WO2011114071A2 - Cyclopeptide synthetique, procede de preparation et utilisations - Google Patents

Cyclopeptide synthetique, procede de preparation et utilisations Download PDF

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    • C07K5/0222—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -X-C(=O)-(C)n-N-C-C(=O)-Y-; X and Y being heteroatoms; n being 1 or 2 with the first amino acid being heterocyclic, e.g. Pro, Trp
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links

Definitions

  • the present invention relates to a novel synthetic cyclopeptide, its method of preparation and its uses in the prevention or treatment of a disease associated with angiogenesis.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a cyclopeptide according to the invention.
  • references in square brackets [] refer to the list of references at the end of the text.
  • Vasculogenesis and angiogenesis are processes responsible for the formation of the circulatory system, the first functional unit during the development of the embryo. Unlike vasculogenesis, angiogenesis involves the growth of new vessels from preexisting vessels.
  • Angiogenesis is an essential process for setting up the vascular system in the embryo, scarring and development of the uterine endometrium.
  • angiogenesis under pathophysiological conditions contributes to the development of rheumatoid arthritis, adult macular degeneration, tumor growth and metastatic spread.
  • angiogenesis plays a preponderant role in neovascularization of tumors.
  • the tumor cells are able to invade the surrounding normal tissue, remolding it, and migrate remotely to form metastases.
  • the tumor vasculature being abnormal and tortuous, it reduces the distribution of therapeutic molecules.
  • Angiogenesis is regulated by pro- and anti-angiogenic factors.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF-1 Fibroblast Growth Factor 1 in English
  • FGF-2 Fibroblast Growth Factor 2
  • VEGF activity is often markedly increased in a wide range of tumor cells, including kidney, breast, ovarian, stomach, lung, bladder, tumors of head and neck, and in the glioblastoma.
  • the anti-angiogenic agents currently marketed target the production of endothelial mitogens, the mitogens themselves, their receptors, or the signaling pathways associated with these agents and cell adhesion molecules, such as integrins.
  • monoclonal antibodies used for the inhibition of tumor vascularization. In general, each monoclonal antibody is specific for a given cancer, that is, the organ and the cause of tumor formation.
  • the main monoclonal antibodies are bevacizumab (Avastin®), cetuximab (Erbitux®), rituximab (Mabthéra®) and trastuzumab (Herceptin ® ).
  • estrogens are considered as hormones involved in the formation and growth of tumors of the mammary gland.
  • many phyto-oestrogens such as genistein (flavonoid) have shown in vitro, estrogenic and / or anti-angiogenic properties according to their class. These compounds bind to the estrogen receptors of breast, ovaries or endometrium for example, contributing to the regulation of cell reproduction mechanisms by initiation of estrogen-dependent transcription.
  • estrogen analogues or compounds with estrogenic properties also have pro or antiangiogenic activity.
  • 2-methoxyestradiol is a strogenic derivative capable of preventing the formation of new vessels.
  • the estrogenic properties of other phytoestrogen analogues called segetalin, extracted from the seeds of Vaccaria segetalis, have also been studied.
  • the object of the invention is therefore to provide a new anti-angiogenic molecule with greater efficacy compared to existing anti-angiogenic molecules.
  • ⁇ Ala represents alanine
  • ⁇ Gly represents glycine
  • ⁇ Val represents valine
  • the term "pharmaceutically acceptable salts” includes salts prepared with acids or bases, non-toxic, depending on the substituents present on the compounds.
  • the corresponding salts may be obtained by addition of an organic or inorganic base to the compound in the presence of a preferably inert solvent.
  • a base addition salt may be sodium, potassium, calcium, ammonium, amino (organic), or magnesium salts.
  • the corresponding salts may be obtained by addition of an organic or inorganic acid optionally in a solvent which is preferably inert.
  • Examples of inorganic acid addition salts can be hydrochloric (or hydrochloride), hydrobromic, nitric, carbonic, monohydrogenocarbon, phosphoric, monohydrogenphosphoric, dihydrogenphosphoric, sulfuric, hydroiodic monohydrogenosulfuric salts.
  • Examples of salts of organic acid additions may be the acetic, propionic, isobutyric, maleic (or maleate), malonic, benzoic, oxalic (or oxalate), glucuronic (or glucuronate), succinic, suberic, fumaric (or fumarate) salts. ), lactic, mandelic, phthalic, benzenesulfonic, p-tolylsulfonic, citric, tartaric, methanesulfonic.
  • amino acids forming the cyclopeptide of formula (I) according to the invention are linked together by a peptide bond.
  • the cyclopeptide according to the invention with anti-angiogenic activity may offer several advantages over conventional anticancer therapies, in particular a specificity of anti-tumor action, easier accessibility of the target, a lower risk of resistance, efficacy in combination therapy with conventional anticancer drugs and the possibility of chemoprophylaxis.
  • the inventors have demonstrated a direct anti-angiogenic activity of the cyclopeptide according to the invention, unlike natural sevein A.
  • the cyclopeptide according to the invention is able to directly impede cell migration and the formation of endothelial cell capillaries, unlike natural segetalin.
  • the invention also relates to the process for the preparation of a cyclopeptide of formula (I), in which:
  • ⁇ Pr is a protecting group selected from the group consisting of acetamidomethyl (Acm), allyloxycarbonyl (Alloc), t-butyloxycarbonyl (Boc), benzyloxymethyl (Bom), 2- (4-biphenylyl) propyl (2 ) oxycarbonyl (Bpoc), 2-bromobenzyloxycarbonyl (Br-Z), butoxymethyl (Bum), benzoic acid (Bz), benzyl (Bzl), dichlorobenzyl (CI 2 Bzl), 2-chlorobenzyloxycarbonyl (CZI) ), W- [1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene) ethyl] (Dde), dithia-succinyl (Dts), 4-methoxybenzyl (Mbzl), 4-methylbenzyl (MeBzl), methoxybenzyl (ob), 4-meth
  • protecting group is meant a group introduced into a molecule in order to prevent secondary reactions from occurring in the course of the synthesis and / or to obtain a certain chemoselectivity.
  • the protecting groups are, in general, inert in the reaction conditions chosen. Once the reaction (s) carried out in the presence of the protecting groups, the latter are removed to return to the starting molecules (deprotection).
  • the term "cyclization agent" a compound for the formation of a cyclic organic compound by the creation of a bond between the organic molecules, providing the constituent elements of this cycle.
  • the cyclizing agent allows the formation of a peptide bond between the C-terminus of glycine and the V-terminus of valine present in the linear compound of formula (IV), and between the C-terminus of the compound Z and the V-terminus of the compound Y present in the linear compound of formula (V), to yield the cyclopeptide of formula (I).
  • the choice of the experimental conditions in particular the nature of the cyclization agent, its concentration and the choice of the two amino acids involved in the cyclization, are important in order to avoid the racemization of the constituent molecules of the compounds of formulas (IV) and (V). ), and the formation of dimers from the compound of formula (IV) or (V).
  • the choice of the aforementioned experimental conditions makes it possible, moreover, to obtain a regioselective cyclization.
  • Phosphorylated azides have been shown to be particularly useful cyclization agents. Examples that may be mentioned include diphenylphosphoryl azide (DPPA), bromo-tris-pyrrolidino phosphoniumhexafluorophosphate (PyBrOP), O-benzotnazole- / V, / V, / V ', / V-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate.
  • DPPA diphenylphosphoryl azide
  • PyBrOP bromo-tris-pyrrolidino phosphoniumhexafluorophosphate
  • O-benzotnazole- / V, / V, / V ', / V-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate O-benzotnazole- / V, / V, / V ', / V-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate.
  • HBTU benzotriazol-1-yl-oxytris- (dimethylamino) -phosphonium hexafluorophosphate
  • BOP benzotriazol-1-yl-oxytris- (dimethylamino) -phosphonium hexafluorophosphate
  • CD1 dicyclohexylcarbodiimide
  • DEPBT 3- (diethoxy) phosphoryloxy) -3H-benzo [d] [1,2,3] triazin-4-one
  • DEPBT triazin-4-one
  • DIC ⁇ , ⁇ '-diisopropylcarbodiimide
  • EDC.HCI methanaminium 2- (1H-7-azabenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate
  • HOBt benzotriazol-1-yl-oxytris- (dimethylamino) -phosphonium hexaflu
  • the concentration of the cyclizing agent is an important parameter in the cyclization reaction.
  • concentration of the cyclizing agent is an important parameter in the cyclization reaction.
  • concentration of between 2.10 "4 and 10" 4 M led to cyclopeptide of formula (I), with concentrations very weak or none of the corresponding dimer.
  • the cyclization reaction can take place in an aprotic organic solvent.
  • acetonitrile, dichloromethane or dimethylformamide there may be mentioned for example acetonitrile, dichloromethane or dimethylformamide.
  • the compound of formula (I) can be obtained at the end of step b) t after the cleavage of the protective groups Pr of the compounds (IV) or (V).
  • the cleavage or cleavage can be done under various acidic and / or basic conditions known to those skilled in the art.
  • step b) may optionally be followed by a washing and / or purification step.
  • the compounds (IV) and (V) can be obtained respectively from the compounds of formula (VI) and (VII):
  • ⁇ Pr, Pri are protecting groups chosen, independently of each other, from the group consisting of acetamidomethyl (Acm), allyloxycarbonyl (Alloc), t-butyloxycarbonyl (Boc), benzyloxymethyl (Bom) , 2- (4-biphenylyl) propyl (2) oxycarbonyl (Bpoc), 2-bromobenzyloxycarbonyl (Br-Z), butoxymethyl (Bum), benzoic acid (Bz), benzyl (Bzl), dichlorobenzyl (CbBzl), 2-chlorobenzyloxycarbonyl (CIZ), N- [1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene) ethyl] (Dde), dithia-succinyl (Dts), chloride fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), 4-methoxybenzyl (Mbzl), 4 methyl
  • C-terminus glycine and compound Z can be successively cleaved under different operating conditions.
  • the compounds (IV) and (V) are obtained after successive cleavages of the protective group Pn and the resin Rs of the compounds of formulas (VI) and (VII), respectively.
  • reaction is meant a (co) polymeric support used in solid phase synthesis. In general, they are functionalized crosslinked (co) polymers insoluble but capable of swelling in the solvents used.
  • the cleavage or cleavage of the Gly-Rs or (Z) -Rs bond after cleavage or cleavage of the ⁇ -Val bond or the ⁇ - ⁇ bond, makes it possible to release the compound of formula ( VI) or (VII) of its synthesis support. The compound resulting from this cleavage is recovered in the filtrate.
  • the cleavage or cleavage can be done under mild acidic and / or basic conditions.
  • mild acidic conditions mention may be made of the use of 1% trifluoroacetic acid (TFA) (cleavage or cleavage of the Gly-Rs or (Z) -Rs bond).
  • Cleavage under mild basic conditions can be done, for example, in the presence of a primary and secondary amine such as piperidine (cleavage or cleavage of the Pn-Val bond or of the Pr-i-Y bond).
  • the compounds (VI) and (VII) can be prepared by successive couplings.
  • the compound (VI) can be prepared by the successive coupling between a compound of formula (VIII):
  • Solid support synthesis involves a carrier consisting of an insoluble (co) polymer (resin), inert under the conditions of synthesis.
  • these polymers (resins) have the particularity of swelling in the solvents used, which ensures a good diffusion of the reagents.
  • Gly or (Pr-Z) are attached to the resin, advantageously, by a covalent bond.
  • the coupling agent may be chosen from the group comprising, for example, bromo-tris-pyrrolidino phosphoniumhexafluorophosphate (PyBrOP), O-benzotriazole-A / N, N- / V-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU).
  • the cyclopeptide according to the invention can be used directly or in the form of a pharmaceutical composition containing it, for its use as a medicament.
  • the subject of the invention is therefore medicaments comprising a cyclopeptide according to the invention.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a cyclopeptide as defined above and optionally one or more pharmaceutically acceptable excipient (s).
  • Excipients are usually non-therapeutic elements that are part of a drug or are used in its manufacture.
  • the purpose of the excipient is to improve the appearance or taste, to ensure the preservation, to facilitate the shaping and the administration of the medicament. It is also used to convey the active ingredient to its site of action and to control its absorption by the body.
  • different excipients may be used. Those skilled in the art are able to select the appropriate excipients according to the desired dosage form and mode of administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be prepared by known methods.
  • the amount of cyclopeptide directly administered or included in the pharmaceutical compositions is a therapeutically effective amount.
  • Effective amount or therapeutically effective amount means an amount of cyclopeptide as is or included in a pharmaceutical composition, which leads to the desired prophylactic or therapeutic effect. Said effective amount can be determined experimentally by standard pharmaceutical procedures.
  • the dose of active principle may vary between 0.1 ⁇ g and 200 mg per kg of body weight per day.
  • these assays are examples of average conditions, there may be special cases where higher or lower dosages are more appropriate.
  • Such assays are part of the invention. According to the usual practice, the dosage appropriate to each patient is determined by the physician according to the mode of administration, the weight and the response of said patient.
  • Modes of administration may include, for example, the oral, sublingual, rectal, topical, nasal, pulmonary, ocular, intestinal and parenteral routes.
  • Parenteral administration may include, for example, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intraarterial, intra-articular, intracisternal, intradermal, intra-lesional, intraocular, intrapleural, intrathecal, intrauterine administration, and intraventricular.
  • the therapeutic indication to be treated as well as the physicochemical and biological properties of the composition make it possible to determine the most appropriate route of administration and formulation. Different formulations and delivery systems are described in the state of the art.
  • compositions may be in the form of instant release, controlled release, or delayed release.
  • the most commonly used formulations are, for example, solutions, suspensions, (micro) emulsions, ointments, gels, patches, tablets, dragees, soft and hard capsules, implants, amorphous or crystalline powders, and lyophilized formulations.
  • compositions are usually sterile and may be presented in unit dosage form such as, for example, ampoules, syringes, injection pens, or multiple dose vials.
  • the compositions may be in the form of suspensions, solutions or emulsions in an aqueous or fatty vehicle and contain physiologically compatible buffers such as, for example, phosphate, histidine, or citrate to adjust the pH of the formulation, agents tonicity such as sodium chloride or dextrose, viscosity agents, suspending agents, dispersing agents, surfactants, antioxidants, biocompatible polymers, chelating agents, preservatives.
  • the vehicle may contain water, a vegetable or synthetic oil and / or organic co-solvents.
  • the parenteral formulation can be reconstituted or diluted prior to its administration.
  • the composition according to the invention may be in the form of suspension of nano / micro particles with polymers as matrix.
  • Other delay formulations may be in the form of implants or pumps.
  • solid, semi-solid or patch formulations may be preferred.
  • the composition may be formulated in liquid or solid form and as an instant-release or controlled / delayed-release formulation, especially in the form of granules, tablets, dragees, soft and hard capsules, liquids, gels, suspensions and emulsions.
  • the cyclopeptide as defined above can be used for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of a disease associated with angiogenesis.
  • An object of the invention relates to the cyclopeptide according to the invention or a pharmaceutical composition as defined above, for the prevention or treatment of a disease associated with angiogenesis.
  • the invention relates to the cyclopeptide according to the invention or the pharmaceutical composition as defined above, for the prevention or the treatment of a disease associated with angiogenesis chosen from the group comprising tumor growth (colon tumor, breast, liver, kidney and prostate), metastatic dissemination (colon tumor, breast, liver, kidney and prostate), hemangiomas, rheumatoid arthritis, endometriosis, atherosclerosis, diabetic retinopathy and macular degeneration.
  • tumor growth colon tumor, breast, liver, kidney and prostate
  • metastatic dissemination colon tumor, breast, liver, kidney and prostate
  • hemangiomas heumatoid arthritis
  • endometriosis endometriosis
  • atherosclerosis diabetic retinopathy
  • macular degeneration macular degeneration
  • the invention relates more particularly to the cyclopeptide according to the invention or the pharmaceutical composition as defined above, for the prevention or treatment of tumor growth (colon, breast, liver, kidney and prostate).
