WO2013143508A2 - Método para la detección, recuperación, identificación y enumeración simultánea de microorganismos y dispositivos para su ejecución - Google Patents

Método para la detección, recuperación, identificación y enumeración simultánea de microorganismos y dispositivos para su ejecución Download PDF

Info

Publication number
WO2013143508A2
WO2013143508A2 PCT/CU2013/000002 CU2013000002W WO2013143508A2 WO 2013143508 A2 WO2013143508 A2 WO 2013143508A2 CU 2013000002 W CU2013000002 W CU 2013000002W WO 2013143508 A2 WO2013143508 A2 WO 2013143508A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzymatic
microorganisms
dimensional structure
solvent
structures
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/CU2013/000002
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2013143508A3 (es
Inventor
Claudio Rodríguez Martínez
Jesús Eduardo GONZÁLEZ RUIZ
Tamara LOBAINA RODRÍGUEZ
Raisa Zhurbenko
Ana Iris BRITO GONZÁLEZ
Mónica LÓPEZ HERNÁNDEZ
Javier ARAGÓN FERNÁNDEZ
Ivonne ALFONSO VALDÉS
Adelaida ORTEGA SURÍS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centro Nacional de Biopreparados
Centro Nacional de Investigaciones Cientificas
Original Assignee
Centro Nacional de Biopreparados
Centro Nacional de Investigaciones Cientificas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro Nacional de Biopreparados, Centro Nacional de Investigaciones Cientificas filed Critical Centro Nacional de Biopreparados
Priority to EP13767434.7A priority Critical patent/EP2837690B1/en
Priority to CA2883197A priority patent/CA2883197C/en
Priority to ES13767434.7T priority patent/ES2650453T3/es
Priority to MX2014011804A priority patent/MX2014011804A/es
Priority to BR112014024361-1A priority patent/BR112014024361B1/pt
Priority to RU2014143767A priority patent/RU2644683C2/ru
Priority to US14/389,568 priority patent/US20150148258A1/en
Publication of WO2013143508A2 publication Critical patent/WO2013143508A2/es
Publication of WO2013143508A3 publication Critical patent/WO2013143508A3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/21—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/245—Escherichia (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/315—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/38—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from Aspergillus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
    • G01N2333/40—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts from Candida

