WO2017203083A1 - Triazoles para la regulación de la homeostasis de calcio intracelular - Google Patents

Triazoles para la regulación de la homeostasis de calcio intracelular Download PDF

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Ainara Vallejo Illarramendi
Adolfo José LÓPEZ DE MUNAIN ARREGI
Pablo Ferrón Celma
Jesús María AIZPURUA IPARRAGUIRRE
Aitziber IRASTORZA EPELDE
José Ignacio MIRANDA MURUA
Iván TORAL OJEDA
Garazi ALDANONDO ARISTIZABAL
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    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration

Definitions

  • the present invention relates to new substituted 1,2,3-triazoles useful for improving or restoring the function of intracellular calcium homeostasis in human and animal cells. It is also related to methods of synthesis of said compounds, pharmaceutical compositions containing them, and their use to prevent or treat musculoskeletal, cardiac and neurodegenerative disorders.
  • Muscular dystrophies are hereditary heterogeneous diseases that are characterized by weakness and progressive atrophy of skeletal muscle.
  • Duchenne muscular dystrophy is one of the most frequent forms, it is linked to the X chromosome and occurs in 1 in 3500 males.
  • allelic form BMD
  • both are produced by mutations in the gene encoding dystrophin, a 427-kDa cytoskeleton protein. Genetic studies are not enough for the eradication of the disease due to the high incidence of sporadic cases, so the search for new effective therapies is urgently needed.
  • LGMDs Waist muscular dystrophies
  • calpainopathy or LGMD2A is the most frequent form and is caused by mutations in the gene that encodes calpain 3 (CAPN3), a non-lysosomal cysteine protease necessary for the proper functioning and regeneration of muscle.
  • Type 1 myotonic dystrophy (DM1) is the most common adult form of muscular dystrophy and is characterized by muscle weakness, myotonia and multisystemic involvement. It is an autosomal dominant hereditary disease caused by an unstable expansion of the CTG triplet repeat located in the 3 ' non-coding region of the DMPK gene, located on the long arm of chromosome 19 and expressed predominantly in skeletal muscle.
  • High baseline levels of intracellular Ca 2+ involve the activation of calpain, protein degradation, the opening of mitochondrial permeability transition pores (PTPm) and, finally, the death of muscle fiber due to necrosis.
  • the increase in intracellular Ca 2+ levels is a complex process that involves Ca 2+ flows through the sarcolemma, calcium losses from the sarcoplasmic reticulum (RS) and abnormal levels of Ca 2+ in the RS.
  • IP3R inositol 1,4,5-triphosphate receptors
  • Myotonic dystrophy has been associated with the deregulation of the alternative connection of the CACNAI S gene that encodes the alpha 1 S subunit of the DHPR dihydropyridine receptor, an essential voltage sensor in the excitation-contraction coupling (E-C).
  • E-C excitation-contraction coupling
  • disorders and diseases are associated with congenital or acquired modifications of the RyRl protein (Kushmir et al. Recent Pat Biotechnol. 2012, 6, 157-166 "Ryanodine receptor patents”).
  • Such disorders and diseases include conditions of the skeletal muscle, heart and nervous system. More specifically, they include, but are not limited to, congenital myopathies, muscular dystrophies, sarcopenia, skeletal muscle fatigue, acquired muscle weakness or atrophy, malignant hyperthermia, irregular heart rhythm disorders and diseases associated with exercise, congestive heart failure, hypertrophic cardiomyopathy, Alzheimer's disease and memory loss associated with age.
  • JTV-519 4- [3- (4-benzylpiperidinyl) -propanoyl] -2,3,4,5-tetrahydro-l, 4- benzothiazepine
  • Compound JTV-519 acts on the ryanodine RyR2 receptor associated with calstabine2 (FKBP12.6), increasing the affinity of FKBP12.6 for the phosphorylated RyR2 receptor via PKA kinase, and also for the mutant RyR2 receptor which, otherwise , have low affinity or do not bind to FKBP12.6.
  • This JTV-519 action repairs the Ca 2+ ion leak in RyR2 (Marks, AR et al US2004 / 229781A1 "Compounds and methods for treating and preventing exercise-induced cardiac arrhythmias").
  • the authors of the present invention have developed new compounds derived from triazole, in particular 4 - [(phenylthio) alkyl] -lH-1, 2,3-triazoles, suitable for modulating RyR receptors that regulate calcium function in animal or human cells.
  • said compounds are designated as "AHK”.
  • the compounds according to the present invention have the capacity to modulate intracellular calcium homeostasis in muscular dystrophic fibers, reversing the observed increases in intracellular calcium.
  • said compounds have a modulating effect on RyR, their ability to recover the RyRl-calstabine interaction on healthy human myotubes subjected to nitro-oxidative stress having been demonstrated.
  • a first aspect of the invention is related to a 1,4,3-disubstituted 1,2,3-triazole compound of Formula (I):
  • R 1 is a biradical C1-C4 alkylene optionally substituted by one or more substituents independently selected from the group consisting of C 1-4 alkyl, C 6 -aryl aryl, F, Cl, CN and N0 2 ;
  • R 2 is a biradical Ci-C 6 alkylene, in which 1, 2 or 3 -CH 2 groups - may optionally be replaced by groups selected from -O- and -S-; and wherein the biradical Ci-C 6 alkylene may be optionally substituted with one or more groups independently selected from C 1-4 alkyl, allyl, propargyl, hydroxymethyl, 1- ethyl hydroxy, 2-hydroxy ethyl, 3-aminopropyl, 4 -aminobutyl, 3-guanidylpropyl, 3- indolylmethyl, C 6 -io aryl, benzyl, 4-hydroxybenzyl, C 6 -io heteroaryl, F, Cl, OH, 0 (C M alkyl), CN, N0 2 , CO (C M alkyl), C0 2 (C M alkyl), -CO H (C M alkyl), - CON (C M alkyl) 2 ;
  • R 3 is a group independently selected from H, C 1-4 alkyl, C 6 -aryl aryl, F, Cl,
  • X is independently selected from the group consisting of OH, 0 (C 1-4 alkyl), 0 (C 6- aryl), OCF 3 , S (C M alkyl), S (C 6- aryl aryl), alkyl Ci- 6 , CF 3 , HC (0) (C1-4 alkyl) and halogen; or two X groups may represent a birradical methylenedioxy, ethylenedioxy or propylenedioxy; and
  • Y is selected from the group consisting of -OH, -C0 2 H, -C0 2 (C 1-4 alkyl), -C0 2 (allyl), -C0 2 (benzyl), -S0 3 H, - H 2 , - H (C M alkyl), -N (C M alkyl) 2 , N (C M alkyl) 3 and - N (heterocyclyl or heteroaryl), wherein said heterocyclyl or heteroaryl is optionally substituted by a C 1-4 alkyl group and where the N atom is part of the heterocyclyl or heteroaryl; or a stereoisomer, pharmaceutically acceptable salt, solvate or complex thereof, or an isotopically labeled derivative or a prodrug thereof.
  • Another aspect of the invention comprises a method of synthesis of the compounds of Formula (I), comprising: a) reacting an alkyne of Formula (II) with an azide of Formula (III),
  • Y is a group as defined above, optionally protected with a carboxyl protecting group, a hydroxyl protecting group or an amino protecting group; b) when n is 0 in the compound of formula (I) obtained in step a), optionally treating said compound of formula (I) with an oxidizing agent to give a compound of formula (I) wherein n is 1 or 2 , R 1 , R 2 , R 3 , m and X are as previously defined, and Y is a group as defined previously optionally protected with a carboxyl protecting group, a hydroxyl protecting group or an amino protecting group; and c) when the compound of formula (I) obtained in step a) or b) has a Y group protected with a protective group, remove said protective group to give a compound of formula (I) wherein R 1 , R 2 , R 3 , m, n, X and Y are as previously defined.
  • Another aspect of the invention is related to pharmaceutical compositions containing a compound of Formula (I), defined as indicated above, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of a compound of formula (I) as defined above for the preparation of a medicament.
  • Figure 1 shows the toxicity curves of the compounds AHK1, AHK2 and S-107 on human myotubes after 24 h of incubation using the Citotox 96 colorimetric assay.