  • the administration of the cyclopeptide of the invention first makes it possible to normalize the tumor vascularization and to facilitate the access of the therapeutic molecules to the tumor and then to completely destroy the tumor vascular network.
  • the cyclopeptide of the invention can be used in therapy, especially oncotherapy, in the mammal and in particular in humans.
  • mammal refers to any mammal.
  • domestic animals such as dogs and cats; farm animals such as hogs, cattle, sheep and goats; animals such as mice and rats; primates like monkeys, chimpanzees; and the man.
  • the invention further relates to the cyclopeptide of the invention or the pharmaceutical composition as defined above, for the prevention or treatment of osteoporosis.
  • the invention relates to the cyclopeptide of the invention for its application as a medicament in the prevention or treatment of a disease associated with the formation of endothelial cell capillary tubes.
  • the invention also relates to the use of the cyclopeptide to prevent the formation of endothelial cell capillary tubes.
  • the cyclopeptide according to the invention has a direct anti-anginal action on cell migration and capillary tube formation of endothelial cells.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating the pathologies indicated above which comprises the administration of a cyclopeptide according to the invention or a pharmaceutical composition comprising it.
  • Figure 1 represents the high-resolution mass spectrum of the SA compound (sevelin A).
  • FIG. 2 represents the high-resolution mass spectrum of compound SP1.
  • Figure 3A shows the high-resolution mass spectrum of compound SP2.
  • Figures 4A and 4B show the effect of conditioned media (MC) on endothelial cell proliferation.
  • the HUVEC cells were treated for 48 hours by the MCs prepared from the culture supernatants of the MCF7 cells (FIG. 4A) or with MC prepared from the culture supernatants of the MDA-MB-23 cells (FIG. 4B), previously treated. during 48h by SA and SP1 (10 ⁇ 12 to 10 ⁇ 5 M).
  • the Inhibitory potential of SA and SP1 on cell proliferation was evaluated against the condition of 10% fetal bovine serum (FBS). Untreated cells were used as a baseline control.
  • the white bars represent the rate of cell proliferation in response to C treated with different concentrations of SP1.
  • the black bars represent the rate of cell proliferation in response to MC treated with different concentrations of SA.
  • the dotted line delineates the cell proliferation rate compared to the basal control.
  • the results are expressed as a change in optical density (OD) read at 450 and 570 nm.
  • Figure 5A depicts the phosphorylation analysis of signaling pathways involved in cell migration and survival (AKT-1) in human umbilical cord endothelial cells (HUVEC), in response to MC obtained from MCF7 cells.
  • HUVEC cells in culture are treated with MC prepared from the supernatants of the MCF7 cells, cells pretreated with different concentrations of SA and SP1 (10 "11-10" 5 M). The HUVEC cells are then recovered and lysed at 5 min of treatment. The histograms displayed represent the result normalized by the ratio P-Akt / t-Akt. The data is expressed in arbitrary units. p-Akt (Akt phospho), t-Akt (total Akt), T0 (basal control).
  • Figure 5B shows the phosphorylation analysis of signaling pathways involved in cell migration and survival (AKT-1) in human umbilical cord endothelial cells (HUVEC), in response to MC obtained from MDA cells.
  • MB-231 shows the phosphorylation analysis of signaling pathways involved in cell migration and survival (AKT-1) in human umbilical cord endothelial cells (HUVEC), in response to MC obtained from MDA cells.
  • MB-231 shows the phosphorylation analysis of signaling pathways involved in cell migration and survival (AKT-1) in human umbilical cord endothelial cells (HUVEC), in response to MC obtained from MDA cells.
  • MB-231 shows the phosphorylation analysis of signaling pathways involved in cell migration and survival (AKT-1) in human umbilical cord endothelial cells (HUVEC), in response to MC obtained from MDA cells.
  • Figure 5C depicts the analysis of phosphorylation of signaling pathways involved in proliferation (ERK1 / 2) in human umbilical cord endothelial cells (HUVEC), in response to MC obtained from MCF7 cells.
  • Figure 5D shows the phosphorylation analysis of signaling pathways involved in proliferation (ERK1 / 2) in human umbilical cord endothelial cells (HUVEC), in response to MC obtained from MDA-MB-231 cells.
  • the HUVEC cells in culture are treated with the MCs prepared from the supernatants of the MDA-MB-231 cells cells previously treated with different concentrations of SA and SP1 (10 11 to 10 5 M).
  • the HUVEC cells are then recovered and lysed at 5 min of treatment.
  • the histograms displayed represent the result normalized by the ratio p-Erk / t-Erk.
  • the data is expressed in arbitrary units.
  • Figure 6A shows the effect of cyclopeptides SP1 and SA on the secretion of VEGFA by MCF7 cells.
  • Cells were treated for 48 h with different concentrations of SA or SP1 (10 "12 to 10" 5 M). Untreated cells represent the basal control while the cells treated with different concentrations of E2 (17- ⁇ estradiol) (10 "5-10" 12 M) represent the positive control.
  • the curve connecting the diamonds (upper line) represents the different concentrations of VEGF-treated cells by E 2.
  • the curve connecting the squares (mean line) corresponds to the different VEGFA concentrations of the cells treated with SP1.
  • the curve connecting the triangles corresponds to the different VEGFA concentrations of the cells treated with SA.
  • the dashed line represents the level of the secretion rate of VEGFA by the cells treated with the culture medium alone (basal control).
  • FIG. 6B represents the effect of cyclopeptides SP1 and SA on the secretion of VEGFA by MDA-MB-231 cells.
  • Cells were treated for 48 h with different concentrations of SA or SP1 (0 "12 to 10" 5 M).
  • the untreated cells represent the basal control while the cells treated with different concentrations of E2 (10 ⁇ 5 to 10-12 M) represent the positive control.
  • the curve connecting the diamonds (top line) represents the different concentrations of VEGFA cells
  • the curve connecting the squares (mean line) corresponds to the different VEGFA concentrations of the cells treated with SP1
  • the curve connecting the triangles corresponds to the different VEGFA concentrations of the cells treated with SA.
  • the white bars represent the different VEGFA concentrations of the cells treated with E 2 .
  • the gray bars represent the different VEGFA concentrations of cells treated with SP1 + E 2 .
  • the black bars represent the different VEGFA concentrations of cells treated with SA + E 2 .
  • FIG 6D shows the inhibitory effect of cyclopeptides SP1, SA and S1 on the secretion of VEGF-A by the MDA-MB-231 cells in the presence of E 2 (1fJ 9 M).
  • Figure 6E shows the effect of cyclopeptides SP1 and S1 on the secretion of VEGFA by MCF7 cells.
  • Figure 6F shows the effect of the cyclopeptides SP1 and S1 on the secretion of VEGFA by DA-MB-231 cells.
  • the white bars represent the concentration of VEGFA in cells treated with E2.
  • the light gray bars represent the VEGFA concentration of untreated cells (basal control).
  • the dark gray bars represent different concentrations of VEGF-treated cells different from S1 (10 ⁇ 12-10 "5 M).
  • the black bars 0 represent different concentrations of VEGF-treated cells by different SP1 ( 10 "12 to 10 " M)
  • the dashed line represents the level of the secretion rate of VEGFA by the cells treated with the culture medium alone (basal control) .
  • Figure 7A shows analysis of VEGF121, VEGF165 and VEGF189 mRNA expression in MCF-7 cells in response to SA and SP1 treatment.
  • Figure 7B shows the analysis of the expression of VEGF121, VEGF-165 and VEGF 89 mRNA in MBA-MB-231 cells in response to SA and SP1 treatment.
  • FIGS. 8A and 8C show the HUVEC differentiation test in Matrigel ®
  • the cells were treated for 16 hours with different concentrations of SA and SP1 (10 6 to 10 -5 M) Two controls were used: 30 g / mL genistein, inhibitor of HUVEC differentiation in Matrigel ® and migration of HUVECs, and EGFR at 50 ng / mL, activator of HUVEC differentiation in Matrigel ® and HUVEC migration Untreated cells were used as basal control (cells cultured in culture medium supplemented with 10% FBS alone) Gen means genistein and EGF stands for Endothelial Growth Factor (Figure 8C) represents the quantification of the length of myotubes observed in each condition relative to the length of myotubes. observed in the basal witness.
  • FIG. 8B represents the evaluation of the anti-angiogenic activity of the SA and S1 cyclopeptides by the HUVEC migration test.
  • the cells were treated for 16 hours with various concentrations of SA and SP1 (10 6-0 "5 M) Two controls were used:. Genistein to 30 mcg / mL) inhibiting the differentiation of HUVEC in Matrigel ® and migration of HUVECs, and EGFR at 50 ng / mL, activator of HUVEC differentiation in Matrigel ® and HUVEC migration Untreated cells were used as basal control (cells cultured in culture medium supplemented with 10% FBS alone) (Gen stands for genistein, EGF stands for epidermal growth factor) EXAMPLES
  • the peptide synthesis was carried out on a solid support on an Applied Biosystem 433A peptide synthesizer marketed by Applied Biosystem.
  • amino acids Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH used in the examples come from the companies Bachem and Iris Biotech.
  • ⁇ -N, N-diisopropylethylamine (DIEA) in N-methylpyrrolidinone (NMP), and NMP are from Applied Biosystem.
  • Piperidine, trifluoroacetic acid (TFA), dichloromethane (DCM) and acetonitrile are marketed by the companies Acros and Applied Biosystem.
  • DPPA Diphenylphosphoryl azide azide
  • DIEA diethyl ether
  • methanol methanol
  • palladium on charcoal marketed by Sigma and Acros.
  • the spectra are carried out in deuterated solvents from the Aldrich and SDS or Eurisotop suppliers.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the linear peptide H2N-Val-Pro-Val-Val-Ala-Gly-OH is synthesized, from Fmoc-Gly-Sasrin, according to the methods of peptide synthesis on support solid on an Applied Biosystem 433A peptide synthesizer (1 equivalent, 0.1 mM) [3].
  • the Sasrin resin is then cleaved from the linear peptide thus obtained with a solution of 1% trifluoroacetic acid in dichloromethane for 45 minutes at room temperature (20 ° C.). After filtration and removal of the resin, the linear peptide is obtained as a colorless oil after vacuum removal of the solvent.
  • the linear peptide (49 mg) is cyclized at a concentration of 2.10 -4 M in acetonitrile in the presence of 34 eq of DIEA and 3 eq of DPPA, under argon, until complete disappearance of the linear peptide (48h) at The reaction is monitored by High Performance Liquid Chromatography (Shimadzu, analytical column C18 prosphere 0 100A 4.6 x 250mm 5 ⁇ (Alltech-Grace), with a solvent gradient (A: water / TFA: 100 / 0.1). B, acetonitrile / water / TFA: 80/20 / 0.1) After removal of the solvent in vacuo, 60 mg of impure cyclic peptide are obtained after precipitation with diethyl ether and filtration. .
  • HPLC purification is finally carried out on a semi-preparative C18 prosphere 100A 10 x 250mm 5 ⁇ column (Alltech-Grace). After lyophilization, the cyclopeptide SP1 is obtained in the form of a white powder.
  • the linear peptide H 2 N-Ala-Gly-Val-Pro-OH is synthesized, from Fmoc-Pro-Sasrin, according to solid support peptide synthesis methods on an Applied Biosystem 433A peptide synthesizer (1 equivalent, 0.1 mM) [3].
  • Ten equivalents of the Fmoc-Val-OH, Fmoc-Gly-OH and Fmoc-Ala-OH amino-acids are successively added to the H 2 N-Pro-resin in the presence of DIEA in W-methylpyrrolidinone, after activation of the acid function using a mixture of HBTU and 0.5M HOBt in solution in DMF.
  • the Fmoc group located at the erminal end of the last amino acid coupled to the resin is cleaved with a solution of NMP 20% piperidine. 161 mg of peptide-resin are obtained.
  • the cyclization of the linear peptide H 2 N-piperazinone-Ala-Gly-Val-Pro-OH is carried out at a concentration of 2.10 -4 M in acetonitrile in the presence of 34 equivalents of DIEA and 3 equivalents of DPPA, under argon, until complete disappearance of the linear peptide (48h) at room temperature (20 ° C.)
  • the reaction is monitored by High Performance Liquid Chromatography (Shimadzu, analytical column C18 prosphere 100A 4.6 x 250mm 5 ⁇ (Alltech-Grace), with a solvent gradient (A: water / TFA: 100 / 0.1; B: acetonitrile / water / TFA: 80/20 / 0, 1).
  • the crude product is directly purified by HPLC on a C18 prosphere 100A 10 x 250mm 5 ⁇ semi-preparative column (Alltech-Grace). After lyophilization, the protected cyclopeptide SP2 (15.2 mg) is obtained in the form of an oil. Finally, the deprotection of the benzyl group is carried out by hydrogenolysis in methanol in the presence of 10% palladium on charcoal. After filtration and removal of the solvent under vacuum, a yellow oil is obtained.
  • linear peptide H 2 N -Val-Pro-Vai-Trp (boc) -Ala-Gly-OH is synthesized, from Fmoc-Gly-Sasrin, according to the peptide synthesis methods on a solid support on a peptide synthesizer.
  • Applied Biosystem 433A (1 equivalent, 0.1 mM) [3].
  • the linear peptide thus obtained is cleaved from the Sasrin resin with a solution of trifluoroacetic acid (TFA) at 1% in dichloromethane for 45 minutes at room temperature (20 ° C). After filtration of the resin, the linear peptide is recovered in the filtrate.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the protected cyclic peptide is obtained.
  • the Boc group of the tryptophan chain of the cyclic peptide is cleaved with a solution of 50% TFA in dichloromethane. After vacuum removal of the solvent, the cyclic peptide is filtered after addition of diethyl ether.
  • Trp 5 3.10 (1H, ⁇ , dd, 16.5, 7.7), 3.12 (1H, Hp, dd, 16.5, 7.7), 4.26 (1H, ha, m), 6.98 (1 H, 6 H, t, 7.8), 7.07 (1 H, 5 H, t, 7.8), 7.14 ⁇ 1H, H 2l s) , 7.34 (1H, H 7l d, 7.8), 7.55 (1H, H 4, d, 7.8), 8.49 (1 H, H NH, d, 5.7) , 10.88 (1H, HLNH, s). Ala 611 , 14 (3H, ⁇ , d, 7.0), 3.69 (1H, Ha, m), 8.92 (1H, HNH, d, 6.3).
  • 3C NR (125 MHz, [2 H 6] -DMSO,? Ppm relative to tetramethylsilane): Glyi, 43.6 (Ca), 169.3 (CO). Val 2> 56.0 (Ca), 30.5 (Cp), 18.2 and 20.3 (Cy), 171.6 (CO). Pro 3 , 61, 1 (Ca), 32.1 (Cp), 22.2 (Cy), 47.66 (C ⁇ ), 172.3 (CO).
  • Vai 4 60.1 (Ca), 30.8 (CP), 19.4 and 20.0 (Cy), 173.4 (CO) .Trp 5 , 56.4 (Ca), 26.8 (Cp ), 122.2, 110.0, 119.2, 121, 9, 19.2, 112.1, 136.9 and 127.9 (aromatic C), 173.7 (CO).
  • Ala 6 50.9 (Ca), 16.2 (Cp), 171.9 (CO).
  • the linear H 2 N-Val-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-OH peptide is synthesized from Fmoc-Gly-Sasrin, according to the solid-supported peptide synthesis methods on an Applied Biosystem 433A peptide synthesizer. (1 equivalent, 0.1 mM) [3].
  • the Sasrin resin is then cleaved from the linear peptide thus obtained with a solution of 1% trifluoroacetic acid in dichloromethane for 45 minutes at room temperature (20 ° C.). After filtration and removal of the resin, the linear peptide is obtained in the form of a colorless oil after removal of the solvent in vacuo.
  • the linear peptide (34 mg) is cyclized at a concentration of 2.10 -4 M in acetonitrile in the presence of 34 eq of DIEA and 3 eq of DPPA, under argon, until complete disappearance of the linear peptide (48h) to ambient temperature.