Definitions

  • the present invention relates to the field of microbiology and more specifically to the detection and identification of microorganisms in different environments and samples.
  • a significant number of conventional culture media and methods are known for the detection and identification of microorganisms, whose main or disadvantages consist of a prolonged period of incubation of the samples (minimum 18-24 h), cumbersome manipulation by using different means to isolate , enrich and identify bacteria and yeasts.
  • silicate nanoparticles have, on the other hand, been used to inhibit microbial growth (Composition comprising aluminum silicates and silver nanoparticles as bactericides. WIPO patent application WO / 20 1/128488).
  • the adhesion of the microorganisms depends on their concentration in the sample; at lower concentration, lower adhesion;
  • the latter are not specially selected for their ability to rapidly promote their growth, and therefore at low concentrations they are not detected. or its detection is late with respect to the needs of the diagnosis;
  • microorganisms such as yeasts, fungi, Gram positive and Gram negative bacteria, microbacteria and nanobacteria are not detected in unison;
  • the objective of the present invention is to provide a new method for the simultaneous detection, recovery, identification and enumeration of a plurality of microorganisms in different samples and the devices for their execution.
  • the novelty of the present invention is that:
  • clays or ceramics that naturally have bactericidal, fungicidal or bacteriostatic activity, such as zeolite, bentonite, kaolinite, among others, without the need for a chemical modification for the promotion of microbial growth, because this inhibitory effect caused by the natural presence in them of "Toxic" ions for microorganisms is eliminated thanks to the absorption or adsorption of nutrient mixtures that are specially designed for each type of sample and each three-dimensional structure. Previous applications of these clays have been aimed at the elimination of bacteria;
  • the use of a variety of natural or artificial clays or ceramics is combined in the same and single test method or in an individual or composite device, each providing different ions that selectively act as catalysts for specific enzymatic reactions of a species, genus or group of microorganisms and that, together with the nutrients and growth factors that provide the nutritional formulations chosen especially for promoting a short period of the lag phase and accelerating microbial growth and, unexpectedly made possible the detection, recovery, identification and / or enumeration of a plurality of microorganisms separately or within the same sample in a time as reduced as 60-90 min, previously not reached for the chromogenic or fluorogenic methods of microbial identification;
  • some microorganisms such as certain species of Pseudomonas showed characteristics that do not commonly show in certain media, for example, when using siliceous soil with the nutritive composition Pseudomonas developed fluorescence in just 120 min, when in the culture media tested containing this compound, fluorescence appears only after 18 h;
  • Ipomoea sweet potatoes tomato extract; papain hydrolyzate of beef heart tissue and bovine blood; enzymatic hydrolysates of whey cheese albumin; enzymatic hydrolysates or buttermilk casein acids and hydrolyzed or autolysed Eudrillus eugeniae with natural or artificial three-dimensional structures that unexpectedly shortened the period of the lag phase of microorganisms;
  • contaminants can be removed from the sample, such as suspended solids in waters that interfere with microbial identification and quantification;
  • an extremely versatile device is achieved which, in the form of a unit or several units combined, enables the detection, recovery, identification and / or counting of the most dissimilar microorganisms in different types of samples, from gaseous, liquid, solid , gels, zoles, with contamination levels from less than 1 CFU / sample unit to 10 9 CFU / sample unit, without interference from sample contaminants.
  • the advantages of the method and the device consist of:
  • the proposed method and devices achieve the detection of all microorganisms and / or their recovery, whether or not they adhere to the structure, unlike the solutions prior to the present invention, which do not guarantee that all microorganisms adhere to the Nanostructures nano (as an example E. coli 0157: H7), nor that all that adhere can be recovered in a reasonable time for future identification;
  • the present method is not essentially based, nor only, on the adhesion of viable microorganisms to the structures of the device, all microorganisms present in the sample are detected, even at low concentrations or from their spores, hyphae or other propagules , and this is achieved unlike the previous methods, in which the adhesion of the microorganisms depends on their concentration in the sample (at lower concentration, lower adhesion);
  • the method provided for in the present invention enables the detection, recovery, identification and / or enumeration, regardless of the original characteristics of the structures, their ions or their pH, unlike some of the patents already described, in which the Adhesion of microorganisms to the structures for concentration and subsequent identification is executed by the activity of the ions on the surfaces of the structures that interact with the microbial cells, so that if the sample carrying the microorganisms contains substances that interfere or trap these ions, or if their pH affects them, the correct detection, identification or timely quantification is not achieved;
  • the proposed invention does not require secondary identification steps, or concentration of the sample, or special aseptic conditions, nor necessarily equipment, and thus differs from the previous descriptions, which most of them require the separation of microorganisms from the structures for subsequent identification, which includes additional steps such as centrifugation, requires additional equipment (centrifuges) and exposes the recovered microorganisms to the environmental contamination or using centrifuges under aseptic conditions;
  • the new method is simple, low cost, identification is not delayed and does not require additional high-tech techniques, unlike other disclosed inventions that provide for one or more additional phases, require culture media independent of the structures to isolate microorganisms for subsequent identification by different methods, including immunoenzymes or other molecular techniques that delay identification, make it more expensive and technically complex;
  • the method is very stable for its execution, allowing each step to be executed with prolonged intervals of time between them in the cases that are required, as already mentioned, the nutritional formulations, when absorbed in the three-dimensional structures with nano- and micro- cavities and after removing the solvent, forming the devices are very stable to changes in temperature and humidity and therefore can be used safely for long periods of time.
  • This effect is due to the fact that the solids of the nutritional formulation have low humidity and the residual moisture is subjected to adsorption forces on the surfaces of the cavities that make up the device and therefore is not available for degradation reactions biochemical or biological, until the second solvent or sample is added;
  • the present invention describes a method with a limit of detection per unit of sample of nutritive compositions that are used very low (less than 1 CFU), which means that they can detect and recover microbial species at very low concentrations and the identification and / or enumeration is facilitated and unlike the procedures disclosed in the state of the art, it does not need large volumes of sample, nor high concentrations of inoculum;
  • microorganisms are detected in unison, such as yeasts, filamentous fungi, Gram positive and Gram negative bacteria, microbacteria and nanobacteria, an effect not previously achieved by other procedures;
  • natural clays that originally have bactericidal, fungicidal or bacteriostatic activities can be used to execute the method and form the devices, without the additional costs of purification or chemical modification for the promotion of microbial growth, thanks to its combination with other components described in the previous paragraph;
  • the method makes it possible to determine the sensitivity or resistance to antimicrobials in unison with their identification in a very short period of time and for any species, genus or group of microorganisms present in the sample, thanks to the combination of different three-dimensional structures, with different nutritional compositions, enzymatic markers and with the selected antimicrobials;
  • the new device is simple, low cost, easily prepared for manufacturing.
  • the nutritional components of the present invention are selected from mixtures of proteins, carbohydrates, vitamins and minerals degraded by chemical or enzymatic methods.
  • One or more of these nutrient mixtures stimulating microbial growth prepared in aqueous solutions or in solutions with salts in concentrations of 0.1 to 3 g / l are inoculated with 0.1 ml of the microorganism (s) possible to detect, recover, identify or enumerate at a concentration of 3 x 10 8 CFU / ml and incubate at temperature and tension of desired oxygen, measuring the microbial growth kinetics by any of the known methods, preferably determining the increase in optical density over time. That or those compositions are selected that guarantee a reduction of the lag phase of growth that does not exceed 60-120 min for the bacteria and 16 h for the yeasts and filamentous fungi.
  • Examples of the nutritional components are the enzymatic hydrolysates of algae Spirulina platensis described in the Certificate of Invention Author of Cuba 22310; Saccharomyces cerevisiae extract obtained by enzymatic hydrolysis as described in the Certificate of Invention Author of Cuba 22221 and enzymatic hydrolyzate of Torula forage yeast (Certificate of Invention Author of Cuba 22280); Ipomoea batatas extract, as disclosed in Cuba patent 23507; tomato extract (Certificate of Invention Author of Cuba 22308); Enzymatic hydrolysates of beef heart tissue (Certificate of Invention Author of Cuba 22442), of bovine blood (Certificate of Invention Author of Cuba 22208) and of beef liver (Certificate of Invention Author of Cuba 22220); Enzymatic hydrolysates of lactoalbumin obtained from cheese whey (Certificate of Invention Author of Cuba 22219), enzymatic hydrolysates or casein acids of
  • enzymatic hydrolysates such as peptones and triptonas or commercial extracts of algae proteins, microorganisms, plant parts, higher animal tissues and their combinations, as an example obtained from meat from meat beef, brain, potato, among others, in amounts of 1 to 10 g / l.
  • one or more chromogenic, fluorogenic or bioluminescent enzyme markers are added thereto in amounts of 0.01 to 2 g / l.
  • these markers can be: phenol-derived compounds, such as ortho- and para-nitrophenols, para-nitro-aniline, indolyl derivatives: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl, 5-bromo-6-chloro -3-indolyl (magenta), 6-chloro-3-indolyl (salmon), derivatives of methylcoumarin and methylumbelliferil (MUG) to detect activities galactosidase, glucuronidase, decarboxylase, glucosidase, phosphatase, among others.
  • phenol-derived compounds such as ortho- and para-nitrophenols, para-nitro-aniline
  • indolyl derivatives 5-bromo-4-chloro-3-indolyl, 5-bromo-6-chloro -3-indo
  • Other substances such as promoters or inhibitors of microorganisms belonging to certain genera, species or groups, can be added to the mixture of nutritional compositions and enzymatic markers.
  • these substances can be vitamins, mineral salts, albumin, antibiotics, dyes, dyes, bile salts, ox bile, sugars, amino acids.
  • Other substances that increase the solubility of the enzyme markers or the permeability of the cells of the microorganisms in amounts of 0.01 to 40 g / l can also be added.
  • the selected nutritional composition can also be added salts, resins, natural plant extracts, fatty acids, esters, bactericides, bacteriostats, alcohols, surface-active substances or mixtures thereof in amounts of 0.01 to 2 g / l and / or antibiotics or antifungals in amounts of 10 to 100 pg / l.
  • the selected nutritional composition, together with the enzyme markers and other components, is dissolved or dispersed in a first solvent in amounts of 1 to 150 g / l.
  • the solvent may be distilled or deionized water, aqueous salt solutions (NaCI, phosphate solutions, among others), alcohols and alcoholic solutions (eg 10% w / v basic fuchsin solution in ethyl alcohol), solutions of substances that increase the solubility of enzyme markers [example dimethylsulfoxide (DMSO)] or the permeability of the cells of microorganisms.
  • aqueous salt solutions NaCI, phosphate solutions, among others
  • alcohols and alcoholic solutions eg 10% w / v basic fuchsin solution in ethyl alcohol
  • solutions of substances that increase the solubility of enzyme markers example dimethylsulfoxide (DMSO)] or the permeability of the cells of microorganisms.
  • the nutrient mixture is formed and together with the enzymatic markers and other components dissolved or suspended in the first solvent, they can be sterilized by any of the known methods, except for those compositions containing thermolabile substances, which should not be heat sterilized.
  • the nutrient mixture is formed and together with the enzymatic markers and dissolved or suspended in the first solvent and other components, they are brought into contact with one or more three-dimensional structures of natural or artificial clays or ceramics or of other ceramics. These three-dimensional structures can be previously sterilized by any of the known methods.
  • the contact time of the nutritional composition and other components dissolved or suspended in the first solvent and the three-dimensional clay or ceramic structure varies, generally, from 10 min for smaller sizes of nanometh or submicron size ( ⁇ 1000 nm) to 60 min for larger structures.
  • These structures have a specific surface area of 2 x 10 3 to 6 x 0 8 m 2 / m 3 and are made up of a plurality of nano-, micro- and macrocavities or their combinations.
  • clays and / or natural or artificial ceramics are selected from kaolinite, halloisite, dickite, nacrite, chrysolite, antigorite, lizardite, vermiculite, mica, hectorite, saponite, hydrotalcite, muscovite, chlorite, diatomaceous earth, bentonites (montmorillonite, sauconite, beidellinite, nontrolite) clinoptilotites, hydroxyapatites, zeolites and calcium phosphates or combinations thereof.
  • the calcium phosphate structures mentioned in the previous paragraph are selected from: metaphosphate [Ca (P0 3 ) 2 ], mono-hydrated monocalcium phosphate [Ca (H 2 P0 4 ) 2 H 2 0], di-hydrogen tetracalcium phosphate ( Ca 4 H 2 P 6 0 2 o), heptacalcium phosphate [Ca 7 (P 5 0i 6 ) 2 ], calcium pyrophosphate (Ca 2 P 2 0 7 and Ca 2 P 2 0 7 2H 2 0), dicalcium phosphate [ CaHP0 4 , CaHP0 4 2H 2 0 and Ca (H 2 P0) 2 ], tricalcium [Ca 3 (P0) 2 ], octacalcium phosphate [Ca 8 H 2 (P0 4 ) 6 5H 2 0], calcium deficient hydroxyapatite [ Ca 10 - x (HP0 4 ) x (P0 4 ) 6-x (OH) 2 -x], hydroxy
  • Natural or artificial clays and / or ceramics and calcium phosphates may have isomorphic substitutions of ions for cations or previously functionalized with different ions, preferably monovalent, divalent, trivalent or tetravalent, which act as enzymatic catalysts, such as Na, K , Ca, Mg, P, Fe, Zn, forming surface layers or distributed throughout its structure.
  • the three-dimensional structures mentioned are selected from those whose cavity dimensions respond to:
  • nano-cavities or particles preferably of rough surfaces, with diameters or clearances of up to 200 nm for nano- and micro-bacteria; - nano- and submicrocavities with diameters or clearances from 5 nm to 1000 nm for bacteria of different sizes;
  • micro- and macro-cavities with diameters or clearances of more than 1 pm and up to 2 mm for bacteria, yeasts and filamentous fungi;
  • the cavities in the structure can be presented in the form of pores, channels, tubes, regular or irregular bags, of different geometric shapes or combinations thereof; or are arranged in the form of layers or sheets.
  • the three-dimensional structures can form a film or layer 5 nm to 1 mm thick especially when used for the detection, identification or enumeration of microorganisms by the membrane filtration technique or for the detection of microorganisms on surfaces; or a column up to 10 cm high, especially when it is required to filter large volumes of liquid or suspension of microorganisms that can be found at low concentrations, or when several areas of the structure with different enzymatic markers or with different nutritive mixtures are used .
  • the structures can also be used in the form of beads or beads with a diameter of 5 nm to 10 mm; hexagons or cubes in particular, forming part of a set of tests with different compositions, or they can be added to the liquid sample or suspension that contains the microorganisms.
  • the height of the structures varies according to the presentation format to be used in the method and ranges from 5 nm for nanoaliquots, or microaliquots, or for joining several structures in a set of sandwich layers, up to 10 cm high.
  • Three-dimensional structures can be presented in forms of fibers or networks that retain microorganisms and allow their detection. When it is desired that the structures detect and identify the microorganisms in the entire volume of a sample, those clays of great swelling capacity are used, until, naturally or by the addition of gelling agents, they take the form of the container containing it. .
  • the three-dimensional structures of the present invention may have different zones with different porosities and different diameters or gaps of the nano-, micro- and macro-cavities through their volume, or their length, or their diameter, distributing said zones in gradient shape or in differentiated areas.
  • compositions and enzymatic markers can be added in each zone, both through their structure, length or diameter, being distributed in this case in concentric areas.
  • the distribution of the compositions, or the concentration of one, or several of its components can be guaranteed in the form of a continuous or discontinuous gradient.
  • alginates such as sodium
  • natural polysaccharides such as pectin and chitin derivatives
  • gum arabic and other gums such as corn and sweet potato, or pre-gelatinized starches
  • dextran and carboxymethyl cellulose and other polymers derived therefrom carrageenan or sodium carrageenan
  • carrageenan or sodium carrageenan the agar
  • agarose and derived artificial polymers derivatives of vinyl alcohol, polybutylene, polyethylene and polypropylene
  • polyvinylpyrrolidone of different molecular weights in amounts of 0.01 to 0.5 g / g of three-dimensional structure.
  • substances that increase its absorption capacity such as activated carbon and cellulose in amounts of 2 to 4 mg / can be added g, for example in the form of sheets.
  • the first solvent is removed.
  • the most recommended procedure is at room temperature and atmospheric pressure with forced air circulation to preserve nutrients and prevent their degradation, as in the case of thermolabile vitamins.
  • the removal of the first solvent can also be carried out by subjecting the three-dimensional structure to drying at a temperature of 25 to 1 10 ° C at atmospheric pressure or at a pressure lower than atmospheric, for example in a vacuum oven, for a period of 30 min to 3 hours. eliminating it by sublimation, or by spray drying at a temperature of 90 to 180 ° C.
  • the structure After the removal of the first solvent, the structure can be preserved until testing for periods of up to 5 years. It is recommended to sterilize the structures with the embedded compositions, preferably, but not exclusively by irradiation of different nature. Other methods can be used, such as autoclaving, for those structures that do not contain thermolabile components.
  • the ability to recover the target microorganisms is checked by selecting those structures that have a detection limit of less than 1 CFU / 10 I for liquid samples, less than 1 CFU / 250 g for solid samples or less than 1 CFU / 10 m 3 air and a maximum limit of up to 10 9 CFU / ml or 10 9 CFU / g or 10 3 CFU / m 3 .
  • the three-dimensional structure can be placed on supports in the form of sheets, layers or cylinders permeable to gases or liquids or impervious to them; or surrounded by waterproof materials on at least 90% of its surface.
  • microbial cells that may be made up of a plurality of the microorganisms to be detected, recovered, identified and / or enumerated belonging to a species, a genus, a group or combinations thereof are contacted, and includes nanobacteria , bacteria, molds and yeasts and spores, hyphae or other propagules, with three-dimensional structures in the presence of a second solvent.
  • This second solvent can be water, a hypotonic, sotonic or hypertonic solution of salts, such as sodium chloride, or the sample itself depending on the nature of the microorganisms to be identified.
  • Examples may be biological samples such as blood or food, such as milk, or sample suspensions.
  • Another variant of the method consists in contacting a suspension of microorganisms in gaseous carriers, such as air or aerosols.
  • the sample is applied to the structure in the following proportions: 0.05 to 3 ml / g, or 0.1 to 10 m 3 / g of three-dimensional structure.
  • the second solvent or the samples containing them can be contacted with the surface of the three-dimensional structure or passing through it, or to a certain depth; the cells or samples containing it being in the form of a suspension in the gas phase or in the liquid phase, or in the form of a gel or with a semi-solid or solid consistency, applying it directly on the structure, or by means of an application device such as, for example , a swab, handle, needle, among others.
  • the samples or the second solvent that contains the microorganisms can be applied to several structures at the same time.
  • the three-dimensional structure is then maintained at temperatures of 20 to 50 ° C for a period coinciding with the longer duration of the lag phase or the end of the growth acceleration phase of the slower developing microorganism, with oxygen tension that can vary, from aerobic conditions, to the total absence of this element depending on the target microorganisms to be detected.
  • nanoparticles or cavities growth is appreciated by the activity of nanobacteria, and other bacteria indirectly by the products of the cleavage of enzymatic markers that can accumulate under the action of microbial enzymes.
  • microcavities smaller bacteria develop, in macrocavities larger bacteria, yeasts and filamentous fungi, and all microorganisms on the surface.
  • the detection and identification of the plurality of cells is executed primarily, but not exclusively by the visual or automatic detection of fluorescence or bioluminescence.
  • other methods can be used, such as: by changing the color of the three-dimensional structure or its consistency, texture, brilliance, opacity, hue, homogeneity, or transparency; or by changes in color, brilliance, hue, transparency, or fluorescence of the second solvent or sample; or by the appearance of bioluminescence, both inside the cavities, and on the surface of the structure; or by the observation of other morphological structures; or metabolic reactions in the three-dimensional structure, in the second solvent or in the sample; or by a combination of several, or all forms of identification.
  • the determination of the concentration of cells in the sample is carried out on the surface of sheets or layers of the structure, or it can be executed by visual enumeration, or by automatic methods on the surface, or by measuring the intensity of the signal Fluorogenic, colorimetric or bioluminescent, under light in the range of the ultraviolet, visible or infrared spectrum, of electrical, thermal, magnetic signals, by changing the pH, or by quantifying the emission or consumption of gases derived from the activity of the microorganisms during the lag phase or the growth acceleration period, such as carbon dioxide, oxygen, hydrogen sulfide, ammonium, hydrogen.
  • the method can be executed with the help of devices formed by a nutritious mixture stimulating microbial growth, selected from the enzymatic hydrolysates of algae Spirulina platensis; enzymatic hydrolyzate of Saccharomyces cerevis ⁇ ae and Torula; Ipomoea batatas extract; tomato extract; enzymatic hydrolyzate of heart and liver liver tissue and bovine blood; enzymatic hydrolysates of lactoalbumin obtained from cheese whey, enzymatic hydrolysates or casein acids from butter whey and hydrolyzed or autolysed from Eudrillus eugeniae and their combinations and one or more chromogenic, fluorogenic or bioluminescent enzyme markers absorbed and / or adsorbed in a three-dimensional structure of clays or natural or artificial ceramics, selected from kaolinite, halloisite, dickite, nacrite, chrysolite, antigorite, lizardite, vermiculite, mica,
  • the devices of the present invention contain all the components necessary for the execution of the method and said components are in dehydrated form in amounts that guarantee the concentrations of each of them as described in the original method.
  • These devices may consist of calcium phosphates selected from metaphosphate [Ca (P03) 2], monohydric monocalcium phosphate [Ca (H 2 P0 4 ) 2 H 2 0], di-hydrogen tetracalcium phosphate (Ca 4 H 2 P60 2 o), heptacalcium phosphate [Ca 7 (P 5 0 16 ) 2 ], calcium pyrophosphate (Ca 2 P 2 07 and Ca 2 P 2 0 7 2H 2 0), dicalcium phosphate [CaHP0 4 , CaHP0 4 -2H 2 0 and Ca (H 2 P0 4 ) 2 ], tricalcium [Ca 3 (P0 4 ) 2 ], octacalcium phosphate [Ca 8 H 2 (P0 4 ) 6 5H 2 0], calcium deficient hydroxyapatite [Ca 10 -x (HPO 4 ) x (PO 4 ) 6 -x (OH) 2 -x], hydroxyapatit
  • Some devices may consist of natural or artificial clays, ceramics and other calcium phosphates with isomorphic ion substitutions or be functionalized by ions or monovalent, divalent, trivalent or tetravalent cations, forming surface layers or distributed throughout their structure. These cations can be Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Zn and essentially play a role as catalysts for the enzymatic reaction of marker degradation.
  • the three-dimensional structures of these devices have cavities in the form of pores, channels, tubes, regular or irregular bags, of different geometric shapes or combinations thereof; or they are arranged in the form of layers or sheets, depending on the type of clay or ceramic used and their obtaining technology, these cavities are classified to direct their use in the method as: - nano-cavities or particles, preferably of rough surfaces, with diameters or clearances of up to 200 nm for nano- and micro-bacteria;
  • micro- and macro-cavities with diameters or clearances of more than 1 pm and up to 2 mm for bacteria, yeasts and filamentous fungi;
  • These devices contain one or several nutritional compositions, whose components are selected from mixtures of proteins, carbohydrates, vitamins and minerals degraded by chemical or enzymatic methods that ensure that the lag phase period does not exceed 60-120 min for bacteria and 16 h for yeasts and filamentous fungi in amounts of 0.33 to 20 mg / g of three-dimensional structure.
  • the devices also contain one or more chromogenic, fluorogenic or bioluminescent enzyme markers within the cavities or on the surface of the structures in amounts of 0.0033 to 0.66 mg / g of three-dimensional structure.
  • the devices may contain pH and redox potential indicators.
  • enzymatic hydrolysates chemical hydrolysates or algae protein extracts, microorganisms, plant parts, higher animal tissues and their combinations in amounts of 0.33 to 4
  • enzymatic hydrolysates chemical hydrolysates or algae protein extracts, microorganisms, plant parts, higher animal tissues and their combinations in amounts of 0.33 to 4
  • bacteriological peptone, tryptone, meat extract, brain extract, heart extract, potato extract, corn extract, rice extract, soy peptone, yeast extract can be mentioned.
  • the devices may contain other substances such as growth promoters, inhibitors, salts, buffers, carbohydrates and other components to promote the growth of microorganisms belonging to certain genera, species or groups in amounts of 0.003 to 14 mg / g.
  • growth promoters such as growth promoters, inhibitors, salts, buffers, carbohydrates and other components to promote the growth of microorganisms belonging to certain genera, species or groups in amounts of 0.003 to 14 mg / g.
  • the components that are inside the cavities or on the surface of the devices are found in amounts of 0.33 to 60 mg / g of the three-dimensional structure.
