WO2011121158A2 - Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos - Google Patents

Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos Download PDF

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    • C12N2533/32—Polylysine, polyornithine

Definitions

  • the present invention is within the field of neurobiology and biomedicine. Specifically, it refers to a method for purification of oligodendrocyte precursor cells (POs) from cerebral cortex from specimens of mature age.
  • POs oligodendrocyte precursor cells
  • oligodendrocytes are responsible for the formation of myelin in the central nervous system (CNS). These oligodendrocytes wrap the axon layer by layer with its own membrane to form a narrow spiral, the sheath, which isolates the axon membrane so that intensity of the electrical impulse is hardly lost.
  • the sheath is interrupted in Ranvier's nodules, which are regularly spaced and are points where almost all sodium channels are concentrated.
  • action potential propagates along the myelinated axon jumping from node to node.
  • This conduction has two main advantages: action potentials travel faster and metabolic energy is conserved because it only disperses in small regions of the axonal membrane in Ranvier's nodules.
  • POs which have the capacity to proliferate, migrate and differentiate, offer the possibility of studying the molecular and cellular mechanisms of morphofunctional differentiation, as well as the processes of myelination, demyelination and remyelination in vitro, and can be a source to promote myelination and / or remyelination in vivo, with special importance in demyelinating pathologies.
  • CNS cells come from neuroepithelial stem cells. These give rise to both neurons and macroglia. Glial cells are astrocytes and oligodendrocytes, which are distinguished by several characteristics. Oligodendrocytes are smaller and have a higher density in their nucleus and cytoplasm. They lack intermediate filaments and glycogen in their cytoplasm and have a high number of microtubules (Peters and cois, 1991, Anat Rec; 229 (3): 384-98).
  • the oligodendrocyte can have many cellular processes or extensions and each of them repeatedly contacts and wraps a portion of neuronal axon. When these envelopes condense, the membrane spiral forms the myelin sheath. In the same axon, adjacent myelin segments belong to different oligodendrocytes and each myelin unit ends near a Ranvier nodule (Bunge, 1968, Physiol Rev. 48 (1): 197-251). Before maturing to form the myelin sheath, oligodendrocytes go through several stages of development defined by the expression of specific surface receptors and by their response to different growth factors, among other molecules.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • POs are characterized by expressing Nestina + , A2B5 + , NG2 / AN2 + , plp-dm20 + , PDGFRa + , GD3 + , CNP + .
  • the onset of terminal differentiation is associated with the synthesis and presence on the cell surface of galactosylceramides (GalC), which recognizes the antibody against O1.
  • Mature oligodendrocytes express the basic myelin protein (MBP) and proteolipid protein (PLP) and synthesize the myelin membrane.
  • MBP basic myelin protein
  • PBP proteolipid protein
  • Other molecular markers expressed by mature oligodendrocytes are O4 + , RIP + , GalC + , ACNP + , MAG + (Rowitch, 2004, Nat Rev Neurosci. 5: 409-417; de Castro and Bribián, 2005, Brain Res Brain Res Rev 49 (2): 227-41).
  • oligodendrocytes and POs are distributed homogeneously throughout the CNS, mainly in the white matter, but also in the gray matter.
  • the proliferation and differentiation of POs follow a caudorrostral gradient along the neural tube.
  • Each step of the differentiation process from the precursor phase to the mature oligodendrocyte phase, can be identified by changes in cell morphology and in the expression of immunocytochemical markers, which accompanies a gradual decline in proliferative and migratory capacity (Almazán, G and cois, 2001, Microsc Res Tech. 15; 52 (6): 753-65; Rowitch, D, 2004, Nat Rev Neurosci. 5 (5): 409-19). The expression of these markers even serves to differentiate between various populations of oligodendrocytes.
  • oligodendrocytes are generated from POs.
  • This cell type has been described in the CNS of adult humans and is an interesting cell source for use in regenerative therapies for the treatment of demyelinating lesions, such as multiple sclerosis.
  • This potential is especially interesting, because it has been shown that axons can be myelinated throughout the life of neurons, even after having undergone a demyelination process (Setzu et al., 2004, Glia 45: 307-31 one ).
  • endogenous POs migrate to the area of injury, but are not able to penetrate and remyelinate effectively, but remain in the periphery or, if they penetrate the area of injury, die (Chang and cois , 2002, N Engl J Med. 346: 165-173).
  • the effectiveness of any purification process of a given cell type is inversely proportional to the time that elapses from obtaining the sample until the time of planting of the cells obtained in the combination of a culture medium and a substrate that allow its survival .
  • the purification of POs from embryonic or perinatal tissue is a much more efficient process than from mature or adult tissue, since in the embryonic stage or at a young age the absolute amount and the relative proportion of POs are significantly greater, and with the age, in addition, the cell survival potential decreases.
  • Cell lines are a useful and frequently used tool in the search for new drugs. Cell lines are obtained spontaneously or artificially from primary cell cultures. These cells can proliferate indefinitely and are often used as models for the study of the cells from which they originate.
  • oligodendroglia rat oligodendroglial cell lines derived from brains of 2-day-old animals have been described, such as the CG-4 line, described by Louis et al in 1992 (J Neurosci Res. 1992; 31 (1): 193-204) or the OL-1 line, described by Lagarde and cois in 2007 (Int J Dev Neurosci. 2007 25 (2): 95-105).
  • the human oligodendroglial cell lines described are derived from gliomas, oligodendrogliomas or oligodendrocytes fused with human tumor cells (Buntinx and cois 2003, J Neurocytol. 32 (1): 25-38). These cells of tumor origin cannot be used safely in the study of oligodendroglial neurobiology, nor as a therapeutic tool for the treatment of demyelinating diseases, since their immortalization process is unknown. For all this, a cell line of human POs obtained through a controlled immortalization process would be very useful for conducting drug response tests and cell therapy trials in demyelinating diseases.
  • the CNS is surrounded by three layers of connective tissue of mesodermal origin known as the meninges (dura, arachnoid and pia mater), which protect the CNS, among other things, against infections and contain cerebrospinal fluid (CSF) in the subarachnoid space, also mechanically protecting the CNS.
  • the choroid plexuses are the areas of the cerebral ventricles where the CSF is produced and are formed by blood capillaries wound on themselves, limited by endothelial cells, lined with a loose connective tissue and finally covered by an epithelial tissue. For the purification of the POs, the complete withdrawal of both the meninges and the choroid plexuses is necessary, to avoid contamination of the culture with cells from other tissues.
  • the authors of the present invention provide a method for the isolation and purification of mature and adult brain POs that allows: i. study the neurobiology of adult POs, more specifically the processes of cell proliferation, migration and differentiation, ii. study the effects of certain drugs on POs, iii. conduct screening studies of molecules to find new therapeutic targets for demyelinating diseases and iv. test cell therapies in animal models of demyelinating lesions.
  • the process of the present invention allows to reduce the duration of the cell purification process and considerably increases the survival of the POs and, thus, the effectiveness of the method valued in the final number of cells obtained.