  • reaction is monitored by High Performance Liquid Chromatography (Shimadzu, analytical column C18 prosphere 100A 4.6 x 250mm 5 ⁇ (Alltech-Grace), with a solvent gradient (A: water / TFA: 100 / 0.1; B: acetonitrile). After removing the solvent in vacuo, 42 mg of impure cyclic peptide are obtained after precipitation with diethyl ether and filtration.
  • the tests relate to the cyclopeptides SP1 according to the invention, SA and S1, and are intended to compare the angiogenic activity of SP1, SA and S
  • the cyclopeptide SP1 has demonstrated a significant resistance to acid hydrolysis.
  • the latter solubilized, at a concentration of 10 -3 M, in a solution of 0.5 M hydrochloric acid, at ambient temperature (20 ° C.), is found unchanged at 72% after 7 days, as against 98% under the same conditions in aqueous solution only. 3-1.
  • the tests relate to the cyclopeptides SP1, SA and S1, more particularly with the objective of comparing the anti-angiogenic activity of the synthetic cyclopeptide SP1 with respect to that of the natural cyclopeptide SA as well as the synthetic cyclopeptide S1.
  • the cyclopeptide SP1 has demonstrated significant resistance to acid hydrolysis.
  • the latter solubilized, at a concentration of 10 -3 M, in a solution of 0.5 M hydrochloric acid, at ambient temperature (20 ° C.), is found unchanged at 72% after 7 days, as against 98% under the same conditions in aqueous solution only b) Cells used
  • the cords were obtained in the Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Medicine of the Center for Obstetric Gynecology of Amiens (CGO).
  • the HUVECs are cultured in M199 medium (Eurobio, France) complete which is an M199 medium supplemented with
  • MFC7 are hormone-dependent human breast adenocarcinoma cells that express both estrogen receptors (ERct + and ⁇ +). These cells have a low metastatic power.
  • MDA-MB231 cells which are non-hormonally dependent, are highly metastatic cells that express only one estrogen receptor, the ⁇ receptor (ER ⁇ and ER +).
  • MCF7 and MDA-MB231 are from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • the HUVECs cells were used to evaluate the anti-angiogenic activity of the cyclopeptides SP1 and SA by studying their direct effects on the proliferation, differentiation and migration of these cells at first.
  • the MCF7 and MDA-MB-231 cells were used to evaluate the indirect anti-angiogenic activity of the cyclopeptides SP1 and SA by studying, on the one hand, their direct effect on the cellular proliferation of these cells (for SP1 and SA) and on the other hand, their indirect effect on endothelial cells by targeting more specifically VEGFA (for SP1, SA and S1).
  • VEGFA is a proangiogenic growth factor synthesized and secreted by these two cell lines MCF7 and MDA-MB231.
  • the secreted VEGFA assay was performed on cell cultures (MCF7 or MDA-MB-231), after synchronization of the cell cycle in phase G1 for 24h and treatment for 48h with the different concentrations of the cyclopeptides SP1, SA and S1 ( 10-12 to 10-5 M) prepared extemporaneously in DMEM culture medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) without phenol red (Invitrogen, France ) and supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Abcys, France).
  • DMEM culture medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • MCF7 and MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of SP1 and SA (10 "12 to 10" 5 M) for 48 hours.
  • the supernatants of these cultures are recovered and called conditioned media (MC).
  • a proliferation test on the HUVEC cells treated with these conditioned media was carried out under the same conditions as the cell proliferation test in a normal culture medium (FIG. 4). Untreated HUVEC cells were used as basal control.
  • AKT-1 and ERK1 / 2 are over-activated serine / threonine kinases in many human cancers [6], [7].
  • the PI3K / AKT and ERK1 / 2 signaling pathways are signaling pathways involved in proliferation (ERK1 / 2), migration and cell survival (PI3K / AKT) [8],
  • the cells (MCF7 and MDA-MB231) are treated with 10 -5 M cyclopeptides SP1 and SA for 6, 8, 12, 16, or 20 h ( Figures 7A and 7B) 7- ⁇ -estradiol (E2) is used as a positive control and untreated cells as basal control RNAs are extracted using the "TriPure Isolation Reagent” kit (Eurobio, France)
  • the cDNA is synthesized using the "AB Applied Biosystems” kit according to the instructions of the cDNAs are then stored at -80 ° C until use.
  • the thermocycler ABI PRISM 7009 HT was used The specific amplification of each sequence was carried out exclusively with primers specific for each isoform
  • the VEGFA primers (Fisher Bioblock, Invitrogen, France) have already been validated [10], [11]
  • endothelial cells to form vessels can be induced in vitro by culturing the endothelial cells in the presence of different components of the extracellular matrix, such as bi- or tri-dimensional collagen I or fibrin gels, or Matrigel ® .
  • Endothelial cells cultured on Matrigel ® can form hair-like structures in just 6 hours, making this test suitable for finding anti-angiogenic molecules [12].
  • These cell differentiation tests were performed on HUVECs (FIG. 8A).
  • the cells are immediately treated in 500 pL Matrigel ® containing different concentrations cyclopeptides SP1 and SA (10 "12 to 10" 5 M), two conditions "positive control” were performed with 50 ng / ml EGF (Endothelial Growth Factor in English), and 30 ⁇ g / mL of genistein (negative control) (Figure 8A) [13]. Untreated cells were used as "basal control” (noted as 10% FBS in Figures 8A-8C).
  • Endothelial cell migration assays were performed to establish the chemoattractant potential of the cyclopeptides SP1 and SA. Migration to a proangiogenic factor is a key step in the process of angiogenesis.
  • the in vitro migration test or injury test is used to estimate the effect of a molecule on endothelial cell migration. The principle of this test is based on the removal of a thin band of confluent endothelial cells from the culture dish and the counting of the cells that migrate into the space released by the wound. The cells are seeded in 500 ⁇ l of complete M 199 medium at 5.10 5 cells per well in 24-well plates.
  • the plate is incubated 24h in a thermostatted oven at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO2. After 24h, the 100% confluent cells are washed once with phosphate buffered saline (PBS from phosphate buffered saline). The injury is then performed. The photos are taken before and after the injury. The cells are then treated with different concentrations 250 ⁇ cyclopeptides SA and SP1 (10 "12-0" 5 M) freshly prepared in M199 medium without phenol red supplemented with 10% FBS. Each concentration is tested three times. The plate is incubated for 24 hours, under the same conditions as on the first day. The photos are shot at the x4 lens after 8h, 6h and 24h using a JVC Ky-F50 video camera connected to the VisioL software and mounted on a Leica microscope (France) ( Figure 8B).
  • PBS phosphate buffered saline
  • MCs obtained from the MCF7 and DA-MB231 cells treated with the cyclopeptides SP1 and SA exhibit an inhibitory activity on the proliferation of HUVECs compared to MC obtained from untreated MCF7 and MDA-MB231 cells.
  • concentrations ranging from 10 "8 to 10" 5 M SP1 and inhibit SA 20 to 26% the proliferation of HUVEC in the presence of MC from cell cultures of MDA-MB- 231 or MCF7 (26% for MDA-MB-231 and 20% for MCF7 cells).
  • This activity suggests an effect of cyclopeptides on the production of proangiogenic growth factors secreted by both cell types (MCF7 and MDA-MB-231). Inhibition of the production of these proangiogenic factors may explain the indirect activity of SP1 and SA on the proliferation of HUVECs.
  • VEGFA is a target of choice. This study shows that MCs were able to inhibit pathway activation
  • PI3K / AKT (FIGS. 5A to 5D) involved in cell survival and the ERK 1/2 pathway involved in endothelial cell proliferation (HUVEC). Analysis of the results shows a significant reduction in phosphorylation of Akt-1 and Erk 1/2 in HUVEC by the MC for concentrations of 10 "7 10 -5 M.
  • cyclopeptides demonstrated an inhibitory potential on phosphorylation of AKT-1 and ERK 1/2, similar to tyrosine kinase inhibitors. This inhibitory effect is very fast.
  • VEGFA angiogenic growth factor secreted by cancer cells
  • MCF7 and MDA-MB-231 An angiogenic growth factor secreted by cancer cells which induces proliferation of endothelial cells by the PI3K / Akt and Erk1 / 2 signaling pathways has been well described in the literature: is VEGFA.
  • the efficacy of SP1 and SA on the secretion, synthesis and transcription of VEGFA has been studied. It has thus been demonstrated that the cyclopeptides SP1 and SA also have an excellent inhibitory potential on the transcription of VEGFA mRNA in mammary adenocarcinoma cells.
  • the inhibitory effects of SP1 and SA on the transcription of VEGFA mRNA are characterized by a significant reduction in VEGFA secretion (FIGS. 6A to 6D). Unlike SP1 and SA, S1 did not show any significant effect on VEGFA secretion ( Figures 6 E and 6F).
  • cyclopeptides SP1 and SA significantly inhibit, in MCF7 cells, the transcription of the mRNA of the diffusible isoforms VEGF121 and VEGF165 and not the transcription of the isoform anchored in the plasma membrane: the isoform VEGF189.
  • cyclopeptides SP1 and SA were active on the inhibition of the three major isoforms of VEGF-A (i VEGFi 2, VEGF and VEGF169 6 s) (Figs 7A and 7B).
  • VEGF121 isoform is considered one of the most tumorigenic factors in breast cancer and is the preponderant isoform in tumor progression.
  • VEGFA secretion in CF7 cells affects only the VEGF121 and VEGF 16 isoforms in contrast to MDA-MB-231 cells where the three isoforms are concerned. This inhibition was observed with cyclopeptides SP1 and SA for relatively high concentrations with
  • SP1 according to the invention and SA demonstrate well the presence of an indirect anti-angiogenic effect which goes through a decrease in the synthesis of VEGFA mRNA.
  • SP1 and SA have IC50s between 10 "8 and 10 ⁇ 9 M for the secretion of VEGFA.
  • the results show that the cyclopeptides SP1 according to the invention and SA do not have a cytotoxic effect on the endothelial cells. These cyclopeptides are relatively stable to hydrolysis, which may make it possible to envisage a sufficiently long pharmacological action.
  • the synthetic cyclopeptide SP1 In contrast to SA, the synthetic cyclopeptide SP1 also has a direct anti-angiogenic action on cell migration and formation of endothelial cell capillary tubes. Therefore, the synthetic cyclopeptide SP1 according to the invention is therefore simple and easy to access. It has strong direct and indirect anti-angiogenic activity without endothelial toxicity. The control of its synthesis makes it possible, depending on the components introduced, to have a molecule having an indirect and / or direct action on angiogenesis, which opens interesting therapeutic perspectives, particularly in the treatment of diseases associated with angiogenesis.

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Abstract

L'invention concerne un cyclopeptide synthétique, son procédé de préparation et ses utilisations dans la prévention ou le traitement d'une maladie associée à l' angiogenèse. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un cyclopeptide selon l'invention.

Description

CYCLOPEPTIDE SYNTHETIQUE
PROCEDE DE PREPARATION ET UTILISATIONS
DESCRIPTION
Domaine Technique
La présente invention se rapporte à un nouveau cyclopeptide synthétique, à son procédé de préparation et à ses utilisations dans la prévention ou le traitement d'une maladie associée à l'angiogenèse.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un cyclopeptide selon l'invention.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets [ ] renvoient à la liste des références présentées à la fin du texte.
Etat de la technique
La vasculogenèse et l'angiogenèse sont des processus responsables de la formation du système circulatoire, première unité fonctionnelle lors du développement de l'embryon. Contrairement à la vasculogenèse, l'angiogenèse implique la croissance de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants.
L'angiogenèse est un processus indispensable pour la mise en place du système vasculaire chez l'embryon, la cicatrisation et le développement de l'endomètre utérin.
Au contraire, l'angiogenèse dans des conditions physiopathologiques, participe au développement de la polyarthrite rhumatoïde, à la dégénérescence maculaire chez l'adulte, à la croissance tumorale et à la dissémination métastatique. Dans le contexte pathologique, l'angiogenèse joue un rôle prépondérant dans la néovascularisation des tumeurs. Les cellules tumorales sont capables d'envahir le tissu normal avoisinant, en le remaniant puis, de migrer à distance pour former des métastases. Par ailleurs, la vascularisation tumorale étant anormale et tortueuse, elle réduit la distribution de molécules thérapeutiques. L'angiogenèse est régulée par des facteurs pro- et anti-angiogéniques. Parmi les facteurs pro-angiogéniques, figurent le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire ou VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor en anglais), qui est un puissant mitogène pour les cellules endothéliales, le facteur de croissance des fibroblastes 1 ou FGF-1 (Fibroblast Growth Factor 1 en anglais) et le facteur de croissance des fibroblastes 2 ou FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2 en anglais).
L'activité du VEGF est souvent augmentée de façon marquée dans une vaste gamme de cellules tumorales, notamment dans le cancer du rein, du sein, de l'ovaire, de l'estomac, du poumon, de la vessie, des tumeurs de la tête et du cou, et dans le glioblastome.
Les agents anti-angiogéniques actuellement commercialisés ciblent la production des agents mitogènes endothéliaux, les agents mitogènes eux- mêmes, leurs récepteurs, ou encore les voies de signalisation associées à ces agents et les molécules d'adhésion cellulaire, comme les intégrines. Il existe un grand nombre d'anticorps monocionaux utilisés dans le cadre de l'inhibition de la vascularisation tumorale. En général, chaque anticorps monoclonal est spécifique d'un cancer donné, c'est-à-dire de l'organe et de la cause de la formation de la tumeur. Les principaux anticorps monocionaux sont le bevacizumab (Avastin®), le cétuximab (Erbitux®), le rituximab (Mabthéra®) et le trastuzumab (Herceptin®). Ces traitements actuels anti-angiogéniques possèdent des effets indésirables tels que l'hypertension pulmonaire, l'hypersensibilité, la toxicité cardiaque et la perforation gastro-intestinale. Par conséquent, la recherche et le développement de nouvelles molécules structuralement plus simples que ces anticorps, avec de meilleurs profils au niveau des voies d'administration, de biodisponibilités, des effets secondaires, de coût de production restent d'actualité.
Dans le cas particulier du cancer du sein, les œstrogènes sont considérés comme des hormones impliquées dans la formation et la croissance de tumeurs de la glande mammaire. Parmi tous les composés qui ont été évalués, de nombreux phyto-œstrogènes tels que la génistéine (flavonoïde) ont montré in vitro, des propriétés œstrogéniques et/ou anti-angiogéniques selon leur classe. Ces composés se fixent aux récepteurs œstrogéniques des cellules du sein, des ovaires ou de i'endomètre par exemple, contribuant à la régulation des mécanismes de reproduction cellulaire par initiation d'une transcription œstrogéno-dépendante. De même, il a été observé que des analogues d'oestrogènes ou des composés dotés de propriétés œstrogéniques possédaient également une activité pro ou anti-angiogénique. Ainsi, le 2- méthoxyestradiol est un dérivé strogénique capable de prévenir la formation de nouveaux vaisseaux. Les propriétés œstrogéniques d'autres analogues de phytoestrogènes appelés ségétalines, extraits des graines de Vaccaria segetalis, ont également été étudiées.
Les progrès récents des connaissances scientifiques sur l'angiogenèse tumorale mettent en évidence qu'un traitement anti-angiogénique offrirait une nouvelle modalité pour maîtriser la croissance tumorale chez les patients atteints de cancer. Parmi tous les acteurs moléculaires impliqués dans l'activation de l'angiogenèse, le VEGF a fait la preuve de son efficacité dans pratiquement tous les modèles expérimentaux de mesure d'activité de l'angiogenèse,
L'invention a donc pour objet de fournir une nouvelle molécule anti- angiogénique présentant une plus grande efficacité par rapport aux molécules anti-angiogéniques existantes.