  • Figure 2 shows the in vitro effect of the AHK1 and AHK2 compounds on intracellular calcium levels at rest in mouse muscle fibers:
  • Figure 3 shows the in vitro effect of the AHK1 and AHK2 compounds on the RyRl-calstabinal interaction in healthy human myotube cultures exposed to peroxynitrite stress.
  • Figure 5 shows the in vivo effect of the compounds AHKl and AHK2 on muscle degeneration / regeneration in dystrophic mdx mice:
  • Figure 6 shows the effect of AHKl treatment on the gene expression pattern of the anterior tibial muscle of mdx mice.
  • Figure 7 shows the in vivo effect of AHK2 compounds on abnormal CNS function in dystrophic mdx mice:
  • Figure 8 shows the in vivo effect of AFD 2 compounds on the cardiomyopathy of mdx mice induced by isoproterenol.
  • Upper panel representative images of heart cuts of control mice BL10 (Ctl), mdx mice (mdx) and mdx mice treated with AFD 2 (mdx AFD 2).
  • Calibration bar lmm. Evans Blue uptake is visualized by fluorescence microscopy.
  • the present invention provides new triazole compounds that are capable of treating or preventing disorders or diseases associated with intracellular calcium dysregulation or RyR receptor dysfunction.
  • the first aspect of the present invention is directed to a compound of formula (I): NN m
  • R is a biradical C1-C4 alkylene optionally substituted by one or more substituents independently selected from the group consisting of C 1-4 alkyl, C 6 -aryl aryl, F, Cl, CN and N 2 ;
  • R 2 is a biradical Ci-C 6 alkylene, in which 1, 2 or 3 -CH 2 groups - may optionally be replaced by groups selected from -O- and -S-; and wherein the biradical Ci-C 6 alkylene may be optionally substituted with one or more groups independently selected from C 1-4 alkyl, allyl, propargyl, hydroxymethyl, 1- ethyl hydroxy, 2-hydroxy ethyl, 3-aminopropyl, 4 -aminobutyl, 3-guanidylpropyl, 3- indolylmethyl, C 6 -io aryl, benzyl, 4-hydroxybenzyl, C 6 -io heteroaryl, F, Cl, OH, 0 (C M alkyl), CN, N0 2 , CO (alkyl C M ), C0 2 (C M alkyl), -CO H (C M alkyl), - CON (C M alkyl) 2 ; R 3 is a group independently
  • X is independently selected from the group consisting of OH, 0 - alkyl (C 1 -4), 0 (aryl C 6- io), OCF 3, S - alkyl (C M), S (aryl C 6- io) alkyl Ci- 6 , CF 3 , HC (0) (C1-4 alkyl) and halogen; or two X groups may represent a birradical methylenedioxy, ethylenedioxy or propylenedioxy; and
  • Y is selected from the group consisting of -OH, -C0 2 H, -C0 2 (C 1 -4 alkyl), -C0 2 (allyl), -C0 2 (benzyl), -S0 3 H, - H 2, - H alkyl (C M), -N (Ci -4) 2 and N (alkyl C M) 3 and - N (heterocyclyl or heteroaryl), wherein said heterocyclyl or heteroaryl is optionally substituted by a C 1 alkyl - 4 and where the N atom is part of the heterocyclyl or heteroaryl; or a stereoisomer, pharmaceutically acceptable salt, solvate or complex thereof, or a derivative thereof isotopically labeled, or a prodrug thereof.
  • biradical alkylene refers to a biradical formed by a linear or branched hydrocarbon chain consisting of atoms of carbon and hydrogen, which has no unsaturation and is attached at its ends to the rest of the molecule through simple bonds, such as, for example, methylene, ethylene, propylene, butylene, etc.
  • the reference to biradical C 1 -C 4 alkylene refers to when said birradical has between 1 and 4 carbon atoms
  • the mention to birradical Ci-C 6 alkylene refers to when said birradical has between 1 and 6 carbon atoms .
  • the biradical alkylene may be substituted as specified in the definitions of the substituents R 1 and R 2 in the compound of formula (I).
  • alkyl refers to a radical formed by a linear or branched hydrocarbon chain consisting of carbon and hydrogen atoms, which contains no saturation and is linked to the rest of the molecule by a single bond, for example methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl, n-pentyl, etc.
  • C 1 -C 4 alkyl refers to when said radical has between 1 and 4 carbon atoms.
  • Ce-Cw aryl refers to a radical formed by an aromatic ring of between 6 and 10 members consisting of carbon and hydrogen atoms, preferably a phenyl radical.
  • Ce-Cw heteroaryl refers to a radical formed by an aromatic ring of between 6 and 10 members consisting of carbon and hydrogen atoms and one or more heteroatoms selected from O, N and S.
  • -N heterocyclyl
  • -N heterocyclyl
  • -N heterocyclyl
  • -N heteroaryl
  • -N heteroaryl
  • R 2 a radical formed by an aromatic ring of between 6 and 10 members consisting of carbon and hydrogen atoms and one or more heteroatoms selected from O, N and S, at least one of them being N and this being directly attached to the radical R 2 .
  • halogen refers to F, Cl, Br or I.
  • isotopically labeled derivative refers to a compound of formula (I) in which at least one of its atoms is isotopically enriched.
  • compounds of formula (I) in which a hydrogen is replaced by a deuterium or tritium, a carbon is replaced by a 13 C or 14 C enriched atom, or a nitrogen is replaced by a 15 N enriched atom they are inside of the scope of this invention.
  • salt preparation refers to any pharmaceutically acceptable salt, ester, solvate, or any other compound that, in its administration to the recipient, is capable of providing (directly or indirectly) a compound of formula (I) such and as described herein. Salt preparation can be carried out by methods known in the state of the art.
  • salts of the compounds provided herein are synthesized from the compound described above containing a basic or acidic unit by conventional chemical methods.
  • such salts are prepared, for example, by reacting the free acidic or basic forms of these compounds with a stoichiometric amount of the appropriate base or acid in water or in an organic solvent or in a mixture of both.
  • non-aqueous media such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile are preferred.
  • acid addition salts include addition salts of mineral acids such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, nitrate, phosphate, and organic acid addition salts such as, for example, acetate, maleate, fumarate , citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate and p-toluenesulfonate.
  • mineral acids such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, nitrate, phosphate
  • organic acid addition salts such as, for example, acetate, maleate, fumarate , citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate and p-toluenesulfonate.
  • alkaline addition salts include inorganic salts such as, for example, sodium, potassium, calcium, ammonium, magnesium, aluminum and lithium, and organic alkaline salts such as, for example, ethylenediamine, ethanolamine, ⁇ , ⁇ -dialkylene ethanolamine, glucamine and basic amino acid salts.
  • Solvates refer to a salt of the compound of formula (I) in which the molecules of a pharmaceutically suitable solvent are incorporated into the crystalline network. Solvation methods in general are known in the state of the art. Examples of pharmaceutically suitable solvents are ethanol, water and the like. In a particular embodiment the solvate is a hydrate.
  • the compounds of formula (I) or their salts or solvates are preferably in pharmaceutically acceptable form or in substantially pure form.
  • a pharmaceutically acceptable form it is understood, inter alia, that they have a pharmaceutically acceptable level of purity, excluding normal pharmaceutical additives such as diluents and excipients, and not including any material considered toxic at normal dosage levels.
  • the purity levels for the drug are preferably above 50%, more preferably above 70%, and even more preferably above 90%. In a preferred embodiment it is above 95% of the compound of formula (I), or of its salts or solvates.
  • the compounds of the present invention represented by the formula (I) described above may include any stereoisomer depending on the presence of chiral centers, including enantiomers and diastereoisomers.
  • the individual isomers, enantiomers or diastereomers and mixtures thereof are within the scope of the present invention.
  • prodrug is used in its broadest sense and encompasses those derivatives that are converted in vivo into the compounds of the invention. Such derivatives include, depending on the functional groups present in the molecule and without limitation, esters, amino acid esters, phosphate esters, sulphonate esters of metal salts, carbamates and amides. Examples of methods for producing a prodrug of a given active compound are known to one skilled in the art and can be found, for example, in Krogsgaard-Larsen et al. "Textbook of Drugdesign and Discovery” Taylor & Francis (April 2002).
  • R 1 is -CH 2 -.