  • a first aspect of the invention relates to a method of obtaining POs from the cerebral cortex of a mammal older than one week, comprising:
  • oligodendrocyte precursor refers to a cell that has not yet differentiated into a mature oligodendrocyte, and that has the potential to differentiate into oligodendrocytes.
  • the PO can be characterized by the Nestina7PSA-NCAM + / plp-dm207PDGFRa + phenotype.
  • the PO can be characterized by the Nestina + / A2B5 + / NG2 / AN2 + / plp-dm20 + / PDGFRa + / GD3 + / CNP + phenotype.
  • the PO can be characterized by the phenotype A2B5 + / NG2 / AN2 + / plp-dm20 + / PDGFRa + / O4 + / GD3 + / CNP + .
  • Nestina, PSA-NCAM, PLP, PDGFRa, A2B5, NG2, 04, GD3 and CNP refer to the expression of cytoplasmic or surface markers that are proteins that are recognized by the Nestina, PSA-NCAM, PLP, PDGFRa, A2B5 antibodies , NG2, 04, GD3 and CNP, respectively.
  • brain refers to mammalian neural tissue older than 7 days, including the forebrain, the hippocampus, the cerebellum, the cortex, the striatum, the telencephalon, the diencephalon. , the midbrain, the hypothalamus, the locus coeruleus and the rombencephalon.
  • mammal as used in the present invention is used to refer to any organism of the Eukaryota super kingdom, Metazoa kingdom, Chordata phylum, Craniata subphylum, Gnathostomata superclass and Mammalia class, and refers to any species of mammal, including humans, nonhuman primates, rodents, equines, canines, felines, cattle, pigs, sheep and lagomorphs.
  • the mammal is more than one week old. More preferably, the mammal is more than two weeks old. Even more preferably, the mammal is between 15 days and 9 months old. Much more preferably, the mammal is between 15 days and 6 months old.
  • step (b) comprises the enzymatic digestion of the sample obtained according to (a). More preferably, the enzyme used for the digestion of step (b) is papain. Even more preferably, the concentration of papain used for the digestion of step (b) is between 50 and 200 micrograms / milliliter.
  • step (b) comprises:
  • iii mechanically dissociate the nerve tissue resulting from step (ii), and iv. enzymatically dissociate the nerve tissue resulting from step (iii).
  • the concentration of papain employed in step (i) is between 150 and 200 micrograms / milliliter. More preferably, the concentration of papain employed in step (i) is between 160 and 190 micrograms / milliliter. Even more preferably, the concentration of papain employed in step (i) is between 170 and 185 micrograms / milliliter. Preferably, the concentration of papain employed in step (iv) is between 50 and 120 micrograms / milliliter. More preferably, the concentration of papain employed in step (iv) is between 60 and 1 10 micrograms / milliliter. Even more preferably, the concentration of papain used in step (iv) is between 70 and 100 micrograms / milliliter.
  • the enzymatic digestion time used in step (b) is between 2 and 22 minutes.
  • the enzymatic digestion time used in step (i) is between 3 and 7 minutes. More preferably, the enzymatic digestion time used in step (i) is between 4 and 6 minutes.
  • the enzymatic digestion time employed in step (iv) It is between 8 and 18 minutes. More preferably, the enzymatic digestion time used in step (iv) is between 9 and 16 minutes.
  • step (b) comprises an enzymatic digestion of the sample obtained according to (a) with DNase. More preferably, step (b) comprises an enzymatic digestion of the sample obtained according to (a) with DNase-1.
  • the efficiency of the method of the invention has been contrasted with the method of cell purification by FACS ("Fluorescence Activated Cell Sorting") and with the commercial kit called “Oligodendrocyte Selection Kif of Heraclitus Biosciences (HB), as described in Examples 1-3
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • HB Heraclitus Biosciences
  • the efficiency of the method of the invention is also contrasted with that described in Example 4, where POs are purified from the optic nerve of the adult rat by immuno-adsorption.
  • Table 1 Comparison of the efficiency of the method described by the invention with that of other methods already described (FACS, Heraclitus Biosciences Kit (HB Kit) and immuno-adsorption). As Table 1 shows, the efficiency of the method of the invention is much higher than that of any other method described so far for the purification of POs from mature or adult tissue.
  • the invention presents a method almost 7 times more efficient than the method of example 2, almost 10 times more efficient than the method of example 3 and more than 27 times more efficient than the method of example 4.
  • Another aspect of the invention relates to the cell obtained or obtainable by the method of the invention, hereafter referred to as "cell of the invention".
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to a cell culture derived from the cell of the invention.
  • Another more preferred embodiment relates to a cell line derived from the cell of the invention. More preferably, the cell line has been immortalized by gene transfection.
  • the term "immortalization” refers to the process of transformation of a cell that consists in the acquisition of said cell of dividing unlimitedly in time, without suffering aging or senescence.
  • transfection refers to any technique or procedure that allows the integration into a series of cells of a living organism of an exogenous gene, or "transgene", and which gives said cells a new biological property. This procedure is well known to one skilled in the art, and can be carried out by viral vectors, by chemical or physical methods. Preferably, the method of transfection is viral infection.
  • the transgene or exogenous gene refers to a DNA that is not normally resident, nor present in the cell to be transformed. In the particular case of the present invention, the DNA encodes a cell immortalization gene.
  • Cell immortalization genes can be considered, but not limited to, the genes that code for: telomerase or reverse telomerase transcriptase, myc genes, or viral genes such as SV40T (simian virus T antigen 40), EBV (Epstein-Barr virus ), adenoviral genes, Papillomavirus genes E6 and E7.
  • SV40T simian virus T antigen 40
  • EBV Epstein-Barr virus
  • adenoviral genes Papillomavirus genes E6 and E7.
  • Another aspect of the invention relates to a method of drug discovery or screening comprising:
  • the term "study the effect of the chemical” includes, but is not limited to, study cell survival, cell viability, cell death, cell stress, cell proliferation, cell migration, cell differentiation, or demyelination studies , myelination or remyelination.
  • FIG. 1 Identification of POs from adult mice (60 days old) of the CD-1 strain.
  • the POs were identified with a double immunocytochemical detection against A2B5 and Olig-2 (A-C) or against NG2 and A2B5 (D-F). Scale bar: 5 microns.
  • FIG. 1 FACS separation of adult brain POs from transgenic plp-GFP mice. Histograms of unlabeled cells (A) and stained with an anti-A2B5 antibody conjugated to phycoerythrin (PE) from the English "phyeoeritrin ') (B). Relative percentages of different cell populations (GFP7A2B5 + , GFP7A2B5 " , GFP + / A2B5 + ) unlabeled (C) and stained with an anti-A2B5 antibody conjugated to PE (D).
  • Figure 3 Identification of POs from human cerebral cortex from tumor resection margins. The POs were identified with a double immunocytochemical staining against PDGFRa and NG2 (AC), against NG2 and A2B5 (DF) and against Olig-2 and A2B5 (Gl). Scale bar: 10 microns.