En outre, il y a aussi un réel besoin de disposer d'une nouvelle molécule anti-angiogénique, présentant des caractéristiques suivantes :
ne possédant pas les effets délétères sur la fonction endothéliale physiologique observées avec les molécules actuelles ; structuralement plus simples que des molécules déjà existantes comme par exemple les anticorps ;
capables de se lier au VEGF ;
présentant de meilleurs profils au niveau de voies d'administration, de biodisponibilités et/ou des effets secondaires ;
ayant une mise en œuvre facile, reproductible et de coût réduit ; capables de normaliser la vascularisation tumorale et de faciliter l'accès des molécules thérapeutiques à la tumeur, avant de détruire complètement le réseau vasculaire tumoral ; capables d'inhiber la croissance des tumeurs hormono- dépendantes telles que les cancers du sein ;
pouvant être utilisées dans le traitement d'un grand nombre de tumeurs de types différents ; et/ou
permettant la mise en place d'un traitement pour faire régresser la tumeur dans des conditions moins drastiques que celles liées aux traitements actuels.
Description de l'invention
La présente invention a précisément pour but de répondre à ces besoins en fournissant un cyclopeptide de formule (I) :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle
■ Ala représente l'alanine ;
■ Gly représente la glycine ;
■ Val représente la valine ;
■ Pro représente la proline
ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « sels pharmaceutiquement acceptables » comprend les sels préparés avec des acides ou bases, non toxiques, en fonction des substituants présents sur les composés. Lorsque les composés de l'invention comportent des fonctions acides, les sels correspondants peuvent être obtenus par addition d'une base organique ou inorganique sur le composé en présence éventuellement d'un solvant de préférence inerte. Des exemples de sel d'addition d'une base peuvent être les sels de sodium, potassium, calcium, ammonium, amino (organique), ou magnésium. Lorsque les composés de l'invention comportent des fonctions basiques, les sels correspondants peuvent être obtenus par addition d'un acide organique ou inorganique éventuellement dans un solvant de préférence inerte. Des exemples de sels d'additions d'acide inorganique peuvent être les sels hydrochlorique (ou chlorhydrate), hydrobromique, nitrique, carbonique, monohydrogénocarbonique, phosphorique, monohydrogénophosphorique, dihydrogénophosphorique, sulfurique, monohydrogénosulfurique hydroiodique. Des exemples de sels d'additions d'acide organique peuvent être les sels acétique, propionique, isobutyrique, maléique (ou maléate), malonique, benzoïque, oxalique (ou oxalate), glucuronique (ou glucuronate) succinique, subérique, fumarique (ou fumarate), lactique, mandélique, phthalique, benzénesulfonique, p-tolylsulfonique, citrique, tartarique, méthanesulfonique.
Les acides aminés formant le cyclopeptide de formule (I), selon l'invention sont reliés entre-eux par une liaison peptidique.
Le cyclopeptide selon l'invention à activité anti-angiogénique, peut offrir plusieurs avantages par rapport aux thérapies anticancéreuses classiques notamment une spécificité d'action anti-tumorale, une accessibilité plus facile de la cible, un risque moins élevé de résistance, une efficacité dans le traitement d'association avec des anticancéreux classiques, et possibilité de chimioprophylaxie.
En outre, les inventeurs ont mis en évidence une acité anti-angiogénique directe du cyclopeptide selon l'invention, au contraire de la ségétaline A naturelle. En effet, le cyclopeptide selon l'invention est en mesure d'entraver directement la migration cellulaire et la formation des tubes capillaires de cellules endothéliales, contrairement à la ségétaline naturelle.
L'invention concerne également le procédé de préparation d'un cyclopeptide de formule (I), dans lequel :
a) on cyclise, un composé de formule (IV) ou (V) :
Pr
Figure imgf000007_0001
(IV) (V) dans laquelle : Ala est l'alanine; Gly est la glycine ; Val est la valine ; X est la valine ; Y est la valine ; et Z est la proline,
■ Pr est un groupe protecteur choisi dans le groupe comprenant l'acétamidométhyle (Acm), l'allyloxycarbonyle (Alloc), le t-butyloxycarbonyle (Boc), le benzyloxyméthyle (Bom), le 2-(4-biphénylyl) propyl(2)oxycarbonyle (Bpoc), le 2-bromobenzyloxycarbonyle (Br-Z), le butoxyméthyle (Bum), l'acide benzoïque (Bz), le benzyle (Bzl), le dichlorobenzyle (CI2Bzl), le 2- chlorobenzyloxycarbonyle (CIZ), le W-[1-(4,4-diméthyl-2,6- dioxocyclohexylidène)éthyle] (Dde), le dithia-succinyle (Dts), le 4- méthoxybenzyle (Mbzl), le 4 méthylbenzyle (MeBzl), le méthoxybenzyle ( ob), le 4-méthoxy-2,3,6-triméthylbenzene sulfonyle (Mtr), le mésitylene-2-sulfonyle (Mts), le 2-nitro-phénylsulfényle (Nps), le benzyle ester (OBzl), le tert-butyle ester (O-tBu), 2,2,4,6,7-pentaméthyldihydrobenzofuran-5-sulfonyle (Pbf), le 2,2,5,7,8,-pentaméthyl-chroman-6-sulfonyle (Pmc), le tert-butyle (tBu), le 2,4,6- triméthoxybenzyle (Tmob), le triphénylméthyle (trityle ou trt),
en présence d'un agent de cyclisation ;
b) on clive les groupes protecteurs des différents composés X, Y, Z, pour récupérer les composés X, Y,Z de départ.
Par « groupe protecteur », on entend un groupe introduit dans une molécule afin d'empêcher des réactions secondaires de se produire dans la suite de la synthèse et/ou pour obtenir une certaine chimiosélectivité.
Les groupes protecteurs sont, en général, inertes dans les conditions réaction nelles choisies. Une fois la ou les réaction(s) menée(s) à bien en présence des groupes protecteurs, ces derniers sont éliminés pour revenir aux molécules de départ (déprotection).
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « agent de cyclisation », un composé permettant la formation d'un composé organique cyclique par la création d'une liaison, entre les molécules organiques, apportant les éléments constitutifs de ce cycle. Dans la présente invention, l'agent de cyclisation permet la formation d'une liaison peptidique entre l'extrémité C- terminale de la glycine et l'extrémité /V-terminale de la valine présentes dans le composé linéaire de formule (IV), et entre l'extrémité C-terminale du composé Z et l'extrémité /V-terminale du composé Y présents dans le composé linéaire de formule (V), pour conduire au cyclopeptide de formule (I).
Le choix des conditions expérimentales notamment la nature de l'agent de cyclisation, sa concentration et le choix des deux acides aminés impliqués dans la cyclisation, sont importants afin d'éviter la racémisation des molécules constitutives des composés de formules (IV) et (V), et la formation de dimères à partir du composé de formule (IV) ou (V). Le choix des conditions expérimentales précitées permet, en outre, d'obtenir une cyclisation régiosélective.
Les azotures phosphorylés se sont révélés être des agents de cyclisation particulièrement intéressants. On peut citer par exemple l'azoture de diphénylphosphoryle (DPPA), le bromo-tris-pyrrolidino phosphoniumhexafluorophosphate (PyBrOP), le 0-benzotnazole-/V,/V,/V',/V- tétraméthyl-uronium-hexafluoro-phosphate (HBTU), le benzotriazole-1-yl-oxy- tris-(diméthylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP), la Λ/,Λ/'- carbonyldiimidazole (CD1), le dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le 3-(diéthoxy- phosphoryloxy)-3H-benzo[d][1 ,2,3] triazin-4-one (DEPBT), la Ν,Ν'- diisopropylcarbodiimide (DIC), Γ hydrochlorure de 1-éthyl-3-(3- diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC.HCI), le 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-yl)- 1 , 1 ,3,3-tétraméthyl uronium hexafluorophosphate de méthanaminium (HAUT), le /V-hydroxybenzotriazole anhydre (HOBt), rhydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1 ,2,3- benzotriazine (HOOBt), le 1/-/-benzotriazolium 1-
[bis(diméthylamino)méthylène]-5-chloro-hexafluorophosphate (1 -),3-oxyde (HCTU), le 6-chloro-1-hydroxybenzotriazole (CI-HOBt), le O-(benzotriazol-l-yl)- /,Λ/,Λ/',Λ/'-tétraméthyluronium tétrafluoroborate (TBTU), le 4,5- dicyanoimidazole.
Comme indiqué, la concentration de l'agent de cyclisation est un paramètre important dans la réaction de cyclisation. Par exemple, dans le cas de la cyclisation d'un composé de formule (IV), il a été observé qu'une concentration comprise entre 2.10"4 et 10"4M conduit au cyclopeptide de formule (I), avec des concentrations très faibles voire nulles du dimère correspondant. La réaction de cyclisation peut avoir lieu dans un solvant organique aprotique. A ce titre, on peut citer par exemple l'acétonitrile, le dichlorométhane ou le diméthylformamide.
Le composé de formule (I) peut être obtenu à l'issue de l'étape b)t après le clivage des groupes protecteurs Pr des composés (IV) ou (V). Le clivage ou la coupure peut se faire dans des conditions acides et/ou basiques variées et connues de l'homme du métier.
La réaction de déprotection de l'étape b) peut éventuellement être suivie d'une étape de lavage et/ou de purification.
Les composés (IV) et (V) peuvent être obtenus respectivement, à partir des composés de formule (VI) et (VII) :
Pr Pr Pr Pr
I l I I
Figure imgf000010_0001
(VI) (VII)
dans lesquels :;
■ Pr, Pri sont des groupes protecteurs choisis, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe comprenant l'acétamidométhyle (Acm), l'allyloxycarbonyle (Alloc), le t-butyloxycarbonyle (Boc), le benzyloxyméthyle (Bom), le 2-(4-biphénylyl) propyl(2)oxycarbonyle (Bpoc), le 2-bromobenzyloxycarbonyle (Br-Z), le butoxyméthyle (Bum), l'acide benzoïque (Bz), le benzyle (Bzl), le dichlorobenzyle (CbBzl), le 2- chlorobenzyloxycarbonyle (CIZ), le /V-[1-(4,4-diméthyl-2,6- dioxocyclohexylidène)éthy!e] (Dde), le dithia-succinyle (Dts), le chlorure de fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), le 4-méthoxybenzyle (Mbzl), le 4 méthylbenzyle (MeBzl), le méthoxybenzyle (Mob), le 4-méthoxy-2,3,6- trimethylbenzene sulfonyle (Mtr), le mésitylene-2-sulfonyle (Mts), le 2- nitro-phénylsulfènyle (Nps), le benzyle ester (OBzl), le tert-butyle ester (O- tBu), 2,2,4,6,7-pentaméthyldihydrobenzofuran-5-sulfonyle (Pbf), le 2,2,5,7,8,-pentaméthyl-chroman-6-sulfonyle (Pmc), le tert-butyle (tBu), le 2,4,6-triméthoxybenzyle (Tmob), le triphénylméthyle (trityle ou trt) ; ■ Rs est une résine choisie dans le groupe comprenant la résine SASRIN, SASRIN-2-pyridylthiocarbonate, la résine WANG, la résine 2-chlorotrityle, la résine TENTAGEL, la résine WANG-TENTAGEL, la résine Wang-PEG, la résine benzhydrylamine, la résine polystyrène-NH^, la résine Merrifield, la résine 4-méthylbenzhydrylamine (MBHA-résine, PAL-MBHA-résine), la résine 4-hydroxyméthylbenzylamide-synbeads, la résine 4- hydroxyméthylphenoxyacétylamidométhylpolystyrène (HMPA-résine) ; après clivage du groupe protecteur Pn et de la résine Rs.
Le groupe protecteur Pr-ι qui est en général lié à l'extrémité W-terminale de la valine et du composé Y, et la résine Rs qui est en général liée à l'extrémité
C-terminale de la glycine et du composé Z, peuvent être successivement clivés dans des conditions opératoires différentes.
Dans une variante de l'invention, les composés (IV) et (V) sont obtenus après clivages successifs du groupe protecteur Pn et de la résine Rs des composés de formule (VI) et (VII), respectivement.
Par « résine », on entend un support (co)polymérique utilisé en synthèse en phase solide. En général, ce sont des (co)polymères réticulés fonctionnalisés insolubles mais capables de gonfler dans les solvants utilisés. A titre d'exemple, le clivage ou la coupure de la liaison Gly - Rs ou (Z)-Rs, après clivage ou coupure de la liaison Ρη-Val ou de la liaison ΡΓΙ-Υ, permet de libérer le composé de formule (VI) ou (VII) de son support de synthèse. Le composé résultant de ce clivage est récupéré dans le filtrat.
Le clivage ou la coupure peut se faire dans des conditions acides et/ou basiques douces. A titre d'exemple de conditions acides douces, on peut citer l'emploi d'acide trifluoroacétique (TFA) à 1% (clivage ou coupure de la liaison Gly - Rs ou (Z)-Rs). Le clivage dans des conditions basiques douces peut se faire par exemple en présence d'une aminé primaire et secondaire comme la pipéridine (clivage ou coupure de la liaison Pn-Val ou de la liaison Pr-i-Y).
A leur tour, les composés (VI) et (VII), peuvent être préparés par couplages successifs.
Ainsi, on peut préparer le composé (VI) par le couplage successif entre un composé de formule (VIII) :
Figure imgf000012_0001
(VII!) et Ala-Pn, (Pr-X)-Pri, (Pr-YJ-Pn, (Pr-ZJ-Pn, Val-Pn respectivement, et le composé (VII) par le couplage successif entre un composé de formule (IX)
Pr
Pr, Rs
(IX) et Val-Pri, Gly-Pn, Ala-Ρη, (Pr-X)-Pn, (Pr-Y)-Pri, respectivement, où Ala, Gly, Val, X, Y, Z, Pr et Pi sont tels que définis précédemment en présence d'un agent de couplage.
L'utilisation d'une résine Rs dans les composés (VIII) et (IX) permet la synthèse respectivement des composés de formule (VI) et (VII) sur support solide suivant les méthodes déjà publiées [2].
La synthèse sur support solide met en jeu un support constitué d'un (co)polymère (résine) insoluble, inerte dans les conditions de la synthèse. En revanche, ces polymères (résines) ont la particularité de gonfler dans les solvants utilisés, ce qui assure une bonne diffusion des réactifs. Dans la présente invention, Gly ou (Pr-Z) sont fixés sur la résine, avantageusement, par une liaison covalente. Les Ala-Pn , (Pr-X)-Pn, (Pr-Y)-Pn, (Pr-ZJ-Pn, Val-Pn dans le cas de (VI), et les Val-Pn, Gly-Pn, Ala-Pn, (Pr-XJ-Pn, (Pr-Y)-Pn dans le cas de (VII), sont ajoutés en solution, souvent en large excès, sur la résine. Après chaque ajout, le composé synthétisé reste lié au (co)polymère insoluble (résine) et pourra être facilement séparé des excès de réactif(s) et des solvants par exemple par simple filtration. Le groupement Pn est ensuite clivé. Ce processus peut être répété autant de fois que nécessaire jusqu'à ce que les composés (VI) et (VII) soient synthétisés. La liaison qui relie ces composés (VI) et (VII) au (co)polymère (résine) ainsi que le groupe protecteur Pri sont alors clivés et le produit de la réaction est récupéré dans le filtrat.
L'agent de couplage peut être choisi dans le groupe comprenant par exemple le bromo-tris-pyrrolidino phosphoniumhexafluorophosphate (PyBrOP), le O-benzotriazole-A/./V^N^/V-tétraméthyl-uronium-hexafluoro-phosphate (HBTU), le benzotriazole-1 -yl-oxy-tris-(diméthylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP), la Λ/,ΛΓ-carbonyldiimidazole (CDI), le dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le 3-(diéthoxy-phosphoryloxy)-3H~ benzo[d][1 ,2,3] triazin-4-one (DEPBT), la Λ/,Λ/'-diisopropylcarbodiimide (DIC), Γ ydrochlorure de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC.HCI), le 2-(1 H-7-azabenzotriazol-1-yl)~1 , ,3,3-tétraméthyl uronium hexafluorophosphate de méthanaminium (HAUT), le W-hydroxybenzotriazole anhydre (HOBt), hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1 ,2,3-benzotriazine (HOOBt), le 1 H-benzotriazolium 1-[bis(diméthylamino)méthylène]-5chloro-,hexafluorophosphate (1-),3-oxyde (HCTU), le 6-chloro-1-hydroxybenzotriazole (CI-HOBt), le O-(benzotriazoM-yl)- Λ/,Λ/,Λ/',Λ/'-tétraméthyluronium tétrafluoroborate (TBTU), le 4,5- dicyanoimidazole.
