwand auch eine anspruchsvolle Abwasseraufbereitung, um die Freisetzung Lindan-ähnlicher Nebenprodukte zu vermeiden. Ferner liefert dieses Verfahren nur eine Ausbeute von etwa 50%.
In den vergangenen Jahren wurden vermehrt Anstrengungen unternommen, um biotechnologische Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure zu entwickeln. Der wirtschaftliche Durchbruch mit solchen Verfahren ist jedoch bei diesen Versuchen nicht gelungen. Die Mehrzahl der bekannten biotechnologischen Verfahren beschränkt sich auf die Herstellung von Zwischenprodukten des Ascorbinsäure- Synthesewegs. Insbesondere von Interesse sind die 2,5-Diketo-D-Gluconsäure (2,5-DKG) und die 2-Keto-L-Gulonsäure (2 -KLG). 2,5-DKG ist deswegen ein wichtiges Zwischenprodukt bei der Herstellung von Ascorbinsäure, da sie selektiv und stereospezifisch in die 2-KLG reduziert werden kann, welche ihrerseits ein Vorläufer der Ascorbinsäure ist. 2-KLG kann in weiterer Folge leicht durch eine Säure- oder Basen-katalysierte Reaktion in Ascorbinsäure umgewandelt werden. Die Herstellung des Zwischenproduktes 2,5-Diketo-D-Gluconsäure (2,5-DKG) mittels aeroben Mikroorganismen, die ausschließlich der Gattungen Acetobacter, Acetomonas, Gluconoacetobacter und Pseudomonas angehören, ist beispielsweise im US Patent 4.316.960 (Pfizer Ine, 1982) beschrieben worden. Die Verwendung dieser Mikroorganismen ist jedoch von einem industriellen Gesichtspunkt ausgesehen wenig zufriedenstellend, da sie bei relativ langen Fermentationszeiten nur eine geringe Ausbeute an 2,5-DKG liefern. Das US Patent 3.790.444 (DAIICHI SEIYAKU CO, Japan, 1974) offenbart die Herstellung von 2,5-DKG mittels Acetobacter fragum (ATCC Nr. 21409) bei relativ guten Ausbeuten. Sonoyama et al. (US Patent 4.879.229; Shionogi & Co., Ltd., Japan, 1989) offenbaren die Verwendung von fakultativ anaeroben Stämmen der Gattung Pectobacter zur Herstellung von 2,5-DKG. Dabei wird ein 2,5-DKG erzeugender Mikroorganismus der Gattung Pectobacter oder irgendein Inhaltsstoff davon (wie z.B. Enzymextrakte) bzw. immobilisierte Zellen in Kontakt mit D-Glucose gebracht.
Auch nicht-fermentative, biokatalytische Verfahren zum Herstellen von Ascorbinsäure- Zwischenprodukten sind beschrieben worden. So beschreibt das EP 1141368Bl (Genencor International, Inc., Kalifornien, 2006) die biokatalytische Herstellung von 2-KLG aus einer Kohlenstoffquelle, wobei der für die Reaktion benötigte Co-Faktor regeneriert wird. Ein alternatives Verfahren ist beispielsweise im US Patent 4.757.012 (Genentech Inc. Kalifornien) offenbart, welches die Reinigung und die rekombinante Herstellung von 2,5- Diketo-Gluconsäure (2,5-DKG)-Reduktase und deren Verwendung zur reduktiven Umwandlung von 2,5-Diketo-Gluconsäure in 2-Keto-L-Gulonsäure (2 -KLG) beschreibt.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, welches einerseits eine wirtschaftliche Alternative zu den bisher beschriebenen biotechnologischen Verfahren darstellt und andererseits die Nachteile des Reichstein- Prozesses überwindet.