  • R 2 is a birradical C 1-4 alkylene optionally substituted with one or two independently selected substituents from the group consisting of methyl, ethyl, propyl, isopropyl, allyl, propargyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tere-butyl, hydroxymethyl, 1-hydroxy ethyl, 2-hydroxyethyl, 3- aminopropyl, 4-aminobutyl, 3- guanidylpropyl, 3-indolylmethyl, phenyl, 1-naphthyl, 2- naphthyl, benzyl, 4-hydroxybenzyl, and C 6 -io- heteroaryl More preferably, R 2 is a birradical -CH 2 - or -CH 2 -CH 2 -, optionally substituted with one or two substituents from the group consisting of methyl, ethyl, propyl,
  • R 2 is a birradical -CH 2 - optionally substituted with two methyl substituents or with a substituent selected from the group consisting of isopropyl, isobutyl and benzyl, or R 2 is a birradical -CH 2 -CH 2 - .
  • R 2 is a birradical -CH 2 - or -CH 2 -CH 2 -.
  • R 3 is H.
  • m is 1.
  • n is 0.
  • X is -0 - alkyl (C 1 -4) or halogen, more preferably is a methoxy group in meta or para or chlorine position.
  • Y is selected from the group consisting of C0 2 H, C0 2 Me, H 2 , - HMe, - Me 2 , - Me 3 , - HEt, - Et 2 , - Et 3 ,
  • Y is selected from the group consisting of C0 2 H, C0 2 Me, H 2, -NHMe, -NMe 2, -NMe 3, -NHEt, -NEt 2 -NEt 3, pyrrolidin-l- ilo, piperidin-l-yl, morpholin-4-yl, 4-piperazin-l-yl, 4-methyl-piperazin-l-yl, pyridin-l-yl, more preferably C0 2 H and -NMe 2 , even more preferably Y is -C0 2 H or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compounds of formula (I) are selected from the group consisting of: l-carboxymethyl-4- [3- (methoxy) phenylthiomethyl] -lH-1, 2,3-triazole, l- [2- (N, N-dimethylamino) ethyl] -4 4- (methoxy) phenylthiomethyl] -lH-l, 2,3-triazole, l-carboxymethyl-4- [4- (methoxy) phenylthiomethyl] -lH -l, 2,3-triazole, (S) -l- (1-carboxy-2-phenylethyl) -4- [3 - (methoxy) phenylthiomethyl] -1 H- 1, 2, 3 -triazole, (R) -l- (l-carboxy-2-phenylethyl) -4- [3- (methoxy) phenylthiomethyl] -lH-l, 2,
  • R 2 is an alkylene biradical C 1 -4 wherein one or two -CH 2 - are replaced by -O-, and wherein said alkylene biradical C 1 -C 4 is optionally substituted with one or two C 1 -C 4 alkyl groups, preferably selected from methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl and tert-butyl.
  • R 2 is a birradical -CH 2 - or -CH 2 -CH 2 -, optionally substituted with one or two substituents independently selected from the group consisting of methyl, isopropyl and isobutyl. Even more preferably, R 2 is a birradical -CH 2 - optionally substituted with two methyl substituents or with a substituent selected from the group consisting of isopropyl and isobutyl, or R 2 is a birradical -CH 2 -CH 2 -.
  • R 3 is H.
  • m is 1.
  • n 0.
  • X is -0 (C 1-4 alkyl) or halogen, more preferably it is a methoxy group in meta or para position or chlorine.
  • Y is selected from the group consisting of H 2 , - H (C1-C4 alkyl), -N (Ci-C 4 alkyl) 2 , -N (Ci- alkyl C 4 ) 3 ,
  • Y is selected from - H 2 , - HMe, - Me 2 , - Me 3 , - HEt, - Et 2 , - Et 3 , pyrrolidin-l-yl, piperidin-l-yl, morpholin-4-yl, 4-piperazin-l-yl, 4-methyl-piperazin-l-yl, pyridin-l-yl or a pharmaceutically acceptable salt of said groups. More preferably, Y is -Me 2 , or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the radical R 1 is -CH 2 -.
  • R 2 is a biradical C 1-4 alkylene optionally substituted with one or two substituents independently selected from the group consisting of methyl, ethyl, propyl, isopropyl, allyl, propargyl, butyl, isobutyl , sec-butyl, tere-butyl, hydroxymethyl, 1-hydroxy ethyl, 2-hydroxyethyl, 3- aminopropyl, 4-aminobutyl, 3-guanidylpropyl, 3-indolylmethyl, phenyl, 1-naphthyl, 2- naphthyl, benzyl, 4- hydroxybenzyl, and C 6 -io- heteroaryl More preferably, R 2 is a birradical -CH 2 - or -CH 2 -CH 2 -, optionally substituted with one or two substituents independently selected from the group consisting of methyl, isopropyl, isobuty
  • R 2 is a birradical -CH 2 - optionally substituted with two methyl substituents or with a substituent selected from the group consisting of isopropyl, isobutyl and benzyl, or R 2 is a birradical -CH 2 -CH 2 - .
  • R 2 is a birradical -CH 2 - or -CH 2 -CH 2 -.
  • R 3 is H.
  • n is 0.
  • X is -0 (C 1-4 alkyl) or halogen, more preferably it is a methoxy group in meta or para position or chlorine.
  • Y is selected from the group consisting of C0 2 H, C0 2 (C1-C4 alkyl), H 2 , - H (C1-C4 alkyl), -N (alkyl Ci- C 4 ) 2 , -N (Ci-C 4 alkyl) 3 ,
  • Y is selected from - H 2 , - HMe, - Me 2 , - Me 3 , - HEt, - Et 2 , - Et 3 , pyrrolidin-l-yl, piperidin-l-yl, morpholin-4-yl, 4-piperazin-l-yl, 4-methyl-piperazin-l-yl, pyridin-l-yl or a pharmaceutically acceptable salt of said groups.
  • Y is selected from the group consisting of C0 2 H and - Me 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compounds of formula (I) of the present invention can be prepared by a process comprising reacting an alkyne of formula (II) with an azide of formula (III):
  • R 1 , R 2 , R 3 , m, n and X in the compounds of formulas (II) - (III) are as defined for the compounds of formula (I), and where Y is a group as defined for compounds of formula (I), optionally protected with a carboxyl protecting group, a hydroxyl protecting group or an amino protecting group, depending on the nature of said group Y.
  • This reaction can be carried out in the presence of a copper catalyst, as per example, copper (II) sulfate / sodium ascorbate, copper (I) iodide or copper (I) acetate.
  • a copper catalyst as per example, copper (II) sulfate / sodium ascorbate, copper (I) iodide or copper (I) acetate.
  • the reaction between the compound of formula (II) and the compound of formula (III) is carried out in the presence of a base, such as, for example, sodium acetate, diisopropylamine or triethylamine.
  • a base such as, for example, sodium acetate, diisopropylamine or triethylamine.
  • the compound of formula (I) obtained according to the above procedure can be treated with an oxidizing agent to give a compound of formula (I) in which n is 1 or 2.
  • oxidizing agents include, for example, 3-chloroperbenzoic acid or tere-butyl hydroperoxide.
  • oxidizing agents include, for example, 3-chloroperbenzoic acid or tere-butyl hydroperoxide.
  • said protective group is removed to give a compound of formula (I) wherein R 1 , R 2 , R 3 , m, n, X and Y are as defined for the compound of formula (I).
  • the removal of the protective group can be performed following procedures commonly known to an expert in organic synthesis.
  • the present invention further provides pharmaceutical compositions comprising a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable stereoisomer, salt, solvate or complex thereof, or an isotopically labeled derivative thereof, or a prodrug thereof; and one or more pharmaceutically acceptable excipients or vehicles.
  • the pharmaceutically acceptable carrier must be acceptable in the sense of being compatible with the other ingredients of the composition and not harmful to the recipient thereof.
  • Said pharmaceutically acceptable carrier can be selected from among organic and inorganic materials that are used in pharmaceutical formulations and which are incorporated as analgesic agents, pH regulators, binders, disintegrants, diluents, emulsifiers, fillers, glidants, solubilizers, stabilizers, suspending agents, tonicity agents and thickeners.