Le cyclopeptide selon l'invention peut être utilisé directement ou sous forme d'une composition pharmaceutique le contenant, pour son utilisation comme médicament.
L'invention a donc pour objet des médicaments comprenant un cyclopeptide selon l'invention.
Un autre objet de la présente invention est une composition pharmaceutique comprenant un cyclopeptide tel que défini précédemment et éventuellement un ou plusieurs excipient(s) pharmaceutiquement acceptable(s).
Les excipients sont habituellement des éléments sans activité thérapeutique qui entrent dans la composition d'un médicament ou qui sont utilisés pour sa fabrication. L'excipient a pour fonction d'améliorer l'aspect ou le goût, d'assurer la conservation, de faciliter la mise en forme et l'administration du médicament. Il sert aussi à acheminer le principe actif vers son site d'action et à contrôler son absorption par l'organisme. Selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités, différents excipients peuvent être utilisés. L'homme du métier est en mesure de choisir les excipients appropriés selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration désirés.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être préparée par des procédés connus.
La quantité de cyclopeptide directement administrée ou comprise dans les compositions pharmaceutiques est une quantité thérapeutiquement effective. Par quantité effective ou quantité thérapeutiquement effective, on entend une quantité de cyclopeptide tel quel ou comprise dans une composition pharmaceutique, qui conduit à l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré. Ladite quantité effective peut être déterminée de manière expérimentale par des procédures pharmaceutiques standards.
Afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré, la dose de principe actif peut varier entre 0,1 μg et 200 mg par kg de poids du corps par jour. Bien que ces dosages soient des exemples de situation moyenne, il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles soient plus appropriés. De tels dosages font partie de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient.
Les modes d'administration peuvent inclure par exemple la voie orale, sublinguale, rectale, topique, nasale, pulmonaire, oculaire, intestinale et parentérale. L'administration parentérale peut comprendre par exemple l'administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale, intra-artérielle, intra-articulaire, intracisternale, intradermique, intra-lésionnelle, intra-oculaire, intrapleurale, intrathécale, intra-utérine, et intraventriculaire. L'indication thérapeutique à traiter ainsi que les propriétés physicochimiques et biologiques de la composition permettent de déterminer la voie d'administration et la formulation les plus appropriées. Différentes formulations et systèmes d'administration sont décrits dans l'état de la technique.
Les compositions pharmaceutiques peuvent être sous forme de libération instantanée, libération contrôlée, ou à libération retard. Les formulations les plus couramment utilisées sont par exemple, des solutions, des suspensions, des (micro-)émulsions, des pommades, des gels, des patchs, des comprimés, des dragées, des capsules molles et dures, des implants, des poudres amorphes ou cristallines, et des formulations lyophilisées.
La formulation appropriée dépend du mode d'administration choisi. Par exemple, pour une administration parentérale par injection, les compositions sont habituellement stériles et peuvent être présentées sous forme de dose unitaire comme par exemple sous forme d'ampoules, de seringues, de stylos d'injection, ou des flacons à doses multiples. Les compositions peuvent être sous forme de suspensions, de solutions ou émulsions dans un véhicule aqueux ou gras et contenir des tampons physiologiquement compatibles comme par exemple, du phosphate, de l'histidine, ou du citrate pour ajuster le pH de la formulation, des agents de tonicité comme par exemple le chlorure de sodium ou le dextrose, des agents de viscosité, des agents de suspension, des agents de dispersions, des surfactants, des antioxydants, des polymères biocompatibles, des agents chélatants, des conservateurs. Selon le site d'injection, le véhicule peut contenir de l'eau, une huile végétale ou synthétique et/ou des co-solvants organiques. Dans certains cas, comme dans le cas d'un produit lyophilisé ou un concentré, la formulation parentérale peut être reconstituée ou diluée préalablement à son administration. Dans le cas de formulations injectables à effet retard, la composition selon l'invention peut être sous forme de suspension de nano/micro particules avec des polymères comme matrice. D'autres formulations à effet retard peuvent être sous forme d'implants ou de pompes. Pour une administration transmucosale ou nasale, des formulations solides, semi-solides ou des patchs peuvent être préférés. Pour une administration orale, la composition peut être formulée sous une forme liquide ou solide et en tant que formulation à libération instantanée ou contrôlée/à retard notamment sous forme de granulés, de comprimés, de dragées, de capsules molles et dures, de liquides, de gels, de suspensions et des émulsions.
Le cyclopeptide tel que défini précédemment, peut être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie associée à l'angiogenèse. Un objet de l'invention concerne le cyclopeptide selon l'invention ou une composition pharmaceutique telle que définie précédemment, pour la prévention ou le traitement d'une maladie associée à l'angiogenèse.
Plus particulièrement, l'invention concerne le cyclopeptide selon l'invention ou la composition pharmaceutique telle que définie précédemment, pour la prévention ou le traitement d'une maladie associée à l'angiogenèse choisie dans le groupe comprenant la croissance tumorale (tumeur de colon, sein, foie, rein et prostate), la dissémination métastatique (tumeur de colon, sein, foie, rein et prostate), les hémangiomes, la polyarthrite rhumatoïde, l'endométriose, l'athérosclérose, la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire.
L'invention concerne plus particulièrement encore, le cyclopeptide selon l'invention ou la composition pharmaceutique telle que définie précédemment, pour la prévention ou le traitement de la croissance tumorale (colon, sein, foie, rein et prostate).
L'administration du cyclopeptide de l'invention permet d'abord de normaliser la vascularisation tumorale et de faciliter l'accès des molécules thérapeutiques à la tumeur et ensuite de détruire complètement le réseau vasculaire tumoral.
Le cyclopeptide de l'invention peut être utilisé en thérapie, notamment en oncothérapie, chez le mammifère et en particulier chez l'homme.
Le terme « mammifère » désigne tout mammifère. A titre d'exemple, on peut citer les animaux domestiques comme les chiens et les chats ; les animaux de ferme comme les porcs, les bovins, les moutons et les chèvres ; les animaux comme les souris et les rats ; les primates comme les singes, les chimpanzés ; et l'homme.
L'invention concerne en outre, le cyclopeptide de l'invention ou la composition pharmaceutique telle que définie précédemment, pour la prévention ou le traitement de l'ostéoporose.
L'invention concerne le cyclopeptide de l'invention pour son application comme médicament dans la prévention ou le traitement d'une maladie associée à la formation des tubes capillaires de cellules endothéliales. L'invention concerne également l'utilisation du cyclopeptide pour empêcher la formation des tubes capillaires de cellules endothéliales.
Contrairement à l'art antérieur, le cyclopeptide selon l'invention possède une action anti-angéogénique directe sur la migration cellulaire et la formation des tubes capillaires des cellules endothéliales.
La présente invention, selon un autre de ses aspects, concerne également une méthode de prévention ou de traitement des pathologies ci- dessus indiquées qui comprend l'administration d'un cyclopeptide selon l'invention ou d'une composition pharmaceutique le comprenant.
Brève description des figures
La figure 1 représente de le spectre de masse haute-résolution du composé SA (ségétaline A).
Masse Haute Résolution : Calculée pour C3iH43N7 a06: 632,3173. Trouvée : 632,3157
- La figure 2 représente le spectre de masse haute-résolution du composé SP1.
Masse Haute Résolution Calculée pour C^^NeNaOe 545,3064. Trouvée : 545,3069
La figure 3A représente le spectre de masse haute-résolution du composé SP2.
Masse Haute Résolution : Calculée pour C22H34NeNa07: 517,2387. Trouvée : 517,2401
La figure 3B représente le spectre de masse haute-résolution du composé
S1.
Masse Haute Résolution. Calculée pour C23H38N6Na06: 517,2728. Trouvée : 517.2751 (S1 = 517.2728 ± 4,4ppm).
Les figures 4A et 4B représentent l'effet des milieux conditionnés (MC) sur la prolifération des cellules endothéliales.
Les cellules HUVEC ont été traitées pendant 48 heures par les MC préparés à partir des surnageant de culture des cellules MCF7 (figure 4A) ou avec MC préparés à partir des surnageants de culture des cellules MDA-MB-23 (figure 4B), préalablement traitées pendant 48h par SA et SP1 (10~12 à 10~5 M). Le potentiel inhibiteur de SA et SP1 sur la prolifération cellulaire a été évalué par rapport à la condition 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Les cellules non traitées ont été utilisées comme témoin basai. Les barres blanches représentent le taux de prolifération cellulaire en réponse aux C traités avec différentes concentrations de SP1. Les barres noires représentent le taux de prolifération cellulaire en réponse aux MC traités avec différentes concentrations de SA. La ligne en pointillé délimite le taux de prolifération cellulaire par rapport au témoin basai. Les résultats sont exprimés en variation de la densité optique (DO), lue à 450 et à 570 nm. Les valeurs correspondent à la moyenne des DO ± SEM de chaque concentration testée (n=3) * p<0,05, **p<0,01 ***p<0,001 versus contrôle.
La figure 5A représente l'analyse de la phosphorylation des voies de signalisation impliquées dans la migration et la survie cellulaire (AKT-1) dans les cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC), en réponse au MC obtenus à partir des cellules MCF7.
Les cellules HUVEC en culture sont traitées par les MC préparés à partir des surnageants des cellules MCF7, cellules préalablement traitées par différentes concentrations de SA et SP1 (10"11 à 10"5 M). Les cellules HUVEC sont ensuite récupérées et lysées à 5 min de traitement. Les histogrammes affichés représentent le résultat normalisé par le rapport P-Akt / t-Akt. Les données sont exprimées en unités arbitraires. p-Akt (phospho Akt), t-Akt (total Akt), T0 (témoin basai).
Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations et les valeurs correspondent à la moyenne ± SEM de chaque concentration testée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 , versus contrôle.
La figure 5B représente l'analyse de la phosphorylation des voies de signalisation impliquées dans la migration et la survie cellulaire (AKT-1) dans les cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC), en réponse au MC obtenus à partir des cellules MDA-MB-231.
Les cellules HUVEC en culture sont traitées par les MC préparés à partir des surnageants des cellules MDA-MB-231 , cellules préalablement traitées par différentes concentrations de SA et SP1 (10"11 à 10"5 M). Les cellules HUVEC sont ensuite récupérées et lysées à 5 min de traitement. Les histogrammes affichés représentent le résultat normalisé par le rapport p-Akt / t-Akt. Les données sont exprimées en unités arbitraires. p-Akt (phospho Akt), t-Akt (total Akt), TO (témoin basai). Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations et les valeurs correspondent à la moyenne ± SEM de chaque concentration testée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001, versus contrôle.
La figure 5C représente l'analyse de la phosphorylation des voies de signalisation impliquées dans la prolifération (ERK1/2) dans les cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC), en réponse au MC obtenus à partir des cellules MCF7.
Les cellules HUVEC en culture sont traitées par les MC préparés à partir des surnageants des cellules MCF7 cellules préalablement traitées par différentes concentrations de SA et SP1 (10 11 à 10"5 M). Les cellules HUVEC sont ensuite récupérées et lysées à 5 min de traitement. Les histogrammes affichés représentent le résultat normalisé par le rapport p-Erk / t-Erk. Les données sont exprimées en unités arbitraires. p-Erk (phospho Erk), t-Erk(total Erk), T0 (témoin basai). Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations et les valeurs correspondent à la moyenne ± SEM de chaque concentration testée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 , versus contrôle.
La figure 5D représente l'analyse de la phosphorylation des voies de signalisation impliquées dans la prolifération (ERK1/2) dans les cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC), en réponse au MC obtenus à partir des cellules MDA-MB-231.
Les cellules HUVEC en culture sont traitées par les MC préparés à partir des surnageants des cellules MDA-MB-231 cellules préalablement traitées par différentes concentrations de SA et SP1 (1011 à 10'5 M). Les cellules HUVEC sont ensuite récupérées et lysées à 5 min de traitement. Les histogrammes affichés représentent le résultat normalisé par le rapport p-Erk / t-Erk. Les données sont exprimées en unités arbitraires. p-Erk (phospho Erk), t-Erk (total Erk), T0 (témoin basai). Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations et les valeurs correspondent à la moyenne ± SEM de chaque concentration testée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 , versus contrôle.
La figure 6A représente l'effet des cyclopeptides SP1 et SA sur la sécrétion du VEGFA par les cellules MCF7. Les cellules ont été traitées pendant 48 h avec différentes concentrations de SA ou SP1 (10"12 à 10"5 M). Les cellules non traitées représentent le témoin basai tandis que les cellules traitées avec différentes concentrations de E2 (17- β estradiol)(10"5 à 10"12 M) représentent, le contrôle positif. La courbe reliant les losanges (ligne supérieure) représente les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par E2. La courbe reliant les carrés (ligne moyenne) correspond aux différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par SP1. La courbe reliant les triangles (ligne inférieure) correspond aux différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par SA. La droite en pointillée représente le niveau du taux de sécrétion du VEGFA par les cellules traitées par le milieu de culture seul (contrôle basai). Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations et les valeurs correspondent à la moyenne ± SE de chaque concentration testée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 , versus contrôle.
- La figure 6B représente l'effet des cyclopeptides SP1 et SA sur la sécrétion du VEGFA par les cellules MDA-MB-231.
Les cellules ont été traitées pendant 48 h avec différentes concentrations de SA ou SP1 ( 0"12 à 10"5 M). Les cellules non traitées représentent le témoin basai tandis que les cellules traitées avec différentes concentrations de E2 (10~5 à 10"12 M) représentent le contrôle positif. La courbe reliant les losanges (ligne supérieure) représente les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par E2. La courbe reliant les carrés (ligne moyenne) correspond aux différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par SP1. La courbe reliant les triangles (ligne inférieure) correspond aux différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par SA. La droite en pointillée représente le niveau du taux de sécrétion du VEGFA par les cellules traitées par le milieu de culture seul (contrôle basai). Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations et les valeurs correspondent à la moyenne ± SEM de chaque concentration testée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 , versus contrôle. - La figure 6C représente l'effet inhibiteur des cyclopeptides SP1 et SA sur la sécrétion du VEGFA par les cellules MCF-7, en présence de E2 (10"9M).. Les cellules ont été traitées pendant 48 h avec différentes concentrations de SA ou SP1 (10"12 à 10'5 M) en présence d'une quantité fixe de E2 (10'9M). Les cellules traitées avec différentes concentrations de E2 uniquement (10~5 à 10~12 M), représente le contrôle positif. Les barres blanches représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par E2. Les barres grises représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par SP1+ E2. Les barres noires représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par SA+ E2. Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations (E2l SP1+ E2 et SA+ E2) et les valeurs correspondent à la moyenne ± SEM de chaque concentration de VEGF observée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 versus contrôle. (E2 : 17 β estradiol).
La figure 6D représente l'effet inhibiteur des cyclopeptides SP1 , SA et S1 sur la sécrétion du VEGFA par les cellules MDA-MB-231 , en présence de E2 (1fJ9M).
Les cellules ont été traitées pendant 48 h avec différentes concentrations de SA ou SP1 (10"12 à 10"5 M) en présence d'une quantité fixe de E2 (10"9M)... Les cellules traitées avec différentes concentrations de E2 uniquement (1CT5 à 10"12 M), représente le contrôle positif. Les barres blanches représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par E2. Les barres grises représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par SP1+ E2.. Les barres noires représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par SA+ E2.. Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations (E2, SP1+E2 et SA+ E2)et les valeurs correspondent à la moyenne ± SEM de chaque concentration de VEGF observée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 versus contrôle. (E2 : 17 β estradiol).
La figure 6E représente l'effet des cyclopeptides SP1 et S1 sur la sécrétion du VEGFA par les cellules MCF7.