Erfindungsgemäß wird die Erfindung dadurch gelöst, dass die Kohlenstoffquelle Glucose ist und die Umwandlung von Glucose in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure durch den Pectobacter cypripedii Stamm HEPOl (DSMZ 12393) direkt erfolgt. Der Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass der erfindungsgemäße Pectobacter cypripedii Stamm HEPOl Glucose direkt in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure (2,5 DKG) umwandeln kann und stellt somit eine Weiterentwicklung des Standes der Technik dar. Bisher war es mittels Pectobacter spp. nur möglich, Gluconsäure, die wesentlich aufwändiger ist als Glucose (Gluconsäure kostet etwa das Doppelte von Glucose), in das Zwischenprodukt 2,5-DKG zu fermentieren. Der neue Pectobacter Stamm HEPOl unterscheidet sich aufgrund von physiologischen und biochemischen Merkmalen vom bisherigen, im Stand der Technik beschrieben Stamm (DSMZ 30182) insofern, als er zur Nitratreduktion, zum Wachstum auf Malonsäure bzw. zur Säurebildung aus L-Rhamnose und D-Maltose fähig ist und ferner eine Urease-Aktivität aufweist. Hingegen weist der Stamm HEPOl (DSMZ 12393) Stärkehydrolyse Aktivität nicht auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann im ersten Schritt die Luftzufuhr bis zum Erreichen anaerober Bedingungen in der Nährlösung verringert bzw. eingestellt werden, wenn die Bildung der 2,5-Diketo-D-Gluconsäure aus dem Zwischenprodukt 2- Keto-D-Gluconsäure ausbleibt. Dadurch wird sichergestellt, dass im Wesentlichen die gesamte 2-Keto-D-Gluconsäure in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure umgewandelt wird, welche das Ausgangssubstrat für die nachfolgende Reduzierung zu 2-Keto-L-Gulonsäure ist, wodurch insgesamt eine höhere Produktausbeute erzielt werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Luftzufuhr über eine Sauerstoffsonde gesteuert werden. Durch die Überwachung des Sauerstoffgehalts in der Nährlösung mittels Sauerstoffsonde wird erreicht, dass einerseits der Sauerstoffgehalt in der Nährlösung dem jeweiligen Optimum des verwendeten Mikroorganismus entspricht und andererseits werden die für die vollständige Umwandlung von 2-Keto-D-Gluconsäure in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure notwendigen anaeroben Bedingungen gesteuert.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung kann während der Fermentation des ersten Schrittes der pH-Wert überwacht und/oder geregelt werden. Die Bildung der Gluconsäure fuhrt zu einem Absenken des pH-Wertes, wodurch das Wachstum der Mikroorganismen unterbunden wird. Durch Regeln des pH- Wertes wird sichergestellt, dass der pH- Wert der Nährlösung immer innerhalb des optimalen Bereichs für das Wachstum der Mikroorganismen liegt und somit das gesunde Wachstum der Mikroorganismen aufrechterhalten wird.
In einer alternativen Ausfuhrungsform der Erfindung kann der erste Schritt des Verfahrens im Batch-Betrieb ausgeführt werden. Dabei werden alle Zutaten in den Fermenter eingebracht und in herkömmlicher Weise durch die Mikroorganismen fermentiert.
In bevorzugter Weise kann jedoch der erste Schritt des Verfahrens im Fed-Batch Betrieb ausgeführt werden. Beim Fed-Batch Betrieb wird durch eine gesteuerte Substratzuführung eine zu starke Absenkung der Eduktkonzentration vermieden, sodass sich die Mikroorganismen immer in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Ferner ist eine Steuerung der Wachstumsrate der Mikroorganismen in Abhängigkeit der gewählten Zufuhr- Strategie möglich. Dies unterbindet die Bildung von mit Wachstum-assoziierten sekundären Metaboliten.
In einer Weiterbildung der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen werden, dass das im zweiten Schritt benötigte Coenzym NADPH durch die Glucose-Dehydrogenase (GDH), die Glucose in Gluconsäure umwandelt, regeneriert wird, wobei die durch die Regenerierung entstehende Gluconsäure, und gegebenenfalls verbleibende Glucose und/oder 2,5-Diketo-D- Gluconsäure des erfindungsgemäßen Verfahrens in den ersten Schritt zurückgeführt wird. Durch die fortlaufende Regenerierung des Coenzyms NADPH kann mit einer geringeren Coenzym-Konzentration gearbeitet werden, als für die vollständige Umwandlung von 2,5- DKG in 2-KLG ohne Coenzym-Regeneration notwendig wäre.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung kann im zweiten Schritt als Puffer Na-Citrat oder Na-Acetat eingesetzt werden. Durch die Verwendung des Na-Citrat- bzw. Na-Acetat-Puffers konnten nicht nur die Kosten für das Puffersystem gesenkt werden, sondern auch die Enzymaktivität im Vergleich zu dem in der Literatur beschriebenen Bis- Tris- Systems erhöht werden.
In Weiterbildung der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen sein, dass die Gluconsäure und gegebenenfalls Glucose und/oder 2,5-Diketo-D-Gluconsäure vor der Rückführung durch chromatographische Trennverfahren, wie Ionentauschchromatographie, von dem 2- Keto-L-Gulonsäure-Produktstrom getrennt werden. Durch die Abtrennung von 2-Keto-L- Gulonsäure aus dem Produktstrom können restliche Glucose bzw. Gluconsäure in den ersten Schritt des Verfahrens zurückgeführt werden, um somit eine höhere Substratverwertung zu erreichen.
In einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung kann die 2,5-Diketo-D-Gluconsäure- Reduktase aus Corynebacterium glutamicum unter Verwendung eines pET- Vektors in E. coli rekombinant hergestellt werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung können zur Herstellung der Insert- DNA als Primer für die PCR CglakrPETF und CglakrPETR und das Plasmid pPCl als Matrize verwendet werden, wobei das amplifizierte Fragment in den Expressionsvektor pET-21d eingesetzt wird. In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der mit pET-21d transformierte E. coli BL21 (DE3) Stamm in einem Minimalmedium MPC- GIy, das in einem Liter 10g Pepton aus Casein, 10 g Glycerol, 0,1 ml IM CaCl2, 1 M MgSO4*7H2O und 200 ml MPC-GIy Salze enthält, gezüchtet werden, wobei die MPC-GIy Salzlösung in einem Liter Wasser 15 g KH2PO4, 2,5 g NaCl und 5 g NH4Cl enthält.
In Weiterführung der vorliegenden Erfindung kann es als Hybridverfahren geführt werden, wobei das Reaktionsgemisch in einen Produktstrom und einen Biokatalysatorstrom durch ein Membrantrennverfahren getrennt wird. Dadurch wird erreicht, dass die Enzyme im Verfahrenskreislauf ohne größere Verluste geführt werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung können schließlich die Enzyme 2,5-Diketo- Gluconsäure-Reduktase und Glucose-Dehydrogenase sowie die Coenzyme NADPH und
NADP+ durch eine geladene Ultrafütrationsmembran zurückgehalten werden. Das Trennen des Produktstromes und des Biokatalysatorstromes durch eine Ultrafütrationsmembran führt dazu, dass die Enzyme bzw. Cofaktoren während des gesamten Verfahrens im
Enzymreaktor vorhanden sind, und nicht ständig durch neue Enzyme oder Cofaktoren ersetzt werden müssen.
Der Gegenstand der Erfindung wird nachstehend anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels beschrieben. Wie oben erwähnt, erfolgt die Herstellung von Ascorbinsäure mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in einem zweistufigen Prozess. In einem ersten Schritt wird Glucose fermentativ in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure (2,5-DKG) umgewandelt. Dazu wurde ein Pectobacter cypripedii-Stamm (HEPOl) aus Heidelbeeren isoliert und bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer DMSZ 12393. Ausgehend von einer Stichagarkultur des Organismus Pectobacter cypripedii wird eine entsprechende Anzahl von Trypton-Soya-Agar (TSA)-Platten beimpft, die bei 28°C für 24 bis 48 Stunden inkubiert werden. Zur Plattenbereitung wurde handelsüblicher TSA verwendet, wie beispielsweise Oxoid CM 131 und entsprechend den Herstellerangaben zubereitet. Die TSA-Platten wurden dann verwendet, um eine Vorkultur zuzubereiten. Dazu wurden 12,17 g Maisquellwasser, 2,76 g Glucosemonohydrat, 0,27g KH2PO4, 0,06 g MgSO4*7H2O und 0,27 g NaCl mit Leitungswasser zu einem Gesamtvolumen von ca. 200 ml aufgeschlämmt. Der pH- Wert des Mediums wurde unter Verwendung von Natronlauge (100 g/l) auf 7,02 eingestellt. Dann wurde das Medium mit Leitungswasser auf ein Gesamtvolumen von 250 ml gebracht. In 300 ml Erlenmeyerkolben wurden jeweils 1,25 g CaCO3 eingewogen und jeweils 50 ml des oben beschriebenen Mediums hinzugefügt und für 20 Minuten bei 121 0C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurden die Erlenmeyerkolben jeweils mittels Impföse mit dem Pectobacter cypripedii Stamm der TSA-Platten beimpft. Die Erlenmeyerkolben wurden dann für 16 Stunden auf einem Schüttelinkubator bei 200 U/min bei 28 °C inkubiert. Die so erhaltende Vorkultur wird für die anschließende Fermentation verwendet. Die Fermentation selbst wurde in einem Rührkesselfermenter mit einem Gesamtvolumen von 10 Litern, der mit einer pH-, ρθ2-, Temperatur- und Gärölelektorde und dazugehöriger Mess- und Regelelektronik ausgerüstet ist, durchgeführt. Weiters wurde der CO2 und O2-Gehalt in der Abluft des Fermenters überwacht.