  • the devices of the present invention have detection limits of less than 1 CFU / 10 I for liquid samples, less than 1 CFU / 250 g for solid samples or less than 1 CFU / 10 m 3 and a maximum limit of up to 10 9 CFU / ml or 10 9 CFU / g or 10 3 CFU / m 3 .
  • Those devices that are used to selectively detect, recover, identify or enumerate certain microorganisms within a sample contain selective agents of microbial growth, selected from the salts (eg bile salts, sodium deoxycholate), others such as resins, natural plant extracts , fatty acids, esters, bactericides, bacteriostatics, alcohols, substances with surface activity or mixtures thereof in amounts of 0.0033 to 0.8 mg / g of the three-dimensional structures of clays or ceramics and antibiotics (eg vancomycin, nalidixic acid ), antifungals (eg nystatin, ketoconazole, amphotericin B), in amounts of 0.033 to 0.33 pg / g.
  • antibiotics eg vancomycin, nalidixic acid
  • antifungals eg nystatin, ketoconazole, amphotericin B
  • Those devices that are used by passing aqueous samples through their three-dimensional structure, and that have very water-soluble components, may contain substances that help fix the nutritive composition and enzymatic markers to the three-dimensional structures, including alginates (for example sodium or calcium), natural polysaccharides; pectin, chitin, gum arabic and other gums, starches such as pregelatinized corn, dextran and carboxymethyl cellulose and other polymers derived therefrom; carrageenan, agar, agarose and artificial polymers derived from vinyl alcohol, polybutylene, polyethylene and polypropylene, polyvinyl pyrrolidone in amounts of 0.01 to 0.5 g / g three-dimensional structure.
  • alginates for example sodium or calcium
  • natural polysaccharides for example sodium or calcium
  • pectin, chitin, gum arabic and other gums starches such as pregelatinized corn, dextran and carboxymethyl cellulose and other polymers derived therefrom
  • Other compounds may be part of the devices, such as substances that increase their absorption capacity, such as activated carbon and cellulose in the amount of 2 to 4 mg / g that is used to form devices whose structures have specific surfaces. of less than 3 x 10 m 2 / m 3 .
  • a device can be formed by a three-dimensional structure or by a set of structures.
  • Each three-dimensional structure can form a film or layer 5 nm to 1 mm thick; or a column up to 10 cm high; or particles of different geometric shapes, such as spheres, pearls, hexagons, cubes, with a diameter of 5 nm to 10 mm; or cylinders or tubes 5 nm to 10 cm in diameter and 5 nm to 10 cm in height; or fibers, nets, or take the shape of the container that contains it.
  • the structure of the device may increase in size and volume due to the "swelling" by absorbing the sample containing the microorganisms, or the second solvent containing the microorganisms and occupying the entire volume of the container containing them.
  • They can be devices made from hydroxyapatite, agar and pre-gelatinized corn starch.
  • a device may have a three-dimensional structure that has different zones with different porosities and different diameters or gaps of the nano-, micro- and macro-cavities through its volume, or its length, or its diameter, said zones being distributed in gradient shape or in differentiated areas.
  • Each device in its unique three-dimensional structure contains one or several different nutritive compositions and enzymatic markers through its volume, length or diameter, distributing said compositions in the form of a gradient or in differentiated areas.
  • the devices can maintain the three-dimensional structure on supports in the form of sheets, layers or cylinders permeable to gases or liquids or impervious to them; or surrounded by waterproof materials on at least 90% of its surface.
  • a mixture of them was also formed in the following amounts: papainic hydrolyzate of heart muscle in the amount of 1 g / l deionized water, Saccharomyces cerevisiae yeast extract in the amount of 1 g / l, Enzymatic casein hydrolyzate in the amount of 2 g / l and 1 g / l of pancreatic heart hydrolyzate.
  • the products to be tested were inoculated with 0.1 ml of a suspension of the target microorganisms at a concentration of 3 x 10 8 CFU / ml.
  • the bases were incubated separately and the mixture for 8 h at 37 ° C in an aerobic atmosphere and the increase in optical density was monitored in a 680 nm spectrophotometer.
  • the nutritive mixture showed a reduction of the lag phase of E. coli growth in 30 min, while the individual bases showed a duration of that variable phase, including: papainic hydrolyzate of heart muscle - 45 min , Saccharomyces cerevisiae yeast extract - 80 min, enzymatic casein hydrolyzate 60 min and pancreatic heart hydrolyzate - 50 min.
  • the mixture of nutritional components was selected, which will be identified hereinafter as CCL, and dissolved in 1 I of deionized water as the first solvent in the amount of 5 g / l (variant 1) and in the amount of 10 g / l (variant 2)
  • pancreatic hydrolyzate of heart muscle was incorporated in the amount of 1 g / l (variant 1) and 2 g / l (variant 2), resulting in nutrient concentrations, as expressed in 5 g / l and 10 g / l, respectively.
  • composition was prepared, two enzymatic markers, one chromogenic [2-nitrophenyl-pD-galactopyranoside (Ci 2 H 15 N0 6 )], were added in amounts of 0.5 g / l (variant 1) and 1 g / l (vanant 2) and other fluorogenic [4-methylumbelliferyl- -D-glucuronide (Ci 6 H 16 0 9 -2H 2 0)] in amounts of 0.075 g / l (variant 1) and 0.15 g / l (variant 2).
  • the nutritional compositions and enzymatic markers were added other substances, such as growth promoters, specifically lactose (5 and 10 g / l), sorbitol (0.5 and 1 g / l), L-tryptophan (1 and 2 g / l); inorganic salts, specifically monobasic potassium phosphate (2.75 and 5.5 g / l), dibasic potassium phosphate (2.75 and 5.5 g / l) and sodium chloride (5 and 10 g / l); Finally, bile salts were incorporated in a concentration of 1.3 to 2.6 g / l.
  • growth promoters specifically lactose (5 and 10 g / l), sorbitol (0.5 and 1 g / l), L-tryptophan (1 and 2 g / l); inorganic salts, specifically monobasic potassium phosphate (2.75 and 5.5 g / l), dibasic potassium phosphate (2.75 and 5.5 g /
  • the selected nutritional composition, together with the enzymatic markers and other components were dissolved in the first solvent in amounts of 23.9 g / l for variant 1 and 47.8 g / l for vanant 2. Once the nutrient mixture was formed and together with the enzyme markers and other components dissolved in the first solvent, they were sterilized by filtration.
  • the nutritive mixtures together with the enzyme markers and other components dissolved in the first solvent were contacted with two three-dimensional ceramic structures specifically the previously sterilized hydroxyapatite at 180 ° C for 60 min.
  • the contact time of the compositions of variant 1 (V1) and variant 2 (V2) was 60 min.
  • the three-dimensional structures mentioned had dimensions of the cavities corresponding to combinations of all the diameters or clearances of the cavities corresponding to nano-microcavities with diameters or clearances of 5 nm to 600 pm in the form of pores. These structures had a cylinder shape of 0.5 cm in diameter and 0.5 cm in height.
  • the first solvent was removed by subjecting the three-dimensional structures to drying at a temperature of 60 ° C in a vacuum oven, for a period of 3 h.
  • a suspension of E. coli in isotonic saline solution was contacted in a concentration of 3 x 10 6 CFU / ml with 0.1 g of the three-dimensional structures in amounts of 0.2 ml (2 ml / g ratio).
  • the three-dimensional structures were then maintained at temperatures of 35 ⁇ 2 ° C, under aerobic conditions for a period of 2 h coinciding with the duration of the lag phase of E. coli growth.
  • V3 - Hydroxyapatite beads with a total weight of 0.2 g, with a specific surface area of 2 x 10 3 m 2 / m 3 , impregnated with the nutritional composition according to V2 of example 1.
  • V4 - Hydroxyapatite beads with a total weight of 0.2 g, with a specific surface area of 3000 m 2 / m 3 , impregnated with the nutritional composition according to V2 of example 1.
  • the structures were absorbed for 2 h with the nutritional compositions and dried under vacuum for 2 h at 60 ° C.
  • V7 Cellulose discs without clays with 6 mm diameter, 0.94 cm 2 of surface and 0.014 g, impregnated with the nutritional composition according to V1 of example 1.
  • the ceramics were embedded in the nutritional composition for 3 h and the first solvent was removed at a temperature of 70 ° C.
  • the papainic hydrolyzate of heart muscle was taken for the bacterial growth promotion test, according to Cuban Invention Author Certificate No. 22442 in an amount of 0.2 g / l deionized water.
  • the base was incubated for 8 h at 37 ° C in an aerobic atmosphere and the increase in optical density was monitored in a 680 nm spectrophotometer.
  • the nutritional base showed a reduction of the lag phase of Enterococcus growth in 120 min.
  • this hydrolyzate was selected and dissolved in 1 I of deionized water as the first solvent in the amount of (10 g / l equivalent to 10 mg / g of structure) and it was added salts to regulate the possible change of pH caused by the three-dimensional structure in specific dipotassium phosphate (3.5 g / l, equivalent to 8.75 mg / g structure), monopotassium phosphate (1.5 g / l, equivalent to 3.75 mg / g structure) and sodium chloride (5 g / l, equivalent to 12.5 mg / g structure), which makes a total nutrient mixture of 50 mg / g). To the structure was added as fluorogenic marker methylumbelliferyl ⁇ -glucoside in the amount of 0.075 g / l, equivalent to 0.1875 mg / g of three-dimensional clay structure.
  • the components were previously sterilized in autoclave at 121 ° C for 15 min.
  • the presence of Enterococcus was observed by blue fluorescence at 120 min.
  • the papain hydrolyzate of heart muscle was taken for the bacterial growth promotion test (Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus avium ATCC 19434, Enterococcus avium ATCC 14025), according to Cuban Invention Author Certificate No. 22442 in quantity of 0.2 g / l desion / zada water.
  • the bases were incubated for 8 h at 37 ° C in an aerobic atmosphere and the increase in optical density was monitored in a spectrophotometer at 680 nm.
  • the nutritional bases showed a reduction of the lag phase of growth of 2 h.
  • concentrations of each component to be embedded in the structures were doubled.
  • a color change was observed in the second solvent, slightly blue, with respect to the original that was greenish for both devices with three-dimensional clay structures for E. avium.
  • variant 1 1 (V 1 1) with the specific surface area of 2 x 10 3 m 2 / m 3
  • variant 12 (V12) with the specific surface area of 3.3 x 10 3 m 2 / m 3
  • variant 13 with the specific surface area of 1.5 x 10 3 m 2 / m 3 .
  • the contact time of the compositions of the variants was 180 min.
  • the first solvent was removed by subjecting the three-dimensional structures to drying at a temperature of 60 ° C in a vacuum oven, for a period of 60 min.
  • a suspension of E. coli in isotonic saline solution was contacted in a concentration of 1 colony in 5 ml and from it 0.1 ml was taken and applied on the surface of the device.
  • V14 - Compacted caolinite in conglomerates with a total weight of 0.2 g, impregnated with the nutritional composition according to V2 of example 1.
  • the spaces between the kaolinite particles form cavities of different shapes, corresponding in size to microcavities.
  • the structures are absorbed for 4 h with the nutritional compositions and dried under vacuum for 3 h at 60 ° C.
  • a suspension of E. coli in isotonic sodium phosphate solution is contacted in a concentration of 10 6 CFU / ml with 0.1 g of the three-dimensional structures in amounts of 0.2 ml (2 ml / g ratio).
  • E. coli strain ATCC 25922 is tested as described in example 1, and is formed according to the V2 of that example, and a nutritional composition is made as described in that variant 2 of example 1, except that it is only add the 4-methylumbelliferyl-pD-glucuronide (MUG) fluorogenic substrate in an amount of 0.2 g / l.
  • MUG 4-methylumbelliferyl-pD-glucuronide
  • the nutrient mixture together with the enzyme marker and other components dissolved in the first solvent are brought into contact with three three-dimensional structures.
  • the first structure of an artificial ceramic nature is composed of a nano-layer of hydroxyapatite with nanoporosity, a specific surface area of 50 x 10 6 m 2 / m 3 and with nanocavities, 20 nm in height that, rests on a lower layer of Agaropectin in the amount of 0.5 g / g.
  • the structure rests on the entire surface of an impermeable disk of cellulose derivatives, specifically 6 cm diameter cellulose nitrate to form a first device (variant 16).
  • the second structure but of siliceous earth with a specific surface area of 3 x 10 5 m 2 / m 3 at 1 x 10 6 m 2 / m 3 and porosity in the range of nano- and microcavities is mixed with the ingredients of the nutritional composition and with the addition of agar (0.3 g / g) dissolved in the first solvent.
  • the second device It is prepared by placing the siliceous earth structure described in a cylinder 3 mm high by 90 mm in diameter (variant 17).
  • the third three-dimensional structure composed of hydroxyapatite with a specific surface area of at least 1.25 x 10 3 m 2 / m 3 with irregular macro- and microcavities, followed by a three-dimensional zeolite structure with a specific surface area greater than 5 x 0 3 m 2 / m 3 .
  • the nutritive compositions of example 1, variant 2 and the fluorogenic substrate described in that variant are absorbed in the first and second structures.
  • the height of the set of three-dimensional structures reaches 10 cm and the diameter of 4 cm.
  • a suspension of E. coli in isotonic saline solution is contacted in a concentration of 10 2 CFU / ml with the entire surface of the first device (V16) with the help of a sodium alginate swab.
  • the three-dimensional structure is then maintained at temperatures of 35 ⁇ 2 ° C, under aerobic conditions for a period of 120 min and the growth is detected by the emission of fluorescence under light at 366 nm with the help of a sensor and is identified by the glucuronidase activity
  • the E. coli suspension in isotonic saline solution is contacted at a concentration of 10 CFU / ml with the entire surface of the second device (V17) with the help of an automatic pipette and distributed with a Drigalski spatula.
  • the three-dimensional structure is then maintained at temperatures of 35 ⁇ 2 ° C, under aerobic conditions for a period of 240 min and the growth is detected by the emission of fluorescence under light at 366 nm with the help of a sensor and is identified by the glucuronidase activity
  • the supports selected were HAP-S ceramics (specific surface area of 7.5 x 10 3 m 2 / m 3 ) and HAP-56 (specific surface area of 3 x 10 5 m 2 / m 3 ), in addition to calcined siliceous earth and purified (TSC) (specific surface area of 5.3 x 10 4 m 2 / m 3 ).
  • a nutrient mixture was prepared, with fluorogenic and chromogenic markers and other components according to V1 of Example 1.
  • Another mixture of a fluorogenic compound was prepared in parallel with salts and other components according to the following composition: ammonium sulfate [(NH 4 ) 2 S0 4 ] 5.0 g / l of the first solvent; potassium hydrogen phosphate [K 2 HP0 4 ] 0.45 g / l; potassium di-hydrogen phosphate [KH 2 P0] 0.31 g / l; sodium hydrogen phosphate [Na 2 HP0] 0.92 g / l; sodium chloride [NaCI] 0.1 g / l; calcium chloride [CaCI 2 ] 0.05 g / l; magnesium sulfate heptahydrate [MgS0 4 .7H 2 0] 0.2 g / l; L-histidine monohydrochloride 0.005 g / l; L-tryptophan 0.02
  • compositions were adjusted to 6.8 pH and sterilized by filtration through Nalgene disposable filtration units (0.2 ⁇ , pore size) (Nalge Co., Rochester, N.Y.).
  • microbial suspensions of approximately 10 8 CFU / ml were prepared in 9 ml of a 0.85% sterile saline solution (w / w), from pure cultures of Escherichia coli ATCC 25922 incubated up to 24 h.
  • the inoculum volume was 0.2 ml for each test variant, guaranteeing an inoculum concentration of 2 x 10 7 .
  • the inoculated devices were incubated at 35 ⁇ 2 ° C under aerobic conditions.
  • the reading was done visually using a 366 nm UV lamp every 30 min.
  • This indicator demonstrates that the microbial species possesses an enzymatic activity in correspondence with the enzymatic marker used in the compositions.
  • each nutritional composition combined with a three-dimensional clay structure responds in a shorter or longer period to the detection or identification of microorganisms.
  • the selection of the nutritional components was also carried out according to the methodology of example 1, but with a strain of Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
  • Individual and mixed enzyme hydrolysates were evaluated, including papainic hydrolyzate of beef heart tissue, according to Certificate of Invention Author of Cuba 22442, and pancreatic hydrolyzate of heart muscle and mixtures thereof.
  • the results showed that for the 3 cases the lag phase had a maximum duration of 120 min, so both were selected to form the nutritional composition.
  • the first mixture (M1) contained: Saccharomyces cerevisiae extract - 3.24 g / l; enzymatic hydrolyzate of bovine blood - 6.37 g / l; enzymatic casein hydrolyzate - 9.97 g / l; commercial soy peptone - 3.24 g / l and commercial meat extract - 2.43 g / l.
  • the second mixture (M2) contained: Saccharomyces cerevisiae extract - 5.0 g / l; enzymatic hydrolyzate of bovine blood - 5.0 g / l; enzymatic casein hydrolyzate - 5.0 g / l; commercial soy peptone - 6.0 g / l and commercial meat extract - 3.0 g / l.
  • the third mixture (M3) contained: Saccharomyces cerevisiae extract - 6.0 g / l; enzymatic bovine blood hydrolyzate - 6.0 g / l; enzymatic hydrolyzate of casein - 3.0 g / l; commercial soy peptone - 6.0 g / l and commercial meat extract - 4.0 g / l.
  • the products to be tested were inoculated with 0.1 ml of a suspension of the target microorganisms at a concentration of 3 x 10 8 CFU / ml.
  • the bases were incubated separately and the mixture for 8 h at 37 ° C in an aerobic atmosphere and the increase in optical density was monitored in a 680 nm spectrophotometer.
  • STR-STAP - nutritional composition
  • STR-STAP enzymatic casein hydrolyzate according to the Certificate of Invention Author of Cuba 22166 (3.0 g / l), Saccharomyces cerevisiae yeast extract according to
  • thallium acetate 0.014 g / l
  • nalidixic acid sodium salt 0.008 g / l
  • DL-phenylalanine 1.0 g / l
  • ammonium ferric citrate 0.5 g / l
  • sodium chloride 0.2 g /
  • dextrose 0.1 g / l
  • 0.2 g / l MU-fos was added as a fluorogenic marker
  • compositions were dissolved in proportion with a first solvent (deionized water) and their pH adjusted to 7.3. They were sterilized by filtration through 0.2 pm disposable filtration units.
  • a first solvent deionized water
  • the target species Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Streptococcus pyogenes ATCC 19615 were selected.
  • the preparation of the dilutions, their inoculation and incubation was carried out as in example 10.
  • Variant 25 allowed the detection of microorganisms of very high nutritional requirement, such as S. aureus in only 5 h and for S. pyogenes it was achieved in 24 h.
  • the inoculum used was 0.2 ml of the sample for each variant.
  • sample was evaluated by the traditional procedure using the CromoCen CC agarized media and bromothymol lactose blue agar (ABL).
  • the CCL combination with HAP-56 was the variant that responded most quickly 2 h with 30 min, followed by the combination with the HAP-S structure that was in 3 h.
  • This result indicates that E. coli is the germ that causes the infection, taking into account the selectivity of the nutritional composition and the device and that in the majority of cases registered in this type of samples it responds to this species.
  • a pure culture of E. coli was used, from which a suspension of the order of 10 8 CFU / ml was prepared.
  • a volume of 0.2 and 0.4 ml was taken, achieving inoculums to be applied in structures of the order of up to 0 7 and inoculated in parallel in both devices: CCL with HAP-S (V35) and MUG with HAP-S (V36).
  • the variants were incubated at 35 ° C and the fluorescence response was observed every 30 min using 366 nm UV.
  • the following table shows the results of the positive fluorescence response time (h: min), as an indicator of the microbial enzymatic activity on the marker used.
  • the results show that there is no significant influence of the pH of the composition on the detection of the enzymatic activity of the microorganism (E. coli) with the selected enzyme marker (MUG).
  • the positive response was detected in the period between 1 h and 30 min at 2 h of culture.
  • the reduction of the duration of the lag phase was studied with the vegetable extract of Ipomoea sweet potatoes previously developed by the authors of the present invention, the enzymatic hydrolyzate of casein, soy peptone, a mixture of peptones and enzymatic yeast hydrolyzate, all in amounts of 0.2 g / l.
  • the optical density was monitored every 1 h in a 380 nm spectrophotometer. As a result, it was observed that for C. albicans, the extract of Ipomoea batatas shortened the lag phase by at least 1 h with respect to the other components, soaking only at 16 h.
  • the first experimental variants were prepared using the MU-fos fluorogenic substrate as the first enzyme marker.
  • the substrate was added in an amount of 0.2 g to the CND composition consisting of: Ipomoea batatas extract 20.0 g; yeast extract Saccharomyces cerevisiae 10.0 g; 1.0 g monopotassium phosphate; magnesium sulfate 0.5 g; 0.5 g sodium deoxycholate and 0.03 g nalidixic acid, for one liter of deionized water.
  • the other composition used was the MCS medium, to which MU-fos was added in the same amount (0.2 g / l).
  • the nutritional compositions prepared with the enzyme markers and other ingredients prepared for each experimental variant were dissolved in proportion with a liter of deionized water as the first solvent and the pH was adjusted to 6.6. They were sterilized by filtration through 0.2 pm disposable filtration units.
  • the microbiological evaluation was performed with the reference strains: Candida albicans ATCC 10231, Candida parapsilosis ATCC 22019 and Candida giabrata ATCC 15126, freshly grown on Sabouraud dextrose agar for 36 h. From these cultures, suspensions were prepared in 9 ml tubes of a 0.85% sterile saline solution (w / w), until reaching a microbial density of the order of 10 8 CFU / ml.
  • a volume of 0.2 ml was inoculated to each variant of the devices according to the method and incubated at 35 ° C. Using the 366 nm UV lamp, the fluorescent response was read every 30 min.
  • the TSC clay somehow blocks the response of either the enzymatic activity of the test microorganisms or that of the specific fluorogenic substrate, since the biological functionality of the nano- is not appreciated during the entire culture period. compound.
  • the response obtained by using this enzymatic marker (MU-fos) as part of the nutritional compositions is closely linked to the structure used as a nanostructured support, with Z being the most convenient among all variants.
  • V52 - zeolite cubes with a total weight of 0.2 g, with a specific surface area of 7.0 x 10 3 m 2 / m 3 , impregnated with the nutritional composition according to V44 of example 15.
  • the structures were absorbed for 1 h with the nutritional compositions and dried under vacuum for 3 h at 60 ° C.
  • the fluorescence of E. coli is observed at 180 min at V50 and 210 min at V51 and that of C. albicans at V52 at 18 h.
  • the bases are incubated separately and the mixture for 8 h at 37 ° C in an aerobic atmosphere and the increase in optical density is monitored in a spectrophotometer at 680 nm.
  • the nutritive mixture shows a reduction of the lag phase of growth of all microorganisms of 90 min, with the exception of Aspergillus while the individual bases show a duration of that variable phase, and in some cases greater than 2 h, so the mixture is selected for the experiments.
  • This mixture is dissolved in a saline solution (NaCI at 9.5 g / l) in an amount of 10 g / l.
  • the nutritional composition is prepared, several enzymatic markers are added to it, one chromogenic [2-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (C12H-15NO6)], in amounts of 1 g / l and three fluorogenic (4-methambelliferyl ⁇ -D- glucuronide, 4-methylmbelliferyl-pD-galactoside and 4-methylumbelliferyl-pD-glucoside) in amounts of 0.2 g / l each.
  • C12H-15NO6 2-nitrophenyl- -D-galactopyranoside
  • fluorogenic 4-methambelliferyl ⁇ -D-galactoside
  • 4-methylmbelliferyl-pD-galactoside 4-methylumbelliferyl-pD-glucoside
  • Other substances such as growth promoters, specifically glucose (10 g / l) were added to the mixtures of the nutritive compositions and enzymatic markers; inorganic salts, specifically monobasic potassium phosphate (5.5 g / l) and dibasic potassium phosphate (5.5 g / l).
  • the selected nutritional composition, together with the enzymatic markers and other components are dissolved in the first solvent in amounts of 32.6 g / l.
  • the nutritive mixtures together with the enzyme markers and other components dissolved in the first solvent are brought into contact with one and several three-dimensional structures of artificial ceramics, specifically the calcined hydroxyapatite and previously sterilized at 180 ° C for 60 min.
  • the contact time of the composition is 30 min.
  • This structure has a specific surface area of 5 x 10 3 m 2 / m 3 and is made up of a plurality of nano, micro- and macrocavities.
  • the three-dimensional structure presents dimensions of the cavities corresponding to combinations of all the diameters or clearances of the cavities corresponding to nano-semimicro- and microcavities with diameters or clearances of 5 nm to 10 pm in the form of pores.
  • These structures have a cylinder shape 100 cm in diameter and 2 cm high.
  • the first solvent is removed by subjecting the three-dimensional structures to drying at a temperature of 60 ° C in a vacuum oven, for a period of 3 h.
  • the ability to recover the target microorganisms is checked, demonstrating that the structures have detection limits of less than 1 CFU / 100 ml by filtering 1 I of an artificially inoculated E. coli suspension to a concentration of 6 CFU, that is per 100 milliliters. They have 0.6 CFU and can be detected by fluorescence and yellowing of the structure.
  • the suspensions of the target microorganisms in isotonic saline solution in contact concentration of 3 x 10 6 CFU / ml are contacted with the three-dimensional structures in amounts of 1 ml and distributed on the surface.
  • the three-dimensional structures are then maintained at temperatures of 35 ⁇ 2 ° C, under aerobic conditions for a period of up to 4 h, coinciding with the duration of the lag phase of E. coli growth.
  • the presence of the target microorganisms in all variants is detected, in one case individually inoculated with each microorganism and in another case with the mixture of them.
  • E. coli fluorescence and color change in the structure to yellowish are observed;
  • E. coli 0157: H7 and Aeromonas hydrophila only the structure color change is observed.
  • the detection is executed in 2 h.
  • Enterococcus avium blue fluorescence is observed without a color change in the structure at 3 h and filamentous fungus grows as a black structure on the surface of the device, but yellow coloration can be seen in the growth zone.
  • all reactions are appreciated.
  • the S. aureus strain is tested as described in example 11, and according to V26 of that example, a nutritional composition and device is formed with the difference that the three-dimensional structure is shaped in the form of a 0.1 disc mm high and 60 cm in diameter.
  • a volume of air of 3 m 3 is passed through the entire volume with the help of an air filtration device that sucks it by negative pressure.
  • Contamination is simulated with the test strain at a concentration of 10 5 CFU / m 3 before filtering the air, to check if its flow influences the desiccation of the structure or its operation.
  • the device When the device is exposed to air, it is moistened with the second solvent, consisting of distilled water and placed to incubate at the temperature and conditions described in Example 1 1.
  • S. aureus can be identified after 240 min.
  • One device is added ciprofloxacin in the amount of 0.003 pg and in another gentamicin in the amount of 0.2 pg. 0.2 ml of the microbial suspension of an E. coli strain isolated from urine culture with a concentration of 3 x 10 8 CFU / ml is inoculated and incubated for 4 h. The absence of E. coli growth is observed at 4 h in the device containing ciprofloxacin and fluorescence in the device containing gentamicin.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