Les cellules ont été traitées pendant 48 h avec différentes concentrations de SP1 ou S1 (10"12 à 10~5 M). Les cellules non traitées représentent le témoin basai (noté 0) tandis que les cellules traitées avec 10"9M de E2 représentent le contrôle positif. Les barres blanches représentent la concentration du VEGFA des cellules traitées par E2. Les barres de couleur gris clair représentent la concentration du VEGFA des cellules non traitées (contrôle basai). Les barres de couleur gris foncé représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par les différentes de S1 (10"12 à 10"5 M). Les barres noires représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par les différentes de SP1 (10"12 à 10"5 M). La droite en pointillée représente le 5 niveau du taux de sécrétion du VEGFA par les cellules traitées par le milieu de culture seul (contrôle basai). Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations des différentes molécules testées et les valeurs correspondent à la moyenne ± SEM de chaque concentration testée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 , versus contrôle,
î o - La figure 6F représente l'effet des cyclopeptides SP1 et S1 sur la sécrétion du VEGFA par les cellules DA-MB-231.
Les cellules ont été traitées pendant 48 h avec différentes concentrations de S1 ou SP1 (10~12 à 10"5 M). Les cellules non traitées représentent le témoin basai (noté 0) tandis que les cellules traitées avec 10"9M de E2 représentent le
15 contrôle positif. Les barres blanches représentent la concentration du VEGFA des cellules traitées par E2. Les barres de couleur gris clair représentent la concentration du VEGFA des cellules non traitées (contrôle basai). Les barres de couleur gris foncé représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par les différentes de S1 (10~12 à 10"5 M). Les barres noires 0 représentent les différentes concentrations du VEGFA des cellules traitées par les différentes de SP1 (10"12 à 10"5 M). La droite en pointillée représente le niveau du taux de sécrétion du VEGFA par les cellules traitées par le milieu de culture seul (contrôle basai). Les résultats sont exprimés en fonction des concentrations des différentes molécules testées et les valeurs correspondent à 5 la moyenne ± SEM de chaque concentration testée (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 , versus contrôle.
La figure 7A représente l'analyse de l'expression de l'ARNm de VEGF121 , VEGF165 et VEGF189 dans les cellules MCF-7 en réponse au traitement par SA et SP1.
0 Les cellules ont été traitées pendant 6 h avec SA et SP1 (10'5 M). Les cellules non traitées représentent le contrôle basai (0) tandis que les cellules traitées avec E2 (10"9 M) représentent le contrôle positif. Les barres blanches caractérisent le taux d'expression de l'ARNm de l'isoforme VEGF121 , les barres grises le taux d'expression de l'ARNm de l'isoforme VEGF165 et les barres noires le taux d'expression de l'ARNm de l'isoforme VEGFi89. Les résultats sont exprimés en fonction des traitements (E2, SP1 et SA) et correspondent à la moyenne ± SEM du taux relatif d'expression de l'ARNm des différentes isoformes du VEGFA, (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 versus contrôle.
La figure 7B représente l'analyse de l'expression de l'ARNm de VEGF121, VEGF-I65 et VEGFi89 dans les cellules MBA-MB-231 en réponse au traitement par SA et par SP1.
Les cellules ont été traitées pendant 6 h avec SA et SP1 (10"5 M). Les cellules non traitées représentent le contrôle basai (0) tandis que les cellules traitées avec E2 (10~9 M) représentent le contrôle positif. Les barres blanches caractérisent le taux d'expression de l'ARNm de l'isoforme VEGF12i, les barres grises le taux d'expression de l'ARNm de l'isoforme VEGF165 et les barres noires le taux d'expression de l'ARNm de l'isoforme VEGFieg. Les résultats sont exprimés en fonction des traitements (E2l SP1 et SA) et correspondent à la moyenne ± SEM du taux relatif d'expression de l'ARNm des différentes isoformes du VEGFA, (n=3) * p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 versus contrôle.
Les figures 8A et 8C représentent le test de différenciation des HUVEC en Matrigel®
Les cellules ont été traitées pendant 16 heures par différentes concentrations de SA et SP1 (106 à 10"5 M). Deux témoins ont été utilisés : la génistéine à 30 g/mL, inhibitrice de la différenciation des HUVEC en Matrigel® et de la migration des HUVEC, et l'EGF à 50 ng/mL, activateur de la différenciation des HUVEC en Matrigel® et de la migration des HUVEC. Les cellules non traitées ont été utilisées comme témoin basai (cellules en culture dans du milieu de culture supplémenté de 10% FBS seul). Gen signifie la génistéine et EGF signifie le facteur de croissance endothéliale (Endothelial Growth Factor en anglais). La figure 8C représente la quantification de la longueur des myotubes observés dans chaque condition par rapport à la longueur des myotubes observés dans le témoin basai.
La figure 8B représente l'évaluation de l'activité anti-angiogénique des cyclopeptides SA et S1 par le test de migration des HUVEC. Les cellules ont été traitées pendant 16 heures par différentes concentrations de SA et SP1 (106 à 0"5 M). Deux témoins ont été utilisés : la génistéine à 30 μg/mL) inhibitrice de la différenciation des HUVEC en Matrigel®et de la migration des HUVEC, et l'EGF à 50 ng/mL, activateur de la différenciation des HUVEC en Matrigel® et de la migration des HUVEC. Les cellules non traitées ont été utilisées comme témoin basai (cellules en culture dans du milieu de culture supplémenté de 10% FBS seul). (Gen signifie génistéine ; EGF signifie le facteur de croissance épidermique). EXEMPLES
Solvants et réactifs
Les résines Fmoc-Gly-Sasrin et Fmoc-Pro-Sasrin utilisées dans les exemples sont commercialisées par la société Bachem.
La synthèse peptidique a été réalisée sur support solide sur un synthétiseur de peptide Applied Biosystem 433A commercialisé par la société Applied Biosystem.
Le mélange du O-benzotriazole-^/Vj/V^A/'-tétraméthyl-uronium-hexafluoro- phosphate (HBTU) et du /V-hydroxybenzotriazole anhydre (HOBt), en solution dans du diméthylformamide (DMF) est commercialisé par la société Applied Biosystem.
Les acides aminés Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH utilisés dans les exemples proviennent des sociétés Bachem et Iris Biotech.
La Λ/,/V-diisopropyléthylamine (DIEA) dans de la /V-méthylpyrrolidinone (NMP), et la NMP proviennent de la société Applied Biosystem. La pipéridine, l'acide trifluoroacétique (TFA), le dichlorométhane (DCM) et l'acétonitrile sont commercialisés par les sociétés Acros et Applied Biosystem.
L'azoture de diphénylphosphoryl azide (DPPA), le DIEA, l'éther diéthylique, le méthanol et le palladium sur charbon sont commercialisés par les sociétés Sigma et Acros.
Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) Les spectres 1H and 13C ont été réalisés sur un instrument Bruker Avance 500. Les déplacements chimiques des protons (δ ppm) ont été calibrés par rapport au tétraméthylsilane. Les constantes de couplage sont données en
Hertz.
Les spectres sont effectués dans des solvants deutérés provenant des fournisseurs Aldrich et SDS ou Eurisotop.
Soectrométrie de masse
Les spectres de masse ont été enregistrés sur un spectromètre Micromass-Waters Q-TOF Ultima, dans des solvants de qualité « pour Analyse ».
Chromatopraphie
Les analyses par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP), ont été réalisées sur une chaîne Shimadzu avec une colonne analytique C18 prosphère 100A (4,6 x 250mm 5μ : débit 1 ml/min) commercialisée par Alltech-Grace avec un détecteur UV (220 nm). Un gradient de deux solvants A (eau/TFA : 100/0,1) et B (acétonitrile/eau/TFA : 80/20/0,1) a été utilisé.
Les purifications par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP), ont été réalisées sur une colonne semi-préparative C18 (prosphère 100A 10 x 250mm 5μ : débit 2-3 ml/min) commercialisée par Alltech-Grace avec un détecteur UV (220 nm).
Exemple 1 : Préparation du cyclopeptide de formule (I) selon l'invention (cyclopeptide SP1)
Figure imgf000025_0001
Le peptide linéaire H2N-Val-Pro-Val-Val-Ala-Gly-OH est synthétisé, à partir de la Fmoc-Gly-Sasrin, selon les méthodes de synthèse peptidique sur support solide sur un synthétiseur de peptide Applied Biosystem 433A (1 équivalent, 0,1 mM) [3].
Après activation de la fonction acide à l'aide d'un mélange HBTU et de 0,5M HOBt en solution dans du D F, dix équivalents d'acides aminés Fmoc- 5 Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Val-OH sont successivement additionnés à la Fmoc-Gly-Sasrin en présence de DIEA dans de la /V-méthylpyrrolidinone (NMP). Après chaque couplage peptidique, le groupe Fmoc situé à l'extrémité N-terminale du dernier acide aminé couplé à la résine est clivé à l'aide d'une solution de NMP à 20% de pipéridine. 148 mg de î o peptide-résine sont obtenus.
La résine Sasrin est ensuite clivée du peptide linéaire ainsi obtenu à l'aide d'une solution d'acide trifluoroacétique à 1% dans du dichlorométhane pendant 45 minutes à température ambiante (20°C). Après filtration et élimination de la résine, le peptide linéaire est obtenu sous forme d'une huile incolore après 15 élimination sous vide du solvant. Le peptide linéaire (49 mg) est cyclisé à une concentration de 2.10"4 M dans l'acétonitrile en présence de 34 eq de DIEA et de 3 eq de DPPA, sous argon, jusqu'à disparition complète du peptide linéaire (48h) à température ambiante. La réaction est suivie par Chromatographie Liquide Haute Performance (Shimadzu, colonne analytique C18 prosphère 0 100A 4,6 x 250mm 5μ (Alltech-Grace), avec un gradient de solvants (A : eau/TFA : 100/0,1 ; B ; acétonitrile/eau/TFA : 80/20/0,1). Après élimination du solvant sous vide, 60 mg de peptide cyclique impur sont obtenus après précipitation à l'éther di-éthylique et filtration. Un produit pâteux est obtenu.
Une purification par CLHP est enfin réalisée sur une colonne semi-5 préparative C18 prosphère 100A 10 x 250mm 5μ (Alltech-Grace). Après lyophilisation, le cyclopeptide SP1 est obtenue sous la forme d'une poudre blanche.
Masse : 22,7 mg ; Rendement : 49%. 0 Masse Haute Résolution. Calculée pour C25H42 eNa06: 545,3064. Trouvée :
545,3069 (SP1 = 545,3069 ± 1 ,1 ppm, figure 2).
Exemple comparatif 1 : Préparation du cyclopeptide (SP2)
Figure imgf000027_0001
Le peptide linéaire H2N-Ala-Gly-Val-Pro-OH est synthétisé, à partir de la Fmoc-Pro-Sasrin, selon les méthodes de synthèse peptidique sur support solide sur un synthétiseur de peptide Applied Biosystem 433A (1 équivalent, 0,1 mM) [3]. Dix équivalents des acide-aminés Fmoc-Val-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH sont successivement additionnés à la H2N-Pro-résine en présence de DIEA dans de la W-méthylpyrrolidinone, après activation de la fonction acide à l'aide d'un mélange HBTU et de 0,5M HOBt en solution dans du DMF. Après chaque couplage peptidique, le groupe Fmoc situé à l'extrémité A erminale du dernier amino-acide couplé à la résine est clivé à l'aide d'une solution de NMP à 20% de piperidine. 161 mg de peptide-résine sont obtenus.
Le peptide linéaire H2N-pipérazinone-Ala-Gly-Val-Pro-OH est obtenu par couplage de deux équivalents de pipérazinone [4] avec un composé de formule (III) dans laquelle q=1 , R8=0, R6=R7=H, R5=Ph-CH20, avec un équivalent du peptide-résine H2N-Ala-Gly-Val-Pro-OH, à une concentration 7.10"3M, dans l'acétonitrile, en présence de 34 équivalents de DIEA et 3 équivalents de DPPA en phase solide, La solution est agitée à température ambiante (20°C) sous atmosphère d'argon pendant 48 heures. Après élimination sous vide du solvant, la déprotection du groupement Boc et le clivage de la résine se font simultanément à l'aide d'un mélange 50/50 de TFA DCM pendant 2 heures.
Après filtration de la résine et élimination sous pression réduite des solvants, la cyclisation du peptide linéaire H2N-pipérazinone-Ala-Gly-Val-Pro- OH est effectuée à une concentration de 2.10"4 M dans l'acétonitrile en présence de 34 équivalents de DIEA et de 3 équivalents de DPPA, sous argon, jusqu'à disparition complète du peptide linéaire (48h) à température ambiante (20°C). La réaction est suivie par Chromatographie Liquide Haute Performance (Shimadzu, colonne analytique C18 prosphère 100A 4,6 x 250mm 5μ (Alltech- Grace), avec un gradient de solvants (A : eau/TFA : 100/0,1 ; B : acétonitrile/eau/TFA : 80/20/0, 1 ).
Après élimination du solvant sous vide, le brut est directement purifié par CLHP sur une colonne semi-préparative C18 prosphère 100A 10 x 250mm 5μ (Alltech-Grace). Après lyophilisation, le cyclopeptide protégé SP2 (15,2 mg) est obtenu sous la forme d'une huile. Enfin, la déprotection du groupe benzyle est réalisée par hydrogénolyse dans le méthanol en présence de 10% de palladium sur charbon. Après filtration et élimination sous vide du solvant, une huile jaune est obtenue.
Masse : 12,5 mg ; Rendement : 18%.
Masse Haute Résolution. Calculée pour C22H34N6Na07: 517,2387. Trouvée : 517,2401 (SP2 - 517,2401 ± 2.7 ppm, figure 3 A).
Exemple comparatif 2 : Préparation de la ségétaline A (cyclopeptide SA)
Figure imgf000028_0001
Le peptide linéaire H2N-Val-Pro-Vai-Trp(boc)-Ala-Gly-OH est synthétisé, à partir de la Fmoc-Gly-Sasrin, selon les méthodes de synthèse peptidique sur support solide sur un synthétiseur de peptide Applied Biosystem 433A (1 équivalent, 0,1 mM) [3].
Après activation de la fonction acide à l'aide d'un mélange HBTU et de 0,5M HOBt en solution dans du DMF, dix équivalents d'acide-aminés Fmoc- Ala-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Val-OH sont successivement additionnés, à la Fmoc-Gly-Sasrin en présence de N,N- diisopropyléthylamine (DIEA) dans de la W-méthylpyrrolidinone (NMP). Après chaque couplage peptidique, le groupe Fmoc situé à l'extrémité /V-terminale du dernier acide aminé couplé à la résine est clivé à l'aide d'une solution de NMP à 20% de pipéridine. 125 mg de résine-peptide (HO-Val-Pro-Val-Trp(boc)-Ala- Gly-Sasrin) ont été obtenus.
Le peptide linéaire ainsi obtenu est clivé de la résine Sasrin à l'aide d'une solution d'acide trifluoroacétique (TFA) à 1 % dans du dichlorométhane pendant 45 minutes à température ambiante (20°C). Après filtration de la résine, le peptide linéaire est récupéré dans le filtrat.
Après élimination sous vide du solvant, 41 ,6 mg de peptide protégé sont obtenus sous forme d'une huile incolore. Le peptide linéaire est cyclisé à une concentration de 2.10"4 M dans l'acétonitrile en présence de 34 équivalents (eq) de DIEA et de 3 eq de DPPA, sous argon, jusqu'à disparition complète du peptide linéaire (48h) à température ambiante (20°C). La réaction est suivie par Chromatographie Liquide Haute Performance (Shimadzu, colonne analytique C18 prosphère 100A 4,6 x 250mm 5μ (Alltech-Grace), avec un gradient de solvants (A : eau/TFA : 100/0,1 ; B ; acétonitrile/eau/TFA : 80/20/0,1).
Après élimination du solvant sous vide, le peptide cyclique protégé est obtenu. Le groupement Boc de la chaîne du tryptophane du peptide cyclique est clivé à l'aide d'une solution de TFA à 50% dans le dichlorométhane. Après élimination sous vide du solvant, le peptide cyclique est filtré après addition d'éther diéthylique.
Un produit pâteux est obtenu. Une purification par CLHP est enfin réalisée sur une colonne semi-préparative C18 prosphère 100A 10 x 250mm 5μ (Alltech-Grace). Après lyophilisation, la ségétaline A est obtenue sous la forme d'une poudre blanche.