Sowohl die Batch- als auch die Fed-Batch-Fermentation wurde mittels herkömmlicher Verfahren analysiert. Zu diesen zählen die Bestimmung der optischen Dichte, die enzymatische Glucose- und Gluconsäurebestimmung und HPLC. Für die Bestimmung der optischen Dichte wurde 1 ml Probe mit 8 ml Zitronensäuremonohydrat-Lösung (40 g/l) versetzt und auf 10 ml aufgefüllt. Die optische Dichte wurde bei 600 nm gemessen. Die Glucose bzw. Gluconsäure wurden jeweils mit einen kommerziell erhältlichen Enzymtest bei 340 nm photometrisch bestimmt (Boehringer, Bestellnummern 716251 bzw. 428191). Für die HPLC wurde ein LC 10-System (Shimadzu LC 10) mit einer Biorad HPX87H (300x7,8 mm) Trennsäule verwendet, wobei zwecks besserer Trennleistung zwei Säulen in Serie geschaltet sind. Die Säule (4O0C) wurde mit 0,005 N H2SO4 eluiert und die einzelnen Fraktionen (Peaks) mit UV- (Shimadzu SPD-IOA) und RI- (Shimadzu RID-IOA)- Detektoren, die hintereinander geschaltet sind, gemessen. Das besagte HPLC-Verfahren wurde zur Analyse der Glucose/Gluconsäure, 2,5-DKG, 2-Keto-D-Gluconsäure, Milchsäure bzw. Essigsäure verwendet.
Die Fermentation kann sowohl als Batch- (Anstellfermentation) als auch als Fed-Batch- Fermentation (Zulauffermentation) durchgeführt werden. Als erstes Beispiel wird eine Batch-Fermentation beschrieben.
Der Fermenter wird dazu zur Hälfte mit Wasser befüllt und bei 101 °C für 30 Minuten sterilisiert. Anschließend wurde der Fermenter leer gepumpt und abgekühlt. Für das Reaktormedium wurden drei unterschiedliche Lösungen (Glucoselösung, Minerallösungen A und B) hergestellt und einzeln sterilisiert. Zur Herstellung der Glucoselösung wurden 1759,8 g Dextrodyn (= Markenname der Fa. Agrana für Glucosemonohydrat) in 1,611 kg deionisiertem Wasser gelöst und bei 1210C für 20 Minuten sterilisiert. Für die Minerallösung A wurden 192,2 g CSL (Com Steep Liquor), 1,35 g MgSO4*7H2O und 8,96 g K2HPO4 in 2503 g Leitungswasser gelöst und bei 121 °C für 20 Minuten sterilisiert. Die Bereitung der Minerallösung B erfolgte durch Aufschlämmung von 182,0 g CaCO3 in 1499,8 g Leitungswasser und anschließender Sterilisation bei 1210C für 20 Minuten. Die sterilen Medien (Glucoselösung, Minerallösungen A und B) wurden über einen sterilen Trichter in den Fermenter eingeführt und das Gewicht durch Rückwägung bestimmt. Der pH-Wert des Mediums im Fermenter wurde durch die Zugabe einer NaOH-Lösung (300 g/l) auf pH 7,0 eingestellt. Anschließend wurde der Fermenter mit dem Inhalt zweier wie oben beschrieben erhaltenen Vorkultur-Erlenmeyerkolben inokuliert. Die folgenden Parameter wurden eingestellt und während der gesamten Fermentationsdauer möglichst konstant gehalten, mit Ausnahme der Luftmenge, wie später beschrieben ist:
• Luftmenge: 3 l/min
• pH: pH 7,0 für die ersten acht Fermentationsstunden, dann pH 5,6 bis zum Fermentationsende (mittels NaOH gesteuert)
• Temperatur: 28°C
• Gelöstsauerstoff: 10% Sättigung (über Rührerdrehzahl geregelt)
Nachdem keine Umsetzung von 2-Keto-D-Gluconsäure zu 2,5-Diketo-D-Gluconsäure in der oben beschriebenen Fermentation mehr erfolgt ist, wird die Luftzufuhr abgedreht, bis anaerobe Bedingungen im Fermenter herrschen. Nach Ablauf einer Zeitperiode von 2 bis 10 Stunden wurde die Luftzufuhr wieder aufgedreht. Diese Maßnahme führte dazu, dass die vollständige Umsetzung von 2-Keto-D-Gluconsäure zu 2,5-Diketo-D-Gluconsäure erfolgte. Mit dem oben beschriebenen Verfahren konnten 137 g 2,5-Diketo-D-Gluconsäure/l erzielt werden, was einer Ausbeute von 71% (Gew./Gew.) entspricht.