  • Pharmaceutical additives such as antioxidants, agents may also be added. aromatics, dyes, aroma enhancing agents, preservatives and sweeteners.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include, among others, carboxymethyl cellulose, crystalline cellulose, glycerin, gum arabic, lactose, magnesium stearate, methyl cellulose, saline, sodium alginate, sucrose, starch, talc and water.
  • the pharmaceutical formulations of the present invention are prepared by procedures well known in the pharmaceutical art.
  • the compounds of formula (I) are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or carrier, such as a suspension or solution.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or carrier such as a suspension or solution.
  • the choice of vehicle is determined by the solubility and chemical nature of the compounds, the route of administration chosen and the standard pharmaceutical practice.
  • the administration of the compounds or compositions of the present invention to a human or animal subject may be by any known procedure including, without limitation, oral administration, sublingual or oral administration, parenteral administration, transdermal absorption, via nasal inhalation or instillation, vaginal, rectal and intramuscular administration.
  • administration is performed parenterally, such as by subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intravenous injection.
  • parenteral administration the compounds of the invention are combined with a sterile aqueous solution that is isotonic with the subject's blood.
  • a sterile aqueous solution that is isotonic with the subject's blood.
  • Such a formulation is prepared by dissolving the solid active ingredient in water containing physiologically compatible substances, such as sodium chloride, glycine and the like, and having a buffered pH compatible with physiological conditions.
  • Said formulation is presented in single or multiple dose containers, such as ampoules or closed vials.
  • the formulation of the compounds of the invention may be presented in the form of capsules, tablets, powders, granules, or as a suspension or solution.
  • Said formulation may include conventional additives, such as lactose, mannitol, starch, etc .; binders, such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, gum arabic, corn starch or gelatins; disintegrants, such as corn starch and starch potato or sodium carboxymethyl cellulose; lubricants, such as talc or magnesium stearate.
  • the compounds of the present invention have proved suitable for modulating RyR receptors that regulate the function of calcium in animal or human cells, so that they are capable of treating or preventing disorders or diseases associated with the deregulation of intracellular calcium caused primarily as a consequence. of dysfunction of RyR receptors.
  • the term "deregulation of intracellular calcium” means an abnormal regulation of calcium levels and calcium fluxes in cells.
  • an increase in the intracellular concentration of calcium (Ca 2+ ) under resting conditions contributes to the damage of toxic muscle cells (myofibers) and the simultaneous activation of Ca 2 + -dependent proteases, such as calpain.
  • Ca 2 + -dependent proteases such as calpain. Since the activity of calpain is increased in necrotic muscle fibers of mdx mice and calpain dysfunction contributes to myodistrophy of the waist and extremities, the prevention of calcium-dependent protease activity by inhibiting intracellular elevations of Ca 2+ It allows to avoid muscular atrophy and, therefore, to treat diseases such as Duchenne's myodystrophy or Becker's myodistrophy.
  • RyR receptors that regulate intracellular calcium function include RyRl, RyR2 and RyR3, as well as a RyR protein or a RyR analog.
  • a RyR analog refers to a functional variant of RyR protein with biological activity that has a homology of 60% or higher in the amino acid sequence with the RyR protein.
  • biological activity of RyR means the activity of the protein or peptide that demonstrates an ability to physically associate with, or bind to, FKBP 12 (calstabine-1) in the case of RyRl and RyR3, and FKBP12.6 (calstabine-2) in the case of RyR2 under the conditions of the tests described herein.
  • FKBP linked to RyR refers to FKBP 12 linked to RyRl (calstabine-1), FKBP 12.6 linked to RyR2 (calstabine-2) and FKBP 12 linked to RyR3 (casltabine-1).
  • a decrease in the level of FKBP bound to RyR in the cells of a subject is limited or avoided when said decrease is, in any case, stopped, hindered, impeded, obstructed or reduced by the administration of the compounds of the invention, so that the level of FKBP bound to RyR in the cells of a subject is higher than it would otherwise be in the absence of the administered compound.
  • the level of FKBP bound to RyR in a subject is detected by standard tests or techniques known to one skilled in the art, such as immunological techniques, hybridization analysis, immunoprecipitation, Western blot analysis, fluorescence imaging techniques and / or detection. of radiation, as well as any other as disclosed in the experimental part of this document.
  • the decrease in the level of FKBP (calstabine) bound to RyR occurs as a result of subjecting the cells of a subject to nitro-oxidative stress.
  • the experimental tests carried out with the compounds of the invention have shown that they allow to minimize the degenerative effects of nitro-oxidative stress on healthy human myotubes through an increase in the affinity of the RyR1 -calstabine-1 interaction.
  • the compounds of the invention avoid disorders or conditions that involve the modulation of RyR receptors or the increase of intracellular calcium, thus allowing the levels thereof to be regularized.
  • disorders or conditions include skeletal muscle disorders and diseases (related to RyRl modulation), disorders and heart diseases (related to the modulation of RyR2) and disorders and diseases of the nervous system (related to the modulation of RyRl, RyR2 or RyR3).
  • a further aspect of the present invention relates to the use of the compounds of formula (I), or a pharmaceutically acceptable stereoisomer, salt, solvate or complex thereof, or an isotopically labeled derivative thereof, or a prodrug thereof.
  • a medicament aimed at the treatment and / or prevention of disorders and diseases of skeletal muscle, disorders and cardiac diseases and disorders and diseases of the nervous system.
  • skeletal muscle disorders and diseases are selected from muscular dystrophies, congenital myopathies, metabolic myopathies and muscular atrophy.
  • said skeletal muscle disorder or disease is Duchenne muscular dystrophy or Becker muscular dystrophy.
  • cardiac disorders and diseases are selected from heart failure, cardiac ischemia, cardiac arrhythmias and cardiomyopathies.
  • disorders and diseases of the nervous system are selected from brain accident, Alzheimer's disease, frontotemporal dementia and cognitive impairment.
  • the compounds according to variant (A) of the present invention are those used in the preparation of a medicament for the treatment of skeletal muscle disorders and diseases, as well as for the treatment of cardiac disorders and diseases, such as those described. previously.
  • the compounds according to variant (B) of the present invention are those used in the preparation of a medicament for the treatment of disorders and diseases of the nervous system as described above.
  • a further aspect of the present invention relates to a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable stereoisomer, salt, solvate or complex thereof, or an isotopically labeled derivative thereof, or a prodrug thereof, for use in the treatment and / or prevention of disorders and diseases of the skeletal muscle, disorders and heart disease and disorders and diseases of the nervous system.
  • Another aspect of the invention is directed to a method for the treatment and / or prevention of skeletal muscle disorders and diseases, disorders and heart diseases and disorders and diseases of the nervous system, which comprises administration to a patient in need of an amount Therapeutically effective of a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable stereoisomer, salt, solvate or complex thereof, or an isotopically labeled derivative thereof, or a prodrug thereof.
  • Therapeutically effective should be understood as sufficient to achieve beneficial or desired results, the preventive and / or therapeutic response being, avoiding or substantially mitigating unwanted side effects.
  • the compounds of the present invention are administered to a subject in an amount effective to modulate abnormal intracellular calcium concentrations.
  • This amount can easily be determined by an expert in the area using known procedures.
  • the release of intracellular calcium through RyR channels can be quantified using calcium-sensitive fluorescent dyes, such as Fluo-3 or Fura-2, and monitoring calcium-dependent fluorescence signals with a photomultiplier tube and software adequate (Brillantes, et al. Cell, 1994, 77, 513-523, "Stabilization of calcium relay channel (ryanodine receptor) f nction by FK506-binding protein"; Gillo, et al. Blood, 1993, 81, 783-792 ).
  • the concentration of the compounds of the invention in serum of a human or animal subject can be determined following methods known in the art (Thebis, M. et al. Drug Test. Analysis 2009, 1, 32-42 "Screening for the calstabin-ryanodine complex stabilizers receiver JTV-519 and S-107 in doping control analysis ").
  • the administered amount of compounds of Formula (I) that is effective in limiting or preventing abnormal levels of intracellular calcium will depend on the relative efficacy of the compound chosen, the severity of the disorder treated and the weight of the affected.
  • the compounds will be administered one or more times a day, for example 1, 2, 3 or 4 times daily, with total typical daily doses in the range of approximately, between 1 mg / kg / day and 100 mg / kg / day, and more preferably between 10 mg / kg / day and 40 mg / kg / day, or an amount sufficient to achieve serum levels between approximately 1 ng / mL and 500 ng / mL.