  • FIG. 4 Identification of POs of human cerebral cortex obtained from traction resection margins. The POs were identified with double immunocytochemical staining against PDGFRa and NG2 (A-C), against NG2 and A2B5 (D-F) and against Olig-2 and A2B5 (G-l). Scale bar: 10 microns.
  • EXAMPLE 1 Purification of mouse cerebral cortex POs of 15 days, 2 months or 6 months of age.
  • the CD1 strain mice were supplied by Charles River Laboratories. All work was carried out according to the Spanish Regulations (RD 1201/2005 (BOE 252 / 34367-91, 2005)) and European (86/609 / EEC and 2003/65 / EC) on animal handling and use.
  • the bottles in which the cells will be seeded with poly-ornithine at a concentration of 10 mg / l are coated one day before the primary culture. Before planting the cells, the poly-ornithine is removed and the bottles are washed to remove the remains. The animals were sacrificed by cervical dislocation and / or CO2 asphyxiation and the brains were removed and taken to a plate with calcium and magnesium saline (HBSS from the English "Hanks' Balanced Salt Solution”) on ice.
  • HBSS calcium and magnesium saline
  • the brains were incubated in different dilutions of a papain solution (SP, consisting of: 0.9 mg / ml papain, 0.2 mg / ml L-cysteine, 0.2 EDTA mg / ml in HBSS) at 37 ° C for 5 minutes (see Table 2).
  • SP a papain solution
  • the remains of meninges and plexuses were finished removing with tweezers and with the help of a stereoscopic microscope. Once clean, the cerebral cortices were taken to a new plate with HBSS on ice.
  • the cell suspension was incubated, for 5 minutes, at 37 ° C and subsequently centrifuged at 900 rpm, for 10 minutes. The supernatant and myelin residues were removed and the cells were resuspended in serum medium.
  • the cell suspension was filtered through a 100 micron mesh and seeded in a final volume of 10 ml of POs medium (DMEM with 10% fetal bovine serum (SFB), 10 ng / ml PDGFq and 1% penicillin and streptomycin) for each bottle of 75 cm 2 of surface, previously coated with poly-ornithine, as described above.
  • POs medium DMEM with 10% fetal bovine serum (SFB), 10 ng / ml PDGFq and 1% penicillin and streptomycin
  • the number of animals needed for each bottle is detailed in Table 2.
  • the medium was changed two days later. Thereafter, the medium was changed every two or three days.
  • the culture flasks were closed and stirred overnight at 300 rpm and 37 ° C temperature. The next morning the medium was collected with the POs in suspension and filtered through a 40 micron mesh, the cell suspension was then centrifuged at 900 rpm for 10 minutes.
  • the cells were resuspended in POs medium and seeded in petri dishes for 45 minutes at 37 ° C to remove microglia cells, which rapidly adhere to the substrate. After this time, the cell suspension was collected, filtered again with a 40 micron mesh and centrifuged again as before. The cells were resuspended and seeded again in PO media and in petri dishes for another 30 minutes at 37 ° C to remove any remaining microglia cells.
  • This medium enriched in POs was collected and centrifuged as described above. The cells were finally resuspended in BS medium (Bottenstein-Sato, for 10 ml of medium: 9.6 ml of DMEM, 100 microliters of SFB, 100 microliters of L-Glutamine 200mM, 100 microliters of Penicillin / Streptomycin, 60 microliters of BSA 5%, 10 microliters of transferrin 100mg / ml, 1, 86 microliters of Insulin 50 mg / ml, 1 microliter of Progesterone 0.62mg / ml, 1 microliter of putrescine160 mg / ml, 1 microliter of T3 3 mg / ml, 1 microliter of T4 4 mg / ml, 1 microliter of sodium selenite 0.39 ng / ml), counted and sown differently for the study of proliferation, migration or differentiation to mature oligodendrocytes (Bribián and co
  • EXAMPLE 2 Purification of mouse cerebral cortex POs of 2 months of age by FACS.
  • the myelin residues were removed by filtration of the cell suspension through a 40 micron mesh followed by centrifugation in sucrose (0.9 M) in HBSS on ice.
  • the cells were stained with anti-A2B5 antibody conjugated to PE and analyzed and separated in a BD FACSAria kit.
  • the cells were separated in HBSS with 2% fetal bovine serum, 25 mM HEPES and 5mM EDTA.
  • EXAMPLE 3 Purification of mouse cerebral cortex POs of 2 months of age using the "Oligodendrocyte Selection Kit" of HB.
  • EXAMPLE 4 Purification of adult rat optic nerve POs using the immuno-adsorption technique ("immunopanning").
  • This method is described in patent application PCT / US1996 / 013279 and consists in the purification of adult rat optic nerve POs from a mixed suspension of optic nerve cells.
  • This cell suspension is first contacted with a plaque where an anti-Thyl antibody has previously been absorbed, which allows the removal of cells of non-glial origin.
  • the cell suspension is then contacted with a second plate previously adsorbed with anti-A2B5 antibody, anti-NG2 antibody or with peanut agglutinin, which will allow only cells with these proteins on their surface to be adsorbed to the plate.
  • These cells will be mostly POs although, in the case of A2B5, they may also be O-2A precursors.
  • EXAMPLE 5 Purification of human cerebral cortex POs from biopsies (resection margins in trauma and tumors). To obtain human POs, the protocol described in example 1 was followed with the following modifications: a. For the sowing of each 25 cm 2 bottle, a quantity of tissue of between 1 and 4 grams was used, finding the best results using 4 grams. b. Enzymatic digestion of the meninges and choroid plexuses was performed using the papain solution (SP) at a dilution of 1: 2.5, for 10 minutes. C. The volume of POs medium was 5 ml per 25 cm 2 bottle. d. Stirring to separate the POs was performed at 250 rpm.
  • SP papain solution
  • the efficiency of this method is 60,000 POs for each gram of fresh tissue used in the case of tumor resection margins and 15,000 POs for each gram of fresh tissue from trauma resection margins.

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Abstract

Método para la purificación de células precursoras de oligodendrocitos (POs) de corteza cerebral a partir de la corteza cerebral de un mamífero de edad superior a una semana, que comprende: obtener una muestra aislada de cerebro; seleccionar las POs de la muestra biológica obtenida anteriormente y cultivar las POs en condiciones de proliferación, migración, movilidad o diferenciación celular. Además, la presente invención se refiere a los POs obtenidos por el método de la invención y a las líneas celulares derivadas del mismo.