Die Fermentation zur Herstellung von 2,5-DKG wurde in einem anderen Versuch als Fed- Batch-Prozess geführt, der im Wesentlichen dem oben beschriebenen Batch-Prozess entspricht, jedoch mit folgenden Änderungen. Das Fermentationsmedium enthält nicht 200 g/l Glucose sondern nur 100 g/l Glucose. Der sterilisierte Rührkessel wurde mit 5,5 Litern (ohne Inokulum) Medium, wie oben beschrieben, befüllt und mit Pectobacter cypripedii (2 Vorkultur-Erlenmeyerkolben) beimpft. Der Zulauf (Feed, 50%-ige Glucoselösung) wurde gestartet, wenn der CO2-Gehalt in der Abluft über 1 Vol.-% liegt. Die Zulaufmenge der Feedlösung wird über den CO2-Gehalt in der Abluft gesteuert, wobei nur soviel Glucoselösung zugeführt wird, dass der CO2-Gehalt nicht wesentlich unter 1% absinkt. Nach einer Fermentationsdauer von 121 Stunden wurden 116 g/l 2,5-Diketo-L-Gluconsäure im Fermentationsmedium bestimmt, was einer Ausbeute von 70% (Gew./Gew.) entspricht. Die in der oben beschriebenen Fermentation hergestellte 2,5-Diketo-Gluconsäure (2,5- DKG) wurde durch zweimaliges Fällen mit Ethanol sowie einmaligem Fällen mit Methanol gereinigt. Die ausgefällten 2,5-DKG-Kristalle wurden im Exsikkator über P2O5 getrocknet. Anschließend erfolgte die weitere Reinigung über einen Chromatographie-Schritt mit einer Amberlite CG 120-11 (Ca2+-Form)-Säule, welche eine Kombination zwischen einer Gelfiltration sowie einer Ionenaustauschchromatographie darstellt. Dazu wurden die Kristalle in 1-2 CV (Column Volumes) 1 M CaCl2 resuspendiert und auf die mit Puffer A (entgastes Wasser) äquilibrierte Säule (Amberlite CG 120-11 (Ca2+-Form) aufgetragen. Aus 11 Fermentationsüberstand erhält man 114 g 2,5-DKG, das entspricht einer Ausbeute von 98,3% (Gew. /Gew.).
Im zweiten Verfahrensschritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die gereinigte 2,5-DKG mittels 2,5-Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase enzymatisch in 2-KLG umgewandelt. Dazu wurde die 2,5-Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase aus Corynebacterium glutamicum (DMSZ 20301) isoliert und mittels PCR amplifiziert. Für die PCR Reaktion wurden alle relevanten Komponenten in einem Mastermix für die Amplifizierungsreaktion, dessen Zusammensetzung in Tabelle 1 gezeigt ist, vereinigt und anschließend in PCR- Röhrchen aliquotiert. Die für die PCR verwendeten Primer weisen folgende Sequenzen auf:
Primer 1 (CglakrPETF)
5' GAT AAG TGG ATC CAA TCT CTG ATG GAT C 3' (SEQ ID NO: 1)
Primer 2 (CglakrPETR)
5' CAG GGC CTT ACC TTA CTC GAG GTT CAG ATC 3' (SEQ ID NO: 2)
Tabelle 1
Reagenz Volumen für 50 μl steriles Wasser auf 50 μl auffüllen
1Ox PCR Puffer ohne MgCl2 5
25 mM MgCl2 3
10 mM dNTPs 1
10 pmol/μl Primer 1 5
10 pmol/μl Primer 2 5
Matrizen DNA 1
Taq DNA Polymerase (5 U/μl) 0,25
Die PCR Röhrchen wurden in einem Thermozykler (T3, Biometra (Göttingen, Deutschland)) eingesetzt und unter den folgenden Bedingungen (Tabelle 2) amplifiziert.