  • the compounds of Formula (I) can be used alone, in combination with each other, or in combination with other drugs that have therapeutic activity including, but not limited to, mRNA exon skip enhancers, gene transcription modulators, diuretics, anti coagulants, platelet agents, antiarrhythmics, inotropic agents, chronotropic agents, ⁇ and ⁇ blockers, angiotensin inhibitors and vasodilators.
  • drugs may be part of the same composition, or be provided as a separate composition, for administration at the same time or at a different time.
  • the present invention also includes an in vitro method for determining the ability of a compound to modulate intracellular calcium levels and prevent dissociation of calstabine from the RyR protein complex, wherein said method comprises: (a) obtaining or generating a cell culture containing receptors RyR; (b) contacting the cells with the compound to be tested; (c) exposing the cells to one or more known conditions that alter intracellular calcium regulation or generate post-translational modifications in the RyR receptor; (d) determine if said compound modulates intracellular calcium levels; and (e) determining whether said compound limits or prevents the dissociation of calstabine from the RyR protein complex.
  • the conditions that alter intracellular calcium regulation or generate post-translational modifications in the RyR receptor are oxidative stress or nitrosative stress.
  • the present invention also contemplates a method of diagnosing a disorder or disease, wherein said method comprises: obtaining a sample of tissue or cells from a subject containing RyR receptors;
  • the compound of formula (I) employed in the diagnostic method is a compound according to variant (C) of the present invention.
  • the tissue sample is a muscle tissue sample.
  • the disorder or disease to be diagnosed is a skeletal muscle disorder or disease.
  • the disorder or disease to be diagnosed is a heart disease or disorder.
  • the disorder or disease to be diagnosed is a disorder or disease of the nervous system.
  • Measures of increased RyR and calstabine interaction and of decreased intracellular calcium levels can be performed using techniques known to an expert, such as immunoprecipitation, in situ proximity ligation assays (PLA) and real-time calcium imaging using fluorescent probes
  • Example 2 The procedure of Example 1 was followed, starting with l- (3-methoxyphenylthio) -2-propyne (2.00 mmol, 356 mg) and methyl azidoacetate (2.00 mmol, 230 mg). Rdto: 537 mg (88%). Yellowish oil.
  • IR (cm -1 ): 2953, 2837 (CH), 1749 (C 0), 1220, 1180 (triazole).
  • EXAMPLE 8 (R) -l- (1-Methoxycarb onyl-2-methyl-propyl) -4- [3 - (methoxy) phenylthiomethyl-lH- 1.2.3-triazole.
  • Example 1 The procedure of Example 1 was followed, starting with l- (3-methoxyphenylthio) -2-propyne (2.00 mmol, 384 mg) and methyl 2-azidoisobutyrate (2.00 mmol, 386 mg). Rdto: 258 mg (40%). Yellowish oil.
  • EXAMPLE 10 1 - (2-Hydroxyethyl) -4- [4- (methoxy) phenylthiomethyl- ⁇ H- 1.2.3-triazole.
  • Example 1 The procedure of Example 1 was followed, starting with l- (4-methoxyphenylthio) -2-propyne (2.00 mmol, 384 mg) and 2-azidoethanol (2.00 mmol, 174 mg). Rdto: 520 mg (98%). Yellowish oil.
  • Lithium hydroxide monohydrate (2.00 mmol, 84 mg) was added to a solution of 1- methoxycarbonylmethyl-4- [4- (methoxy) phenylthiomethyl] -lH-1, 2,3-triazole (1.00 mmol, 305 mg, Example 1) in THF / H 2 0 (1: 1, 8 mL) and the resulting mixture was stirred at room temperature for one hour. The organic solvent was evaporated, the resulting aqueous mixture was acidified with 1M HCl, and the solution was extracted with EtOAc (2 x 10 mL). The combined organic phases were dried (MgSO 4 ) and the solvent was evaporated under reduced pressure. Rdto: 158 mg (54%). White solid.
  • EXAMPLE 12 1-Carboxymethyl-4- [3- (methoxy) phenylthiomethyl-lH-1.2.3-triazole.
  • Example 1 1 The procedure of Example 1 1 was followed, starting from (R) -l- (l-methoxycarbonyl-2-phenylethyl) -4- [3- (methoxy) phenylthiomethyl] -lH-1, 2,3-triazole (1, 00 mmol, 383 mg, example 4). Rdto: 280 mg (76%). White solid. Mp: 78-86 ° C.
  • the NMR data were identical to those in example 13.
  • EXAMPLE 17 (S) - 1 - (1-Carboxy-2-methylpropyl) -4- [3 - (methoxy) phenylthiomethyl-IH-1.2.3-triazole.
  • EXAMPLE 19 1 - (1-Carboxy-1-methyl ethyl) -4- [3 - (methoxy) phenylthiomethyl-IH- 1.2.3 -triazole.
  • EXAMPLE 20 l- [2- (N.N-Dimethylamino) etill-4- [4- (methoxy) phenylthiomethyl-lH-1.2.3-triazole.
  • Triethylamine (8.80 mmol, 1.22 mL) and mesyl chloride (4.39 mmol, 0.34 mL) were successively added over a solution of l- (2-hydroxyethyl) -4- [4- (methoxy) phenylthiomethyl] - 1 H-1, 2,3-triazole (2.92 mmol, 776 mg, example 10) in anhydrous THF (16 mL) cooled to 0 ° C under a nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature overnight.
  • EXAMPLE 21 l-Methoxycarbonylmethyl-4- (phenylsulfinylmethyl) -lH-1.2.3-triazole.
  • EXAMPLE 22 l-Carboxymethyl-4- [3- (methoxy) phenylsulfonylmethyl-lH-1.2.3-triazole.
  • EXAMPLE 24 Biological tests of in vitro toxicity in human cells.
  • EXAMPLE 25 In vitro assays to determine intracellular calcium levels in mouse muscle fibers.
  • Fibers isolated from the mouse short digital flexor muscle were cultured overnight in the presence or absence of AFD and AFIK2 compounds at a concentration of 150 nM. Basal intracellular calcium levels were evaluated by incubating the fibers with the Fura 2-AM ratiometric fluorochrome (4 ⁇ ) and pluronic acid (0.02%) for 30 minutes at 37 ° C, in the culture medium. The fibers were visualized with a high resolution digital camera and the intracellular [Ca 2+ ] was estimated by the excitation ratio 340 nm / 380 nm.
  • Figure 2 shows the in vitro effect of AFD and AFIK2 compounds on intracellular levels of calcium at rest in the aforementioned mouse muscle fibers.
  • dystrophic fibers that were not treated showed a significant increase in calcium levels compared to control fibers (CTRL).
  • CTRL control fibers
  • AFD 1 and AFIK2 rescued intracellular calcium levels to control levels demonstrating the ability to reverse the increases in intracellular calcium observed in muscle fibers.
  • the compounds according to the invention carry out this reversal through a mechanism that involves modulation of RyR channels.
  • EXAMPLE 26 In vitro assays on the interaction of RyRl-calstabine 1
  • This test was carried out in human myotubes LHCN-M2 control after 9 days in differentiation medium. Said myotubes were pre-treated for 12 hours with the compounds AHK1 and AHK2 at a concentration of 150 nM. After the treatment, the myotubes were subjected to nitro-oxidative stress by peroxitrites by the addition of SIN1 (5 mM) for 30 minutes.
  • the colocalization of RyRl-calstabine was analyzed using the in situ proximity ligation technique (PLA in situ) for which the Sigma Duolink II Red Fluorescence Kit was used, and specific antibodies against RyRl and calstabine 1. This technique allows detect the exact location of two antigens that are less than 40nm from each other.
  • PPA in situ the in situ proximity ligation technique
  • 3 photographs were quantified for each condition with approximately 9 myotubes per field, using Image J software (http: // r sb. Inf o. Nor H. gov / ij / dowrs 1 oad. ht mi). In each image, the colocalization area was normalized with the myosin expression area, which was determined by immunofluorescence with a specific fluorescein-conjugated antibody.
  • the compounds AHK1 and AHK2 according to the invention have the capacity to partially recover the decrease in the interaction of RyRl-calstabinal in cultures of healthy human myotubes after being subjected to nitro-oxidative stress.