Description

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS PRECURSORAS DE
OLIGODENDROCITOS
La presente invención se encuentra dentro del campo de la neurobiología y la biomedicina. Específicamente, se refiere a un método para la purificación de células precursoras de oligodendrocitos (POs) de corteza cerebral a partir de ejemplares de edad madura.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los axones de muchas neuronas de vertebrados están aislados por la vaina de mielina, que aumenta enormemente la velocidad con la que el axón puede conducir el potencial de acción. Los oligodendrocitos son los responsables de la formación de la mielina en el sistema nervioso central (SNC). Estos oligodendrocitos envuelven el axón capa a capa con su propia membrana hasta formar una estrecha espiral, la vaina, que aisla la membrana del axón de manera que no se pierde apenas intensidad del impulso eléctrico. La vaina se interrumpe en los nodulos de Ranvier, que están espaciados regularmente y son puntos donde se concentran casi todos los canales de sodio. Estas excelentes características de la envuelta del axón hacen que la despolarización de la membrana en un nodo se extienda casi inmediatamente y de manera pasiva al siguiente. Así, el potencial de acción se propaga a lo largo del axón mielinizado saltando de nodo en nodo. Esta conducción tiene dos ventajas principales: los potenciales de acción viajan más rápido y la energía metabólica se conserva porque sólo se dispersa en pequeñas regiones de la membrana axonal en los nodulos de Ranvier.
La importancia de la mielinización viene demostrada por las enfermedades desmielinizantes, como la esclerosis múltiple, en la que la vaina de mielina en algunas regiones del SNC es destruida por algún mecanismo todavía desconocido. Los oligodendrocitos son células post-mitóticas, totalmente diferenciadas, que no se dividen in vivo, lo cual dificulta su cultivo in vitro a largo plazo (Verity y cois, 1993 J Neurochem. 60(2):577-87). Los POs, que tienen capacidad de proliferar, migrar y de diferenciarse, ofrecen la posibilidad de estudiar los mecanismos moleculares y celulares de diferenciación morfofuncional, así como los procesos de mielinización, desmielinización y remielinización in vitro, y pueden ser una fuente para promover la mielinización y/o la remielinización in vivo, con especial importancia en patologías desmielinizantes.
Todas las células del SNC provienen de las células troncales neuroepiteliales. Éstas dan lugar tanto a las neuronas como a la macroglia. Las células gliales son los astrocitos y los oligodendrocitos, que se distinguen por varias características. Los oligodendrocitos son de menor tamaño y presentan mayor densidad en su núcleo y su citoplasma. Carecen de filamentos intermedios y glucógeno en su citoplasma y presentan un elevado número de microtúbulos (Peters y cois, 1991 , Anat Rec; 229(3):384-98).
El oligodendrocito puede tener muchos procesos o extensiones celulares y cada una de ellas contacta y envuelve repetidas veces una porción de axón neuronal. Cuando estas envueltas se condensan, la espiral de membrana forma la vaina de mielina. En el mismo axón, los segmentos de mielina adyacentes pertenecen a distintos oligodendrocitos y cada unidad de mielina termina cerca de un nodulo de Ranvier (Bunge, 1968, Physiol Rev. 48(1 ): 197- 251 ). Antes de madurar hasta formar la vaina de mielina, los oligodendrocitos pasan por varias etapas de desarrollo definidas por la expresión de receptores de superficie específicos y por su respuesta a distintos factores de crecimiento, entre otras moléculas. Así, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, del inglés "platelet-derived growth factor") se asocia tanto a la autorrenovación como a la generación de oligodendrocitos (Richardson y cois, 1988, Nature. 9; 333(6173):562-5.; Raff y cois, 1989 Development. 105(3):595- 603; Noble y cois, 1988 Nature. 9; 333(6173):560-2). Así, los POs se caracterizan por expresar Nestina+, A2B5+, NG2/AN2+, plp- dm20+, PDGFRa+, GD3+, CNP+. Posteriormente los POs dan lugar a los preoligodendrocitos que expresan los mismos marcadores excepto Nestina y además presentan 04 (Rowitch, 2004, Nat Rev Neurosci. 5:409-417; de Castro y Bribián, 2005, Brain Res Brain Res Rev. 49(2):227-41 )
El inicio de la diferenciación terminal (oligodendrocito inmaduro) se asocia a la síntesis y a la presencia en la superficie celular de galactosilceramidas (GalC), que reconoce el anticuerpo contra O1 .
Los oligodendrocitos maduros expresan la proteína básica de la mielina (MBP) y la proteína proteolípida (PLP) y sintetizan la membrana de mielina. Otros marcadores moleculares expresados por los oligodendrocitos maduros son O4+, RIP+, GalC+, ACNP+, MAG+ (Rowitch, 2004, Nat Rev Neurosci. 5:409-417; de Castro y Bribián, 2005, Brain Res Brain Res Rev. 49(2):227-41 ).
Aunque la mayoría de los estudios de los progenitores O-2A y los oligodendrocitos maduros se han llevado a cabo en roedores, tanto células O- 2A, como células multipolares A2B5+/O4+, así como oligodendrocitos maduros O1 + han sido identificados en cerebro fetal humano (Rivkin y cois, 1995, Ann Neurol; 38(1 ):92-101 ).
En el adulto, tanto los los oligodendrocitos como los POs se distribuyen de manera homogénea por todo el SNC, principalmente en la sustancia blanca, pero también en la sustancia gris.
La proliferación y diferenciación de los POs (incluyendo el subsiguiente proceso de mielinización) siguen un gradiente caudorrostral a lo largo del tubo neural. Cada paso del proceso de diferenciación, desde la fase de precursor hasta la de oligodendrocito maduro, puede ser identificado por cambios en la morfología celular y en la expresión de marcadores inmunocitoquímicos, lo que se acompaña de un descenso paulatino de la capacidad proliferativa y migratoria (Almazán, G y cois, 2001 , Microsc Res Tech. 15; 52(6):753-65; Rowitch, D, 2004, Nat Rev Neurosci. 5(5):409-19). La expresión de estos marcadores sirve incluso para diferenciar entre diversas poblaciones de oligodendrocitos. De hecho, se ha propuesto la existencia de dos poblaciones distintas de POs: una población dependiente del PDGF, población que denominamos PDGFRa+, y otra independiente de este factor de crecimiento, población plp/dm20+ (Spassky, N y cois, 2000, Glia. 15; 29(2): 143-8; Spassky, N y cois, 1998, J Neurosci. 15; 18(20):8331 -43.; Pringle, NP y Richarson, WD, 1993, Development.1 17(2):525-33.; Le Bras, B, 2005, Int J Dev Biol. 49(2-3):209-20). Ambas poblaciones de oligodendrocitos experimentan un variado patrón de migración para colonizar todo el SNC durante el desarrollo.
Durante el desarrollo, los oligodendrocitos se generan a partir de POs. Este tipo celular se ha descrito en el SNC de humanos adultos y constituye una fuente celular interesante para su uso en terapias regenerativas para el tratamiento de lesiones desmielinizantes, como por ejemplo la esclerosis múltiple. Este potencial resulta especialmente interesante, porque se ha demostrado que los axones pueden ser mielinizados a lo largo de toda la vida de las neuronas, incluso después de haber sufrido un proceso de desmielinización (Setzu y cois., 2004, Glia 45:307-31 1 ). En respuesta al daño desmielinizante, los POs endógenos migran hacia la zona de lesión, pero no son capaces de penetrar y remielinizar de manera efectiva, sino que se quedan en la periferia o, si penetran en la zona de lesión, mueren (Chang y cois, 2002, N Engl J Med. 346: 165-173).