Tabelle 2
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Das amplifizierte PCR Produkt wurde unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt. Nach der Reinigung wurde das DNA Insert mittels den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol verdaut und in den entsprechend vorbehandelten pET-21d-Vektor (Novagen, Darmstadt, Deutschland) mittels des Topo TA Cloning Kits (Invitrogen) kloniert. Die pET-Vektoren basieren auf dem T7-Expressionssystem, das sich durch eine sehr hohe Transkriptionseffizienz auszeichnet. Das System stammt aus dem Bakteriophagen T7, der durch seine starken Promotoren, die von der phageneigenen T7- RNA-Polymerase erkannt werden, erfolgreich mit der Transkriptionsmaschinerie des Wirtes in Konkurrenz tritt. Der hergestellte Vektor (pET-21d) wurde mittels Hitzeschocktransformation in E. coli BL21(DE3)-Zellen (Invitrogen Carlsbad, USA) transformiert. Der E. coli Stamm BL21(DE3) eignet sich besonders für die Expression rekombinanter Proteine in pET-Systemen. Unter der Kontrolle des lacUV-5- Promotors wird die T7-RNA-Polymerase nach EPTG Zugabe exprimiert und anschließend werden die unter der Kontrolle des T7-Promotors liegenden Gene transkribiert. Das pET-System wurde deshalb ausgewählt, da dadurch ein C-terminaler His-tag an das gewünschte DNA-Insert angefügt und somit eine sehr einfache Reinigung des DNA-Inserts mittels Nickelchelat- Affinitätschromatographie möglich wird. Die rekombinanten Zellen werden dann in einem modifizierten Minimalmedium (MPC-Gly-Medium), welches in einem Liter 10 g Pepton aus Casein, 10 g Glycerol, 0,1 ml IM CaCl2, 1 M MgSO4*7H2O, und 200 ml MPC-GIy Salze enthält, gezüchtet, wobei die MPC-GIy Salzlösung in einem Liter Wasser 15 g KH2PO4, 2,5 g NaCl und 5 g NH4Cl enthält. Nachdem die rekombinanten Zellen im besagten Medium bei 370C bis zu einer optischen Dichte von 0,6-0,8 gezüchtet wurden, wird die Expression des heterologen Gens durch die Zugabe von 5 g/l Laktose induziert und den Zellen ermöglicht, bei 250C, pH 7,0 und pθ2 20% zu wachsen, bis eine optische Dichte von 8,0 erreicht wurde. Die rekombinanten Zellen wurden durch Zentrifugation (15000 g) für 20 Minuten pelletiert und anschließend mittels Homogenisator (Homogenizer Invensis APV-2000, 1000 bar) oder French Pressure Cell (70 bar) mechanisch zerstört. Wie oben erwähnt, wird die rekombinante 2,5-Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase unter Verwendung der immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) gereinigt. Bei dieser Technik wird das Medium zuerst mit einem Übergangsmetallion (Ni2+) geladen, um einen Chelat vor der Verwendung zu bilden. Die Proteine binden an das Medium, in Abhängigkeit der Gegenwart von Oberflächen-Histindinresten, die eine Affinität für die chelatierten Metallionen besitzen. Die Bindungsstärke wird dabei grundsätzlich durch das Metallion und den pH- Wert des Puffers bestimmt. Das gebundene Protein kann durch kompetitive Elution mit Imidazol eluiert werden. Der Iminodiessigsäureligand wird an die chelatierende Sepharose gekoppelt und ermöglicht somit den Austausch der immobilisierten Metallionen. Die so hergestellte 2,5-Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase (DKR) weist eine Aktivität von etwa 200 U/l Kultur auf. Für die enzymatische Umsetzung von 2,5-DKG in 2-KLG wird die DKR in löslicher Form eingesetzt. Dazu wird zu einem 21 Reaktionsgefäß 250 mM (58 g/l) 2,5-DKG, 2 U/ml DKR, 250 mM (45 g/l) Glucose, 2 U/ml Glucose-Dehydrogenase (GDH) und 0,26 mM (0,21 g/l) NADP+ hinzugefugt. Das Volumen im Batchreaktor betrug 500 bzw. 1000 mL. Die Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG erfordert das Coenzym NADPH, welches durch die gleichzeitige Oxidation von Glucose zu Gluconsäure (GA) mittels Glucose-Dehydrogenase (GDH: EC 1.1.1.47 aus Bacillus cereus, Amano, Japan) regeneriert wird. Die Umwandlungsreaktion findet bei 250C, pH- Wert 7,0, der mit Ammoniak konstant gehalten wird, unter kontinuierlichem Rühren statt. Diese Reaktion liefert bei den genannten Bedingungen 56,0 g 2-Keto-L-Gulonsäure/l Reaktionslösung (d.h. Puffer, entweder Na- Acetat oder Na-Citrat oder Bis-Tris) (Ausbeute 96,7%) und 42,1 g Gluconsäure/1 Reaktionslösung (d.h. Puffer, entweder Na-Acetat oder Na-Citrat oder Bis-Tris) (Ausbeute 93,5%). Die 2-Keto-L-Gulonsäure wird in weiterer Folge von der Gluconsäure, Glucose und 2,5-DKG durch einen Ionentauscher abgetrennt und für die weitere Umsetzung in Ascorbinsäure verwendet. Die Gluconsäure, Glucose und 2,5-DKG werden in den ersten Reaktionsschritt (Fermentation von Pectobacter cypripedii) rückgeführt.