La presente invención describe un método y dispositivos para la detección, recuperación, identificación y enumeración simultánea de una pluralidad de microorganismos consistente en proveer mezclas de sustancias nutritivas especialmente seleccionadas entre aquellas que acortan la fase lag de crecimiento de bacterias y mohos y que, conjuntamente con marcadores enzimáticos fluorescentes, cromogénicos o bioluminiscentes y otros componentes nutritivos o inhibidores del crecimiento, son embebidos en estructuras tridimensionales de arcillas o cerámicas naturales o artificiales con cavidades de diferentes dimensiones y formas y superficies específicas entre 2 x 103 y 6 x 108 m2/m3.

Description

MÉTODO PARA LA DETECCIÓN, RECUPERACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y ENUMERACIÓN SIMULTÁNEA DE MICROORGANISMOS Y DISPOSITIVOS
PARA SU EJECUCIÓN
5 La presente invención se relaciona con el campo de la microbiología y más específicamente con la detección e identificación de microorganismos en diferentes ambientes y muestras.
Se conoce una número significativo de medios y métodos convencionales de cultivo para la detección e identificación de microorganismos, cuyas principales 0 desventajas consisten en un período prolongado de incubación de las muestras (mínimo 18-24 h), engorrosa manipulación al emplear diferentes medios para aislar, enriquecer e identificar las bacterias y levaduras.
Algunas soluciones se han brindado para reducir el tiempo de identificación, como el empleo de medios con sustratos cromogénicos y fluorogénicos, que resultan 5 igualmente muy demorados para las necesidades, en términos de inmediatez, en la identificación.
El empleo de materiales cerámicos, incluyendo los nanoestructurados ha estado dirigido fundamentalmente a la concentración de los microorganismos en las muestras para su posterior identificación y a la detección o la identificación con 0 anticuerpos monoclonales o fragmentos de estructuras genéticas acopladas a nanoestructuras (Integration of hydroxyapatite concentraron of bacteria and seminested PCR to enhance detection of Salmonella typhimurium from ground beef and bovine carcass sponge samples. Elaine D. Berry and Gregory R. Siragusa. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service2. 5 Román L. Hruska U.S. Meat Animal Research CenterClay Center, NE 68933- 0166. Accepted for Publication February 15, 1999), (Method of manufacturing hydroxyapatite and uses therefor in delivery of nucleic acids. United States Patent Application US20080095820).
Por otra parte, las nanopartículas de silicatos se han empleado, por el contrario, 0 para inhibir el crecimiento microbiano (Composition comprising aluminum silicates and silver nanoparticles as bactericides. WIPO patent application WO/20 1 /128488).
En la patente de Estados Unidos US6596505 B2 del 2003 Ceri y colaboradores, propusieron un aparato y métodos para ensayar el efecto de materiales y de las 5 superficies en la formación de biofiimes. El método comprende el empleo de hidroxiapatita y medios de cultivo para formar biofilmes y la posterior identificación de las características de esos microorganismos. El método no prevé la identificación en un solo paso y requiere de aditamentos para la formación de biofilmes, y para fines de identificación no es muy adecuado, ya que se conoce que las características metabólicas de los microorganismos y su resistencia a los antimicrobianos varía al formarse los biofilmes.
En la invención de Hatzmann M.J . y colaboradores (WO 2009/067012 A2) se reivindica un método para detectar microorganismos en diferentes materiales líquidos, y prevé la concentración del microorganismo en un dispositivo tipo filtro, conectado a otros aparatos y cuyo filtro está conformado por una estructura de hidroxiapatita, un medio de cultivo y sustratos cromogénicos y fluorogénicos. Las principales limitaciones del método consisten en que se necesita de una fase de concentración de la muestra para poder detectar la contaminación, que solo se aplica a muestras líquidas y necesita de otro equipamiento y que la respuesta de identificación no es rápida ni exacta para muchos microorganismos, ya que se basa en la detección de las actividades glucuronidasa o galactosidasa.
En resumen, las deficiencias de los métodos descritos con anterioridad en la bibliografía científica y en los documentos de patentes consisten en:
- no todos los microorganismos se adhieren a las estructuras de las nano estructuras (como ejemplo E. coli Ο157.Ή7), ni todos los que se adhieren pueden ser recuperados en un tiempo razonable para su futura identificación;
- la adhesión de los microorganismos depende de su concentración en la muestra; a menor concentración, menor adhesión;
- en la mayoría de los métodos es necesario la separación de los microorganismos de las estructuras para su posterior identificación, lo que requiere de pasos adicionales tales como la centrifugación que implica el uso de equipos adicionales y expone a los microorganismos recuperados a la contaminación ambiental o a utilizar centrífugas bajo condiciones de asepsia;
- las invenciones que prevén esta fase adicional, requieren de medios de cultivo para aislar los microorganismos para su identificación posterior por diferentes métodos inmunoenzimáticos o por otras técnicas moleculares;
- los métodos protegidos por las invenciones, descritas hasta el momento, basan la identificación en mecanismos de detección con anticuerpos monoclonales que son muy sensibles a las temperaturas y tienen corta vida útil; o utilizan técnicas de detección de fragmentos de AND o ARN, que requieren de equipos adicionales de elevado costo para laboratorios pequeños o de escasos recursos;
- no se promueve realmente el crecimiento acelerado de los microorganismos, por tanto, a concentraciones muy bajas, se dificulta la identificación e incluso no se detecta, o se requiere filtrar grandes volúmenes de muestra para la detección de esas bajas concentraciones;
- en las escasas invenciones que prevén el contacto de los microorganismos con las nano- o micro- estructuras y con medios de cultivo, éstos últimos no son seleccionados especialmente por su capacidad de promover rápidamente su crecimiento, y por tanto a bajas concentraciones no son detectados o su detección es tardía con respecto a las necesidades del diagnóstico;
- las bases nutritivas existentes en mercados internacionales seleccionadas para emplearse en los medios de cultivo no son capaces de promover la formación de enzimas y multiplicar la biomasa en un tiempo reducido, pues no logran reducir la fase lag de crecimiento microbiano;
- en una misma estructura basada materiales nanoporosos o conformadas por nanopartículas agregadas, no se detectan al unísono una amplia variedad de microorganismos, tales como levaduras, hongos, bacterias Gram positivas y Gram negativas, microbacterias y nanobacterias;
- la mayoría de los métodos patentados requiere que la muestra se aplique en estado liquido y, además, que se concentre por filtración, y no comprende la recuperación de microorganismos suspendidos en aire y otros gases o en muestras sólidas;
- algunas de las arcillas naturales, como la zeolita, el caolín y otras, por su propia composición mineral, resultan inhibitorias por sí mismas para la mayoría de los microorganismos, por lo que no se utilizan para la promoción del crecimiento, sino para su inhibición;
- ninguno de los métodos, hasta ahora divulgados, garantiza una sencilla, rápida y simultánea recuperación, detección e identificación de una pluralidad de microorganismos que pueden encontrarse en concentraciones tan bajas como 1 UFC/tamaño de muestra y en un período de tiempo reducido. El objetivo de la presente invención consiste en proveer un nuevo método para la detección, recuperación, identificación y enumeración simultánea de una pluralidad de microorganismos en diferentes muestras y los dispositivos para su ejecución.
La novedad de la presente invención consiste en que:
- el método prevé la promoción intensa y acelerada de la formación de estructuras celulares y enzimas por una combinación de efectos antes no descrita, ni en la literatura científica, ni en los documentos de patentes.
Estos efectos se logran en esencia: a) mediante el uso de composiciones nutritivas especialmente producidas por métodos originales que acortan la fase lag de crecimiento y promueven la fase de aceleración del crecimiento; b) la aceleración de los procesos enzimáticos de degradación de sustratos indicadores por el aporte de iones que pueden contener las estructuras tridimensionales de las arcillas o cerámicas; c) el efecto mecánico de adhesión de las estructuras arcillosas o cerámicas que poseen combinaciones de cavidades de diferentes tamaños, los cuales atrapan, retienen o albergan a microorganismos de las más disímiles tallas, desde nanómetros hasta colonias de varios centímetros o estructuras filamentosas de hongos, hifas o esporas y/o otros propágulos; d) el efecto de multiplicación de la muy elevada superficie de contacto que brindan las nano- y micro- estructuras que incrementa significativamente la velocidad de degradación enzimática en una fase sólida; e) el efecto de las cargas que puedan aportar los iones en la superficie de las estructuras tridimensionales, incluyendo las arcillosas, o de los ingredientes de las composiciones nutritivas que pueden incrementar la adhesión de las células; y en general, al contrario de las anteriores soluciones, no se basa en la recuperación, detección e identificación de los microorganismos solamente en la adhesión a las estructuras (concentración);
- por primera vez se logra emplear arcillas o cerámicas que, de manera natural, presentan actividad bactericida, fungicida o bacteriostática, tales como la zeolita, bentonita, caolinita, entre otras, sin la necesidad de una modificación química para la promoción de crecimiento microbiano, debido a que este efecto inhibidor provocado por la presencia natural en ellas de iones "tóxicos" para los microorganismos es eliminado gracias a la absorción o adsorción de las mezclas nutritivas que son diseñadas especialmente para cada tipo de muestra y cada estructura tridimensional. Las aplicaciones anteriores de estas arcillas han estado dirigidas a la eliminación de las bacterias;
- no existen soluciones anteriores que combinen la promoción de crecimiento sobre arcillas naturales o artificiales con los sustratos, pues en las soluciones anteriores que emplean los sustratos cromogénicos y fluorogénicos la identificación se ejecuta sólo sobre la base exclusiva de la acción de dichos sustratos en presencia de elevadas concentraciones de células y por otra parte las soluciones anteriores para promover el crecimiento de hongos o bacterias en arcillas o cerámicas, no tienen como propósito la identificación, sino el incremento de la concentración de células;
- por primera vez, se combina el empleo de una diversidad de arcillas o cerámicas naturales o artificiales en un mismo y único método de ensayo o en un dispositivo individual o compuesto, aportando cada uno diferentes iones que actúan selectivamente como catalizadores de reacciones enzimáticas específicas de una especie, género o grupo de microorganismos y que, conjuntamente con los nutrientes y factores de crecimiento que aportan las formulaciones nutritivas escogidas especialmente por promover un período corto de la fase lag y acelerar el crecimiento microbiano e, inesperadamente posibilitaron la detección, recuperación, identificación y/o enumeración de una pluralidad de microorganismos por separado o dentro de una misma muestra en un tiempo tan reducido como 60-90 min, antes no alcanzado para los métodos cromogénicos o fluorogénicos de identificación microbiana;
- sorprendentemente, algunos microorganismos, tales como determinadas especies de Pseudomonas mostraron características que comúnmente no muestran en determinados medios, por ejemplo, al emplear la tierra silícea con la composición nutritiva Pseudomonas desarrolló fluorescencia en tan sólo 120 min, cuando en los medios de cultivo ensayados que contienen este compuesto, la fluorescencia aparece sólo después de las 18 h;
- inesperadamente se detectó, por primera vez, que al disminuir la talla de (as cavidades y en especial de los poros en las estructuras tridimensionales de los dispositivos ensayados, y por tanto al aumentar la superficie de contacto y la disponibilidad de cargas superficiales, se aceleraba la reacción enzimática de degradación de los sustratos y se detectaban las bacterias al menos con 60 min de antelación en comparación con las mismas estructuras que contenían la misma composición nutrícional y para el mismo microorganismo, pero con mayores tallas de las cavidades;
- en las variantes del método que prevén el empleo de estructuras tridimensionales con formulaciones nutritivas, sustratos indicadores específicos y antimicrobianos en diferentes combinaciones paralelas como parte de los dispositivos, se logra determinar la sensibilidad a los antimicrobianos conjuntamente con la identificación de los microorganismos en un solo paso;
- por primera vez se combinan en un dispositivo y como parte de un método los hidrolizados enzimáticos de alga Spirulina platensis; hidrolizados enzimáticos de Saccharomyces cerevisiae y de Torula; extracto de
Ipomoea batatas; extracto de tomate; hidrolizado papaínico de tejido de corazón de res y de sangre bovina; hidrolizados enzimáticos de lactoalbúmina de suero de queso; hidrolizados enzimáticos o ácidos de caseína de suero de mantequilla e hidrolizado o autolizado de Eudrillus eugeniae con las estructuras tridimensionales naturales o artificiales que inesperadamente acortaron el período de la fase lag de los microorganismos;
- en una misma etapa de detección del método se pueden eliminar los contaminantes de la muestra, tales como los sólidos en suspensión en las aguas que interfieren en la identificación y cuantificación microbiana;
- se logra un dispositivo extremadamente versátil que en forma de una unidad o de varias unidades combinadas, posibilita la ejecución de la detección, recuperación, identificación y/o recuento de los más disímiles microorganismos en diferentes tipos de muestras, desde gaseosas, líquidas, sólidas, geles, zoles, con niveles de contaminación desde menos de 1 UFC/unidad de muestra hasta 109 UFC/unidad de muestra, sin interferencia de contaminantes de las muestras. Las ventajas del método y del dispositivo consisten en:
- todos los microorganismos viables pueden ser detectados, recuperados e identificados y/o enumerados al unísono ya que los principios del método garantizan todas las condiciones para ello;
- el método y los dispositivos propuestos logran la detección de todos los microorganismos y/o su recuperación, se adhieran o no a la estructura, a diferencia de las soluciones anteriores a la presente invención, que no garantizan que todos los microorganismos se adhieren a las nanoestructuras nano (como ejemplo E. coli 0157:H7), ni que todos los que se adhieren pueden ser recuperados en un tiempo razonable para su futura identificación;
- como el presente método no se basa esencialmente, ni solamente, en la adhesión de los microorganismos viables a las estructuras del dispositivo, se detectan todos los microorganismos presentes en la muestra, incluso a bajas concentraciones o a partir de sus esporas, hifas u otros propágulos, y esto se logra a diferencia de los métodos anteriores, en los cuales la adhesión de los microorganismos depende de su concentración en la muestra (a menor concentración, menor adhesión);
- el método previsto en la presente invención posibilita la detección, recuperación, identificación y/o enumeración, independientemente de las características originales de las estructuras, sus iones o su pH, a diferencia de algunas de las patentes ya descritas, en la cuales, la adhesión de microorganismos a las estructuras para su concentración y posterior identificación se ejecuta por la actividad de los iones en las superficies de las estructuras que interactúan con las células microbianas, de forma tal, que si la muestra que porta los microorganismos contiene sustancias que interfieran o atrapen estos iones, o si su pH los afecta, no se logra la correcta detección, identificación o cuantificación oportuna;
- la invención propuesta no necesita de pasos secundarios de identificación, o concentración de la muestra, o condiciones especiales de asepsia, ni obligatoriamente de equipos y así se diferencia de las descripciones anteriores, que en su gran mayoría necesitan de la separación de los microorganismos de las estructuras para su posterior identificación, lo que incluye pasos adicionales como la centrifugación, requiere de equipos adicionales (centrífugas) y expone a los microorganismos recuperados a la contaminación ambiental o a utilizar centrífugas bajo condiciones de asepsia;
- el nuevo método es sencillo, de bajo costo, la identificación no es demorada y no requiere de técnicas de alta tecnología adicionales, por el contrario de otras invenciones divulgadas que prevén una o varias fases adicionales, requieren de medios de cultivo independientes de las estructuras para aislar los microorganismos para su posterior identificación por diferentes métodos, incluyendo los inmunoenzimáticos o por otras técnicas moleculares que demoran la identificación, la encarecen y complejizan técnicamente;
- el método descrito en la solicitud de patente se ejecuta con seguridad y bajo disímiles condiciones de laboratorio, ambientales y tiene elevada estabilidad, ya que los reactivos y formulaciones o composiciones nutritivas, una vez embebidas en las estructuras tridimensionales de los dispositivos son muy estables a la temperatura y humedad ambientales del laboratorio, lo que marca diferencias significativas con métodos y dispositivos relacionados con anterioridad en la bibliografía científica y de patentes, pues en ellos, por lo general, la identificación se basa en mecanismos de detección con anticuerpos monoclonales que son muy sensibles a las temperaturas y tienen corta vida útil; o utilizan técnicas de detección de fragmentos de AND o ARN, que requieren de equipos adicionales de elevado costo para laboratorios pequeños o de escasos recursos;
- el método es muy estable para su ejecución permitiendo ejecutar cada paso con intervalos prolongados de tiempo entre ellos en los casos que se requiera pues, como ya se mencionó, las formulaciones nutritivas, al ser absorbidas en las estructuras tridimensionales con nano- y micro- cavidades y después de eliminado el solvente, conformando los dispositivos son muy estables a los cambios de temperatura y humedad y por tanto pueden ser empleadas con seguridad por largos períodos de tiempo. Este efecto se debe a que los sólidos de la formulación nutritiva poseen baja humedad y la humedad residual está sometida a fuerzas de adsorción de las superficies de las cavidades que conforman el dispositivo y por tanto no está disponible para las reacciones de degradación bioquímica o biológica, hasta que se adicione el segundo solvente o la muestra;
- la presente invención describe un método con un límite de detección por unidad de muestra de las composiciones nutritivas que se emplean muy bajo (inferior a 1 UFC), lo que significa que las mismas pueden detectar y recuperar las especies microbianas a muy bajas concentraciones y la identificación y/o enumeración se facilita y a diferencia de los procedimientos divulgados en el estado del arte, no necesita de grandes volúmenes de muestra, ni altas concentraciones de inoculo;
- bajas concentraciones (menos de 1 UFC/unidad de muestra) de microorganismos de diferentes especies, géneros, grupos y tallas son detectadas al unísono por el presente método gracias al contacto de los nutrientes y los sustratos marcadores especialmente seleccionados para diferentes estructuras tridimensionales de diferentes características; esto se ejecuta contrariamente a lo antes concebido por otros autores que no seleccionan dichos nutrientes especialmente por su capacidad de promover rápidamente el crecimiento en condiciones específicas de las estructuras y las características de los microorganismos a detectar y por tanto, a bajas concentraciones, algunos no son detectados, o su detección es tardía con respecto a las necesidades del diagnóstico;
- en una misma estructura o dispositivo se detecta al unísono una amplia variedad de microorganismos, tales como levaduras, hongos filamentosos, bacterias Gram positivas y Gram negativas, microbacterias y nanobacterias, efecto antes no logrado por otros procederes;
- con la invención descrita en este documento se posibilita, con una misma combinación de estructura-compuesto nutritivo-marcadores enzimáticos detectar, recuperar, identificar y/o enumerar los microorganismos suspendidos en gases, por ejemplo en el aire, en líquidos, o en muestras sólidas, diferenciándose marcadamente de los procedimientos tradicionales que utilizan utensilios, soportes, componentes, medios de cultivo diferentes según el tipo de muestra a tratar, como en el caso de análisis de muestras líquidas en el que se emplean medios especiales y membranas filtrantes de acetato o nitrato de celulosa y, sin embargo, para muestras sólidas, estas membranas no se emplean, los medios tienen variaciones en su fórmula e incluso el tamaño de la placa es diferente; - según la presente invención, se pueden emplear sin limitaciones todas las arcillas o cerámicas naturales y fosfatos de calcio, pues ellas, en los dispositivos, se combinan con composiciones nutritivas y otros componentes que neutralizan el efecto inhibitorio que pueden presentar algunos iones que contienen, por ejemplo, la zeolita, la caolinita o la bentonita, por sólo citar 3 ejemplos; marcando una gran diferencia con el empleo de estas arcillas previsto en soluciones anteriores, en las que se prevé su uso como antibacterianos;
- para los propósitos del presente método (detección, recuperación, identificación y/o enumeración) se pueden emplear, para ejecutar el método y conformar los dispositivos, arcillas naturales que originalmente presentan actividades bactericida, fungicida o bacteriostática, sin los gastos adicionales de purificación o modificación química para la promoción de crecimiento microbiano, gracias a su combinación con otros componentes descritos en el párrafo anterior;
- el método posibilita determinar la sensibilidad o resistencia a los antimicrobianos al unísono con su identificación en un período de tiempo muy reducido y para cualquier especie, género o grupo de microorganismos presente en la muestra, gracias a la combinación de diferentes estructuras tridimensionales, con diferentes composiciones nutritivas, marcadores enzimáticos y con los antimicrobianos seleccionados;
- el nuevo dispositivo es sencillo, de bajo costo, de fácil preparación para su fabricación.
A continuación se ofrece la descripción detallada de la invención.
Los componentes nutritivos de la presente invención son seleccionados entre las mezclas de proteínas, hidratos de carbono, vitaminas y minerales degradadas por métodos químicos o enzimáticos Una o varias de estas mezclas nutritivas estimuladoras del crecimiento microbiano, preparadas en soluciones acuosas o en soluciones con sales en concentraciones de 0, 1 a 3 g/l, se inoculan con 0, 1 mi del o de los microorganismos posibles a detectar, recuperar, identificar o enumerar a concentración de 3 x 108 UFC/ml y se incuban a la temperatura y tensión de oxígeno deseados, midiendo la cinética de crecimiento microbiano por cualesquiera de los métodos conocidos, preferiblemente determinando el incremento de la densidad óptica en el tiempo. Se selecciona aquella o aquellas composiciones que garantizan una reducción de la fase lag de crecimiento que no supere los 60-120 min para las bacterias y 16 h para las levaduras y hongos filamentosos.
Ejemplos de los componentes nutritivos son los hidrolizados enzimáticos de alga Spirulina platensis descrito en el Certificado de Autor de Invención de Cuba 22310; extracto de Saccharomyces cerevisiae obtenido por hidrólisis enzimática según se describe en el Certificado de Autor de Invención de Cuba 22221 e hidrolizado enzimático de levadura forrajera de Torula (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22280); extracto de Ipomoea batatas, según se divulga en la patente de Cuba 23507; extracto de tomate (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22308); hidrolizados enzimáticos de tejido de corazón de res (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22442), de sangre bovina (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22208) y de hígado de res (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22220); hidrolizados enzimáticos de lactoalbúmina obtenida de suero de queso (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22219), hidrolizados enzimáticos o ácidos de caseína de suero de mantequilla (Certificados de Autor de Invención de Cuba 22166 y 22089, respectivamente) e hidrolizado o autolizado de Eudrillus eugeniae (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22381 ). Las composiciones seleccionadas se disuelven o suspenden en un primer solvente en cantidades de 1 a 50 g/l.
A ellos se pueden incorporar, además, otros hidrolizados enzimáticos, hidrolizados químicos, tales como peptonas y triptonas o extractos comerciales de proteínas de algas, de microorganismos, partes vegetales, tejidos animales superiores y sus combinaciones, como ejemplo los obtenidos a partir de carne de res, de cerebro, de papa, entre otros, en cantidades de 1 a 10 g/l.