  • the analysis of the RyRl-Calstl interaction by means of the PLA technique showed that in the presence of SIN1 the dissociation of the RyRl-Calstl complex occurs and that said dissociation can be partially prevented by pretreatment with the compounds AHK1 and AHK2.
  • the quantification of the PLA images with ImageJ is shown, while in the lower panel representative images of PLA of each condition are shown, where the points represent the RyRl-Calstl interaction (calibration bar 50 ⁇ ).
  • the compounds tested according to the invention not only improve the functionality of Duchenne or Becker dystrophic myotubes, but also minimize the degenerative effects of nitro-oxidative stress on healthy human myotubes through an increase in the affinity of the RyRl-calstabinal interaction. According to these results, the compounds of the invention may be useful as therapeutic agents against diseases caused by the decrease in RyR-calstabinal affinity under conditions of nitro-oxidative stress.
  • mice One month old male mdx dystrophic mice supplied by Jackson Laboratory (http s: // www j ax. Org / strain / 001801) were used. Biological assays to measure the effect of Ahulken compounds (AHK) on muscle function were performed with mice one month old, while in vivo tests to determine the effect on the heart and CNS were performed with mice four months old One month old mice were treated with compound AHK1 or compound AHK2 for 5 weeks, where said compounds were administered in the drinking water at a concentration of 0.25 mg / mL. Weekly, the muscular strength of the front legs was measured using a grip strength meter and the value obtained was normalized by the animal's body weight.
  • Ahulken compounds AHK
  • the anterior tibial muscle was obtained, which was processed for later biochemical and immunohistological analysis to determine the degree of muscle damage.
  • Regeneration derived from cell death was determined in muscle cryosections by quantifying the percentage of central nuclei, using standard immunofluorescence techniques to detect collagen IV and cell nuclei.
  • Figure 5 shows representative cryostat cuts of diaphragms of control mice and of dystrophic mice marked to see collagen IV and DAPI to see nuclei.
  • the 5-week treatment of mdx mice with AHK1 and AHK2 significantly reduced the percentage of central nuclei, which demonstrates the ability of said compounds to reduce histopathological markers of muscular dystrophy after 5 weeks of treatment.
  • the biochemical analysis of the tibialis anterior muscle was performed by RNA extraction and analysis of the expression pattern in control mice, in mdx mice and in mice subjected to the different treatments.
  • the RT2 Profiler PCR Array specific to human skeletal muscle, myogenesis and myopathy (PAHS-099Z, QIAGEN) was used, using cDNA mixtures of at least 3 mice per group.
  • the expression profile of 84 genes involved in pathophysiological mechanisms of skeletal muscle was analyzed.
  • the experiments were performed on the 7300 Real-Time PCR (Applied Biosystems) and the results obtained were analyzed using the QIAGEN online software
  • the results show that the compounds according to the invention show capacity to reduce by half the number of overexpressed genes in mdx dystrophic muscle.
  • Genes likely to be modulated by the AHK compounds include, but are not limited to, Aktl, Bcl2, Casp3, Cast, Cav3, Cryab, Ctnnbl, Dagl, Des, Dysf, Foxo3, Igfbp3, Igfbp5, Ikbkb, Mapk3, Myodl, Nfkbl, Ppargclb, Prkaal, Rpsókbl, Utr, Casp3, Igf2, Illb, 116, Lmna, Mmp9, Myog, Tgfbl, Tnncl and Tnntl.
  • Aktl, Illb, Mapk3, Mmp9 and Utr are genes related to skeletal muscle loss or atrophy.
  • four-month-old mice were treated for 5 weeks with the compound AHK2 in the drinking water at a concentration of 0.25 mg / mL.
  • Four-month-old mdx mice show an exacerbated defensive response after acute stress that is independent of motor, cardiac and respiratory deficits, and that is controlled by central mechanisms (Figure 7). Acute stress was performed by manual immobilizations for 15 seconds, in a position that is usually used to perform intraperitoneal injections.
  • mice After acute stress, the mice are monitored for 1 minute and the% of freezing time, or periods of tonic immobility of at least 1 second with a 90% immobility sensitivity is calculated. No differences were observed in the freezing of non-stressed mice, indicating that the exacerbated defensive response shown by mdx mice is independent of motor deficits.
  • the treatment of AHK2 for 5 weeks significantly improves the CNS phenotype of mdx mice related to an exacerbated defensive response.
  • the myocardium of the four month old mdx dystrophic mice is very susceptible to mechanical stress and the isoproterenol compound induces cardiomyopathy in these mice (Figure 8).
  • the integrity of the cardiomyocyte sarcolemma was determined by measuring the uptake of the Evans Blue dye, which accumulates in the cardiomyocytes that have membrane damage.
  • Evans Blue was administered 24 hours before the extraction of the hearts, at a concentration of 10 mg / ml by intraperitoneal injection (10 ul / g body weight).
  • the damage with isoproterenol was performed by 3 sequential intraperitoneal injections of beta-i soproterenol (350 ng / g body weight), after 18, 20 and 22 h of the administration of Evans Blue to determine the degree of muscle damage.
  • Regeneration derived from cell death was determined in muscle cryosections by quantifying the percentage of central nuclei, using standard immunofluorescence techniques to detect collagen IV and cell nuclei.
  • Figure 8 shows cryostat sections representative of hearts of control mice and dystrophic mice injected with Evans Blue to see the cardiac damage generated by isoproterenol.
  • the 5-week treatment of mdx mice with AFIK2 increases the integrity of the cardiomyocyte sarcolemma of mdx mice and protects the myocardium from isoproterenol-induced damage, indicating that said compound reaches the heart muscle, is able to modulate the receptor of ryanodine type 2 (RyR2) and is effective in vivo to prevent cardiomyopathies.
  • RyR2 ryanodine type 2

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Abstract

La presente invención se relaciona con 1,2,3-triazoles de fórmula (I) útiles para mejorar o restaurar la función de homeostasis de calcio intracelular y la unión RyR-calstabina en células humanas y animales. También está relacionada con métodos de síntesis de dichos compuestos, con composiciones farmacéuticas que los contienen, y con su uso para prevenir o tratar trastornos músculo-esqueléticos, cardíacos y del sistema nervioso.

Description

DESCRIPCIÓN
Triazoles para la regulación de la homeostasis de calcio intracelular Campo de la invención
La presente invención está relacionada con nuevos 1,2,3-triazoles sustituidos útiles para mejorar o restaurar la función de homeostasis de calcio intracelular en células humanas y animales. También está relacionada con métodos de síntesis de dichos compuestos, con composiciones farmacéuticas que los contienen, y con su uso para prevenir o tratar trastornos músculo-esqueléticos, cardíacos y neurodegenerativos.
Antecedentes de la invención
Las distrofias musculares son enfermedades hereditarias heterogéneas que se caracterizan por la debilidad y atrofia progresiva del músculo esquelético. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las formas más frecuentes, está ligada al cromosoma X y se da en 1 de cada 3500 varones. Como en el caso de su forma alélica más benigna (la distrofia muscular de Becker, BMD), ambas están producidas por mutaciones en el gen que codifica la distrofina, una proteína del citoesqueleto de 427- kDa. Los estudios genéticos no son suficientes para la erradicación de la enfermedad debido a la alta incidencia de casos esporádicos por lo cual la búsqueda de nuevas terapias eficaces es de urgente necesidad. Las distrofias musculares de cintura (LGMDs) son un amplio grupo de distrofias musculares hereditarias caracterizadas por la debilidad proximal progresiva con afectación predominante de las cinturas pélvica y escapular. Dentro de las formas recesivas de LGMD, la calpainopatía o LGMD2A es la forma más frecuente y está producida por mutaciones en el gen que codifica la calpaína 3 (CAPN3), una cisteín proteasa no lisosomal necesaria para el correcto funcionamiento y regeneración del músculo.
La distrofia miotónica tipo 1 (DM1), es la forma adulta más frecuente de distrofia muscular y se caracteriza por debilidad muscular, miotonía y afectación multisistémica. Es una enfermedad hereditaria autosómica dominante causada por una expansión inestable de la repetición del triplete CTG localizado en la región no codificante 3 ' del gen DMPK, localizado en el brazo largo del cromosoma 19 y expresado predominantemente en músculo esquelético.