El estudio de los POs durante el desarrollo embrionario ha permitido conocer los mecanismos moleculares que regulan la migración, proliferación y diferenciación de este tipo celular. Sin embargo, existen pocos datos acerca de la biología de los POs en cerebro adulto, ya que hasta la fecha sólo se han podido aislar de manera eficiente los POs de embriones o neonatos. Por tanto, no se ha podido estudiar cuál es la fisiología de estos POs adultos, sus similitudes y divergencias con lo visto en POs embrionarios o postnatales tempranos.
La eficacia de cualquier proceso de purificación de un tipo celular dado es inversamente proporcional al tiempo que transcurre desde la obtención de la muestra hasta el momento de la siembra de las células obtenidas en la combinación de un medio de cultivo y un sustrato que permitan su supervivencia. La purificación de POs a partir de tejido embrionario o perinatal es un proceso mucho más eficiente que a partir de tejido maduro o adulto, ya que en estadio embrionario o a corta edad la cantidad absoluta y la proporción relativa de POs son significativamente mayores, y con la edad, además, el potencial de supervivencia celular disminuye.
Hasta la fecha, la mayor parte de los estudios se han realizado con cultivos de POs purificados a partir de cerebro embrionario, preferentemente, o perinatal (desde recién nacido hasta, máximo, 3-4 días de edad). Hay pocos estudios en los que se obtengan POs a partir de tejido adulto, con la excepción del nervio óptico de rata (Shi y cois, 1998, J Neurosci. 18(12):4627-4636). Esto ha imposibilitado el estudio de la neurobiología de los POs adultos, lo cual es crucial para el avance de la investigación sobre las enfermedades desmielinizantes en cuanto a la búsqueda de nuevas terapias farmacológicas y al desarrollo de la medicina regenerativa se refiere.
Las líneas celulares son una herramienta útil y de uso frecuente en la búsqueda de nuevos fármacos. Las líneas celulares se obtienen de forma espontánea o artificial a partir de cultivos celulares primarios. Estas células pueden proliferar indefinidamente y se usan frecuentemente como modelos para el estudio de las células de las que proceden. En el caso de la oligodendroglia, se han descrito líneas celulares oligodendrogliales de rata derivadas de cerebros de animales de 2 días de edad, como la línea CG-4, descrita por Louis y cois en 1992 (J Neurosci Res. 1992; 31 (1 ): 193-204) o la línea OL-1 , descrita por Lagarde y cois en 2007 (Int J Dev Neurosci. 2007 25(2):95-105). Las líneas celulares oligodendrogliales humanas descritas proceden de gliomas, oligodendrogliomas o de oligodendrocitos fusionados con células tumorales humanas (Buntinx y cois 2003, J Neurocytol. 32(1 ):25-38). Estas células de origen tumoral no pueden usarse de manera segura en el estudio de la neurobiología oligodendroglial, ni como herramienta terapéutica para el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes, pues se desconoce su proceso de inmortalización. Por todo esto, una línea celular de POs humanos obtenida mediante un proceso de inmortalización controlada sería de gran utilidad para la realización de ensayos de respuesta a fármacos y ensayos de terapia celular en enfermedades desmielinizantes.
El SNC está rodeado de tres capas de tejido conectivo de origen mesodérmico conocidas como las meninges (duramadre, aracnoides y piamadre), que protegen el SNC, entre otras cosas, frente a infecciones y contienen el líquido cefalorraquídeo (LCR) en el espacio subaracnoideo, protegiendo también mecánicamente el SNC. Los plexos coroideos son las zonas de los ventrículos cerebrales donde se produce el LCR y están formados por capilares sanguíneos enrollados sobre sí mismos, limitados por células endoteliales, revestidos de un tejido conjuntivo laxo y finalmente recubiertos por un tejido epitelial. Para la purificación de los POs es necesaria la completa retirada tanto de las meninges como de los plexos coroideos, para evitar la contaminación del cultivo con células procedentes de otros tejidos. Los métodos de purificación de POs descritos hasta ahora solucionan la retirada de las meninges y los plexos coroideos con una ardua, lenta, laboriosa y delicada disección con pinzas bajo el microscopio estereoscópico, lo cual incrementa la muerte celular significativamente especialmente en ejemplares adultos. Es necesario, por tanto, un procedimiento sencillo y que permita la purificación de POs a partir de tejido neural maduro o adulto, que permita el estudio de la neurobiología de esta población celular, así como la realización de ensayos de respuesta a fármacos y ensayos de terapia celular en enfermedades desmielinizantes.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención proporcionan un método para el aislamiento y la purificación de POs de cerebro maduro y adulto que permite: i. estudiar la neurobiología de POs adultos, más concretamente los procesos de proliferación, migración y diferenciación celular, ii. estudiar los efectos de determinados fármacos en los POs, iii. realizar estudios de criba de moléculas para encontrar nuevas dianas terapéuticas para las enfermedades desmielinizantes y iv. ensayar terapias celulares en modelos animales de lesiones desmielinizantes.
Además, el procedimiento de la presente invención permite disminuir la duración del proceso de purificación celular e incrementa considerablemente la supervivencia de los POs y, con ello, la eficacia del método valorada en el número final de células obtenido.
Esto se consigue eliminando la mayor parte de las meninges y los plexos coroideos mediante una digestión enzimática. Como se detalla en el ejemplo 1 , la incubación de los cerebros previamente disecados en una solución de la cistein-proteasa papaína a una concentración (variable según la edad) durante 5 minutos a 37°C, permite la rápida separación de estos tejidos del tejido nervioso de interés.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de POs a partir de la corteza cerebral de un mamífero de edad superior a una semana, que comprende:
a) obtener una muestra aislada de cerebro,
b) seleccionar las POs de la muestra biológica obtenida en (a) y c) cultivar las POs en condiciones de proliferación o diferenciación.
El término "precursor de oligodendrocito" o PO tal y como se usa en la presente invención, se refiere a una célula que aún no se ha diferenciado en un oligodendrocito maduro, y que tiene potencial para diferenciarse en oligodendrocitos. En un aspecto de la invención, el PO puede caracterizarse por el fenotipo Nestina7PSA-NCAM+/plp-dm207PDGFRa+. En otro aspecto de la invención, el PO puede caracterizarse por el fenotipo Nestina+/A2B5+/NG2/AN2+/plp-dm20+/PDGFRa+/GD3+/CNP+. Incluso en otro aspecto de la invención, el PO puede caracterizarse por el fenotipo A2B5+/NG2/AN2+/plp-dm20+/PDGFRa+/O4+/GD3+/CNP+. Nestina, PSA-NCAM, PLP, PDGFRa, A2B5, NG2, 04, GD3 y CNP se refieren a la expresión de marcadores citoplásmicos o de superficie que sean proteínas que se reconozcan por los anticuerpos Nestina, PSA-NCAM, PLP, PDGFRa, A2B5, NG2, 04, GD3 y CNP, respectivamente.