Una vez preparada la composición, a ésta se le adiciona uno o varios marcadores enzimáticos cromogénicos, fluorogénicos o bioluminiscentes en cantidades de 0,01 a 2 g/l. Ejemplos de estos marcadores pueden ser: los compuestos derivados del fenol, tales como orto- y para- nitrofenoles, para-nitro-anilina, indolil derivados: 5-bromo-4-cloro-3-indolil, 5-bromo-6-cloro-3-indolil (magenta), 6-cloro- 3-indolil (salmón), los derivados de la metilcoumarina y del metilumbeliferil (MUG) para detectar actividades galactosidasa, glucuronidasa, decarboxilasa, glucosidasa, fosfatasa, entre otras. A la mezcla de las composiciones nutritivas y marcadores enzimáticos se le pueden adicionar otras sustancias, tales como promotores o inhibidores de microorganismos pertenecientes a determinados géneros, especies o grupos. Ejemplos de estas sustancias pueden ser las vitaminas, sales minerales, albúmina, antibióticos, colorantes, tintes, sales biliares, bilis de buey, azúcares, aminoácidos. Igualmente se pueden adicionar otras sustancias que aumenten la solubilidad de los marcadores enzimáticos o la permeabilidad de las células de los microorganismos en cantidades de 0,01 hasta 40 g/l.
Si se pretende determinar la sensibilidad a los antimicrobianos y antifúngicos, o a las soluciones de limpieza o desinfección, o para comprobar el efecto bactericida o bacteriostático en particular de alguna sustancia o producto, a la composición nutritiva seleccionada se le puede adicionar, además, sales, resinas, extractos naturales de plantas, ácidos grasos, ésteres, bactericidas, bacteriostáticos, alcoholes, sustancias con actividad de superficie o sus mezclas en cantidades de 0,01 a 2 g/l y/o antibióticos o antifúngicos en cantidades de 10 a 100 pg/l.
La composición nutritiva seleccionada, conjuntamente con los marcadores enzimáticos y demás componentes, se disuelve o dispersa en un primer solvente en cantidades de 1 a 150 g/l.
El solvente puede ser el agua destilada o desionizada, soluciones acuosas de sales (NaCI, soluciones de fosfato, entre otras), alcoholes y soluciones alcohólicas (ejemplo solución de fucsina básica al 10 % p/v en alcohol etílico), soluciones de sustancias que aumenten la solubilidad de los marcadores enzimáticos [ejemplo de dimetilsulfóxido (DMSO)] o la permeabilidad de las células de los microorganismos.
Conformada la mezcla nutritiva y conjuntamente con los marcadores enzimáticos y demás componentes disueltos o suspendidos en el primer solvente, se pueden esterilizar por cualquiera de los métodos conocidos, a excepción de aquellas composiciones que contienen sustancias termolábiles, que no deben ser esterilizadas por calor.
Una vez conformada la mezcla nutritiva y conjuntamente con los marcadores enzimáticos y disueltos o suspendidos en el primer solvente y demás componentes, éstos se ponen en contacto con una o varias estructuras tridimensionales de arcillas o cerámicas naturales o artificiales o de otras cerámicas. Estas estructuras tridimensionales pueden previamente someterse a esterilización por cualquiera de los métodos conocidos.
El tiempo de contacto de la composición nutritiva y demás componentes disueltos o suspendidos en el primer solvente y la estructura tridimensional de arcilla o cerámica varía, por lo general, desde 10 min para las tallas menores de tamaño nanométhco o submicrométrico (< 1000 nm) hasta 60 min para las estructuras de mayor tamaño.
Estas estructuras cuentan con una superficie específica de 2 x 103 a 6 x 08 m2/m3 y están conformadas por una pluralidad de nano-, micro- y macro- cavidades o sus combinaciones.
Estas arcillas y/o cerámicas naturales o artificiales son seleccionadas entre la caolinita, halloisita, dickita, nacrita, crisolita, antigorita, lizardita, vermiculita, mica, hectorita, saponita, hidrotalcita, muscovita, clorita, la tierra de diatomea, bentonitas (montmorillonita, sauconita, beidellinita, nontrolita) clinoptilotitas, hidroxiapatitas, zeolitas y fosfatos de calcio o sus combinaciones.
Las estructuras de fosfato de calcio mencionadas en el párrafo anterior son seleccionadas entre: metafosfato [Ca(P03)2], fosfato monocálcico mono-hidratado [Ca(H2P04)2 H20], di-hidrógeno fosfato tetracálcico (Ca4H2P602o), fosfato heptacálcico [Ca7(P50i6)2], pirofosfato de calcio (Ca2P207 y Ca2P2072H20), fosfato dicálcico [CaHP04, CaHP04 2H20 y Ca(H2P0 )2], tricálcico [Ca3(P0 )2], fosfato octacálcico [Ca8H2(P04)6 5H20], hidroxiapatita deficiente en calcio [Ca10- x(HP04)x(P04)6-x(OH)2-x], hidroxiapatita [Ca10(PO )6(OH)2], fosfato tetracálcico [Ca40(P04)2], apatita [Ca10(PO4)6(OH,F,CI,Br)2], carbonatoapatita [Ca5(P04,C03)3(OH,F)] o mezcla de ellas.
Las arcillas y/o cerámicas naturales o artificiales y los fosfatos de calcio pueden poseer sustituciones isomórficas de los iones por cationes o previamente funcionalizadas con diferentes iones, preferiblemente monovalentes, divalentes, trivalentes o tetravalentes, que actúan como catalizadores enzimáticos, tales como Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Zn, formando capas superficiales o distribuidas en toda su estructura.
Las estructuras tridimensionales mencionadas son seleccionadas entre aquellas cuyas dimensiones de las cavidades responden a:
- nano- cavidades o partículas, preferiblemente de superficies rugosas, con diámetros u holguras de hasta 200 nm para nano- y micro- bacterias; - nano- y submicro- cavidades con diámetros u holguras de 5 nm a 1000 nm para bacterias de diferentes tallas;
- micro- cavidades con diámetros u holguras de 1 μιπ a 1000 pm para bacterias y células de levaduras;
- micro- y macro- cavidades con diámetros u holguras de más de 1 pm y hasta 2 mm para bacterias, levaduras y hongos filamentosos;
- combinaciones con todos los diámetros u holguras de las cavidades desde nano- hasta macro- de 2 mm para la pluralidad de microorganismos.
Las cavidades en la estructura pueden presentarse en forma de poros, canales, tubos, bolsas regulares o irregulares, de diferentes formas geométricas o sus combinaciones; o se disponen en forma de capas o láminas.
Las estructuras tridimensionales puede conformar una película o capa de 5 nm a 1 mm de espesor en especial cuando se emplean para la detección, identificación o enumeración de microorganismos por la técnica de filtración por membrana o para la detección de microorganismos en superficies; o una columna de hasta 10 cm de altura, en especial, cuando se requiere filtrar grandes volúmenes de líquido o suspensión de microorganismos que pueden encontrarse a bajas concentraciones, o cuando se emplean varias zonas de la estructura con diferentes marcadores enzimáticos o con diferentes mezclas nutritivas.
Las estructuras pueden también emplearse en forma de esferas o perlas de diámetro de 5 nm a 10 mm; hexágonos o cubos en especial, formando parte de un conjunto de pruebas con diferentes composiciones, o pueden ser adicionadas a la muestra líquida o suspensión que contiene los microorganismos.
Se puede utilizar otras estructuras en forma de cilindros o tubos desde un diámetro muy pequeño de 5 nm para pequeñas alícuotas, uniendo varios de esos tubos para conformar un conjunto de ellos hasta 10 cm de diámetro que simulan el diámetro de una placa de Petri para aquellos exámenes previstos en normas para recuentos que requieren de esa superficie.
La altura de las estructuras varía según el formato de presentación a emplear en el método y va desde los 5 nm para las nanoalícuotas, o microalícuotas, o para la unión de varias estructuras en un conjunto de capas tipo sandwich, hasta 10 cm de altura.
Las estructuras tridimensionales pueden presentarse en formas de fibras o redes que retienen los microorganismos y permiten su detección. Cuando se desea que las estructuras detecten e identifiquen los microorganismos en todo el volumen de una muestra, se utilizan aquellas arcillas de gran capacidad de hinchazón, hasta que, de manera natural o mediante la adición de gelificantes, adopten la forma del recipiente que la contenga.
Las estructuras tridimensionales de la presente invención pueden presentar diferentes zonas con distintas porosidades y diferentes diámetros u holguras de las nano-, micro- y macro- cavidades a través de su volumen, o de su longitud, o de su diámetro, distribuyendo dichas zonas en forma de gradiente o en zonas diferenciadas.
A las estructuras tridimensionales, se- les puede adicionar diferentes composiciones nutritivas y marcadores enzimáticos en cada zona, tanto a través de su estructura, longitud o de su diámetro, distribuyéndose en este caso en zonas concéntricas. La distribución de las composiciones, o la concentración de uno, o varios de sus componentes se puede garantizar en forma de gradiente continuo o discontinuo.
A las estructuras, se le pueden adicionar sustancias que coadyuvan la fijación de la composición nutritiva y los marcadores enzimáticos seleccionados y otros componentes en aquellos casos en que se sospeche que el fluido de la muestra pueda arrastrar dicha composición. Entre estas sustancias se pueden emplear los alginatos, como el de sodio; polisacáridos naturales, tales como derivados de la pectina y de la quitina; goma arábiga y otras gomas; almidones, como los de maíz y de boniato, o almidones pre-gelatinizados; la dextrana y la carboximetilcelulosa y otros polímeros derivados de ellos; carragenina o el carragenato de sodio; el agar; la agarosa y polímeros artificiales derivados; derivados del alcohol vinílico, del polibutileno, polietileno y polipropileno; y la polivinilpirrolidona de diferentes pesos moleculares en cantidades de 0,01 a 0,5 g/g de estructura tridimensional.
A la estructura tridimensional, en el caso de que su superficie específica sea menor de 500 m2/g, se le puede adicionar sustancias que aumentan su capacidad de absorción, tales como el carbón activado y la celulosa en cantidades de 2 a 4 mg/g, por ejemplo en forma de láminas.
Al concluir la etapa de absorción, se elimina el primer solvente. El procedimiento más recomendado es a temperatura ambiente y presión atmosférica con circulación forzada de aire para preservar los nutrientes y evitar su degradación, como el caso de las vitaminas termolábiles. La eliminación del primer solvente puede ser ejecutada también sometiendo la estructura tridimensional a secado a temperatura de 25 a 1 10 °C a presión atmosférica o a presión menor que la atmosférica, por ejemplo en horno de vacío, por un período de 30 min a 3 h o eliminándolo por sublimación, o por secado por aspersión a temperatura de 90 a 180 °C.
Después de la eliminación del primer solvente, se puede conservar la estructura hasta el momento del ensayos por períodos de hasta 5 años. Se recomienda esterilizar las estructuras con las composiciones embebidas, preferiblemente, pero no exclusivamente por irradiación de diferente naturaleza. Otros métodos se pueden utilizar, como la esterilización en autoclave, para aquellas estructuras que no contienen componentes termolábiles.
Se comprueba la capacidad de recuperar los microorganismos diana seleccionando aquellas estructuras que poseen un límite de detección de menos de 1 UFC/10 I para las muestras líquidas, menos de 1 UFC/250 g para las muestras sólidas o menos de 1 UFC/10 m3 de aire y un límite máximo de hasta 109 UFC/ml ó 109 UFC/g ó 103 UFC/m3.
Antes de comenzar el ensayo, se puede colocar la estructura tridimensional sobre soportes en forma de láminas, capas o cilindros permeables a gases o líquidos o impermeables a los mismos; o rodeadas por materiales impermeables en al menos el 90 % de su superficie.
Con posterioridad, se ponen en contacto las células microbianas que pueden estar conformadas por una pluralidad de los microorganismos a detectar, recuperar, identificar y/o enumerar pertenecientes a una especie, un género, un grupo o combinaciones de ellas, e incluye a las nanobacterias, bacterias, mohos y levaduras y las esporas, hifas u otros propágulos, con las estructuras tridimensionales en presencia de un segundo solvente.
Este segundo solvente puede ser el agua, una solución hipotónica, ¡sotónica o hipertónica de sales, como por ejemplo el cloruro de sodio, o la propia muestra en dependencia de la naturaleza de los microorganismos a identificar.
Ejemplos pueden ser muestras biológicas como la sangre o alimentos, como la leche, o suspensiones de la muestra.
Otra variante del método consiste en poner en contacto una suspensión de microorganismos en portadores gaseosos, tales como el aire o aerosoles.
La muestra se aplica a la estructura en las siguientes proporciones: 0,05 a 3 ml/g, o de 0,1 a 10 m3/g de estructura tridimensional. Para detectar, recuperar, identificar o cuantificar la pluralidad de células se puede poner en contacto el segundo solvente o las muestras que las contienen con la superficie de la estructura tridimensional o pasándola a través de ella, o hasta una determinada profundidad; estando las células o las muestras que la contienen en forma de una suspensión en fase gaseosa o en fase líquida, o en forma de gel o con consistencia semisólida o sólida, aplicándola directamente sobre la estructura, o mediante un dispositivo de aplicación como, por ejemplo, un hisopo, asa, aguja, entre otros.
Las muestras o el segundo solvente que contiene los microorganismos se pueden aplicar a varias estructuras a la vez.
A continuación se mantiene la estructura tridimensional a temperaturas de 20 a 50 °C por un período coincidente con la mayor duración de la fase lag o del final de la fase de aceleración del crecimiento del microorganismo de más lento desarrollo, con tensión de oxígeno que puede variar, desde condiciones aerobias, hasta la ausencia total de este elemento en dependencia de los microorganismos diana a detectar.
El crecimiento se observa a partir de los 30 min hasta los 240 min para las bacterias, y conjuntamente con la detección se puede identificar las diferentes especies, géneros o grupos. Para ello, las estructuras se mantienen en las condiciones antes señaladas para propiciar el crecimiento microbiano, tanto en el interior de las cavidades, como en la superficie.
Para determinados microorganismos de muy lento crecimiento, como las levaduras y hongos filamentosos el crecimiento se observa en tan solo 16 h en lugar de 36 - 72 h que se observa al emplear los métodos tradicionales.
En las nano- partículas o cavidades se aprecia el crecimiento por la actividad de nanobacterias, y de otras bacterias indirectamente por los productos de la escisión de los marcadores enzimáticos que bajo la acción de las enzimas microbianas se puedan acumular en ellas. En las micro- cavidades se desarrollan las bacterias de menor talla, en las macro- cavidades las bacterias de mayor talla, las levaduras y los hongos filamentosos y en la superficie todos los microorganismos.
La detección e identificación de la pluralidad de células se ejecuta fundamentalmente, pero no exclusivamente por la detección visual u automática de la fluorescencia o la bioluminiscencia. Además se puede emplear otros métodos, tales como: por el cambio de color de la estructura tridimensional o de su consistencia, textura, brillantez, de su opacidad, tonalidad, homogeneidad, o transparencia; o por los cambios de color, de brillantez, tonalidad, transparencia, o fluorescencia del segundo solvente o de la muestra; o por la aparición de bioluminiscencia, tanto en el interior de las cavidades, como en la superficie de la estructura; o por la observación de otras estructuras morfológicas; o reacciones metabólicas en la estructura tridimensional, en el segundo solvente o en la muestra; o por una combinación de varias, o de todas las formas de identificación.
La determinación de la concentración de células en la muestra se realiza sobre la superficie de láminas o capas de la estructura, o se puede ejecutar mediante la enumeración visual, o mediante métodos automáticos en la superficie, o mediante la medición de la intensidad de la señal fluorogénica, colorimétrica o bioluminiscente, bajo luz en el rango del espectro ultravioleta, visible o infrarrojo, de señales eléctricas, térmicas, magnéticas, por el cambio de pH, o po la cuantificación de la emisión o consumo de gases derivados de la actividad de los microorganismos durante la fase lag o del período de aceleración del crecimiento, tales como dióxido de carbono, oxígeno, sulfuro de hidrógeno, amonio, hidrógeno. Conjuntamente con la identificación de la pluralidad de microorganismos, se puede determinar la resistencia o sensibilidad a los antimicrobianos, tales como bactericidas, bacteriostáticos, fungicidas, soluciones de limpieza, adicionando a la mezcla de la composición nutritiva y de los marcadores enzimáticos, dichas sustancias y observando la inhibición total o parcial del crecimiento, la desaceleración del mismo, la prolongación de la fase lag, o por la ausencia de reacción de degradación de los sustratos.
El método puede ser ejecutado con ayuda de dispositivos conformados por una mezcla nutritiva estimuladora del crecimiento microbiano, seleccionada entre los hidrolizados enzimáticos de alga Spirulina platensis; hidrolizado enzimático de Saccharomyces cerevisíae y de Torula; extracto de Ipomoea batatas; extracto de tomate; hidrolizado enzimático de tejido de corazón e hígado de res y de sangre bovina; hidrolizados enzimáticos de lactoalbúmina obtenida de suero de queso, hidrolizados enzimáticos o ácidos de caseína de suero de mantequilla e hidrolizado o autolizado de Eudrillus eugeniae y sus combinaciones y uno o varios marcadores enzimáticos cromogénicos, fluorogénicos o bioluminiscentes absorbidos y/o adsorbidos en una estructura tridimensional de arcillas o cerámicas naturales o artificiales, seleccionadas entre la caolinita, halloisita, dickita, nacrita, crisolita, antigorita, lizardita, vermiculita, mica, hectorita, saponita, hidrotalcita, muscovita, clorita, la tierra de diatomea, bentonitas (montmorillonita, sauconita, beidellinita, nontrolita), y fosfatos de calcio, o sus combinaciones conformadas por una pluralidad de nano- cavidades o partículas; submicro-, micro- y macro- cavidades.
Los dispositivos de la presente invención contienen todos los componentes necesarios para la ejecución del método y dichos componentes se encuentran en forma deshidratada en cantidades que garantizan las concentraciones de cada uno de ellos como se describe en el método original.
Estos dispositivos pueden estar conformados por fosfatos de calcio seleccionadas entre el metafosfato [Ca(P03)2] , fosfato monocálcico mono- hidratado [Ca(H2P04)2 H20], di-hidrógeno fosfato tetracálcico (Ca4H2P602o), fosfato heptacálcico [Ca7(P5016)2], pirofosfato de calcio (Ca2P207 y Ca2P207 2H20), fosfato dicálcico [CaHP04, CaHP04-2H20 y Ca(H2P04)2], tricálcico [Ca3(P04)2], fosfato octacálcico [Ca8H2(P04)6 5H20], hidroxiapatita deficiente en calcio [Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x], hidroxiapatita [Ca10(PO4)6(OH)2], fosfato tetracálcico [Ca40(P04)2], apatita [Ca10(PO4)6(OH,F,CI,Br)2], carbonatoapatita [Ca5(P04,C03)3(OH,F)] o mezcla de ellos. También pueden contener mezclas de las sustancias mencionadas con los fosfatos descritos en el párrafo anterior.
Algunos dispositivos pueden estar conformados por arcillas naturales o artificiales, cerámicas y otros fosfatos- de calcio con sustituciones isomórficas de iones o ser funcionalizados por iones o por cationes monovalentes, divalentes, trivalentes o tetravalentes, formando capas superficiales o distribuidas en toda su estructura. Estos cationes pueden ser el Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Zn y esencialmente jugar un papel de catalizadores de la reacción enzimática de degradación de los marcadores.
Las estructuras tridimensionales de estos dispositivos presentan cavidades en forma de poros, canales, tubos, bolsas regulares o irregulares, de diferentes formas geométricas o sus combinaciones; o se disponen en forma de capas o láminas, dependiendo del tipo de arcilla o cerámica empleada y de su tecnología de obtención estas cavidades se clasifican para dirigir su empleo en el método como: - nano- cavidades o partículas, preferiblemente de superficies rugosas, con diámetros u holguras de hasta 200 nm para nano- y micro- bacterias;
- nano- y submicro- cavidades con diámetros u holguras de 5 nm a 1000 nm para bacterias de diferentes tallas;
- micro- cavidades con diámetros u holguras de 1 pm a 1000 pm para bacterias y células de levaduras;
- micro- y macro- cavidades con diámetros u holguras de más de 1 pm y hasta 2 mm para bacterias, levaduras y hongos filamentosos;
- combinaciones con todos los diámetros u holguras de las cavidades desde nano- hasta macro- de 2 mm para la pluralidad de microorganismos.
Estos dispositivos contienen una o varias composiciones nutritivas, cuyos componentes son seleccionados entre las mezclas de proteínas, hidratos de carbono, vitaminas y minerales degradadas por métodos químicos o enzimáticos que garanticen que el período de fase lag no supere los 60-120 min para las bacterias y 16 h para las levaduras y hongos filamentosos en cantidades de 0,33 a 20 mg/g de estructura tridimensional.
Los dispositivos también contienen uno o varios marcadores enzimáticos cromogénicos, fluorogénicos o bioluminiscentes dentro de las cavidades o en la superficie de las estructuras en cantidades de 0,0033 a 0,66 mg/g de estructura tridimensional. Además de estos sustratos, los dispositivos pueden contener indicadores de pH y de potencial redox.
Adicionalmente, dentro de la composición nutritiva incluida en los dispositivos se pueden incorporar otros productos comerciales tales como hidrolizados enzimáticos, hidrolizados químicos o extractos de proteínas de algas, microorganismos, partes vegetales, tejidos animales superiores y sus combinaciones en cantidades de 0,33 a 4 mg/g de estructura tridimensional. Como ejemplos de estas sustancias se pueden señalar la peptona bacteriológica, la triptona, el extracto de carne, de cerebro, de corazón, el extracto de papa, de maíz, de arroz, la peptona de soya, el extracto de levadura.
Los dispositivos pueden contener otras sustancias tales como promotores de crecimiento, inhibidores, sales, tampones, hidratos de carbono y otros componentes para promover el crecimiento de microorganismos pertenecientes a determinados géneros, especies o grupos en cantidades de 0,003 hasta 14 mg/g. En su totalidad, los componentes que se encuentran dentro de las cavidades o en la superficie de los dispositivos (mezcla de la composición nutritiva con los marcadores enzimáticos y demás componentes) se encuentran en cantidades de 0,33 a 60 mg/g de la estructura tridimensional.
Los dispositivos de la presente invención poseen límites de detección de menos de 1 UFC/10 I para las muestras líquidas, menos de 1 UFC/250 g para las muestras sólidas o menos de 1 UFC/10 m3 y un límite máximo de hasta 109 UFC/ml ó 109 UFC/g ó 103 UFC/m3.
Aquellos dispositivos que son empleados para detectar, recuperar, identificar o enumerar selectivamente determinados microorganismos dentro de una muestra contienen agentes selectivos del crecimiento microbiano, seleccionados entre las sales (ejemplo las sales biliares, desoxicolato de sodio), otras como resinas, extractos naturales de plantas, ácidos grasos, ésteres, bactericidas, bacteriostáticos, alcoholes, sustancias con actividad de superficie o sus mezclas en cantidades de 0,0033 a 0,8 mg/g de las estructuras tridimensionales de las arcillas o cerámicas y antibióticos (ejemplo vancomicina, ácido nalidíxico), antifúngicos (ejemplo nistatina, ketoconazol, amfotericina B), en cantidades de 0,033 a 0,33 pg/g.
Aquellos dispositivos que se emplean haciendo pasar muestras acuosas a través de su estructura tridimensional, y que poseen componentes muy solubles en agua, pueden contener sustancias que coadyuvan la fijación de la composición nutritiva y los marcadores enzimáticos a las estructuras tridimensionales, entre ellos los alginatos (por ejemplo de sodio o de calcio), polisacáridos naturales; pectina, quitina, goma arábiga y otras gomas, almidones como el pregelatinizado de maíz, dextrana y carboximetilcelulosa y otros polímeros derivados de ellos; carragenina, agar, agarosa y polímeros artificiales derivados, derivados del alcohol vinílico, del polibutileno, polietileno y polipropileno, polivinilpirrolidona en cantidades de 0,01 a 0,5 g/g de estructura tridimensional.
Otros compuestos pueden formar parte de los dispositivos, como el caso de sustancias que aumentan su capacidad de absorción, tales como el carbón activado y la celulosa en cantidad de 2 a 4 mg/g que se emplea para conformar los dispositivos cuyas estructuras tienen superficies específicas de menos de 3 x 10 m2/m3.
Un dispositivo puede estar formado por una estructura tridimensional o por un conjunto de estructuras. Cada estructura tridimensional puede conformar una película o capa de 5 nm a 1 mm de espesor; o una columna de hasta 10 cm de altura; o partículas de diferentes formas geométricas, tales como esferas, perlas, hexágonos, cubos, de diámetro de 5 nm a 10 mm; o cilindros o tubos de 5 nm a 10 cm de diámetro y de 5 nm a 10 cm de altura; o fibras, redes, o adoptar la forma del recipiente que la contenga. En algunos casos la estructura del dispositivo puede aumentar en tamaño y volumen producto de la "hinchazón" al absorber la muestra que contiene los microorganismos, o al segundo solvente que contiene los microorganismos y ocupar todo el volumen del recipiente que los contenga. Pueden ser dispositivos elaborados a partir de hidroxiapatita, agar y almidón pre gelatinizado de maíz.