Masse: 10,1 mg ; Rendement : 29%.
Masse Haute Résolution. Calculée pour C3iH43N7Na06: 632,3173. Trouvée : 632,3157 (SA = 632,3157±2.5 ppm, figure 1). 1H NMR (500 MHz, [2H6]-DMSO, δ ppm relatif au tétraméthylsilane, J(Hz)): Gly!, 3,32 ( H, Ha, m), 3,66 (1 H, Ha, m), 7,44 (1 H, HNH, m). Val2, 0,82 (3H, Ηγ, d, 6,8), 0,95 (3H, Ηγ, d, 6,7), 2,11 (1 H, Ηβ, m), 4,51 (1 H, Ha, dd, 8,7 , 4,9), 7,42 (1 H, HNH, m). Pro3, 1 ,68 (1 H, Ηγ, m), 1 ,91 (1 H, Ηγ, m), 1 ,94 (1 H, Hp, m), 2,05 (1 H, Ηβ, m), 3,57 (1 H, Ηδ, m), 3,59 (1 H, Ηδ, m), 4,35 (1 H, Ηα, d, 8,0). Val4, 0,75 (3H, Ηγ, d, 6,2), 0,77 (3H, Ηγ, d, 6,2), 2,05 (1 H, Ηβ, m), 4,13 (1 H, Ηα, t, 9,8), 7,31 (1 H, HNH, d, 9,8). Trp5, 3,10 (1 H, Ηβ, dd, 16,5 ; 7,7), 3,12 (1 H, Hp, dd, 16,5 , 7,7), 4,26 (1 H, Ha, m), 6,98 (1 H, H6, t, 7,8), 7,07 (1 H, H5, t, 7,8), 7,14 <1 H, H2l s), 7,34 (1 H, H7l d, 7,8), 7,55 (1 H, H4, d, 7,8), 8,49 (1 H, HNH, d, 5,7), 10,88 (1 H, HLNH, s). Ala6l 1 ,14 (3H, Ηβ, d, 7,0), 3,69 (1 H, Ha, m), 8,92 (1 H, HNH, d, 6,3).
3C N R (125 MHz, [2H6]-DMSO, Ô ppm relatif au tétraméthylsilane): Glyi, 43,6 (Ca), 169,3 (CO). Val2> 56,0 (Ca), 30,5 (Cp), 18,2 et 20,3 (Cy), 171 ,6 (CO). Pro3, 61 ,1 (Ca), 32,1 (Cp), 22,2 (Cy), 47,66 (CÔ), 172,3 (CO). Vai4, 60,1 (Ca), 30,8 (CP), 19,4 et 20,0 (Cy), 173,4 (CO).Trp5, 56,4 (Ca), 26,8 (Cp), 122,2, 110,0, 119,2, 121 ,9, 19,2, 112,1 , 136,9 et 127,9 (C aromatique), 173,7 (CO). Ala6, 50.9 (Ca), 16,2 (Cp), 171 ,9 (CO).
Exemple comparatif 3 : Préparation d'un cyclopeptide, analogue de la ségétaline A (cyclopeptide S1
Figure imgf000030_0001
Le peptide linéaire H2N-Val-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-OH est synthétisé, à partir de la Fmoc-Gly-Sasrin, selon les méthodes de synthèse peptidique sur support solide sur un synthétiseur de peptide Applied Biosystem 433A (1 équivalent, 0,1 mM) [3].
Après activation de la fonction acide à l'aide d'un mélange HBTU et de 0,5M HOBt en solution dans du DMF, dix équivalents d'acides aminés Fmoc- Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Val-OH sont successivement additionnés à la Fmoc-Gly-Sasrin en présence de DIEA dans de la W-méthylpyrrolidinone (NMP). Après chaque couplage peptidique, le groupe Fmoc situé à l'extrémité A erminale du dernier acide aminé couplé à la résine est clivé à l'aide d'une solution de NMP à 20% de pipéridine. 103 mg de peptide-résine sont obtenus.
La résine Sasrin est ensuite clivée du peptide linéaire ainsi obtenu à l'aide d'une solution d'acide trifluoroacétique à 1 % dans du dichlorométhane pendant 45 minutes à température ambiante (20°C). Après filtration et élimination de la résine, le peptide linéaire est obtenu sous forme d'une huile incolore après élimination sous vide du solvant. Le peptide linéaire (34 mg) est cyclisé à une concentration de 2.10'4 M dans l'acétonitrile en présence de 34 eq de DIEA et de 3 eq de DPPA, sous argon, jusqu'à disparition complète du peptide linéaire (48h) à température ambiante. La réaction est suivie par Chromatographie Liquide Haute Performance (Shimadzu, colonne analytique C18 prosphère 100A 4,6 x 250mm 5μ (Alltech-Grace), avec un gradient de solvants (A : eau/TFA : 100/0,1 ; B : acétonitrile/eau/TFA : 80/20/0,1). Après élimination du solvant sous vide, 42 mg de peptide cyclique impur sont obtenus après précipitation à l'éther di-éthylique et filtration. Un produit pâteux est obtenu.
Une purification par CLHP est enfin réalisée sur une colonne semi- préparative C18 prosphère 100A 10 x 250mm 5μ (Alltech-Grace). Après lyophilisation, le cyclopeptide S1 est obtenu sous la forme d'une (poudre pâteuse légèrement beige).
Masse : 14.75 mg ; Rendement : 45%.
Masse Haute Résolution. Calculée pour C^HaeNeNaOe: 517,2728. Trouvée : 517.2751 (S1 = 517.2728 ± 4,4ppm, figure 3B).
Exemple 3 : Tests biologiques
Les tests ont portés sur les cyclopeptides SP1 selon l'invention, SA et S1 , et ont pour but de comparer l'activité angiogénique de SP1 , SA et S Le cyclopeptide SP1 a démontré une résistance importante à l'hydrolyse acide. Ce dernier solubilisé, à une concentration de 10"3M, dans une solution d'acide chlorhydrique à 0,5 M, à température ambiante (20°C), est retrouvé inchangé à 72% au bout de 7 jours, contre 98% dans les mêmes conditions en solution aqueuse uniquement. 3-1. Préparation
a) Cyclopeptides utilisés
Les tests ont portés sur les cyclopeptides SP1 , SA et S1 , plus particulièrement avec l'objectif de comparer l'activité anti-angiogénique du cyclopeptide synthétique SP1 par rapport à celle du cyclopeptide naturel SA ainsi que le cyclopeptide synthétique S1.
Le cyclopeptide SP1 a démontré une résistance importante à l'hydrolyse acide. Ce dernier solubilisé, à une concentration de 10"3M, dans une solution d'acide chlorhydrique à 0,5 M, à température ambiante (20°C), est retrouvé inchangé à 72% au bout de 7 jours, contre 98% dans les mêmes conditions en solution aqueuse uniquement. b) Cellules utilisées
Les trois peptides, après solubilisation dans l'eau à une concentration de
10"3M, ont été testés à des concentrations allant de 10"12 à 10"5M sur différents types de cultures cellulaires :
(i) de cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC), et
(ii) de cellules d'adénocarcinome mammaire humain : MCF7 et MDA- MB231.
Les cordons ont été obtenus dans le service de gynécologie obstétrique et médecine de la reproduction du Centre de Gynécologie Obstétrique d'Amiens (CGO).
Les HUVECs sont mises en culture dans le milieu M199 (Eurobio, France) complet qui est un milieu M199 supplémenté de
20% de sérum fœtal bovin (FBS ; Abcys, France),
1 % de 200 mM glutamine stabilisée (GIBCO, France), 1 % de pénicilline/streptomycine (concentrations finales de 100 Ul/ml et 100pg/mL respectivement) (Invitrogen, France), et
- 2ml de Supplément de Croissance de Cellules Endothéliales
(ECGS ; PromoCell, France).
Les MFC7 sont des cellules d'adénocarcinome mammaire humain hormono-dépendant qui expriment les deux récepteurs aux œstrogènes (ERct+ et ΕΡνβ+). Ces cellules ont un faible pouvoir métastatique. Les cellules MDA- MB231 , non hormonodépendantes, sont des cellules à fort pouvoir métastatique qui n'expriment qu'un seul récepteur aux oestrogènes, le récepteur β (ERa- et ER +). Les MCF7 et les MDA-MB231 proviennent de l'American Type Culture Collection (ATCC).
3-2. Test de prolifération, de cytotoxicité cellulaire et de mesure de la concentration de VEGF synthétisé
a) Test de prolifération, et de cytotoxicité
Les cellules HUVECs, ont été utilisées pour évaluer l'activité anti- angiogénique des cyclopeptides SP1 et SA en étudiant leurs effets directs sur la prolifération, la différenciation et la migration de ces cellules dans un premier temps..
Dans un deuxième temps, les cellules MCF7 et MDA-MB-231 ont été utilisées pour évaluer l'activité anti-angiogénique indirecte des cyclopeptides SP1 et SA en étudiant d'une part, leur effet direct sur la prolifération cellulaire de ces cellules (pour SP1 et SA) et d'autre part, leur effet indirect sur les cellules endothéliales en ciblant plus particulièrement le VEGFA (pour SP1 , SA et S1).. VEGFA est un facteur de croissance proangiogénique synthétisé et sécrété par ces deux lignées cellulaires MCF7 et MDA-MB231.
Pour tester l'effet direct sur la prolifération et la cytotoxicité cellulaire, deux conditions expérimentales ont été utilisées :
(i) à 0% de sérum fœtal bovin (FBS) : cette condition permet d'évaluer l'effet activateur des cyclopeptides SP1 et SA sur la prolifération cellulaire.
(ii) à 10% de sérum fœtal bovin (FBS) : cette condition permet d'évaluer l'effet inhibiteur des cyclopeptides SP1 et SA sur la prolifération cellulaire.
Il apparaît que ni SP1 ni SA ne modifient la prolifération des HUVEC, MCF7 et MDA-MB-231 (tests de prolifération en milieu normal). b) Mesure de la sécrétion du VEGFA
Le dosage du VEGFA sécrété a été réalisé sur les cultures cellulaires (MCF7 ou MDA-MB-231), après synchronisation du cycle cellulaire en phase G1 pendant 24h et traitement pendant 48h avec les différentes concentrations des cyclopeptides SP1 , SA et S1 (10"12 à 10~5 M) préparées extemporanément dans du milieu de culture DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) sans rouge de phénol (Invitrogen, France) et supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS ;Abcys, France). Chaque concentration de cyclopeptide SP1 , SA et S1 est testée trois fois. Le 17- -estradiol (E2), utilisé comme contrôle positif [5] (Sigma, France), induit la sécrétion du VEGFA par les cellules MCF7 et les cellules MDA-MB-231 (figures 6A, 6B, 6E et 6F). SP1 et SA présentent des IC50 comprises entre 10~8 et 10"9 M(figures 6A et 6B). S1 à des concentrations de 10"12M à 10"5M ne modifie pas la sécrétion du VEGFA par les MCF7 et les MDA-MB-231 par rapport au condition basale (cellules cultivées dans du DMEM supplémenté de 10%FBS sans aucun traitement)..
Les cellules MCF7 et MDA-MB-231 ont été traitées par différentes concentrations de SP1 et SA (10"12 à 10"5 M) pendant 48 heures. Les surnageants de ces cultures sont récupérés et appelés milieux conditionnés (MC). Un test de prolifération sur les cellules HUVEC traitées par ces milieux conditionnés a été réalisé dans les mêmes conditions que le test de prolifération cellulaire en milieu de culture normal (figure 4). Les cellules HUVEC non traitées ont été utilisées comme contrôle basai.
L'effet inhibiteur de SP1 et SA sur la sécrétion du VEGF préalablement induite par E2 a également été évalué (figures 6C à 6D). Ainsi, les cellules (MCF7 et MDA-MB-231) ont été traitées pendant 48h avec des concentrations fixes de SP1 et SA (10'6 ou 10'5M) en présence de concentrations variables de E2 (10"12 à 10"5 M). Le taux de VEGFA sécrété a ensuite été dosé avec le kit Quantikine® ELISA de détection du VEGF humain (RaD, France). c) Analyse de la phosphorylation de AKT-1 et ERK1/2
L'analyse des voies de signalisation PI3K/AKT et ERK1/2 a été réalisée par Western Blot. AKT-1 et ERK1/2 sont des sérine/thréonine kinases suractivées dans de nombreux cancers humains [6], [7]. Les voies de signalisation PI3K/AKT et ERK1/2 sont des voies de signalisation impliquées dans la prolifération (ERK1/2), la migration et la survie cellulaire (PI3K/AKT) [8],
[9]· Pour analyser la phosphorylation de AKT-1 et ERK1/2 (figures 5A à 5D), les cellules HUVEC mises en culture dans du milieu M199 (Eurobio, France) sans rouge de phénol, ont été privées de sérum pendant une heure pour déphosphoryler Akt-1 et ERK1/2. Les cellules HUVEC ont été ensuite traitées pendant 5, 15 et 30 minutes dans des MC composés du M 199 sans rouge de ont été ensuite traitées phénol supplémentés avec 10% de FBS et 20% de surnageant de culture de MCF7 ou MDA-MB-231 préalablement traitées avec des cyclopeptides SP1 et SA (10~12 à 10"5 M). Les cellules HUVEC non traitées ont été utilisées comme contrôle basai. Parallèlement, un test de prolifération sur ces cellules HUVEC traitées par ces milieux conditionnés a été réalisé dans les mêmes conditions que celles du le test de prolifération cellulaire en milieu de culture normal (figure 4).
3-3. Analyse de l'activité des cyclopeptides SP1 et SA sur l'expression des transcrits du VEGFA et de ses isoformes
L'analyse de l'activité des cyclopeptides SP1 et SA sur l'expression des trois isoformes du VEGFA (VEGF12 , VEGF165 et VEGF189) a également été réalisée par réaction de RT-PCR quantitative.
Les cellules (MCF7 et MDA-MB231) sont traitées avec 10"5 M de cylopeptides SP1 et SA pendant 6, 8, 12, 16, ou 20 h (figures 7A et 7B). Le 7- β-estradiol (E2) est utilisé comme contrôle positif et les cellules non traitées comme contrôle basai. Les ARN sont extraits en utilisant le kit « TriPure Isolation Reagent» (Eurobio, France). L'ADNc est synthétisé en utilisant le kit «AB Applied Biosystems » selon les instructions du fournisseur. Les ADNc sont ensuite stockés à -80°C jusqu'à leur utilisation. Pour quantifier l'expression de l'ARNm codant pour les trois principaux isoformes de VEGFA (VEGF121 , VEGF165 et VEGF139), le thermocycler ABI PRISM 7009 HT (Applied Biosystems) a été utilisé. L'amplification spécifique de chaque séquence a été réalisée exclusivement avec des amorces spécifiques de chaque isoforme. Les amorces de VEGFA (Fisher Bioblock, Invitrogen, France) ont déjà été validées [10], [11]. Les amorces 2-microglobuline ont été utilisées comme contrôle interne. 3-4. Tests de différenciation cellulaire (formation de tube en Matrigel®)
La différenciation des cellules endothéliales pour former des vaisseaux peut être induite in vitro en cultivant les cellules endothéliales en présence de différents composants de la matrice extracellulaire, comme des gels bi- ou tri- dimensionnels de collagène I ou de fibrine, ou du Matrigel®. Les cellules endothéliales cultivées sur Matrigel® (Basement Membrane Matrix, BD, USA) peuvent former des structures de type capillaire en à peine 6 heures, ce qui rend ce test adapté à la recherche de molécules antiangiogéniques [12]. Ces tests de différenciation cellulaire ont été réalisés sur les HUVEC (figure 8A). Les cellules sont aussitôt traitées dans 500 pL de Matrigel® contenant différentes concentrations des cyclopeptides SP1 et SA (10"12 à 10"5 M), deux conditions « contrôle positif» ont été effectuées avec 50 ng/mL d'EGF (Endothelial Growth Factor en anglais), et 30 pg/mL de génistéine (contrôle négatif) (figure 8A) [13]. Les cellules non traitées ont été utilisées comme « contrôle basai » (noté 10% de FBS sur les Figures 8A-8C).