El término "cerebro" tal y como se usa en la presente invención, se refiere a tejido neural de mamífero de edad superior a 7 días, incluyendo el prosencéfalo, el hipocampo, el cerebelo, la corteza, el estriado, el telencéfalo, el diencéfalo, el mesencéfalo, el hipotálamo, el locus coeruleus y el rombencéfalo.
El término "mamífero" tal y como se usa en la presente invención, se utiliza para referirse a cualquier organismo del superreino Eukaryota, reino Metazoa, phylum Chordata, subphylum Craniata, superclase Gnathostomata y clase Mammalia, y se refiere a cualquier especie de mamífero, incluyendo humanos, primates no humanos, roedores, equinos, caninos, felinos, bovinos, porcinos, ovinos y lagomorfos. Preferiblemente, el mamífero tiene más de una semana de edad. Más preferiblemente, el mamífero tiene más de dos semanas de edad. Aún más preferiblemente, el mamífero tiene entre 15 días y 9 meses de edad. Mucho más preferiblemente, el mamífero tiene entre 15 días y 6 meses de edad. Preferiblemente, el paso (b) comprende la digestión enzimática de la muestra obtenida según (a). Más preferiblemente, la enzima empleada para la digestión del paso (b) es la papaína. Aún más preferiblemente, la concentración de papaína empleada para la digestión del paso (b) es de entre 50 y 200 microgramos/mililitro.
En una realización preferida, el paso (b) comprende:
i. una primera digestión enzimática de la muestra obtenida según (a), ii. retirar las meninges y los plexos coroideos,
iii. disociar mecánicamente el tejido nervioso resultante del paso (ii), y iv. disociar enzimáticamente el tejido nervioso resultante del paso (iii).
Preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso (i) es de entre 150 y 200 microgramos/mililitro. Más preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso (i) es de entre 160 y 190 microgramos/mililitro. Aún más preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso (i) es de entre 170 y 185 microgramos/mililitro. Preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso (iv) es de entre 50 y 120 microgramos/mililitro. Más preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso (iv) es de entre 60 y 1 10 microgramos/mililitro. Aún más preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso (iv) es de entre 70 y 100 microgramos/mililitro.
Preferiblemente, el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (b) es de entre 2 y 22 minutos.
Preferiblemente, el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (i) es de entre 3 y 7 minutos. Más preferiblemente, el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (i) es de entre 4 y 6 minutos.
Preferiblemente, el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (iv) es de entre 8 y 18 minutos. Más preferiblemente, el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (iv) es de entre 9 y 16 minutos.
Preferiblemente, el paso (b) comprende una digestión enzimática de la muestra obtenida según (a) con DNasa. Más preferiblemente, el paso (b) comprende una digestión enzimática de la muestra obtenida según (a) con DNasa-l .
La eficiencia del método de la invención se ha contrastado con el método de purificación celular mediante FACS (del inglés "Fluorescence Activated Cell Sorting") y con el kit comercial denominado "Oligodendrocyte Selection Kif de Heraclitus Biosciences (HB), como está descrito en los ejemplos 1 -3. Además, se contrasta también la eficiencia del método de la invención con el descrito en el ejemplo 4, donde se purifican POs a partir de nervio óptico de rata adulta mediante inmuno-adsorción.
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Tabla 1 . Comparativa de la eficiencia del método que describe la invención con la de otros métodos ya descritos (FACS, Kit de Heraclitus Biosciences (Kit HB) e inmuno-adsorción). Como muestra la tabla 1 , la eficiencia del método de la invención es mucho más elevada que la de cualquier otro método descrito hasta ahora para la purificación de POs a partir de tejido maduro o adulto. La invención presenta un método casi 7 veces más eficiente que el método del ejemplo 2, casi 10 veces más eficiente que el método del ejemplo 3 y más de 27 veces más eficiente que el método del ejemplo 4.
Otro aspecto de la invención se refiere a la célula obtenida u obtenible mediante el método de la invención, de ahora en adelante denominada "célula de la invención". Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a un cultivo celular derivado de la célula de la invención. Otra realización más preferida se refiere a una línea celular derivada de la célula de la invención. Más preferiblemente, la línea celular se ha inmortalizado mediante transfección génica.
El término "inmortalización" se refiere al proceso de transformación de una célula que consiste en la adquisición de dicha célula de dividirse ilimitadamente en el tiempo, sin sufrir envejecimiento o senescencia.
El término "transfección génica" se refiere a cualquier técnica o procedimiento que permita la integración en una serie de células de un organismo vivo de un gen exógeno, o "transgén", y que confiere a dichas células una nueva propiedad biológica. Este procedimiento es sobradamente conocido por un experto en la materia, y puede llevarse a cabo mediante vectores virales, mediante métodos químicos o físicos. Preferiblemente, el método de transfección es la infección viral. El transgén o gen exógeno se refiere a un ADN normalmente no residente, ni presente en la célula que se pretende transformar. En el caso particular de la presente invención el ADN codifica para un gen de inmortalización celular. Pueden considerarse genes de inmortalización celular, pero sin limitarnos, los genes que codifican para: telomerasa o transcriptasa reversa de la telomerasa, genes myc, o genes virales como SV40T (antígeno T del virus de simio 40), EBV (virus de Epstein- Barr), genes adenovirales, genes del Papilomavirus E6 y E7.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de descubrimiento o screening de fármacos que comprende:
a. establecer un cultivo celular a partir de los POs según la reivindicación 16, o una línea celular según la reivindicación 17, b. administrar una sustancia química al cultivo o línea celular de (a), c. estudiar el efecto de la sustancia química de (b) en el cultivo celular de (a) El término "estudiar el efecto de la sustancia química" comprende, pero sin limitarnos, estudiar la supervivencia celular, la viabilidad celular, la muerte celular, el estrés celular, la proliferación celular, la migración celular, la diferenciación celular, o estudios de desmielinización, mielinización o remielinización.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 . Identificación de POs de ratones adultos (60 días de edad) de la cepa CD-1 . Los POs se identificaron con una doble detección inmunocitoquímica contra A2B5 y Olig-2 (A-C) o contra NG2 y A2B5 (D-F). Barra de escala: 5 mieras.
Figura 2. Separación por FACS de POs de cerebro adulto de ratones transgénicos plp-GFP. Histogramas de las células sin marcar (A) y teñidas con un anticuerpo anti-A2B5 conjugado con ficoeritrina (PE, del inglés "phyeoeritrin') (B). Porcentajes relativos de las distintas poblaciones celulares (GFP7A2B5+, GFP7A2B5", GFP+/A2B5+) sin marcar (C) y teñidas con un anticuerpo anti-A2B5 conjugado con PE (D). Figura 3. Identificación de POs de corteza cerebral humana procedentes de márgenes de resección de tumores. Los POs se identificaron con una doble tinción inmunocitoquímica contra PDGFRa y NG2 (A-C), contra NG2 y A2B5 (D-F) y contra Olig-2 y A2B5 (G-l). Barra de escala: 10 mieras.