Un dispositivo puede poseer una estructura tridimensional que presenta diferentes zonas con distintas porosidades y diferentes diámetros u holguras de las nano-, micro- y macro- cavidades a través de su volumen, o de su longitud, o de su diámetro, distribuyéndose dichas zonas en forma de gradiente o en zonas diferenciadas.
Cada dispositivo en su única estructura tridimensional contiene una o varias composiciones nutritivas y marcadores enzimáticos diferentes a través de su volumen, longitud o diámetro, distribuyendo dichas composiciones en forma de gradiente o en zonas diferenciadas.
Los dispositivos pueden mantener la estructura tridimensional sobre soportes en forma de láminas, capas o cilindros permeables a gases o líquidos o impermeables a los mismos; o rodeada por materiales impermeables en al menos el 90 % de su superficie.
A continuación se exponen algunos ejemplos de ejecución
Ejemplo 1.
Se tomaron para la prueba de promoción de crecimiento de bacterias (E. colí) varias bases nutritivas, entre ellas, hidrolizado papaínico de músculo de corazón, según el Certificado de Autor de Invención de Cuba No. 22442 en cantidad de 0,2 g/l de agua desionizada, extracto de levadura Saccharomyces cerevisiae, según el Certificado de Autor de Invención de Cuba No. 22221 , en cantidad de 0,2 g/l, hidrolizado enzimático de caseína (Certificados de Autor de Invención de Cuba 22166) en cantidad de 0,2 g/l y 0,2 g/l de hidrolizado pancreático de corazón.
Igualmente se conformó una mezcla de ellas en las siguientes cantidades: hidrolizado papaínico de músculo de corazón en cantidad de 1 g/l de agua desionizada, extracto de levadura Saccharomyces cerevisiae en cantidad de 1 g/l, hidrolizado enzimático de caseína en cantidad de 2 g/l y 1 g/l de hidrolizado pancreático de corazón.
Los productos a ensayar se inocularon con 0, 1 mi de una suspensión de los microorganismos diana a concentración de 3 x 108 UFC/ml.
Se incubaron las bases por separado y la mezcla por 8 h a 37 °C en atmósfera aerobia y se monitoreó el incremento de la densidad óptica en un espectrofotómetro a 680 nm.
De todas las variantes, la mezcla nutritiva mostró una reducción de la fase lag de crecimiento de E. coli en 30 min, mientras que las bases individuales mostraron una duración de esa fase variable, entre ellas: hidrolizado papaínico de músculo de corazón - 45 min, extracto de levadura Saccharomyces cerevisiae - 80 min, hidrolizado enzimático de caseína 60 min y el hidrolizado pancreático de corazón - 50 min.
De esta manera, se seleccionó la mezcla de componentes nutritivos, que en lo adelante se identificará como CCL, y se disolvió en 1 I de agua desionizada como primer solvente en cantidad de 5 g/l (variante 1 ) y en cantidad de 10 g/l (variante 2)·
A esta mezcla nutritiva se le había incorporado el hidrolizado pancreático de músculo de corazón en cantidad de 1 g/l (variante 1 ) y 2 g/l (variante 2), resultando las concentraciones de los nutrientes, como ya se expresó en 5 g/l y 10 g/l, respectivamente.
Una vez preparada la composición, a ésta se le adicionaron dos marcadores enzimáticos, uno cromogénico [2-nitrofenil-p-D-galactopiranósido (Ci2H15N06)], en cantidades de 0,5 g/l (variante 1) y 1 g/l (vanante 2) y otro fluorogénico [4-metilumbeliferil- -D-glucurónido (Ci6H1609-2H20)] en cantidades de 0,075 g/l (variante 1 ) y 0,15 g/l (variante 2).
A las mezclas de las composiciones nutritivas y marcadores enzimáticos se les adicionaron otras sustancias, tales como promotores de crecimiento, específicamente lactosa (5 y 10 g/l), sorbitol (0,5 y 1 g/l), L-triptófano (1 y 2 g/l); sales inorgánicas, específicamente fosfato monobásico de potasio (2,75 y 5,5 g/l), fosfato dibásico de potasio (2,75 y 5,5 g/l) y cloruro de sodio (5 y 10 g/l); por último se incorporaron las sales biliares en concentración de 1 ,3 a 2,6 g/l.
La composición nutritiva seleccionada, conjuntamente con los marcadores enzimáticos y demás componentes se encontraban disueltas en el primer solvente en cantidades de 23,9 g/l para la variante 1 y 47,8 g/l para la vanante 2. Conformada la mezcla nutritiva y conjuntamente con los marcadores enzimáticos y demás componentes disueltos en el primer solvente, se esterilizaron por filtración.
Las mezclas nutritivas conjuntamente con los marcadores enzimáticos y demás componentes disueltos en el primer solvente se pusieron en contacto con dos estructuras tridimensionales de cerámicas específicamente la hidroxiapatita previamente esterilizada a 180 °C por 60 min.
El tiempo de contacto de las composiciones de la variante 1 (V1 ) y de la variante 2 (V2) fue de 60 min.
Estas estructuras contaban con una superficie específica de 7500 m2/m3.
Las estructuras tridimensionales mencionadas presentaban dimensiones de las cavidades correspondientes a combinaciones de todos los diámetros u holguras de las cavidades correspondientes a nano- micro- cavidades con diámetros u holguras de 5 nm a 600 pm en forma de poros. Estas estructuras presentaban forma de cilindro de 0,5 cm de diámetro y 0,5 cm de altura.
Al concluir la etapa de absorción, se eliminó el primer solvente sometiendo las estructuras tridimensionales a secado a temperatura de 60 °C en horno de vacío, por un período de 3 h.
Se comprobó la capacidad de recuperar el microorganismo diana (E. colf) demostrando que las estructuras poseían límites de detección de menos de 1 UFC/100 mi para ambas variantes.
Se puso en contacto una suspensión de E. coli en solución isotónica salina en concentración de 3 x 106 UFC/ml con 0, 1 g de las estructuras tridimensionales en cantidades de 0,2 mi (relación de 2 ml/g).
A continuación se mantuvieron las estructuras tridimensional a temperaturas de 35 ± 2 °C, en condiciones aerobias por un período de 2 h coincidente con la duración de la fase lag de crecimiento de E. coli.
Al concluir la incubación por 2 h se detectó la presencia del microorganismo objeto en ambas variantes por la fluorescencia bajo luz ultravioleta a 366 nm visualmente en el líquido sobrenadante y se pudo identificar E. coli por su reacción positiva a la glucuronidasa (fluorescencia).
Ejemplo 2
Similar a la variante 1 del ejemplo 1 , con la diferencia que se conformaron las siguientes vanantes: V3 - Perlas de hidroxiapatita con un peso total de 0,2 g, con una superficie específica de 2 x 103 m2/m3, impregnada con la composición nutritiva según la V2 del ejemplo 1 .
V4 - Perlas de hidroxiapatita con un peso total de 0,2 g, con una superficie específica de 3000 m2/m3, impregnada con la composición nutritiva según la V2 del ejemplo 1 .
Se absorbieron las estructuras por 2 h con las composiciones nutritivas y se secaron al vacío por 2 h a 60 °C.
Se inocularon con 2 UFC/ml de E. col i en un volumen de 0,2 mi (1 ml/g)
La fluorescencia de E. coli se observó a los 120 min.
Ejemplo 3
V5 - Perlas de hidroxiapatita con un peso total de 0,2 g, con una superficie específica de impregnada con la composición nutritiva según la V2 del ejemplo 1 . V6 - Perlas de hidroxiapatita con un peso total de 0,2 g, con una superficie específica de 1 ,5 x 103 m2/m3, impregnada con la composición nutritiva según la V2 del ejemplo 1 .
V7 - Discos de celulosa sin arcillas con 6 mm de diámetro, 0,94 cm2 de superficie y 0,014 g, impregnada con la composición nutritiva según la V1 del ejemplo 1 . V8 - composición nutritiva según la V1 del ejemplo 1 en volumen de 0,25 mi.
Se embebieron las cerámicas en la composición nutritiva por 3 h y se eliminó el primer solvente a temperatura de 70 °C.
Se inocularon 0, 1 mi de suspensión concentrada (1 colonia en 5 mi de solución salina) de E. coli.
Como resultado se observó la fluorescencia a los 90 min en la V6, a los 105 min en la V5 y no se observó ni en la V7 ni en la V8, lo que demuestra que la combinación del empleo de las arcillas tridimensionales en combinación con las mezclas nutritivas escogidas entre aquellas que acortan la fase lag de crecimiento aceleran la detección e identificación microbiana en comparación con el empleo solamente de la composición, o de ésta con otro tipo de estructuras.
Ejemplo 4
En general el método se ejecutó según el ejemplo 1 , con las siguientes diferencias: Se tomaron para la prueba de promoción de crecimiento de bacterias el hidrolizado papaínico de músculo de corazón, según el Certificado de Autor de Invención de Cuba No. 22442 en cantidad de 0,2 g/l de agua desionizada.
Se incubó la base por 8 h a 37 °C en atmósfera aerobia y se monitoreó el incremento de la densidad óptica en un espectrofotómetro a 680 nm.
La base nutritiva mostró una reducción de la fase lag de crecimiento de Enterococcus en 120 min.
Para la preparación del dispositivo (variante 9) para ejecutar el método, se seleccionó este hidrolizado y se disolvió en 1 I de agua desionizada como primer solvente en cantidad de (10 g/l equivalente a 10 mg/g de estructura) y se le añadieron sales para regular el posible cambio de pH provocado por la estructura tridimensional en específico fosfato dipotásico (3,5 g/l, equivalente a 8,75 mg/g de estructura), fosfato monopotásico (1 ,5 g/l, equivalente a 3,75 mg/g de estructura) y cloruro de sodio (5 g/l, equivalente a 12,5 mg/g de estructura), lo que hace un total de mezcla nutritiva de 50 mg/g). A la estructura se le adicionó como marcador fluorogénico metilumbeliferil^-glucósido en cantidad de 0,075 g/l, equivalente a 0, 1875 mg/g de estructura arcillosa tridimensional.
Previamente se esterilizaron los componentes en autoclave a 121 °C por 15 min. La presencia de Enterococcus se observó por la fluorescencia azulosa a los 120 min.
Ejemplo 5
En general el método se ejecutó según el ejemplo 4, con las siguientes diferencias:
Se tomaron para la prueba de promoción de crecimiento de bacterias (Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC 19434, Enterococcus avium ATCC 14025) el hidrolizado papaínico de músculo de corazón, según el Certificado de Autor de Invención de Cuba No. 22442 en cantidad de 0,2 g/l de agua desion/zada.
Se incubaron las bases por 8 h a 37 °C en atmósfera aerobia y se monitoreó el incremento de la densidad óptica en un espectrofotómetro a 680 nm.
Las bases nutritivas mostraron una reducción de la fase lag de crecimiento de 2 h. Para la preparación del dispositivo para ejecutar el método, se duplicaron las concentraciones de cada componente a embeber en las estructuras. A los 90 min se observó un cambio de color en el segundo solvente, ligeramente azuloso, con respecto al original que era verdoso para ambos dispositivos con estructuras tridimensionales arcillosas para E. avium.
A los 150 min se observó la aparición de fluorescencia en el segundo solvente, para el dispositivo de 7,5 x 103 m2/m3 de superficie específica (variante 10) y ligera fluorescencia para el dispositivo con superficie específica de 2 x 103 m2/m3 (vanante 1 1 ) para E. avium.
A los 210 min E. faecalis fue detectado en el dispositivo de la variante 1 1 por la aparición de fluorescencia.
A los 240 min todos los microorganismos mostraron fluorescencia en las estructuras tridimensionales.
Ejemplo 6
Se ejecutó según el ejemplo 1 , con las siguientes diferencias:
Se prepararon 3 dispositivos: el de la variante 1 1 (V 1 1 ) con la superficie específica de 2 x 103 m2/m3, el de la variante 12 (V12) con la superficie específica de 3,3 x 103 m2/m3 y la variante 13 con la superficie específica de 1 ,5 x 103 m2/m3.
El tiempo de contacto de las composiciones de las variantes fue de 180 min.
Al concluir la etapa de absorción, se eliminó el primer solvente sometiendo las estructuras tridimensionales a secado a temperatura de 60 °C en horno de vacío, por un período de 60 min.
Se puso en contacto una suspensión de E. coli en solución isotónica salina en concentración de 1 colonia en 5 mi y de ella se tomaron 0,1 mi y se aplicaron sobre la superficie del dispositivo.
A los 90 min se observó fluorescencia en el dispositivo con la estructura de la variante 1 1 (V1 1 ).
A los 210 min se observó fluorescencia en los otros dos dispositivos (V12 y V13) con las estructuras de superficie específica de 1 ,5 x 103 m2/m3 a 3,3 x 103 m2/m3.
Ejemplo 7
Similar a la variante 1 del ejemplo 1 , con la diferencia que se conforman las siguientes variantes:
V14 - Caolinita en conglomerados compactada con un peso total de 0,2 g, impregnada con la composición nutritiva según la V2 del ejemplo 1 . Los espacios entre las partículas de caolinita conforman cavidades de disímiles formas, de tamaño correspondiente a micro- y macro- cavidades.
V15 - Bentonita en polvo molinada por molino de bolas y compactada con posterioridad con un peso total de 0,2 g, impregnada con la composición nutritiva según la V2 del ejemplo 1 . Los espacios entre las partículas de caolinita conforman cavidades de disímiles formas, de tamaño correspondiente a micro- cavidades.
Se absorben las estructuras por 4 h con las composiciones nutritivas y se secan al vacío por 3 h a 60 °C.
Se pone en contacto una suspensión de E. coli en solución isotónica de fosfato de sodio en concentración de 106 UFC/ml con 0,1 g de las estructuras tridimensionales en cantidades de 0,2 mi (relación de 2 ml/g).
La fluorescencia de E. coli se observa a ios 280 min. Ejemplo 8
La cepa de E. coli ATCC 25922 se ensaya como se describe en el ejemplo 1 , y se conforma según la V2 de ese ejemplo, y se confecciona una composición nutritiva según se describe en esa variante 2 del ejemplo 1 , con excepción que solamente se adiciona el sustrato fluorogénico 4-metilumbelliferil-p-D-glucurónido (MUG) en cantidad de 0,2 g/l.
La mezcla nutritiva conjuntamente con el marcador enzimático y demás componentes disueltos en el primer solvente se ponen en contacto con tres estructuras tridimensionales.
La primera estructura de naturaleza cerámica artificial está compuesta por una nano- capa de hidroxiapatita con nanoporosidad, superficie específica de 50 x 106 m2/ m3 y con nano- cavidades, de 20 nm de altura que, descansa sobre una capa inferior de agaropectina en cantidad de 0,5 g/g. La estructura descansa, a su vez, sobre toda la superficie de un disco impermeable de derivados de la celulosa, específicamente nitrato de celulosa de 6 cm de diámetro para conformar un primer dispositivo (variante 16).
La segunda estructura, pero de tierra silícea con una superficie específica de 3 x 105 m2/m3 a 1 x 106 m2/m3 y porosidad en el rango de las nano- y micro- cavidades se mezcla con los ingredientes de la composición nutritiva y con adición de agar (0,3 g/g) disueltos en el primer solvente. El segundo dispositivo se prepara colocando la estructura de tierra silícea descrita en un cilindro de 3 mm de altura por 90 mm de diámetro (variante 17).
La tercera estructura tridimensional, compuesta por hidroxiapatita con una superficie específica de mínima de 1 ,25 x 103 m2/m3 con macro- y micro- cavidades irregulares, seguida de una estructura tridimensional de zeolita con una superficie específica mayor de 5 x 03 m2/m3. Se absorben en la primera y segunda estructuras las composiciones nutritivas del ejemplo 1 , variante 2 y el sustrato fluorogénico descrito en esa variante. La altura del conjunto de las estructuras tridimensionales alcanza los 10 cm y el diámetro de 4 cm. Con ella se conforma un dispositivo, colocando esta columna tridimensional en un tubo de material impermeable con una abertura en la parte superior y otra inferior, de forma tal, que el tubo de material impermeable (derivado del cloruro de vinilo) rodea la estructura en el 90 % de la superficie externa (variante 8).
Se pone en contacto una suspensión de E. coli en solución isotónica salina en concentración de 102 UFC/ml con toda la superficie del primer dispositivo (V16) con ayuda de un hisopo de alginato de sodio. A continuación se mantiene la estructura tridimensional a temperaturas de 35 ± 2 °C, en condiciones aerobias por un período de 120 min y se detecta el crecimiento por la emisión de fluorescencia bajo luz a 366 nm con ayuda de un sensor y se identifica por la actividad glucuronidasa.
Se pone en contacto la suspensión de E. coli en solución isotónica salina en concentración de 10 UFC/ml con toda la superficie del segundo dispositivo (V17) con ayuda de una pipeta automática y se distribuye con una espátula de Drigalski. A continuación se mantiene la estructura tridimensional a temperaturas de 35 ± 2 °C, en condiciones aerobias por un período de 240 min y se detecta el crecimiento por la emisión de fluorescencia bajo luz a 366 nm con ayuda de un sensor y se identifica por la actividad glucuronidasa.
Se pasa una muestra de 10 I de agua desionizada, contaminada artificialmente con E. coli a concentración de 8 UFC/10 I a través de todo el volumen del dispositivo y se pone a incubar en las condiciones descritas en los experimentos anteriores. Después de 210 min se observa fluorescencia en el interior del dispositivo. Ejemplo 9
Se evaluaron cuatro estructuras tridimensionales de arcillas o cerámicas naturales con dos composiciones nutricionales para la identificación de bacterias Gram-negativas.
La selección de los componentes nutritivos se ejecutó según el ejemplo 1 .
Con esta composición se prepararon diferentes dispositivos para ejecutar el método.
Los soportes seleccionados fueron las cerámicas HAP-S (superficie específica de 7,5 x 103 m2/m3) y HAP-56 (superficie específica de 3 x 105 m2/m3), además de tierra silícea calcinada y purificada (TSC) (superficie específica de 5,3 x 104 m2/m3).
Se preparó una mezcla nutritiva, con marcadores fluorogénico y cromogénico y otros componentes según la V1 del ejemplo 1. Se preparó en paralelo otra mezcla de un compuesto fluorogénico con sales y otros componentes según la siguiente composición: sulfato de amonio [(NH4)2S04] 5,0 g/l del primer solvente; hidrógeno fosfato de potasio [K2HP04] 0,45 g/l; di-hidrógeno fosfato de potasio [KH2P0 ] 0,31 g/l; hidrógeno fosfato de sodio [Na2HP0 ] 0,92 g/l; cloruro de sodio [NaCI] 0, 1 g/l; cloruro de calcio [CaCI2] 0,05 g/l; sulfato de magnesio heptahidratado [MgS04.7H20] 0,2 g/l; L-histidina monoclorhidrato 0,005 g/l; L-triptófano 0,02 g/l; L-metionina 0,02 g/l y dextrosa 10,0 g/l y MUG en cantidad de 0,2 g/l.
Ambas composiciones se ajustaron a 6,8 de pH y se esterilizaron por filtración a través de unidades de filtración desechables Nalgene (0,2 μιη, tamaño del poro) (Nalge Co., Rochester, N.Y.).
La preparación de las estructuras tridimensionales con las mezclas se realizó siguiendo la siguiente metodología:
-se pesó por independiente 1 g de cada soporte estructurado en contenedores resistentes al calor seco
-se esterilizaron a 180 °C por 1 h, se adicionó 2 mi de la composición nutricional o de la mezcla del marcador enzimático con sales y otros componentes (MCS) estéril por filtración bajo flujo laminar vertical y se embebieron durante 1 h en la estructura, se destaparon y se dejaron bajo flujo laminar vertical hasta su la eliminación del primer solvente durante 3 h, bajo condiciones de asepsia se re envasó una porción de 0, 1 g del dispositivo, de forma tal que su diámetro y altura fuera de 0,5 cm, así obtenido a un contenedor de vidrio calidad hidrolítica 1 , transparente, con tapa y de capacidad máxima 2 mi. Los dispositivos finales contenían: sulfato de amonio [(NH4)2S04] 10 mg/g de estructura tridimensional; hidrógeno fosfato de potasio [K2HP04] 0,9 mg/g; dihidrógeno fosfato de potasio [KH2P04] 0,62 mg/g; hidrógeno fosfato de sodio [Na2HP04] 1 ,84 mg/g; cloruro de sodio [NaCI] 0,2 mg/g; cloruro de calcio [CaCI2] 0, 1 mg/g; sulfato de magnesio heptahidratado [MgS04.7H20] 0,4 mg/g; L-histidina monoclorhidrato 0,001 mg/g; L-triptófano 0,04 mg/g; L-metionina 0,04 mg/g y dextrosa 20,0 mg/g y MUG en cantidad de 0,4 mg/g, para un total de 34,55 mg/g.
El diseño experimental abarcó las siguientes variantes de ensayo:
Tipos de soporte
Composición MCS
nutritiva
HAP-S V18 V22
HAP-56 V19 V23
TSC V20 V24
Para la inoculación de todas las variantes de estudio, se prepararon suspensiones microbianas de aproximadamente 108 UFC/ml, en 9 mi de una disolución salina estéril al 0,85% (p/p), a partir de cultivos puros de Escherichia coli ATCC 25922 incubados hasta 24 h. El volumen del inoculo fue de 0,2 mi para cada variante de ensayo, garantizando una concentración del inoculo de 2 x 107. Los dispositivos inoculados fueron incubados a 35 ± 2 °C en condiciones aerobias.
La lectura se realizó de forma visual utilizando lámpara UV de 366 nm cada 30 min.
Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente tabla, declarando el período en horas.min de la respuesta positiva a la fluorescencia.
Dispositivos con mezcla
+ marcadores + Microorganismo Dispositivos MCS
otros componentes
HAP-S HAP-56 TSC HAP-S HAP-56 TSC
(V18) (V19) (V20) (V22) (V23) (V24)
2:30 3:30 2:30 E. coli 24:00 5:00 24:00 Este indicador demuestra que la especie microbiana posee una actividad enzimática en correspondencia con el marcador enzimático empleado en las composiciones.
Se demuestra además, que no es obvio que cada composición nutritiva combinada con una estructura arcillosa tridimensional responda en un menor o período de tiempo a la detección o identificación de los microorganismos.
Se demuestra además, que la combinación de las estructuras arcillosas o cerámicas con las mezclas nutritivas, los marcadores enzimáticos y demás ingredientes acelera la identificación con respecto a las variantes de la V21 a la V23 que no poseían los componentes nutritivos basados en los hidrolizados y extractos de proteínas protegidos anteriormente por los autores de la presente invención, demostrando lo imprescindible de emplear composiciones que prevén la disminución de la fase lag de crecimiento de las bacterias para disminuir el tiempo de detección e identificación.
Este experimento también demostró que sorprendentemente las composiciones nutricíonales diseñadas son capaces de atenuar o eliminar el efecto inhibitorio o aplicación antibacteriana de esta estructura descrito por varios autores para determinados procesos biotecnológicos, en especial de la zeolita (V21 ) cuando se le adiciona una composición nutritiva especialmente diseñada para eliminar ese efecto antibacteriano.
Ejemplo 10
Se evaluaron las cuatro estructuras tridimensionales de arcillas o cerámicas naturales con dos composiciones nutricíonales para la identificación de bacterias Gram-negatívas descritas en el ejemplo anterior (ejemplo 9).
La selección de los componentes nutritivos se ejecutó igualmente según la metodología del ejemplo 1 , pero con una cepa de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Se evaluaron hidrolizados enzimáticos individuales y en mezclas, entre ellos hidrolizado papaínico de tejido de corazón de res, según Certificado de Autor de Invención de Cuba 22442, e hidrolizado pancreático de músculo de corazón y sus mezclas. Los resultados mostraron que para los 3 casos la fase lag tuvo una duración máxima de 120 mín, por lo que ambos fueron seleccionados para conformar la composición nutritiva.
Con esta composición se prepararon diferentes dispositivos para ejecutar el método. Se preparó una mezcla nutritiva, con marcadores fluorogénico y cromogénico y otros componentes según la V1 del ejemplo 1 . Se preparó en paralelo otra mezcla de un compuesto fluorogénico con sales y otros componentes según lo descrito en el ejemplo anterior (MCS).
El resto de la preparación de los dispositivos y de la inoculación se efectuó según lo descrito en el ejemplo 9, con la diferencia que al experimento se le incorporó la inoculación en los dispositivos de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y de Enterococcus faecalis ATCC 29212. El diseño experimental abarcó las siguientes variantes de ensayo:
Tipos de soporte
Composición MCS
nutritiva
HAP-S V18 V21
HAP-56 V 9 V22
TSC V20 V23
Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente tabla, declarando el período en horas:min de la respuesta positiva a la fluorescencia.
Dispositivos con mezcla
+ marcadores + otros Microorganismo Dispositivos con MCS
componentes
HAP-S HAP-56 TSC HAP-S HAP-56 TSC
(V18) (V19) (V20) (V22) (V23) (V24)
3:00 24:00 P. aeruginosa 3:00 -
E. faecalis
Se observó de manera inesperada la aparición de fluorescencia verdosa de Pseudomonas en las estructuras cerámicas tridimensionales en sólo 3 h en la variante V 8, efecto antes nunca logrado en los diagnosticadores conocidos.
En segundo lugar se demuestra cómo para detectar determinados microorganismos e identificarlos en un período mínimo de tiempo es de vital importancia la superficie específica y la talla de las cavidades (3 h para la V18 y 24 h para la V19). Además la dependencia del tipo de arcilla específica en combinación con una mezcla que pueda eliminar el efecto inhibidor de estas arcillas o cerámicas (se detecta en V18 y no se detecta en V20 o V21 ).
Se demuestra que la combinación de 2 estructuras con composiciones diferentes unidas en un solo dispositivo (V19 + V22) conllevan finalmente a la identificación de los microorganismos diana.
Una vez más se corrobora que las composiciones nutritivas específicas seleccionadas entre las que recortan la fase lag de crecimiento a unos minutos garantizan la detección, identificación y recuperación en sólo minutos (280 min). Se comprobó el carácter selectivo del dispositivo al inhibir E. faecalis, pues la composición embebida en la estructura arcillosa, en conjunto con ésta lograron inhibirlo incluso a concentraciones tan elevadas del orden 107 UFC/ml.