La formation de tubes est quantifiée par des techniques d'analyses d'images, permettant notamment de mesurer le nombre et la longueur des tubes ou l'aire couverte par le réseau de capillaires [14]. La Figure 8C présente le résultat obtenu par ce test, dans laquelle les valeurs correspondent à la longueur en mm des tubes capillaires ± SEM ; et chaque concentration est testé trois fois (n=3) *p<0,05, **p<0,01 , ***p<0.001 versus contrôle.
On peut observer que la formation des tubes est fortement inhibée par SP1. Par conséquent, le cyclopeptide SP1 a un effet significatif sur la formation des tubes capillaire de cellules endothéliales.
3-5. Tests de migration des cellules endothéliales
Des tests de migration des cellules endothéliales (cellules HUVEC) ont été réalisées afin d'établir le potentiel chimioattractant des cyclopeptides SP1 et SA. La migration vers un facteur proangiogénique est une étape clé du processus d'angiogenèse. Le test de migration ou test de blessure in vitro permet d'estimer l'effet d'une molécule sur la migration des cellules endothéliales. Le principe de ce test repose sur le retrait d'une fine bande de cellules endothéliales confluentes de la boîte de culture et le dénombrement des cellules qui migrent dans l'espace libéré par la blessure. Les cellules sont ensemencées dans 500 \iL de milieu M 199 complet à raison de 5.105 cellules par puits dans des plaques de 24 puits. La plaque est incubée 24h en étuve thermostatée à 37°C en atmosphère humide avec 5% de CO2. Après 24h, les cellules confluentes à 100% sont lavées une fois avec du tampon phosphate salin (PBS venant de phosphate buffered saline). La blessure est alors réalisée. Les photos contrôles sont prises avant et après la blessure. Les cellules sont ensuite traitées avec 250μί des différentes concentrations des cyclopeptides SA et SP1 (10"12 à 0"5 M) préparées extemporanément dans du milieu M199 sans rouge de phénol supplémenté de 10% de FBS. Chaque concentration est testée trois fois. La plaque est incubée pendant 24h, dans les mêmes conditions que lors du premier jour. Les photos sont prises à l'objectif x 4 après 8h, 6h et 24h en utilisant une vidéo caméra JVC Ky-F50 connectée au logiciel VisioL et montée sur un microscope Leica (France) (figure 8B).
En contrôle, nous avons utilisé les mêmes contrôles que lors du test de Matigel®, 50ng/mL d'EGF (activateur de la migration) et 30 g/mL de génistéine (inhibiteur de la migration cellulaire), les cellules non traitées ont été utilisées comme contrôle basai [13].
3-6. Résultats de l'activité anti-angioqénique des cyclopeptides
a) Quelque soit la concentration testée (10"12 à 10"5 M), les cyclopeptides SP1 et SA n'affectent pas la prolifération des trois types cellulaires testés (HUVEC, MCF7, MDA-MB-231 ). Ceci démontre l'absence d'activité cytotoxique par absence d'effet direct sur la prolifération des cellules endothéliales ainsi que sur les cellules cancéreuses, pour les cyclopeptides SP1 et SA. Ce résultat est très intéressant car contrairement aux traitements anti-angiogéniques actuels qui présentent une cytotoxicité sur les cellules endothéliales pouvant conduire à des effets indésirables tels que l'hypertension pulmonaire, l'hypersensibilité, la toxicité cardiaque et la perforation gastro-intestinale, les cyclopeptides SP1 et SA ne présentent pas d'activité cytotoxique direct sur la prolifération des cellules endothéliales. En ce qui concerne la prolifération des cellules endothéliales en milieux conditionnés (MC), il apparaît que les MC obtenus à partir des cellules MCF7 et DA-MB231 traitées par les cyclopeptides SP1 et SA présentent une activité inhibitrice sur la prolifération des HUVEC par rapport aux MC obtenus à partir des cellules MCF7 et MDA-MB231 non traitées. A des concentrations comprises entre 10"8 et 10"5M, SP1 et SA inhibent de 20 à 26% la prolifération des HUVEC en présence de MC issus des cultures de cellules de MDA-MB- 231 ou de MCF7 (26% environ pour MDA-MB-231 et 20% pour des cellules MCF7). Cette activité laisse penser à un effet des cyclopeptides sur la production de facteurs de croissance proangiogéniques sécrétées par les deux types de cellules (MCF7 et MDA-MB-231). L'inhibition de la production de ces facteurs proangiogéniques pourrait expliquer l'activité indirecte de SP1 et SA sur la prolifération des HUVEC.
b) Parmi ces facteurs inhibés, le VEGFA est une cible de choix. Cette étude montre que les MC ont été capables d'inhiber l'activation de la voie
PI3K/AKT (figures 5A à 5D) impliquée dans la survie cellulaire et la voie ERK 1/2 impliquée dans la prolifération des cellules endothéliales (HUVEC). L'analyse des résultats indique une réduction significative de la phosphorylation de Akt-1 et Erk 1/2 dans les HUVEC par les MC pour des concentrations de 10"7 à 10~5M.
Dans le cadre de cette étude, les cyclopeptides ont démontré un potentiel inhibiteur sur la phosphorylation de AKT-1 et ERK 1/2, similaire à des inhibiteurs de tyrosine kinase. Cet effet inhibiteur est très rapide.
c) Un facteur de croissance angiogénique sécrété par les cellules cancéreuses (MCF7 et MDA-MB-231) qui induit la prolifération des cellules endothéliales par les voies de signalisation PI3K/Akt et Erk1/2 a été bien décrit dans la littérature : il s'agit du VEGFA. L'efficacité de SP1 et SA sur la sécrétion, la synthèse et la transcription du VEGFA ont été étudiés. Il a ainsi pu être démontré que les cyclopeptides SP1 et SA ont également un excellent potentiel inhibiteur sur de la transcription de l'ARNm du VEGFA dans les cellules d'adénocarcinome mammaire. Les effets inhibiteurs de SP1 et SA sur la transcription de l'ARNm du VEGFA se caractérisent par une réduction significative de la sécrétion du VEGFA (figures 6A à 6D). Contrairement à SP1 et SA, S1 n'a pas montré aucun effet significatif sur la sécrétion du VEGFA (figures 6 E et 6F).
d) De plus, les cyclopeptides SP1 et SA inhibent significativement, dans les cellules MCF7, la transcription de l'ARNm des isoformes diffusibles VEGF121 et VEGF165 et non pas la transcription de l'isoforme ancrée dans la membrane plasmique : l'isoforme VEGF189. Dans les cellules DA-MB-231 , les cyclopeptides SP1 et SA se sont révélés actifs sur l'inhibition des trois principaux isoformes du VEGFA (VEGFi2i, VEGF 6s et VEGF169) (figures 7A et 7B).
C'est un résultat important car l'isoforme VEGF121 est considéré comme l'un des facteurs les plus tumorigènes dans le cancer du sein et est l'isoforme prépondérante dans la progression tumorale.
La réduction de la sécrétion du VEGFA dans les cellules CF7 ne touche que les isoformes VEGF121 et VEGF165 contrairement aux cellules MDA-MB-231 où les trois isoformes sont concernés. Cette inhibition a été observée avec les cyclopeptides SP1 et SA pour des concentrations relativement fortes avec des
IC50 significatives. e) Une activité anti-angiogénique directe et spécifique du cyclopeptide SP1 a été mise en évidence. Il a été démontré que le cyclopeptide SP1 à des concentrations de 10~6 à 10"5M est en mesure d'entraver directement la migration cellulaire et la formation des tubes capillaires de cellules endothéliales contrairement à la ségétaline A (figures 8A et 8B). Ce résultat est comparable à celui décrit dans la littérature avec la génistéine mais a des plus fortes concentrations (30 pg/ml) [15]. La SA cependant, contrairement à SP1 n'a montré aucun effet significatif sur la formation des tubes capillaires et la migration des cellules endothéliales.
3-7. Conclusion
Les différents résultats anti-angiogéniques obtenus sur les cyclopeptides
SP1 selon l'invention et SA, démontrent bien la présence d'un effet anti- angiogénique indirect qui passe par une diminution de la synthèse de l'ARNm du VEGFA. SP1 et SA présentent des IC50 comprises entre 10"8 et 10~9 M pour la sécrétion du VEGFA. Les résultats montrent que les cyclopeptides SP1 selon l'invention et SA n'ont pas d'effet cytotoxique sur les cellules endothéliales. Ces cyclopeptides sont relativement stables à l'hydrolyse ce qui peut permettre d'envisager une action pharmacologique suffisamment longue.
Contrairement à SA, le cyclopeptide synthétique SP1 possède en outre une action anti-angiogénique directe sur la migration cellulaire et la formation des tubes capillaires de cellules endothéliales. Par conséquent, le cyclopeptide synthétique SP1 selon l'invention est donc simple et d'accès facile. Il possède une forte activité anti-angiogénique directe et indirecte sans toxicité endothéliale. Le contrôle de sa synthèse permet, en fonction des composants introduits, de disposer d'une molécule possédant une action indirecte et/ou directe sur l'angiogenèse ce qui ouvre des perspectives thérapeutiques intéressantes notamment dans les traitements des maladies associées à l'angiogenèse.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Cyclopeptide de formule (I)
Figure imgf000043_0001
dans laquelle
■ Ala représente l'alanine ;
■ Gly représente la glycine ;
■ Val représente la valine ;
■ Pro représente la proline
ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
2. Composition pharmaceutique comprenant un cyclopeptide selon la revendication 1 , et/ou un ou plusieurs excipient(s) pharmaceutiquement acceptable(s).
3. Cyclopeptide selon la revendication 1 ou la composition selon la revendication 2, pour son utilisation comme médicament.
4. Cyclopeptide selon la revendication 1 ou composition selon la revendication 2, pour son application comme médicament dans la prévention ou le traitement d'une maladie associée à l'angiogenèse.
5. Cyclopeptide selon la revendication 1 ou composition selon la revendication 2, pour son application comme médicament dans la prévention ou le traitement d'une maladie associée à l'angiogenèse choisie dans le groupe comprenant la croissance tumorale (tumeur de colon, sein, foie, rein et prostate), la dissémination métastatique (tumeur de colon, sein, foie, rein et prostate), les hémangiomes, la polyarthrite rhumatoïde, l'endométriose, l'athérosclérose, la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire.
6. Cyclopeptide selon la revendication 1 ou composition selon la revendication 2, pour son application comme médicament dans la prévention ou le traitement de l'ostéoporose.
7. Cyclopeptide selon la revendication 1 ou composition selon la revendication 2,, pour son application comme médicament dans la prévention ou le traitement de la croissance tumorale du colon, du sein, du foie, du rein et de la prostate.
8. Cyclopeptide selon la revendication 1 ou composition selon la revendication 2, pour son application comme médicament dans la prévention ou le traitement d'une maladie associée à la formation des tubes capillaires de cellules endothéliales.
9. Utilisation du cyclopeptide selon la revendication 1 , pour empêcher la formation des tubes capillaires de cellules endothéliales.
10. Procédé de préparation d'un cyclopeptide de formule (I), selon la revendication 1 , dans lequel :
a) on cyclise, un composé de formule (IV) ou (V) :
Figure imgf000044_0001
(IV) (V)
dans laquelle : Ala est l'alanine; Gly est la glycine ; Val est la valine ; X est la valine ; Y est la valine ; et Z est la proline,
■ Pr est un groupe protecteur choisi dans le groupe comprenant l'acétamidométhyle (Acm), l'allyloxycarbonyle (Alloc), le t-butyloxycarbonyle (Boc), le benzyloxyméthyle (Bom), le 2-(4-biphénylyl) propyl(2)oxycarbonyle (Bpoc), le 2-bromobenzyloxycarbonyle (Br-Z), le butoxyméthyle (Bum), l'acide benzoïque (Bz), le benzyle (Bzl), le dichlorobenzyle (CI2Bzl), le 2- chlorobenzyloxycarbonyle (CIZ), le A/-[1-(4,4-diméthyl-2,6- dioxocyclohexylidène)éthyle] (Dde), le dithia-succinyle (Dts), le 4- méthoxybenzyle (Mbzl), le 4 méthylbenzyle (MeBzl), le méthoxybenzyle (Mob), le 4-méthoxy-2,3,6-triméthylbenzene sulfonyie (Mtr), le mésitylene-2-sulfonyle (Mts), le 2-nitro-phénylsulfényle (Nps), le benzyle ester (OBzl), le tert-butyle ester (O-tBu), 2,2,4,6,7-pentaméthyldihydrobenzofuran-5-sulfonyle (Pbf), le 2,2,5,7,8,-pentaméthyl-chroman-6-sulfonyle (Pmc), le tert-butyle (tBu), le 2,4,6- triméthoxybenzyle (Tmob), le triphénylméthyle (trityle ou trt),
en présence d'un agent de cyclisation ;
b) on clive les groupes protecteurs des différents composés X, Y, Z, pour récupérer les composés X, Y,Z de départ.
1 1 . Procédé de préparation selon la revendication 6, dans lequel on obtient les composés (IV) et (V) respectivement, à partir des composés de formule (VI) et (VII) :
Figure imgf000045_0001
(VI) (VII)
dans lesquels :;
- Pr, Pri sont des groupes protecteurs choisis, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe comprenant l'acétamidométhyle (Acm), l'allyloxycarbonyle (Alloc), le t-butyloxycarbonyle (Boc), le benzyloxyméthyle (Bom), le 2-(4-biphénylyl) propyl(2)oxycarbonyle (Bpoc), le 2-bromobenzyloxycarbonyle (Br-Z), le butoxyméthyle (Bum), l'acide benzoïque (Bz), le benzyle (Bzl), le dichlorobenzyle (CfeBzl), le 2- chlorobenzyloxycarbonyle (CIZ), le W-[1-(4,4-diméthyl-2,6- dioxocyclohexylidène)éthyle] (Dde), le dithia-succinyle (Dts), le chlorure de fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), le 4-méthoxybenzyle (Mbzl), le 4 méthylbenzyle (MeBzl), le méthoxybenzyle (Mob), le 4-méthoxy-2,3,6- trimethylbenzene sulfonyie (Mtr), le mésitylene-2-sulfonyle (Mts), le 2- nitro-phénylsulfènyle (Nps), le benzyle ester (OBzl), le tert-butyle ester (O- tBu), 2,2,4,6,7-pentaméthyldihydrobenzofuran-5-sulfonyle (Pbf), le 2,2,5,7,8,-pentaméthyl-chroman-6-sulfonyle (Pmc), le tert-butyle (tBu), le 2,4,6-triméthoxybenzyle (Tmob), le triphénylméthyle (trityle ou trt) ;
■ Rs est une résine choisie dans le groupe comprenant la résine SASRIN, SASRIN-2-pyridylthiocarbonate, la résine WANG, la résine 2-chlorotrityle, la résine TENTAGEL, la résine WANG-TENTAGEL, la résine Wang-PEG, la résine benzhydrylamine, la résine polystyrène-Nhb, la résine Merrifield, la résine 4-méthylbenzhydrylamine (MBHA-résine, PAL-MBHA-résine), la résine 4-hydroxyméthylbenzylamide-synbeads, la résine 4- hydroxyméthylphenoxyacétylamidométhylpolystyrène (HMPA-résine) ; après clivage du groupe protecteur Ρη et de la résine Rs.
12. Procédé de préparation selon la revendication 7, dans lequel on prépare le composé (VI) par le couplage successif entre un composé de formule (VIII) :
Figure imgf000046_0001
(VIII) et Ala-Pr1 t (Pr-X)-Pn, (Pr-Y)-Pri, (Pr-Z)-Pri, Val-Pn respectivement, et le composé (VII) par le couplage successif entre un composé de formule (IX) :
Pr
Figure imgf000046_0002
(IX) et Val-Pn, Gly-Pn, Ala-Pn, (Pr-X)-Pr f (Pr-Y)-Pr1 ( respectivement, où Ala, Gly, Val, X, Y, Z, Pr et Pi sont tels que définis à la revendication 10,
en présence d'un agent de couplage.
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