Figura 4. Identificación de POs de corteza cerebral humana obtenidos a partir de márgenes de resección de traumatismos. Los POs se identificaron con una doble tinción inmunocitoquímica contra PDGFRa y NG2 (A-C), contra NG2 y A2B5 (D-F) y contra Olig-2 y A2B5 (G-l). Barra de escala: 10 mieras.
Figura 5. Comparación de la eficiencia de nuestro protocolo entre diferentes estirpes de ratones (CD-1 , BL-6, plp-GFP). Los resultados se analizaron mediante el test de la t de Student utilizando como valores críticos *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001 .
Figura 6. Comparación de la eficiencia de la presente invención entre la estirpe de ratón que produjo la mayor cantidad de OPCs (CD-1 ) (A) y el resto de estirpes (B) con respecto a los dos tipos de biopsias (márgenes de resección de tumores y de traumatismos). En todos los casos, los resultados se analizaron mediante el test de la t de Student utilizando como valores críticos *P<0,05; **P<0,01 y ***P<0,001 .
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1 : Purificación de POs de corteza cerebral de ratón de 15 días, 2 meses o 6 meses de edad.
Los ratones de cepa CD1 fueron suministrados por Charles River Laboratories. Todo el trabajo se llevó a cabo según las Normativas Española (RD 1201/2005 (BOE 252/34367-91 , 2005)) y Europea (86/ 609/ EEC and 2003/65/EC) sobre manejo y uso animal. Un día antes del cultivo primario se recubren los frascos en los que se sembrarán las células con poli-ornitina a una concentración de 10 mg/l. Antes de sembrar las células se retira la poli-ornitina y se lavan los frascos para eliminar los restos. Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y/o asfixia con CO2 y los cerebros se extrajeron y se llevaron a una placa con solución salina con calcio y magnesio (HBSS del inglés "Hanks' Balanceó Salt Solution") en hielo.
Para retirar rápidamente las meninges y los plexos coroideos, los cerebros se incubaron en diferentes diluciones de una solución de papaína (SP, compuesta por: papaína 0,9 mg/ml, L-cisteína 0,2 mg/ml, EDTA 0,2 mg/ml en HBSS) a 37°C durante 5 minutos (ver Tabla 2). Los restos de meninges y plexos se terminaron de retirar con pinzas y con la ayuda de un microscopio estereoscópico. Una vez limpias, las cortezas cerebrales se llevaron a una nueva placa con HBSS en hielo.
Animales % relativo
Estadio 1a digestión 2a digestión POs obtenidos
/ frasco de POs
P0 3 SP 1 :10 5 min SP 1 : 10 5min 263.148±6.508 100
P15 5 SP 1 :5 5 min SP 1 :5 10 min 123.194±8.774 50
P60 5 SP 1 :5 5 min SP 1 :5 15 min 68.444±5.461 25
P180 5 SP 1 :5 5 min SP 1 :5 15 min 39.757±4.410 12 Tabla 2. Resumen de los tiempos de Incubación y las concentraciones enzlmáticas preferidas para cada estadio postnatal analizado y número total de POs obtenidos por animal y porcentaje relativo con respecto de la edad estándar: P0 (neonato). El tejido fue disociado mecánicamente con la ayuda de unas tijeras y se preincubó durante 5 minutos a 37°C. Los trozos de tejido se incubaron en diferentes diluciones de la solución de papaína arriba descrita pero en HBSS sin calcio ni magnesio. La dilución y el tiempo de incubación empleados para cada edad animal están detallados en la Tabla 2. La digestión enzimática se paró mediante la adición de medio con suero y DNasal (DMEM, del inglés "Dulbecco's Modified Eagle Médium", con 10% de suero fetal bovino y 1 % de DNasal).
Tras disociar mecánicamente el tejido mediante unos 25 pases de micropipeta, la suspensión celular se incubó, durante 5 minutos, a 37°C y posteriormente se centrifugó a 900 rpm, durante 10 minutos. El sobrenadante y los restos de mielina se eliminaron y las células se resuspendieron en medio con suero. La suspensión celular se filtró por una malla de 100 mieras y se sembró en un volumen final de 10 mi de medio de POs (DMEM con 10% de suero fetal bovino (SFB), 10 ng/ml de PDGFq y 1 % de penicilina y estreptomicina) por cada frasco de 75 cm2 de superficie, previamente recubierto con poli-ornitina, como está descrito arriba. La densidad celular de siembra depende de cada estadio. El número de animales necesarios para cada frasco se detalla la Tabla 2. Un día después se cambió la totalidad de medio para evitar la muerte celular en ejemplares maduros (P15) y adultos (P60, P180). En el caso de animales postnatales el medio se cambio dos días después. A partir de entonces, el medio se cambió cada dos o tres días. Un mes o 40 días después de la siembra se obtuvo una monocapa de astrocitos con POs sobre ella. Para purificar los POs, los frascos de cultivo se cerraron y se agitaron durante la noche, a 300 rpm y 37°C de temperatura. A la mañana siguiente se recogió el medio con los POs en suspensión y se filtró por una malla de 40 mieras, centrifugándose después la suspensión celular a 900 rpm durante 10 minutos. Las células se resuspendieron en medio de POs y se sembraron en placas petri durante 45 minutos a 37°C para eliminar las células de microglía, que se adhieren rápidamente al sustrato. Transcurrido este tiempo se recogió la suspensión celular, se volvió a filtrar con una malla de 40 mieras y se volvió a centrifugar como antes. Las células se resuspendieron y sembraron de nuevo en medio de POs y en placas petri durante otros 30 minutos a 37°C para retirar las células de microglía que pudieran quedar.
Este medio enriquecido en POs se recogió y centrifugó como se describe arriba. Las células fueron finalmente resuspendidas en medio BS (Bottenstein- Sato, para 10 mi de medio: 9,6 mi de DMEM, 100 microlitros de SFB, 100 microlitros de L-Glutamina 200mM, 100 microlitros de Penicilina/Estreptomicina, 60 microlitros de BSA al 5%, 10 microlitros de transferrina 100mg/ml, 1 ,86 microlitros de Insulina 50 mg/ml, 1 microlitro de Progesterona 0,62mg/ml, 1 microlitro de putrescina160 mg/ml, 1 microlitro de T3 3 mg/ml, 1 microlitro de T4 4 mg/ml, 1 microlitro de selenito sódico 0,39 ng/ml), contadas y sembradas de distinta forma para el estudio bien de proliferación, de migración o de diferenciación hacía oligodendrocitos maduros (Bribián y cois, 2006, Mol Cell Neurosci. 33(1 ):2-14; Merchán y cois., 2007, Mol Cell Neurosci. 36(3):355-68, Bribián y cois., 2008, Dev Neurobiol. 68(13): 1503- 16).