Ejemplo 1 1
Evaluación de tres tipos de estructuras tridimensionales de arcillas o cerámicas naturales (HAP-S, HAP-56 y TSC) con dos composiciones nutricionales para la identificación de bacterias Gram positivas.
Se tomaron para la prueba de promoción de crecimiento de bacterias (Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes) varias mezclas de bases nutritivas, entre ellas extracto de Saccharomyces cerevisiae obtenido por hidrólisis enzimática según se describe en el Certificado de Autor de Invención de Cuba 22221 , hidrolizado enzimático de sangre bovina (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22208), hidrolizado enzimático de caseína (Certificados de Autor de Invención de Cuba 22089, hidrolizados enzimáticos de soya comercial y extracto de carne comercial.
La primera mezcla (M1) contenía: extracto de Saccharomyces cerevisiae - 3,24 g/l; hidrolizado enzimático de sangre bovina - 6,37 g/l; hidrolizado enzimático de caseína - 9,97 g/l; peptona de soya comercial - 3,24 g/l y extracto de carne comercial - 2,43 g/l.
La segunda mezcla (M2) contenía: extracto de Saccharomyces cerevisiae - 5,0 g/l; hidrolizado enzimático de sangre bovina - 5,0 g/l; hidrolizado enzimático de caseína - 5,0 g/l; peptona de soya comercial - 6,0 g/l y extracto de carne comercial - 3,0 g/l.
La tercera mezcla (M3) contenía: extracto de Saccharomyces cerevisiae - 6,0 g/l; hidrolizado enzimático de sangre bovina - 6,0 g/l; hidrolizado enzimático de caseína - 3,0 g/l; peptona de soya comercial - 6,0 g/l y extracto de carne comercial - 4,0 g/l.
Los productos a ensayar se inocularon con 0, 1 mi de una suspensión de los microorganismos diana a concentración de 3 x 108 UFC/ml.
Se incubaron las bases por separado y la mezcla por 8 h a 37 °C en atmósfera aerobia y se monitoreó el incremento de la densidad óptica en un espectrofotómetro a 680 nm.
Todas las variantes acortaron la fase lag a sólo 1 h para el S. pyogenes y para S aureus la duración de ésta fase fue de sólo 2 h. Se escogió entre ellas la M3, pues el crecimiento de S. pyogenes fue algo más intenso en ella.
Se ensayaron las composiciones nutricionales siguientes:
- composición nutritiva (STR-STAP) compuesta por: hidrolizado enzimático de caseína según el Certificado de Autor de Invención de Cuba 22166 (3,0 g/l), extracto de levadura Saccharomyces cerevisiae según el
Certificado de Autor de Invención de Cuba 22221 (6,0 g/l) y el hidrolizado enzimático de sangre según el Certificado de Autor de Invención de Cuba 22208 (6,0 g/l). Además se incorporó el extracto de carne comercial (4,0 g/l); digerido papaínico de proteínas de soya (6,0 g/l). Se adicionaron además otros componentes, tales como el talio acetato (0,014 g/l); ácido nalidíxico sal sódica (0,008 g/l); DL-fenilalanina (1 ,0 g/l); citrato férrico amónico (0,5 g/l); sodio cloruro (0,2 g/), dextrosa (0,1 g/l) y como marcador fluorogénico se adicionó 0,2 g/l de MU-fos;
- composición adicional sintética sin hidrolizados ni extractos (MCS según ejemplo anterior) con la adición de 4-metilumbeliferil fosfato (MU-fos) en cantidad de 0,2 g.
Las composiciones se disolvieron en proporción con un primer solvente (agua desionizada) y se ajustó su pH a 7,3. Se esterilizaron por filtración a través de unidades de filtración desechables de 0,2 pm.
La preparación de los dispositivos se realizó siguiendo la metodología descrita en el ejemplo 10 y el diseño experimental abarcó las siguientes variantes de ensayo: Composición
Estructura MU-fosfato MU-fosfato
STR-STAP MSC
HAP-S V26 V29
TSC V27 V30
Sin estructura
V28
tridimensional
Para el ensayo se seleccionaron las especies diana Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Streptococcus pyogenes ATCC 19615. La preparación de las diluciones, su inoculación e incubación se ejecutó como en el ejemplo 10.
En las tablas siguientes se muestra el período (en h:min) del desarrollo de la fluorescencia una vez para las especies microbianas evaluadas frente a cada marcador enzimático empleando solamente las composiciones de las variantes de la 24 a la 27, o sea solamente las que contienen la mezcla nutritiva.
Dispositivo Microorganismo
Sin estructura
HAP-S TSC
tridimensional
3 00 5Ϊ00 24:00 S. aureus
4: 00* 24:00* - S. pyogenes
*: fluorescencia débil pero perceptible
La evaluación realizada con este sustrato fluorogénico demostró que las variantes más satisfactorias en cuanto a rapidez en la respuesta fueron las combinaciones STR-STAP con HAP-S (variante 24) que en sólo 3 - 5 h de incubación permitió la detección de S. aureus y de S. pyogenes.
La variante 25 posibilitó la detección de microorganismos de muy alta exigencia nutritiva, como S. aureus en sólo 5 h y para S. pyogenes se logró en 24 h.
Una vez más se demostró que sólo la combinación de las mezclas nutritivas con los marcadores enzimáticos y las estructuras cerámicas tridimensionales (V24- V25) son capaces de acelerar la detección microbiana con respecto a las composiciones solas (V26) o incluso lograr su detección (V26 negativa para S. pyogenes). Otras combinaciones se ejecutaron para conformar dispositivos compuestos de 2 estructuras con dos composiciones diferentes, una conteniendo los hidrolizados y extractos u otra sintética:
V24 + V27 = V29
V25 + V28 = V30
V24 + V28 = V31
V25 + V27 = V32
La combinación de las estructuras de las variantes estudiadas arrojó mejores resultados en cuanto al tiempo de detección para uno de los dispositivos combinados y no fue necesaria la combinación para el resto, tal y como se describe a continuación:
- la combinación de la HAP-s con la composición nutritiva original con esa misma estructura tridimensional, pero con la composición sintética (V32), redujo el tiempo de detección de S. aureus de 5 h a 3 h y para S. pyogenes de 24 h a 4,30'h.
Ejemplo 12
Estudio de la respuesta de diferentes dispositivos y del método frente a una muestra de orina. La conformación de los dispositivos se realizó utilizando cuatro tipos de estructuras tridimensionales de arcillas naturales y artificiales y cerámicas (HAP-S, HAP-56) combinadas cada una con la composición descrita en la variante 1 del ejemplo 1 y ejecutando el método como se describe en el ejemplo 9.
El inoculo utilizado fue de 0,2 mi de la muestra para cada variante.
En paralelo la muestra fue evaluada por el procedimiento tradicional utilizando los medios agarizados CromoCen CC y agar azul bromotimol lactosa (ABL).
En ambos esquemas de ensayo (nuevo método con el dispositivo arcilloso y método tradicional) las muestras inoculadas fueron incubadas a 35 °C. La lectura del ensayo con la aplicación del dispositivo se realizó cada 30 min utilizando lámpara UV de 366 nm.
En la siguiente tabla se indica el período (en h:min) en que se detectó la fluorescencia, lo que demostró la presencia de infección en la muestra clínica, relacionada con una especie positiva al marcador enzimático empleado. HAP-S + CCL (V33) HAP-56 + CCL (V34)
3:00 2W
La combinación CCL con HAP-56 fue la variante que respondió con mayor rapidez 2 h con 30 min, seguida de la combinación con la estructura HAP-S que fue en 3 h. Este resultado indica que E. coli es el germen causante de la infección, teniendo en cuenta la selectividad de la composición nutritiva y del dispositivo y que en la mayoría de los casos registrados en este tipo de muestras responde a esta especie.
Por los procedimientos convencionales sólo se detectó E. coli en ambos medios (CromoCen CC y ABL) a las 24 h.
De esta manera se demostró lo acertado del nuevo método y del dispositivo y que se aceleró el procedimiento en al menos 8 veces.
Ejemplo 13
Estudio de la relación entre la capacidad nutricional de las composiciones y el desarrollo de la actividad enzimática microbiana sobre un marcador enzimático. Para ello, se seleccionó como referencia el nano-compuesto CCL con HAP-S, conformado según lo descrito en el ejemplo 9. Por otro lado, se preparó una variante que utilizó como soporte HAP-S, la cual se embebió en una solución acuosa de MUG en concentración de 0,2 g/l (p/v) y posteriormente se deshidrató siguiendo la misma metodología detallada en el ejemplo 9.
Como microorganismo de ensayo se utilizó un cultivo puro de E. coli, a partir del cual se preparó una suspensión del orden de las 108 UFC/ml. Para el estudio se tomó un volumen de 0,2 y 0,4 mi, logrando inóculos a aplicar en las estructuras del orden de hasta 07 y se inoculó en paralelo en ambos dispositivos: CCL con HAP-S (V35) y MUG con HAP-S (V36).
Las variantes se incubaron a 35 °C y cada 30 min se observó la respuesta a fluorescencia utilizando UV de 366 nm.
Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente tabla, destacando el tiempo en h:min en que se apreció la respuesta positiva a fluorescencia. Volumen de inoculo (ml)/densidad final 0,2 ml/107 0,4 ml/10a
CCL/HAP-S 2: 00 1 :30
MUG/HAP-S 4:00 3:30
Este experimento demostró la significativa influencia que tiene la combinación de los hidrolizados o extractos obtenidos a partir de sustancias nutritivas de naturaleza proteica presentes en la composición nutritiva utilizada. Ello posibilitó que la especie microbiana se adaptó con mayor rapidez a las condiciones del dispositivo y expresó durante su desarrollo, dentro de la fase lag (2 h) la actividad enzimática que permitió, en este caso, su identificación frente al marcador enzimático utilizado en un periodo mínimo de 1 h con 30 min.
Sin embargo, para la estructura que contenía sólo el sustrato fluorogénico la respuesta se encontró 2 h más tarde, pues esta se basa no en la activación de mecanismos enzimáticos, sino en detectarlos a muy elevadas concentraciones, que es el método empleado en las soluciones descritas anteriormente en el estado del arte. Ejemplo 14
Estudio de la influencia del pH de la composición sobre la acción del sustrato fluorogénico para revelar la actividad enzimática microbiana.
Utilizando la composición CCL descrita en el ejemplo 9, se prepararon cuatro variantes experimentales a diferentes valores de pH (6,6 - 6,8 - 7,0 - 7,2). Cada vanante se esterilizó por filtración y de forma independiente se embebieron en la cerámica HAP-S (variante 37) y se inocularon e incubaron siguiendo el procedimiento referido en el ejemplo 9.
En la siguiente tabla se recogen los resultados del tiempo (h:min) de respuesta positiva a la fluorescencia, como indicador de la actividad enzimática microbiana sobre el marcador utilizado.
pH de la composición 6,6 6,8 7,0 7,2
CCL/HAP-S 1 :30 1 :30 2:00 1 :30
Los resultaron demuestran que no existe una influencia significativa del pH de la composición sobre la detección de la actividad enzimática del microorganismo (E. coli) con el marcador enzimático seleccionado (MUG). La respuesta positiva se detectó en el período comprendido entre 1 h y 30 min a las 2 h de cultivo.
Ejemplo 15
Evaluación de cuatro estructuras tridimensionales de arcillas o cerámicas naturales (HAP-S, HAP-56 y TSC) utilizando dos composiciones nutricíonales y dos marcadores enzimáticos por independientes para la identificación de especies del género Candida.
Para seleccionar el o los compuestos nutritivos se estudió la reducción de la duración de la fase lag con el extracto vegetal de Ipomoea batatas desarrollado anteriormente por los autores de la presente invención, el hidrolizado enzimático de caseína, la peptona de soya, una mezcla de peptonas e hidrolizado enzimático de levadura, todos en cantidades de 0,2 g/l. Se monitoreó la densidad óptica cada 1 h en un espectrofotómetro a 380 nm. Como resultado se observó que para C. albicans el extracto de Ipomoea batatas acortaba la fase lag en al menos 1 h con respecto a los demás componentes, llagando sólo a 16 h.
Las primeras variantes experimentales se prepararon utilizando como primer marcador enzimático el sustrato fluorogénico MU-fos. El sustrato se adicionó en cantidad de 0,2 g a la composición CND constituida por: extracto de Ipomoea batatas 20,0 g; extracto de levadura Saccharomyces cerevisiae 10,0 g; fosfato monopotásico 1 ,0 g; magnesio sulfato 0,5 g; sodio desoxicolato 0,5 g y ácido nalidíxico 0,03 g, para un litro de agua desionizada.
La otra composición utilizada fue el medio MCS, al cual se le adicionó MU-fos en igual cantidad (0,2 g/l).
En paralelo se prepararon variantes similares empleando como marcador enzimático el sustrato L-prolina metilcoumarina (L-Pro), adicionado en cantidad de 0,2 g a las composiciones CND y MCS, respectivamente.
Las composiciones nutritivas preparadas con los marcadores enzimáticos y demás ingredientes preparados para cada variante experimental se disolvieron en proporción con un litro de agua desionizada como primer solvente y se les ajustó el pH a 6,6. Se esterilizaron por filtración a través de unidades de filtración desechables de 0,2 pm.
La preparación de las estructuras se realizó siguiendo la metodología descrita en el ejemplo 9 y el diseño experimental abarcó las siguientes variantes de ensayo: Marcador enzimático y medio de cultivo
Estructura MU-fosfato L-prolina
CND MCS CND MCS
HAP-S V38 V41 V44 V47
HAP-56 V39 V42 V45 V48
TSC V40 V43 V46 V49
La evaluación microbiológica se realizó con las cepas de referencia: Candida albicans ATCC 10231 , Candida parapsilosis ATCC 22019 y Candida giabrata ATCC 15126, recién cultivadas en agar dextrosa de Sabouraud durante 36 h. A partir de estos cultivos se prepararon suspensiones en tubos de 9 mi de una disolución salina estéril al 0,85% (p/p), hasta alcanzar una densidad microbiana del orden de 108 UFC/ml.
Se inoculó un volumen de 0,2 mi a cada variante de los dispositivos según el método y se incubó a 35 °C. Utilizando lámpara UV de 366 nm se realizó la lectura de la respuesta fluorescente cada 30 min.
Los resultados obtenidos se muestran de forma independiente para cada marcador enzimático en las tablas siguientes reflejando el período (rv.min) en que detectó la respuesta positiva a la reacción fluorescente.
Sustrato fluorogénico: MU-fos
Medio CND Microorganismo Medio MCS
HAP-S HAP-56 TSC HAP-S HAP-56 TSC
(V38) (V39) (V40) (V41 ) (V42) (V43)
- NU C. albicans - NU
15:00* NU C. parapsilosis 15:00* NU
15:00* NU C. giabrata 15:00* NU
*: fluorescencia perceptible, NU: no útil, - respuesta negativa
Ante todo, es importante resaltar que las tres especies de Candida evaluadas poseen actividad fosfatasa, por lo que en todos los casos las variantes fueron examinadas con el propósito de detectar la respuesta positiva a la fluorescencia frente al sustrato Mu-fos.
Por otro lado, la evaluación de este sustrato fluorogénico (MU-fos), una vez más, demostró su degradación frente a la cerámica HAP-56, ya que desde que se hidrató el nano-compuesto, reveló la aparición de una respuesta positiva a fluorescencia, la cual no está relacionada con la acción enzimática de la especie microbiana. Ello invalida la lectura desde el inicio reportándose como no útil.
Por otro lado, la arcilla TSC, de algún modo bloquea la respuesta ya sea de la actividad enzimática de los microorganismos de ensayo o la del sustrato fluorogénico en específico, ya que no se aprecia durante todo el período de cultivo la funcionalidad biológica del nano-compuesto.
Con respecto a la cerámica HAP-S se detectó una respuesta similar para cada composición ensayada pero variable para cada especie de Candida.
Con C. albicans se detectó que la especie no fue capaz de manifestar su actividad sobre el sustrato MU-fos, en cambio las especies C. parapsilosis y C. glabrata a pesar de resultar con una baja intensidad se observó la aparición de la fluorescencia a las 15 h de cultivo, indicador que no aumentó su intensidad durante un período mayor de incubación.
En general, la respuesta obtenida al utilizar este marcador enzimático (MU-fos) como parte de las composiciones nutricionales, está estrechamente vinculada con la estructura utilizada como soporte nano-estructurado, resultando entre todas las variantes la de Z la más conveniente.
La siguiente tabla refleja los resultados encontrados con el sustrato fluorogénico L-Pro.
Sustrato fluorogénico: L-Pro
Medio CND Microorganismo Medio MCS
HAP-S HAP-56 TSC HAP-S HAP-56 TSC
(V44) (V45) (V46) (V47) (V48) (V49)
15:00 15:00 15:00 C. albicans 15:00 15:00 15:00
15:00 15:00a 15:00 C. parapsilosis 15:00* 15:00a 15:00
C. glabrata
*: fluorescencia débil pero perceptible, a: fluorescencia con mayor intensidad
De acuerdo con otros estudios realizados por los autores de la presente invención para la detección de la actividad enzimática de varias especies de Candida es conocido que las especies C. albicans y C. parapsilosis poseen actividad enzimática L-prolina amidasa. En cambio C. glabrata carece de la acción de dicha enzima. Partiendo de este conocimiento previo, se realizó la lectura particularizando la búsqueda de una respuesta positiva a la fluorescencia para las especies C. albicans y C. parapsilosis.
Se detectó que las variantes fabricadas con las estructuras HAP-S, HAP-56 y TSC para ambos medios de cultivo (CND y MCS), manifestaron resultados satisfactorios al permitir la detección de C. albicans y C. parapsilosis en sólo 15 h. No obstante, de manera original se resalta la mayor intensidad de la respuesta fluorescente, al utilizar la cerámica HAP-56.
Con respecto a la utilización de la zeolita, como soporte con este sustrato fluorogénico, se encontró una incompatibilidad, ya que no reflejó la actividad microbiana o de algún modo bloqueó la degradación del sustrato L-Pro, resultando no idónea la funcionalidad microbiológica del nano-compuesto.
Ejemplo 16
Similar a la variante 1 del ejemplo 1 , con la diferencia que se conforman las siguientes variantes:
V50 - conjunto de arcillas de zeolita natural comprimidas en forma de gragea con un peso total de 0,2 g, con una superficie específica de 3 x 105 m2/m3 impregnada con la composición nutritiva según la V1 del ejemplo 1 .
V51 carbonatoapatita [Ca5(P04,C03)3(OH)] en polvo colocada en un pocilio de 1 cm de altura y 1 cm de alto, con un peso de 0,5 g, con una superficie específica de 4 x 103 m2/m3 y talla de las cavidades de 700 pm, impregnada en la composición nutritiva según la V2 del ejemplo 1 .
V52 - cubos de zeolita con un peso total de 0,2 g, con una superficie específica de 7,0 x 103 m2/m3, impregnada con la composición nutritiva según la V44 del ejemplo 15.
Se absorbieron las estructuras por 1 h con las composiciones nutritivas y se secaron al vacío por 3 h a 60 °C.
Se inoculan con inoculo de 06 UFC/ml de E. coli (V50 y V51 ) y de C. albicans (V52) en un volumen de 0,2 mi (1 ml/g).
La fluorescencia de E. coli se observa a los 180 min en la V50 y 210 min en V51 y la de C. albicans en la V52 a las 18 h.
Ejemplo 17
Se toman para la prueba de promoción de crecimiento de bacterias tales como E. coli, E. coli 0 57.H7, Aeromonas hydrophila, Enterococcus avium y el hongo filamentoso Aspergillus niger. Cada uno de los microorganismos se ensaya con varias bases nutritivas, entre ellas, hidrolizado papainico de músculo de corazón, según el Certificado de Autor de Invención de Cuba No. 22442 en cantidad de 0,2 g/l de agua desionizada, extracto de levadura Saccharomyces cerevisiae según el Certificado de Autor de Invención de Cuba No. 22221 , en cantidad de 0,2 g/l, hidrolizado enzimático de caseína (Certificados de Autor de Invención de Cuba 22166), 0,2 g/l de extracto de Ipomoea batatas, según se divulga en la patente de Cuba 23507; extracto de tomate en cantidad de 0,2 g/l (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22308); e hidrolizado enzimático de sangre bovina (Certificado de Autor de Invención de Cuba 22208) en cantidad de 0,2 g/l. Igualmente se conformó una mezcla de ellas en cantidades de 0,2 g/l cada una de ellas.
Se incuban las bases por separado y la mezcla por 8 h a 37 °C en atmósfera aerobia y se monitorea el incremento de la densidad óptica en un espectrofotómetro a 680 nm.
De todas las variantes, la mezcla nutritiva muestra una reducción de la fase lag de crecimiento de todos los microorganismos de 90 min, a excepción de Aspergillus mientras que las bases individuales muestran una duración de esa fase variable, y en algunos casos superior a las 2 h, por lo que se selecciona la mezcla para los experimentos.
Esta mezcla se disuelve en una solución salina (NaCI a 9,5 g/l) en cantidad de 10 g/l.
Una vez preparada la composición nutritiva, a ésta se le adicionan varios marcadores enzimáticos, uno cromogénico [2-nitrofenil- -D-galactopiranósido (C12H-15NO6)], en cantidades de 1 g/l y tres fluorogénicos (4-met¡lumbelliferil^-D- glucurónido, 4-met¡lumbelliferil-p-D-galactósido y 4-metilumbelliferil-p-D- glucósido) en cantidades de 0,2 g/l cada uno.
A las mezclas de las composiciones nutritivas y marcadores enzimáticos se les adicionaron otras sustancias, tales como promotores de crecimiento, específicamente glucosa (10 g/l); sales inorgánicas, específicamente fosfato monobásico de potasio (5,5 g/l) y fosfato dibásico de potasio (5,5 g/l). La composición nutritiva seleccionada, conjuntamente con los marcadores enzimáticos y demás componentes se encuentran disueltas en el primer solvente en cantidades de 32,6 g/l. Conformada la mezcla nutritiva y conjuntamente con los marcadores enzimáticos y demás componentes disueltos en el primer solvente, se esterilizan por filtración. Las mezclas nutritivas conjuntamente con los marcadores enzimáticos y demás componentes disueltos en el primer solvente se ponen en contacto con una y varias estructuras tridimensionales de cerámicas artificiales, específicamente la hidroxiapatita calcinada y previamente esterilizada a 180 °C por 60 min.
El tiempo de contacto de la composición es de 30 min.
Esta estructura cuenta con una superficie específica de 5 x 103 m2/m3 y está conformada por una pluralidad de nano, micro- y macro- cavidades.
La estructura tridimensional presenta dimensiones de las cavidades correspondientes a combinaciones de todos los diámetros u holguras de las cavidades correspondientes a nano- semimicro- y micro- cavidades con diámetros u holguras de 5 nm a 10 pm en forma de poros. Estas estructuras presentan forma de cilindro de 100 cm de diámetro y 2 cm de altura.
Al concluir la etapa de absorción, se elimina el primer solvente sometiendo las estructuras tridimensionales a secado a temperatura de 60 °C en horno de vacío, por un período de 3 h.
Se comprueba la capacidad de recuperar los microorganismos diana, demostrando que las estructuras poseen límites de detección de menos de 1 UFC/100 mi filtrando 1 I de una suspensión de E. coli artificialmente inoculada hasta concentración de 6 UFC, o sea por 100 mililitros se tienen 0,6 UFC y se logra detectar por fluorescencia y coloración amarillosa de la estructura.
Para el ensayo, se ponen en contacto las suspensiones de los microorganismos diana en solución isotónica salina en concentración de 3 x 106 UFC/ml con las estructuras tridimensionales en cantidades de 1 mi y se distribuyen en la superficie.
A continuación se mantienen las estructuras tridimensional a temperaturas de 35 ± 2 °C, en condiciones aerobias por un período de hasta 4 h coincidente con la duración de la fase lag de crecimiento de E. coli.
Al concluir la incubación por un máximo de 4 h se detecta la presencia de los microorganismos objeto en todas las variantes, en un caso inoculadas individualmente con cada microorganismo y en otro caso con la mezcla de ellos. En el caso de E. coli, se observa fluorescencia y cambio de color en la estructura a amarillento; para E. coli 0157:H7 y Aeromonas hydrophila, sólo se observa el cambio de color de la estructura. Para todos ellos la detección se ejecuta en 2 h. En el caso de Enterococcus avium se observa fluorescencia azul sin cambio de color en la estructura a las 3 h y hongo filamentoso crece como una estructura negra en la superficie del dispositivo, pero antes se aprecia coloración amarilla en la zona de crecimiento. En el caso en que se inocula la muestra con la mezcla de microorganismos se aprecian todas las reacciones.
Ejemplo 18
La cepa de S. aureus se ensaya como se describe en el ejemplo 11 , y se conforma, según la V26 de ese ejemplo, una composición nutritiva y dispositivo con la diferencia que la estructura tridimensional está conformada en forma de un disco de 0,1 mm de altura y 60 cm de diámetro. Un volumen de aire de 3 m3 se hace pasar por todo el volumen con ayuda de un dispositivo para filtración de aire que lo succiona por presión negativa. Se simula la contaminación con la cepa de ensayo a concentración de 105 UFC/m3 antes de filtrar el aire, para comprobar si su flujo influye en la desecación de la estructura o en su funcionamiento. Expuesto el dispositivo al aire éste se humedece con el segundo solvente, consistente en agua destilada y se coloca a incubar a la temperatura y condiciones descritas en el ejemplo 1 1 . S. aureus se logra identificar a los 240 min.
Ejemplo 19
Similar al ejemplo 1 , con la diferencia que se elaboran dos dispositivos según la V1 del ejemplo 1 . A un dispositivo se le adiciona ciprofloxacina en cantidad de 0,003 pg y en otra gentamicina en cantidad de 0,2 pg. Se inoculan 0,2 mi de la suspensión microbiana de una cepa de E. coli aislada de urocultivo con una concentración de 3 x 108 UFC/ml y se incuba por 4 h. Se observa ausencia de crecimiento de E. coli a las 4 h en el dispositivo que contiene ciprofloxacina y fluorescencia en el dispositivo que contiene gentamicina.