In einer alternativen Ausführungsform kann das oben beschriebene zweistufige Verfahren, welches in zwei räumlich getrennten und nicht miteinander verbundenen Reaktionsgefäßen abläuft, zu einem sogenannten Hybridverfahren kombiniert werden. Dazu werden der Rührkessel, in welchem die Fermentation von Pectobacter cypripedii HEPOl und die damit verbundene Umwandlung von Glucose in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure (Schritte 1 des obigen Verfahrens) abläuft, und der Enzymreaktor, in welchem die durch die 2,5-Diketo-D- Gluconsäure-Reduktase katalysierte Reaktion stattfindet, über Verbindungsleitungen direkt miteinander verbunden. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Hybridverfahrens liegt darin, dass im Fermenter kontinuierlich 2,5-DKG gebildet wird, welche, nachdem die Mikroorganismen aus dem Flüssigkeitsstrom des Fermenters durch Filtration abgetrennt wurden, in den Enzymreaktor geleitet wird. Hierfür ist es notwendig das Reaktionsgemisch des Enzymreaktors in einen Produkt- und einen Biokatalysatorstrom zu trennen, wobei die Trennung mittels einer geladenen Ultrafiltrationsmembran bewerkstelligt wird. Die für eine kontinuierliche Prozessführung notwendigen Enzyme, DKR und GDH, sowie die Coenzyme NADPH und NAPD+ werden im Enzymreaktor zurückgehalten, während die unverbrauchten Substrate 2,5-Diketo-D-Glucose und Glucose sowie die Produkte Gluconsäure und 2-Keto-L-Gulonsäure die Membran ungehindert passieren können. Die Enzyme (DKR und GDH) werden durch die Ultrafiltrationsmembran aufgrund ihrer Größe zurückgehalten, wohingegen die Coenzyme (NADPH und NADP+) aufgrund ihrer negativen Ladung am Durchgang gehindert werden. Bezüglich der Rückführung von unverbrauchter Glucose (Ausgangsmaterial der GDH-Reaktion) und von Gluconsäure, welche einerseits das Produkt der GDH-Katalyse ist und andererseits das Ausgangsmaterial für die Fermentation von Pectobacter cypripedii darstellt, muss das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens 2-Keto-L-Gulonsäure aus dem Produktstrom abgetrennt werden. Hierzu wurde die Ionenaustauschchromatographie (stark-basischer AIEX) eingesetzt, um die 2-Keto-L-Gulonsäure von der Glucose bzw. Gluconsäure zu trennen. Das Biokatalysator-System (DKR, GDH und NADPH) bleibt durch die Ultrafiltrationsmembran im Enzymreaktor.
Die für das erfindungsgemäße Hybridverfahren verwendeten Gefäße sind im Stand der Technik bekannt und sind einerseits ein herkömmlicher Rührkessel, der die notwendige Mess- und Steuerelektronik wie beispielsweise pH-Elektrode, pO2-Elektrode etc. aufweist, und andererseits ein Enzymreaktor, der eine semipermeable Membran aufweist. Die verwendete semipermeable Membran ist eine geladene Ultrafiltrationsmembran (NTR- 7430, Nitto Electric Industrial Co. (Japan)). In dem Rührkessel findet die fermentative Umsetzung von Gluconsäure in 2,5-DKG mittels Pectobacter cypripedii HEPOl statt, während in dem Enzymreaktor die biokatalytische Umsetzung von 2,5-DKG in 2-KLG unter gleichzeitiger Regenerierung des Coenzyms NADPH abläuft. Der sterile Rührkessel mit einem Reaktorvolumen von 10 Litern wurde mit Medium, welches oben für die Fed- Batch Fermentation beschrieben ist, befüllt und der Rührkessel mit dem Inhalt zweier Vorkultur-Erlenmeyerkolben des Pectobacter cypripedii HEPOl Stammes inokuliert. Der Pectobacter cypripedii-Stamm (HEPOl) wurde bei 280C, pH 7 bzw. 5,6, wie oben beschrieben, bei einer Gelöstsauerstoff-Konzentration von 10% fermentiert und ergab 137 g/l Produkt. Ein Teil der Kultursuspension wird von dem Rührkessel abzogen, filtriert, und der Überstand wird in den Enzymreaktor eingeleitet. Die Umsetzungsreaktion in dem Enzymreaktor findet bei 25°C (da wie oben erwähnt nach wie vor zwei Reaktoren verwendet werden, die miteinander verbunden sind, können unterschiedliche Temperaturen verwendet werden) und einem pH Wert von 6,4 statt, welcher mit Ammoniak konstant gehalten wird. Das Produkt dieser Fermentation, 2,5-Diketo-D-Gluconsäure, wurde unter Zugabe von 2 U/ml DKR, 2 U/ml und 106 g Glucose/1 Puffer (entweder Na-Acetat oder Na- Citrat) in dem Enzymreaktor in die unmittelbare Vorstufe der Ascorbinsäure, 2-Keto-L- Gluonsäure mit einer Ausbeute von 132 g/l umgewandelt. Das Volumen im Enzymreaktor beträgt ebenfalls 10 L. Die Enzyme (DKR und GDH) sowie die Coenzyme werden durch die