Las arriba mencionadas así como otras distrofias musculares (como la DM2, LGMD recesiva y dominante, miopatías congénitas o metabólicas entre otras) comparten alteraciones en la homeostasis del calcio intracelular. Debido a que la alteración de la concentración intracelular de Ca2+ en las fibras musculares parece representar un mecanismo patogénico central común, el desarrollo de intervenciones terapéuticas que prevengan las alteraciones del Ca2+ intracelular constituye una diana terapéutica muy valiosa. (Vallejo-Illarramendi et al. Expert Rev. Molec. Med. 2014, 16, el 6, doi: 10.1017/erm.2014.17 "Dysregulation of calcium homeostasis in muscular dystrophies").
Niveles básales elevados de Ca2+ intracelular conllevan la activación de la calpaína, la degradación de proteínas, la apertura de poros de transición de permeabilidad mitocondrial (PTPm) y, finalmente, la muerte de la fibra muscular por necrosis. El aumento de los niveles de Ca2+ intracelular es un proceso complejo que involucra flujos de Ca2+ a través del sarcolema, pérdidas del calcio desde el retículo sarcoplásmico (RS) y niveles anormales de Ca2+ en el RS. En ratones mdx, un modelo animal de distrofia muscular de Duchenne, la S-nitrosilación anormal de los residuos de cisteína del receptor de rianodina RyRl y RyR2 conlleva la disociación de la calstabina del complejo proteico, lo cual produce canales inestables que pierden calcio en estado de reposo. Esta nitrosilación parece producida por una desregulación del óxido nítrico que causa estrés nitrosativo y oxidativo en los músculo de ratones distróficos mdx (Dudley et al., Am. J. Pathol. 2006; Bellinger et al., Nat Med. 2009, 15, 325-330; Fauconier et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 2010). Además, la expresión inducida de la microdistrofina en miotubos deficientes de distrofina revierte el aumento de la liberación de calcio dependiente de receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) a niveles controles, lo que sugiere la implicación de IP3R en la alteración de la homeostasis del Ca2+ en DMD.
Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha demostrado que la calpaína 3 (CAPN3) interactúa con la calsecuestrina (CSQ), proteína que participa en la homeostasis del calcio. En ratones knockout de CAPN3 (C3KO, Capn3-/-), la reducción de los niveles de RyRl se acompaña de una reducción en la liberación del Ca2+ desde el RS. A su vez, se ha visto que tras la liberación de calcio del RS en ratones Capn3-/-, la recaptación de Ca2+ hacia el RS se produce más lentamente, aunque la base de este hallazgo necesita ser estudiada más en profundidad. Sin embargo, se ha observado que la pérdida de la actividad proteolítica de la CAPN3 en ratones Capn3 cs/cs no afecta a la homeostasis del calcio, lo cual indica que la función estructural de la CAPN3 es clave para el mantenimiento de la homeostasis de Ca2+.
La distrofia miotónica se ha asociado con la desregulación de la conexión alternativa del gen CACNAI S que codifica la subunidad alfa 1 S del receptor de dihidropiridina DHPR, un sensor de voltaje imprescindible en el acoplamiento excitación-contracción (E-C). En la DM1 y DM2, la omisión del exon 29 de CACNAI S es mayor, lo que aumenta la conductancia del canal y la sensibilidad al voltaje.
Varios trastornos y enfermedades se asocian a modificaciones congénitas o adquiridas de la proteína RyRl (Kushmir et al. Recent Pat Biotechnol. 2012, 6, 157-166 "Ryanodine receptor patents"). Dichos trastornos y enfermedades comprenden condiciones del músculo esquelético, cardiaco y del sistema nervioso. Más concretamente incluyen, pero no se limitan a, miopatías congénitas, distrofias musculares, sarcopenia, fatiga del músculo esquelético, debilidad muscular adquirida o atrofia, hipertermia maligna, trastornos y enfermedades de ritmo cardiaco irregular asociados a ejercicio, insuficiencia cardiaca congestiva, miocardiopatía hipertrófica, enfermedad de Alzheimer y pérdida de memoria asociada a la edad. En todas estas afecciones se ha sugerido que elevaciones de las concentraciones de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) en condiciones de reposo contribuyen directamente a la toxicidad de la célula (miofibra, cardiomiocito, neurona o célula glial), su deterioro y la activación simultánea de proteasas dependientes de Ca2+ . Existen dos tipos principales de receptores de rianodina relacionados con canales de calcio en fibras musculares: RyRl situado en el músculo esquelético, y RyR2 situado en el músculo cardíaco. Cada canal de calcio está formado por un tetrámero de proteína RyR, pudiendo cada monómero de RyR interaccionar con una proteína de casltabina. RyRl se une a FKBP12 (calstabinal) y RyR2 se une a FKBP12.6 (calstabina2). Tanto en corazón como en músculo esquelético se ha visto que la disociación anormal de las calstabinas y los canales RyR por la nitrosilación progresiva de los canales de RyR, causa un incremento de la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico al citoplasma intracelular, reduciendo el rendimiento muscular durante la contracción y activando, a largo plazo, la disfunción muscular (Bellinger et al, Nat. Med. 2009, 15, 325-330; Fauconier et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 2010, 107, 1559-1564). En el estado de la técnica se conocen algunos compuestos de bajo peso molecular que muestran actividad terapéutica en tejidos musculares dañados. Por ejemplo, se ha demostrado la utilidad de la 4-[3-(4-bencilpiperidinil)-propanoil]-2,3,4,5-tetrahidro-l,4- benzotiazepina (JTV-519) para prevenir la necrosis de músculos cardíacos y el infarto de miocardio. A concentraciones de 10~6 M, el compuesto JTV-519 inhibe in vitro la necrosis miocardial inducida por adrenalina y cafeína en el ventrículo izquierdo de un corazón de rata sin afectar el ritmo cardíaco ni la presión ventricular izquierda (Kaneko, N. et al W092/12148A1 "Preparation of 4-[(4-benzylpiperidinyl)-alkanoyl]-2,3,4,5- tetrahydro-l,4-benzothiazepine derivatives for inhibiting the kinetic cell death of cardiac muscles without inhibiting cardiac functions"). El compuesto JTV-519 actúa sobre el receptor de rianodina RyR2 asociado a la calstabina2 (FKBP12.6), aumentando la afinidad de FKBP12.6 por el receptor RyR2 fosforilado via kinasa PKA, y también por el receptor RyR2 mutante que, de otro modo, tienen una baja afinidad o no se enlazan a FKBP12.6. Esta acción de JTV-519 repara la fuga de ión Ca2+ en RyR2 (Marks, A. R. et al US2004/229781A1 "Compounds and methods for treating and preventing exercise-induced cardiac arrhythmias").
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JTV-519
También es conocido que composiones farmacéuticamente activas conteniendo el compuesto S-107, u otras tetrahidrobenzotiazepinas estructuralmente relacionadas, son eficaces para tratar o prevenir trastornos o enfermedades relacionadas con los receptores RyR2 que regulan el funcionamiento de los canales de calcio en células cardíacas (Marks, A. R. et al US2006/194767A1 "Benzothiazepines as novel agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors and their preparation and pharmaceutical compositions"; ver también: Mei, Y. et al. PLoS One. 2013, 8: e54208 "Stabilization of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel- FKBP12 complex by the 1,4-benzothiazepine derivative S107"). También es conocido que la misma familia de compuestos es activa como estabilizante de la interacción RyRl-calstabinal, reduciendo la fatiga muscular (Marks, A. R. et al WO2008/060332A2 "Methods using tetrahydrobenzothiazepine compounds for treating or reducing muscle fatigue") y para tratar la sarcopenia (Marks, A. R. et al WO2012/019071A1 "Methods and compositions comprising benzazepine derivatives for preventing and treating sarcopenia").
Algunos derivados de carvedilol han sido descritos como asistentes de la normalización de la homeostasis de calcio intracelular por acción sobre los receptores RyR2, probando de este modo un efecto beneficioso en terapia cardíaca (Chen, S. et al. US2007/025489A1 "Preparation of carbazoles as ryanodine receptor type 2 (RyR2) antagonists for treatment of cardiac conditions").