EJEMPLO 2: Purificación de POs de corteza cerebral de ratón de 2 meses de edad mediante FACS.
La separación celular por activación de fluorescencia se llevó a cabo con ratones transgénicos p/p-GFP (Spassky et al, 1998; Bribián et al, 2006, Merchán et al, 2007). Los animales se sacrificaron como en el ejemplo 1 y los cerebros se extrajeron de la misma manera. Las meninges y los plexos coroideos se retiraron como en el ejemplo 1 y las cortezas cerebrales se disecaron mecánicamente con el "Neural Tissue Dissociation Kit" de Miltenyi Biotec, según las instrucciones del fabricante.
Los restos de mielina se eliminaron mediante una filtración de la suspensión celular a través de una malla de 40 mieras seguida de una centrifugación en sacarosa (0,9 M) en HBSS en hielo.
Las células se tiñeron con anticuerpo anti-A2B5 conjugado con PE y se analizaron y separaron en un equipo FACSAria de BD. Las células se separaron en HBSS con 2% de suero fetal bovino, 25 mM HEPES y 5mM EDTA.
Como muestra la Figura 2, en el cerebro de ratones adultos (2 meses de edad) hay un porcentaje muy bajo (en torno al 2%) de células doble positivas para GFP (plp) y A2B5. Además, el proceso de separación provoca una muerte masiva de células, ya que sólo alrededor del 50% de las células analizadas sobreviven 24 horas después de la separación.
La purificación de POs de corteza cerebral de ratón de 2 meses de edad mediante FACS tiene un rendimiento final de 10.000 POs por cada animal utilizado.
EJEMPLO 3: Purificación de POs de corteza cerebral de ratón de 2 meses de edad mediante el "Oligodendrocyte Selection Kit" de HB.
Es importante puntualizar que este kit está descrito por el fabricante para la obtención de oligodendrocitos inmaduros con fenotipo O4+/GalC" a partir de cerebros de rata o ratón P3, es decir, de 3 días de edad, lo que anteriormente hemos llamado estadio perinatal. Los animales se sacrificaron como en el ejemplo 1 y los cerebros se extrajeron de la misma manera. Posteriormente, se siguieron las instrucciones del fabricante detalladas en el manual del usuario.
A pesar de haber introducido el paso de digestión enzimática de las meninges (ver arriba) para minimizar la muerte celular, este método ("Oligodendrocyte Selection K¡t") resultó casi 10 veces menos eficaz que el descrito en el Ejemplo 1 , con un rendimiento final de 7.500 POs por animal adulto.
EJEMPLO 4: Purificación de POs de nervio óptico de rata adulta mediante la técnica de inmuno-adsorción (del inglés, "immunopanning').
Este método está descrito en la solicitud de patente PCT/US1996/013279 y consiste en la purificación de los POs de nervio óptico de rata adulta a partir de una suspensión mixta de células del nervio óptico. Esta suspensión celular se pone en contacto primeramente con una placa donde previamente se ha absorbido un anticuerpo anti-Thyl , lo que permite la retirada de células de origen no glial. La suspensión celular se pone entonces en contacto con una segunda placa previamente adsorbida con anticuerpo anti-A2B5, anticuerpo anti-NG2 o con aglutinina de cacahuete, que va a permitir que sólo las células con estas proteínas en su superficie queden adsorbidas a la placa. Estas células serán en su mayoría POs aunque, en el caso de A2B5, podrán ser también precursores O-2A.
La eficiencia de este método es aproximadamente de 2.500 POs por cada animal (1 .250 POs por nervio óptico; WO/1997/007200; Shi y cois, 1998), lo cual es enormemente inferior (30 veces) a la del método de la invención (Tabla n
EJEMPLO 5: Purificación de POs de corteza cerebral humana a partir de biopsias (márgenes de resección en traumatismos y tumores). Para la obtención de POs humanos se siguió el protocolo descrito en el ejemplo 1 con las siguientes modificaciones: a. Para la siembra de cada frasco de 25 cm2 se empleó una cantidad de tejido de entre 1 y 4 gramos, encontrando los mejores resultados empleando 4 gramos. b. La digestión enzimática de las meninges y los plexos coroideos se realizó empleando la solución de papaína (SP) a una dilución de 1 :2,5, durante 10 minutos. c. El volumen de medio de POs fue de 5 mi por frasco de 25 cm2. d. La agitación para separar los POs se realizó a 250 rpm.
La eficiencia de este método es de 60.000 células POs por cada gramo de tejido fresco utilizado en el caso de márgenes de resección de tumores y de 15.000 células POs por cada gramo de tejido fresco procedente de márgenes de resección de traumatismos.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método de obtención de POs a partir de la corteza cerebral de un mamífero de edad superior a una semana, que comprende: a) obtener una muestra aislada de cerebro,
b) seleccionar las POs de la muestra biológica obtenida en (a) y
c) cultivar las POs en condiciones de proliferación, migración, movilidad o diferenciación celular.
2. El método según la reivindicación anterior donde el paso (b) comprende la digestión enzimática de la muestra obtenida según (a).
3. El método según la reivindicación 2 donde el paso (b) comprende: i. una primera digestión enzimática de la muestra obtenida según (a), ii. retirar las meninges y los plexos coroideos,
iii. disociar mecánicamente el tejido nervioso resultante del paso (ii), y iv. disociar enzimáticamente el tejido nervioso resultante del paso (iii).
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-3 donde la enzima empleada para la digestión enzimática del paso (b) es la papaína.
5. El método según la reivindicación 4 donde la concentración de papaína empleada en el paso (b) es de entre 50 y 200 microgramos/mililitro.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde la concentración de papaína empleada en el paso (i) es de entre 150 y 200 microgramos/mililitro.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, donde la concentración de papaína empleada en el paso (iv) es de entre 50 y 120 microgramos/mililitro.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde la concentración de papaína empleada en el paso (iv) es de entre 70 y 100 microgramos/mililitro.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-8, donde el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (b) es de entre 2 y 22 minutos.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, donde el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (i) es de entre 3 y 7 minutos.
1 1 . El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, donde el tiempo de la digestión enzimática empleada en el paso (iv) es de entre 8 y 18 minutos.
12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 , donde el paso (b) comprende una digestión enzimática con DNasa.
13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, donde el mamífero tiene más de dos semanas de edad.
14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, donde el mamífero tiene entre 15 días y 9 meses de edad.
15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, donde el mamífero tiene entre 15 días y 6 meses de edad.
16. POs obtenibles por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 15.
17. Una línea celular de POs obtenible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -15, o por la inmortalización celular mediante transfeccion génica de los POs de la reivindicación 16.
18. Método de descubrimiento de fármacos que comprende:
a. establecer un cultivo celular a partir de los POs, según la reivindicación 16, o una línea celular de POs, según la reivindicación 17,
b. administrar una sustancia química al cultivo o línea celular de (a), c. estudiar el efecto de la sustancia química de (b) en el cultivo celular de (a).
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