Ultrafiltrationsmembran in dem Enzymreaktor zurückgehalten, während der Produktstrom (Glucose, Gluconsäure und 2-Keto-L-Gulonsäure) aus dem Enzymreaktor abgezogen, über eine Ionenaustauschchromatographie-Säule (Säulenmaterial Amberlite FPA90, Rohm and Haas) geleitet und mit verschiedenen Eluenten (H2O, Methanol und H2SO4) eluiert wird, um den Produktstrom in seine Einzelkomponenten zu trennen, wodurch es möglich wird, Glucose und Gluconsäure von der 2-Keto-L-Gulonsäure zu trennen, wobei die 2-Keto-L-Gulonsäure als Methylester-KLG eluiert wird. Die Ausbeute an 2-Keto-L- Gulonsäure betrug 132 g/l. Die Glucose bzw. Gluconsäure (99 g/l) werden in den Rührkessel zurückgeführt und dort durch den Pectobacter cypripedii Stamm HEPOl metabolisiert, um weitere 2,5-Diketo-D-Gluconsäure zu bilden. Somit bildet das beschriebene Hybridverfahren einen geschlossen Kreislauf, um möglichst hohe Produktausbeuten (2-Keto-L-Gulonsäure) bei gleichzeitiger Verwendung der ursprünglich zugesetzten Enzyme bzw. Coenzyme zu erreichen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Herstellen von Ascorbinsäure, bei welchem in einem ersten Schritt eine Kohlenstoffquelle fermentativ in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure umgewandelt wird, welche dann in einem zweiten Schritt enzymatisch mit 2,5-Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase aus Corynebacterium glutamicum zu 2-Keto-L-Gulonsäure umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle Glucose ist und die Umwandlung von Glucose in 2,5-Diketo-D-Gluconsäure durch den Pectobacter cypripedii Stamm HEPOl (DSMZ 12393) direkt erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im ersten Schritt die Luftzufuhr bis zum Erreichen anaerober Bedingungen in der Nährlösung verringert bzw. eingestellt wird, wenn die Bildung der 2,5-Diketo-D-Gluconsäure aus dem Zwischenprodukt 2-Keto-D-Gluconsäure ausbleibt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Luftzufuhr über eine Sauerstoffsonde gesteuert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass während der Fermentation des ersten Schrittes der pH- Wert überwacht und/oder geregelt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Schritt des Verfahrens im Batch-Betrieb ausgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Schritt des Verfahrens im Fed-Batch Betrieb ausgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das im zweiten Schritt benötigte Coenzym NADPH durch die Glucose-Dehydro genäse, die
Glucose in Gluconsäure umwandelt, regeneriert wird, wobei die durch die Regenerierung entstehende Gluconsäure, und gegebenenfalls verbleibende Glucose und/oder 2,5-Diketo-D-Gluconsäure in den ersten Schritt zurückgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Schritt als Puffer
Na-Citrat oder Na-Acetat eingesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Gluconsäure und gegebenenfalls Glucose und/oder 2,5-Diketo-D-Gluconsäure vor der Rückführung durch chromatographische Trennverfahren, wie Ionentauschchromatographie, von dem 2-Keto-L-Gulonsäure-Produktstrom getrennt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die 2,5- Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase aus Corynebacterium glutamicum unter Verwendung eines pET -Vektors in E. coli rekombinant hergestellt ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Insert- DNA als Primer für die PCR CglakrPETF und CglakrPETR und das Plasmid pPCl als Matrize verwendet wird, wobei das amplifizierte Fragment in den Expressionsvektor pET-21d eingesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der mit pET-21d transformierte E. coli BL21 (DE3) Stamm in einem Minimalmedium MPC-GIy, das in einem Liter 10g Pepton aus Casein
10g Glycerol 0,1 ml IM CaCl2 1 M MgSO4*7H2O 200 ml MPC-GIy Salze enthält, gezüchtet wird, wobei die MPC-GIy Salzlösung in einem Liter Wasser
15 g KH2PO4 2,5 g NaCl S g NH4Cl enthält. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es als Hybridverfahren geführt wird, wobei das Reaktionsgemisch in einen Produktstrom und einen Biokatalysatorstrom durch ein Membrantrennverfahren getrennt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme 2,5-Diketo-D- Gluconsäure-Reduktase und Glucose-Dehydrogenase sowie die Coenzyme NADPH und NADP+ durch eine geladene Ultrafiltrationsmembran zurückgehalten werden.
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