Claims

REIVINDICACIONES
Método para la detección, recuperación, identificación y/o enumeración simultánea de microorganismos caractenzado por: disolver o suspender una mezcla nutritiva estimuladora del crecimiento microbiano, en un solvente en cantidades de 1 a 50 g/l y uno o varios marcadores enzimáticos cromogénicos, fluorogénicos o bioluminiscentes disueltos en un solvente, absorber los componentes en una o varias estructuras tridimensionales de arcillas o cerámicas naturales o artificiales; eliminar el solvente; poner en contacto las células microbianas o las muestras que las contienen con la estructura tridimensional en presencia de un segundo solvente; mantener las estructuras en condiciones tales que garantice un crecimiento e identificación de la pluralidad de los m.o. por la degradación de los marcadores en el interior de los nano-, micro- y macro- cavidades y en la superficie de las estructuras manteniéndolas a a temperatura de 20 a 50 °C por un período coincidente con la mayor duración de la fase lag y del final de la fase de aceleración del crecimiento del microorganismo de más lento desarrollo y detectar, identificar y enumerar la pluralidad de microorganismos.
Método según la reivindicación 1 , caracterizado por una mezcla nutritiva que se selecciona entre los hidrolizados enzimáticos de alga Spirulina platensis; extracto de Saccharomyces cerevisiae obtenido por hidrólisis enzimática e hidrolizado enzimático de levadura forrajera Torula; extracto de Ipomoea batatas, extracto de tomate; hidrolizados enzimáticos de tejido de corazón de res, de sangre bovina y de hígado de res; hidrolizados enzimáticos de lactoalbúmina obtenida de suero de queso, hidrolizados enzimáticos o ácidos de caseína de suero de mantequilla, e hidrolizado o autolizado de Eudríllus eugeniae.
Método según la reivindicación 1 , caracterizado por estructuras tridimensionales de arcillas y cerámicas naturales o artificiales, que se seleccionan entre la caolinita, halloisita, dickita, nacrita, crisolita, antigorita, lizardita, vermiculita, mica, hectorita, saponita, hidrotalcita, muscovita, clorita, la tierra de diatomea, bentonitas (montmorillonita, sauconita, beidellinita, nontrolita), clinoptilotitas, hidroxiapatitas, zeolitas y fosfatos de calcio, o sus combinaciones con una superficie específica de 2 x 103 a 6 x 108 m2/m3 conformadas por una pluralidad de nano-, micro- o macro- cavidades o sus combinaciones;
4. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por adicionar al primer solvente uno o varios marcadores enzimáticos cromogénicos, fluorogénicos o bioluminiscentes en cantidades de 0,01 a 2 g/l.
5. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por la adición a la mezcla nutritiva de otros hidrolizados enzimáticos, hidrolizados químicos o extractos de proteínas de algas, microorganismos, partes vegetales, tejidos animales superiores y sus combinaciones en cantidades de 1 a 10 g/l.
6. Método según las reivindicaciones 1 , caracterizado porque los fosfatos de calcio son: metafosfato [Ca(P03)2], fosfato monocálcico mono-hidratado [Ca(H2P04)2 H20], di-hidrógeno fosfato tetracalcico (Ca4H2P602o), fosfato heptacálcico [Ca7(P5016)2], pirofosfato de calcio (Ca2P207 y Ca2P207 2H20), fosfato dicálcico [CaHP04, CaHP04-2H20 y Ca(H2P04)2], tricálcico [Ca3(P0 )2], fosfato octacálcico [Ca8H2(P0 )6 5H20], hidroxiapatita deficiente en calcio [Ca-i o-x(HP0 )x(P04)6-x(OH)2-x], hidroxiapatita [Cai0(PO4)6(OH)2], fosfato tetracálcico [Ca40(P04)2], apatita [Ca10(PO4)6(OH,F,CI,Br)2], carbonatoapatita [Ca5(P04,C03)3(OH,F)] o combinaciones indistintamente de dos o mas de cualquiera de ellos.
7. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por utilizar como primer solvente el agua destilada; o agua desionizada; o soluciones acuosas de sales tales como de cloruro de sodio, de fosfatos; alcoholes y soluciones alcohólicas, como la solución de fucsina básica al 10% p/v en alcohol etílico, u otras sustancias que aumenten la solubilidad de los marcadores enzimáticos o la permeabilidad de las células de los microorganismos, tales como el dimetil sulfóxido.
8. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por disolver el conjunto de la composición nutritiva, los marcadores enzimáticos y demás componentes en el primer solvente en relación de 1 a 150 g/l.
9. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por la eliminación del primer solvente, sometiendo la estructura tridimensional a secado a temperatura ambiente con circulación forzada de aire por convección, o temperatura de 25 a 1 10 °C a presión atmosférica o a presión menor que la atmosférica, por un período de 30 min a 3 h o eliminándolo por sublimación, o por secado por aspersión a temperatura de 90 a 180 °C.
10. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por poseer un límite de detección y de cuantificación de menos de 1 UFC/10 I para las muestras líquidas, menos de 1 UFC/250 g para las muestras sólidas o menos de 1 UFC/10 m3 de aire y un límite máximo de hasta 109 UFC/ml ó 109 UFC/g ó 103 UFC/m3
1 1 . Método según la reivindicación 1 , caracterizado por utilizar como segundo solvente el agua, una solución de sales, para la mayoría de las bacterias y hongos, hipotónica o ¡sotónica y para los extremófilos y microoganismos que viven en las aguas marinas, hipertónica, o la propia muestra.
12. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por poner en contacto la pluralidad de microorganismos o la muestra que los contiene en una relación de 0,05 a 13 ml/g, o de 0, 1 a 10 m3/g de estructura tridimensional. 13. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por poner en contacto la pluralidad de células microbianas que pueden estar conformadas por una diversidad de los microorganismos a detectar, recuperar, identificar y/o enumerar, pertenecientes a una especie, un género, un grupo o combinaciones de ellas, e incluye a las nanobacterias, bacterias, mohos y levaduras y las esporas, hifas u otros propágulos a identificar o las muestras que las contienen en contacto con la superficie de una o varias estructuras tridimensionales o pasándola a través de ellas, o hasta una determinada profundidad; estando las células o las muestras que las contienen en forma de una suspensión en fase gaseosa o en fase líquida, o en forma de gel o con consistencia semisólida o sólida, aplicándola directamente sobre la estructura, o mediante un dispositivo de aplicación. 14. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por mantener la estructura tridimensional durante la fase de detección de los microorganismos en atmósferas con tensión de oxígeno que puede variar, desde condiciones aerobias para los m.o. aerobios y aerobios facultativos, hasta la ausencia total de este elemento para los anaerobios o anaerobios facultativos.
15. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por la identificación de la pluralidad de células por la detección visual u automática de la fluorescencia; por el cambio de color de la estructura tridimensional o de su consistencia, textura, brillantez, opacidad, tonalidad, homogeneidad, o transparencia; o por los cambios de color, de brillantez, tonalidad, transparencia, o fluorescencia del segundo solvente o de la muestra; o por la aparición de bioluminiscencia, tanto en el interior de las cavidades, como en la superficie de la estructura; o por la observación de otras estructuras morfológicas; o reacciones metabólicas en la estructura tridimensional, en el segundo solvente o en la muestra; o por una combinación de varias o de todas las formas de identificación.
16. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por la detección o la determinación de la concentración de células en la muestra, mediante la enumeración visual o automática de las mismas en la superficie de la estructura tridimensional, o mediante la medición de la intensidad de la señal fluorogénica, colorimétn'ca o bioluminiscente, bajo luz en el rango del espectro ultravioleta, visible o infrarrojo, de señales eléctricas, térmicas, magnéticas, por el cambio de pH, o por la cuantificación de la emisión o consumo de gases derivados de la actividad de los microorganismos durante la fase lag o del período de aceleración del crecimiento, tales como dióxido de carbono, oxígeno, sulfuro de hidrógeno, amonio, hidrógeno.
17. Método según la reivindicación 1 , caracterizado porque se puede determinar la resistencia o sensibilidad a los antimicrobianos, tales como bactericidas, bacteriostáticos, fungicidas, soluciones de limpieza, adicionando a la mezcla de la composición nutritiva y de los marcadores enzimáticos dichas sustancias y observando la inhibición total o parcial del crecimiento, la desaceleración del mismo, la prolongación de la fase lag, o por la ausencia de reacción de degradación de los sustratos.
8. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por emplear estructuras tridimensionales seleccionadas entre aquellas cuyas dimensiones de las cavidades o partículas responden a:
• nano- cavidades o partículas, con diámetros u holguras de hasta 200 nm para nano- y micro- bacterias;
• nano- y submicro- cavidades con diámetros u holguras de 5 nm a 1000 nm para bacterias de diferentes tallas;
· micro- cavidades con diámetros u holguras de 1 pm a 1000 pm para bacterias y células de levaduras;
• micro- y macro- cavidades con diámetros u holguras de más de 1 pm y hasta 2 mm para bacterias, levaduras y hongos filamentosos;
• combinaciones con todos los diámetros u holguras de las cavidades desde nano- hasta macro- de 2 mm para la pluralidad de microorganismos.
9. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por el empleo de las estructuras arcillosas o cerámicas tridimensionales descritas que poseen sustituciones isomórficas de los iones por cationes o son previamente funcionalizadas con diferentes iones, que actúan como catalizadores enzimáticos, tales como Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Zn, formando capas superficiales o distribuidas en toda su estructura.
20. Método según la reivindicación 1 , caracterizado porque en el primer o segundo solvente pueden ser adicionadas otras sustancias promotoras o inhibidoras del crecimiento de microorganismos, pertenecientes a determinados géneros, especies o grupos de microorganismos, en cantidades de 0,01 hasta 40 g/l.
21 . Método según la reivindicación 1 , caracterizado por adicionar a la composición nutritiva seleccionada sales, resinas, extractos naturales de plantas, ácidos grasos, ésteres, bactericidas, bacteriostáticos, alcoholes, sustancias con actividad de superficie o sus mezclas en cantidades de
0,01 a 2 g/l del primer o segundo solvente o antibióticos o antifúngicos en cantidades de 10 a 100 pg/l del primer o segundo solvente.
22. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por la adición a la estructura tridimensional de sustancias que coadyuvan la fijación de la composición nutritiva y los marcadores enzimáticos seleccionados entre los alginatos, polisacáridos naturales; pectina, quitina, goma arábiga y otras gomas, almidones, dextrana y carboximetilcelulosa y otros polímeros derivados de ellos; carragenina, agar, agarosa y polímeros artificiales derivados, derivados del alcohol vinílico, del polibutíleno, polietileno y polipropileno, polivinilpirrolidona en cantidades de 0,01 a 0,5 g/g de estructura tridimensional.
23. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por la adición a la estructura tridimensional de sustancias que aumentan su capacidad de absorción, tales como el carbón activado y la celulosa en cantidades de 2 a 4 mg/g.
24. Método según la reivindicación 1 , caracterizados por el empleo de una estructura tridimensional con capacidad de "hinchazón" al absorber la muestra que contiene los microorganismos, o al segundo solvente que contiene los microorganismos y aumentar su volumen.
25. Método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la estructura tridimensional puede conformar una película o capa de 5 nm a 1 mm de espesor; o una columna de hasta 10 cm de altura; o esferas o perlas de diámetro de 5 nm a 10 mm; hexágonos o cubos; o cilindros o tubos de 5 nm a 10 cm de diámetro y de 5 nm a 10 cm de altura; o fibras, redes; o adoptar la forma del recipiente que la contenga.
26. Método según la reivindicación 1 , caractenzado por el empleo de una estructura tridimensional que presenta diferentes zonas distintas porosidades y diferentes diámetros u holguras de las nano-, micro- y macro- cavidades a través de su volumen, o de su longitud, o de su diámetro, distribuyendo dichas zonas en forma de gradiente o en zonas diferenciadas.
27. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por el empleo de una estructura tridimensional que contiene diferentes composiciones nutritivas y marcadores enzimáticos a través de su volumen, longitud o diámetro, distribuyendo dichas composiciones en forma de gradiente o en zonas diferenciadas.
28. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por mantener la estructura tridimensional sobre soportes en forma de láminas, capas o cilindros permeables a gases o líquidos o impermeables a los mismos; o rodeadas por materiales impermeables en al menos el 90 % de su superficie.
29. Dispositivos para la ejecución del método descrito en las reivindicaciones de la 1 a la 29 caracterizados por conformarse de una o varias estructuras tridimensionales de arcillas o cerámicas naturales o artificiales, seleccionadas entre la caolinita, halloisita, dickita, nacrita, crisolita, antigorita, lizardita, vermiculita, mica, hectorita, saponita, hidrotalcita, muscovita, clorita, la tierra de diatomea, bentonitas (montmorillonita, sauconita, beidellinita, nontrolita), clinoptilotitas, hidroxiapatitas, zeolitas y fosfatos de calcio, o sus combinaciones con una superficie específica de 2 x 103 a 6 x 108 m2/m3 en una pluralidad de nano-, micro- o macro- cavidades o sus combinaciones y contener en su interior o en la superficie una mezcla nutritiva seleccionada entre los hidrolizados enzimáticos de alga Spirulina platensis; extracto de Saccharomyces cerevisiae obtenido por hidrólisis enzimática e hidrolizado enzimático de levadura forrajera Torula; extracto de Ipomoea batatas, extracto de tomate; hidrolizados enzimáticos de tejido de corazón de res, de sangre bovina y de hígado de res; hidrolizados enzimáticos de lactoalbúmina obtenida de suero de queso, hidrolizados enzimáticos o ácidos de caseína de suero de mantequilla; e hidrolizado o autolizado de Eudrillus eugeniae y sus combinaciones y uno o varios marcadores enzimáticos cromogénicos, fluorogénicos o bioluminiscentes.
30. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por contener uno o varios marcadores enzimáticos cromogénicos, fluorogénicos o bioluminiscentes en cantidades de 0,0033 a 0,66 mg/g de estructura tridimensional.
31 . Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por contener, otros hidrolizados enzimáticos, hidrolizados químicos o extractos de proteínas de algas, microorganismos, partes vegetales, tejidos animales superiores y sus combinaciones en cantidades de hasta 0,33 a 4 mg/g de estructura tridimensional.
32. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por contener la mezcla de composiciones nutritivas, marcadores enzimáticos y demás ingredientes selectivos, inhibidores o promotores de crecimiento en cantidades de 0,33 mg/g hasta 60 mg/g de estructura tridimensional.
33. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados porque la estructura tridimensional está conformada por arcillas o cerámicas con sustituciones isomórficas de los iones por cationes o previamente funcionalizadas con diferentes iones que actúan como catalizadores enzimáticos, tales como Na, , Ca, Mg, P, Fe, Zn, formando capas superficiales o distribuidas en toda su estructura.
34. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizado porque los fosfatos de calcio que conforman su estructura tridimensional se seleccionan entre: metafosfato [Ca(P03)2], fosfato monocálcíco mono-hidratado [Ca(H2P04)2 H20], di-hidrógeno fosfato tetracálcico (Ca4H2P6O20), fosfato heptacálcico [Ca7(P50i6)2] , pirofosfato de calcio (Ca2P207 y Ca2P207 2H20), fosfato dicálcico [CaHP04, CaHP04-2H20 y Ca(H2P04)2], tricálcico [Ca3(P04)2], fosfato octacálcico [Ca8H2(P04)6 5H20], hidroxiapatita deficiente en calcio [Caio-x(HP04)x(P04)6-x(OH)2-x], hidroxiapatita [Cai0(PO4)6(OH)2], fosfato tetracálcico [Ca40(P04)2], apatita [Caio(P04)6(OH,F,Cl1Br)2]! carbonate-apatita [Ca5(P04,C03)3(OH1F)] o combinaciones indistintamente de dos o más de cualquiera de ellos.
35. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por poseer un límite de detección y de cuantificación de menos de 1 UFC/10 I para las muestras líquidas, menos de 1 UFC/250 g para las muestras sólidas o menos de 1
UFC/10 m3 de aire y un límite máximo de hasta 109 UFC/ml ó 109 UFC/g ó 103 UFC/m3.
36. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por estructuras tridimensionales que presentan cavidades en forma de poros, canales, tubos, bolsas regulares o irregulares, de diferentes formas geométricas o sus combinaciones; o se disponen en forma de capas o láminas.
37. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por estructuras tridimensionales seleccionadas entre aquellas cuyas dimensiones de las cavidades o partículas responden a:
- nano- cavidades o partículas, preferiblemente de superficies rugosas, con diámetros u holguras de hasta 200 nm para nano- y micro- bacterias;
nano- y submicro- cavidades con diámetros u holguras de 5 nm a 1000 nm para bacterias de diferentes tallas;
- micro- cavidades con diámetros u holguras de 1 pm a 1000 pm para bacterias y células de levaduras;
micro- y macro- cavidades con diámetros u holguras de más de 1 pm y hasta 2 mm para bacterias, levaduras y hongos filamentosos;
combinaciones con todos los diámetros u holguras de las cavidades desde nano- hasta macro- de 2 mm para la pluralidad de microorganismos.
38. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por contener agentes selectivos del crecimiento microbiano, seleccionados entre las sales, otras como resinas, extractos naturales de plantas, ácidos grasos, ésteres, bactericidas, bacteriostáticos, alcoholes, sustancias con actividad de superficie o sus mezclas en cantidades de 0,0033 a 0,8 mg/g de las estructuras tridimensionales de las arcillas o cerámicas y antibióticos o antifúngicos en cantidades de 0,033 a 0,33 pg/g.
39. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por contener sustancias que coadyuvan la fijación de la composición nutritiva y los marcadores enzimáticos seleccionados entre los alginatos, polisacáridos naturales; pectina, quitina, goma arábiga y otras gomas, almidones, dextrana y carboximetilcelulosa y otros polímeros derivados de ellos; carragenina, agar, agarosa y polímeros artificiales derivados, derivados del alcohol vinílico, del polibutileno, polietileno y polipropileno, polivinilpirrolidona en cantidades de 0,01 a 0,5 g/g de estructura tridimensional.
40. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por contener sustancias que aumentan su capacidad de absorción, tales como el carbón activado y la celulosa en cantidad de 2 a 4 mg/g.
41. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por tener la forma de una película o capa de 5 nm a 1 mm de espesor; o de una columna de hasta 10 cm de altura; o de esferas o perlas de diámetro de 5 nm a 10 mm; de hexágonos o cubos; o de cilindros o tubos de 5 nm a 10 cm de diámetro y de 5 nm a 10 cm de altura; o de fibras, redes; o adoptar la forma del recipiente que la contenga.
42. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por poseer diferentes zonas de distintas porosidades y diferentes diámetros u holguras de las nano-, - micro- y macro- cavidades a través de su estructura total, o de su longitud, o de su diámetro, distribuyendo dichas zonas en forma de gradiente o en zonas diferenciadas.
43. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por contener diferentes composiciones nutritivas y marcadores enzimáticos a través de su volumen, longitud o diámetro, distribuyendo dichas composiciones en forma de gradiente o en zonas diferenciadas.
44. Dispositivos según la reivindicación 29, caracterizados por mantener la estructura tridimensional sobre soportes en forma de láminas, capas o cilindros permeables a gases o líquidos o impermeables a los mismos; o rodeadas por materiales impermeables en al menos el 90 % de su superficie.
PCT/CU2013/000002 2012-03-30 2013-03-27 Método para la detección, recuperación, identificación y enumeración simultánea de microorganismos y dispositivos para su ejecución Ceased WO2013143508A2 (es)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13767434.7A EP2837690B1 (en) 2012-03-30 2013-03-27 Method for simultaneous detection, recovery, identification and counting of microorganisms and three dimentioanl structure for the implementation of said method
CA2883197A CA2883197C (en) 2012-03-30 2013-03-27 Method for simultaneous detection, recovery, identification and counting of microorganisms and devices for the implementation of said method
ES13767434.7T ES2650453T3 (es) 2012-03-30 2013-03-27 Método para la detección, recuperación, identificación y conteo simultáneos de bacterias y hongos, y disposición de estructura tridimensional para la implementación de dicho método
MX2014011804A MX2014011804A (es) 2012-03-30 2013-03-27 Metodo para la deteccion, recuperacion, identificacion y enumeracion simultanea de microorganismos y dispositivos para su ejecucion.
BR112014024361-1A BR112014024361B1 (pt) 2012-03-30 2013-03-27 Método para a detecção, a recuperação, a identificação e a contagem simultâneas de micro-organismos e dispositivos para a sua implementação
RU2014143767A RU2644683C2 (ru) 2012-03-30 2013-03-27 Способ получения трехмерных структур, используемых для детекции, выделения или подсчета микроорганизмов
US14/389,568 US20150148258A1 (en) 2012-03-30 2013-03-27 Method for simultaneous detection, recovery, identification and counting of microorganisms and devices for the implementation of said method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU20120055A CU24137B1 (es) 2012-03-30 2012-03-30 Método para la detección, recuperación, identificación y enumeración simultánea de microorganismos
CUCU/P/2012/0055 2012-03-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2013143508A2 true WO2013143508A2 (es) 2013-10-03
WO2013143508A3 WO2013143508A3 (es) 2014-05-08

Family

ID=49261336

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CU2013/000002 Ceased WO2013143508A2 (es) 2012-03-30 2013-03-27 Método para la detección, recuperación, identificación y enumeración simultánea de microorganismos y dispositivos para su ejecución

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20150148258A1 (es)
EP (1) EP2837690B1 (es)
BR (1) BR112014024361B1 (es)
CA (1) CA2883197C (es)
CU (1) CU24137B1 (es)
ES (1) ES2650453T3 (es)
MX (1) MX2014011804A (es)
RU (1) RU2644683C2 (es)
WO (1) WO2013143508A2 (es)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016085688A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 3M Innovative Properties Company Devices and kits for the propagation or storage of microorganisms, and methods of making and using
RU2636620C1 (ru) * 2016-10-25 2017-11-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН" (ТюмНЦ СО РАН) Способ оптической оценки концентрации микробных клеток в суспензии
US20190032001A1 (en) * 2014-11-10 2019-01-31 Charm Sciences,Inc. Culture peel plate

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182445B (zh) * 2018-09-20 2021-10-22 吉林农业大学 一种霉菌和酵母计数测试片、制备方法及其应用
JP7426725B2 (ja) * 2018-10-30 2024-02-02 Ｃｒａｉｆ株式会社 細胞外小胞を捕捉するために用いられるデバイス、細胞外小胞の保存方法および移送方法
CN110257468B (zh) * 2019-06-03 2022-05-27 北京鑫骥金诺医疗器械有限公司 一种用于细菌计数的质控的组合物、制备方法及其应用
CN112795486B (zh) * 2020-12-30 2023-09-19 兴源环境科技股份有限公司 一种畜禽粪污微藻养殖同步产乙醇的方法
CN114563396A (zh) * 2022-01-26 2022-05-31 湖南农业大学 一种水中原核细胞型微生物总数现场快速检测试剂盒和检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596505B2 (en) 2000-04-17 2003-07-22 University Technologies International, Inc. Apparatus and methods for testing effects of materials and surface coatings on the formation of biofilms
US20080095820A1 (en) 2002-04-18 2008-04-24 Kumta Prashant N Method of manufacturing hydroxyapatite and uses therefor in delivery of nucleic acids
WO2009067012A2 (en) 2007-11-23 2009-05-28 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tn0 System for detecting microbial contamination
WO2011128488A1 (es) 2010-04-16 2011-10-20 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Composición de silicatos de aluminio y nanopartículas de plata como bactericidas

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1520217A (en) * 1977-01-11 1978-08-02 Wyo Ben Products Inc Inorganic support for culture media
US5009898A (en) * 1988-09-29 1991-04-23 Kabushiki Kaisha Sangi Antimicrobial hydroxyapatite powders and methods for preparing them
US5705332A (en) * 1994-04-25 1998-01-06 University Of Hawaii Detection and identification of Salmonella and Shigella
RU2139344C1 (ru) * 1997-12-23 1999-10-10 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН Способ приготовления питательной среды для культивирования сальмонелл
CU22808A1 (es) * 2000-04-18 2005-06-24 Ct Nac Biopreparados Composición y método para la detección y recuento diferenciado y temprano de organismos microscópicos gram-negativos
CU22844A1 (es) * 2000-09-07 2004-02-20 Ct Nac Biopreparados Medio de cultivo y método para la identificación de microorgnismos gram-negativos
RU2260046C2 (ru) * 2001-10-19 2005-09-10 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Клеточный микрочип и его применение в способе исследования живых клеток
US20030138874A1 (en) * 2001-11-09 2003-07-24 Taintor Read Robert Method and kit for rapid concurrent identification and antimicrobial susceptibility testing of microorganisms from broth culture
CA2634325A1 (en) * 2005-12-19 2007-06-28 Centro Nacional De Biopreparados Nutrient medium for yeast culture
US8043845B2 (en) * 2006-09-20 2011-10-25 American Sterilizer Company Sterilization indicator
US9212384B2 (en) * 2006-09-28 2015-12-15 Tsumara & Co. Microbial culture medium and microbial culture method using acid/activated clay
US7745169B2 (en) * 2006-11-10 2010-06-29 Biolumix Inc. Device and method for the detection and enumeration of multiple groups of microorganisms
US20110045470A1 (en) * 2007-08-01 2011-02-24 Hitachi Chemical Co., Ltd. Pathogen detection in large-volume particulate samples
WO2012134724A1 (en) * 2011-03-30 2012-10-04 3M Innovative Properties Company Fluorogenic or fluorophoric compounds and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596505B2 (en) 2000-04-17 2003-07-22 University Technologies International, Inc. Apparatus and methods for testing effects of materials and surface coatings on the formation of biofilms
US20080095820A1 (en) 2002-04-18 2008-04-24 Kumta Prashant N Method of manufacturing hydroxyapatite and uses therefor in delivery of nucleic acids
WO2009067012A2 (en) 2007-11-23 2009-05-28 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tn0 System for detecting microbial contamination
WO2011128488A1 (es) 2010-04-16 2011-10-20 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Composición de silicatos de aluminio y nanopartículas de plata como bactericidas

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2837690A4

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190032001A1 (en) * 2014-11-10 2019-01-31 Charm Sciences,Inc. Culture peel plate
WO2016085688A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 3M Innovative Properties Company Devices and kits for the propagation or storage of microorganisms, and methods of making and using
CN107002008A (zh) * 2014-11-25 2017-08-01 3M创新有限公司 用于增殖或储存微生物的装置和套件及其制备和使用方法
US10344253B2 (en) 2014-11-25 2019-07-09 3M Innovative Properties Company Devices and kits for the propagation or storage of microorganisms, and methods of making and using
CN107002008B (zh) * 2014-11-25 2021-04-02 3M创新有限公司 用于增殖或储存微生物的装置和套件及其制备和使用方法
RU2636620C1 (ru) * 2016-10-25 2017-11-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН" (ТюмНЦ СО РАН) Способ оптической оценки концентрации микробных клеток в суспензии

Also Published As

Publication number Publication date
US20150148258A1 (en) 2015-05-28
BR112014024361B1 (pt) 2022-06-07
CA2883197C (en) 2020-03-31
CA2883197A1 (en) 2013-10-03
CU20120055A7 (es) 2013-12-27
BR112014024361A2 (pt) 2017-07-25
RU2644683C2 (ru) 2018-02-13
EP2837690A2 (en) 2015-02-18
MX2014011804A (es) 2015-03-19
EP2837690B1 (en) 2017-09-13
CU24137B1 (es) 2015-12-23
RU2014143767A (ru) 2016-05-27
WO2013143508A3 (es) 2014-05-08
EP2837690A4 (en) 2015-11-25
BR112014024361A8 (pt) 2022-03-08
ES2650453T3 (es) 2018-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2013143508A2 (es) Método para la detección, recuperación, identificación y enumeración simultánea de microorganismos y dispositivos para su ejecución
US10280446B2 (en) Methods and articles for detecting deoxyribonuclease activity
JP2003524417A (ja) バルク液から微生物を表面培養するための装置および方法
US8828682B2 (en) Methods and articles for detecting hemolytic microorganisms
MX2011013562A (es) Deteccion de bacterias que producen acido.
ES2739905T3 (es) Método para determinar la sensibilidad de microorganismos a sustancias antimicrobianas
KR102013428B1 (ko) 살모넬라 검출용품 및 사용 방법
BRPI0819517B1 (pt) Método para detectar um micro-organismo produtor de gás
JP2001511654A (ja) 微生物を検出するためのセンサー器具、及びそのための方法
BRPI0818959B1 (pt) método para detecção de espécies de listeria em uma superfície ambiental
US8846384B2 (en) System for detecting microbial contamination
ES2900493T3 (es) Detección rápida de E. coli en un dispositivo de cultivo de película fina
BR112016015647B1 (pt) Método para detecção e/ou identificação e/ou enumeração de pelo menos um microorganismo alvo em uma amostra suscetível de contê-lo, dispositivo que compreende um suporte poroso e seus usos
JP5476054B2 (ja) セレウス菌グループ検出用培地
EP4310192A1 (en) Method of determining the existence and/or degree of resistance of microorganisms to antimicrobial agents
JP4743334B1 (ja) 微生物リスクの簡易評価方法とその課題を回避する機能性空間
CN107227337A (zh) 微孔板法测定p型红辉沸石分子筛抗菌剂抗菌性能的方法
ES2966679T3 (es) Métodos y composiciones para mejorar la detección de microorganismos
CN106939329B (zh) 一种用于检测霉菌性阴道炎的培养液、试剂盒及检测方法
JP2007292481A (ja) 抗真菌性評価方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2014/011804

Country of ref document: MX

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2883197

Country of ref document: CA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112014024361

Country of ref document: BR

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013767434

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013767434

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014143767

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13767434

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14389568

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112014024361

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20140930

ENPC Correction to former announcement of entry into national phase, pct application did not enter into the national phase

Ref document number: 112014024361

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 1.3 NA RPI NO 2429 DE 25/07/2017 POR TER SIDO INDEVIDA.

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112014024361

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Free format text: COMO OS DEPOSITANTES DA FASE INTERNACIONAL DO PEDIDO INTERNACIONAL PCT ?CLAUDIO RODRIGUEZ MARTINEZ?, ?JESUS EDUARDO GONZALEZ RUIZ?, ?TAMARA LOBAINA RODRIGUEZ?, ?RAISA ZHURBENKO?, ?ANA IRIS BRITO GONZALEZ?, ?MONICA LOPEZ HERNANDEZ?, JAVIER ARAFON FERNANDEZ?, ?IVONNE ALFONSO VALDES? E ?ADELAIDA ORTEGA SURIS? FORAM EXCLUIDOS DA FASE NACIONAL DO PEDIDO DO QUADRO DE DEPOSITANTES, APRESENTE DOCUMENTO DE CESSAO DO PEDIDO INTERNACIONAL COM DATA ANTERIOR A FASE NACIONAL PARA REGULARIZAR SUA TITULARIDADE; OU RETIFIQUE A ENTRADA NA FASE NACIONAL DO, INCLUINDO-OS E APRESENTANDO SUAS RESPECTIVAS PROCURACOES.

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112014024361

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Free format text: EM ADITAMENTO A EXIGENCIA PUBLICADA NA RPI 2630, APRESENTE DOCUMENTOS COMPROBATORIOS QUE EXPLIQUEM A DIVERGENCIA NO NOME DO INVENTOR CONSTANTE NA PUBLICACAO INTERNACIONAL "JESUS EDUARDO GONZALEZ RUIZ" E O CONSTANTE DA PETICAO NO 870210065209 DE 19/07/2021 "JESUS EDUARDO GONZALEZ RUIZ GONZALO". CUMPRE FRISAR QUE A DIVERGENCIA NAO ACONTECE NA PROCURACAO APRESENTADA NA CITADA PETICAO.

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112014024361

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20140930