Finalmente, es conocido que el isomorfo del receptor de rianodina RyR3 regula la homeostasis de calcio intracelular en el cerebro u otros tejidos neuronales, y su modulación usando benzotiazepinas ha sido reivindicada para tratar algunos trastornos neuronales (Marks, A. R. et al WO2012/037105A1 "Methods and compositions comprising benzazepine derivatives for treating or preventing stress-induced neuronal disorders and diseases"). Además, tanto RyRl como RyR2 se expresan en el cerebro, y hay evidencias de que la regulación del calcio y el estrés nitro-oxidativo están involucrados en diversos trastornos cerebrales y muerte neuronal (Kakizawa et al, EMBO J. 2012, 31, 417-428; Liu X et al, Cell. 2012, 150, 1055-1067).
Todos estos antecedentes pondrían de manifiesto que el desarrollo de compuestos que permitan regular o modular los receptores RyR, regulando los niveles de calcio intracelular, proporcionaría una útil alternativa para el tratamiento de trastornos musculares, así como en enfermedades cardíacas y neurodegenerativas.
Sumario de la invención
Los autores de la presente invención han desarrollado nuevos compuestos derivados de triazol, en particular, 4-[(feniltio)alquil]-lH-l,2,3-triazoles, adecuados para modular receptores RyR que regulan la función del calcio en células animales o humanas. En la invención, dichos compuestos se designan como "AHK".
Tal como se pone de manifiesto en la parte experimental, los compuestos según la presente invención tienen capacidad para modular la homeostasis de calcio intracelular en fibras distróficas musculares, revirtiendo los incrementos observados de calcio intracelular. Además, dichos compuestos tienen un efecto modulador sobre RyR, habiéndose demostrado su capacidad para recuperar la interacción RyRl-calstabina sobre miotubos humanos sanos sometidos a estrés nitro-oxidativo.
Por su parte, los ensayos in vivo han puesto de manifiesto que dichos compuestos permiten además mejorar la fuerza de agarre en ratones distróficos, así como normalizar genes distróficos sobre-expresados y reducir los marcadores histopatológicos distróficos.
Por ello, un primer aspecto de la invención está relacionado con un compuesto 1,2,3- triazol 1,4-disustituido de Fórmula (I):
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(I)
en el cual: R1 es un birradical alquileno C1-C4 opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionado independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-4, arilo C6-io, F, Cl, CN y N02;
R2 es un birradical alquileno Ci-C6, en el cual 1, 2 ó 3 grupos -CH2- pueden estar opcionalmente reemplazados por grupos seleccionados entre -O- y -S-; y en el que el birradical alquileno Ci-C6 puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre alquilo C1-4, alilo, propargilo, hidroximetilo, 1- hidroxi etilo, 2-hidroxi etilo, 3-aminopropilo, 4-aminobutilo, 3-guanidilpropilo, 3- indolilmetilo, arilo C6-io, bencilo, 4-hidroxibencilo, heteroarilo C6-io, F, Cl, OH, 0(alquilo CM), CN, N02, CO(alquilo CM), C02(alquilo CM), -CO H(alquilo CM), - CON(alquilo CM)2;
R3 is un grupo seleccionado independientemente entre H, alquilo C1-4, arilo C6-io, F, Cl,
Br, I; m se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4; n se selecciona entre 0, 1, 2;
X se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en OH, 0(alquilo C1-4), 0(arilo C6-io), OCF3, S(alquilo CM), S(arilo C6-io), alquilo Ci-6, CF3, HC(0)(alquilo C1-4) y halógeno; o dos grupos X pueden representar un birradical metilendioxi, etilenedioxi o propilendioxi; e
Y se selecciona del grupo que consiste en -OH, -C02H, -C02(alquilo C1-4), -C02(alilo), -C02(bencilo), -S03H, - H2, - H(alquilo CM), -N(alquilo CM)2, N(alquilo CM)3 y - N(heterociclilo o heteroarilo), donde dicho heterociclilo o heteroarilo se encuentra opcionalmente sustituido por un grupo alquilo C1-4 y donde el átomo N forma parte del heterociclilo o heteroarilo; o un estereoisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado marcado isotópicamente o un profármaco del mismo.
Otro aspecto de la invención comprende un método de síntesis de los compuestos de Fórmula (I), que comprende: a) hacer reaccionar un alquino de Fórmula (II) con una azida de Fórmula (III),
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(Π) (III) opcionalmente en presencia de un catalizador de cobre y opcionalmente presencia de una base, para dar un compuesto de fórmula (I) como se definido previamente, en donde: los grupos R1, R2, R3, m, n y X en los compuestos de fórmulas (II)-(III) son según se han definido anteriormente, e
Y es un grupo según se ha definido anteriormente, opcionalmente protegido con un grupo protector de carboxilo, un grupo protector de hidroxilo o un grupo protector de amino; b) cuando n es 0 en el compuesto de fórmula (I) obtenido en la etapa a), opcionalmente tratar dicho compuesto de fórmula (I) con un agente oxidante para dar un compuesto de fórmula (I) en donde n es 1 o 2, R1, R2, R3, m y X son según se han definido previamente, e Y es un grupo según se define previamente opcionalmente protegido con un grupo protector de carboxilo, un grupo protector de hidroxilo o un grupo protector de amino; y c) cuando el compuesto de fórmula (I) obtenido en la etapa a) o b) tiene un grupo Y protegido con un grupo protector, eliminar dicho grupo protector para dar un compuesto de fórmula (I) en donde R1, R2, R3, m, n, X e Y son según se han definido previamente.
Otro aspecto de la invención está relacionado con composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de Fórmula (I), definido según se ha indicado arriba, junto con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso de un compuesto de fórmula (I) como se ha definido más arriba para la preparación de un medicamento.
Un último aspecto de la invención se dirige al uso de un compuesto de fórmula (I) como se ha definido más arriba en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de trastornos o enfermedades relacionadas con la desregulación de la concentración de calcio intracelular o con la disfunción de receptores RyR, en particular trastornos o enfermedades del músculo esquelético, trastornos o enfermedades cardíacos y trastornos o enfermedades del sistema nervioso.
Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra las curvas de toxicidad de los compuestos AHKl, AHK2 y S-107 sobre miotubos humanos tras 24 h de incubación usando el ensayo colorimétrico Citotox 96.
La Figura 2 muestra el efecto in vitro de los compuestos AHKl y AHK2 sobre los niveles intracelulares de calcio en estado de reposo en fibras musculares de ratón:
A) Imagen de fibra aislada del músculo flexor digital corto que muestra el característico patrón de estriación. B) Imágenes representativas de fibras [fibras control (CTRL) y fibras distróficas (MDX)] cargadas con fura-2AM tras realizar la corrección de fondo necesaria para medir los niveles de calcio intracelular. C) Histograma que muestra los niveles básales de calcio intracelular en los distintos grupos de fibras. El número de fibras analizadas (n) se muestra en el histograma (Kruskal-Wallis and U Mann- Whitney, *p<0,05).
La Figura 3 muestra el efecto in vitro de los compuestos AHKl y AHK2 sobre la interacción RyRl-calstabinal en cultivos de miotubos humanos sanos expuestos a estrés por peroxinitritos.
La Figura 4 muestra el efecto provocado sobre la fuerza de agarre en ratones distróficos mdx tratados con los compuestos AHKl y AHK2. *p< 0,05; n=10 ratones control (CTRL); n=l l ratones mdx no tratados (MDX); n=10 ratones mdx tratados con AHKl (MDX+AHK1); y n=6 ratones mdx tratados con AHK2 (MDX+AHK2). La Figura 5 muestra el efecto in vivo de los compuestos AHKl y AHK2 sobre la degeneración/regeneración muscular en ratones mdx distróficos:
A) Cortes de criostato representativos de diafragmas de ratones control y distróficos en el que se observa el colágeno IV marcado con un anticuerpo fluorescente, y los núcleos marcados con 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). B) Muestra el número de núcleos centrales obtenidos en secciones de ratones control (CTRL), ratones distróficos (MDX) y ratones distróficos tratados con AHKl (MDX+AHK1) y AHK2 (MDX+AHK2).*p<0,05; n=3 CTRL; n=7 MDX D; n=7 MDX+AHK1 y n=4 MDX+AHK2).
La Figura 6 muestra el efecto del tratamiento con AHKl en el patrón de expresión génica del músculo tibial anterior de ratones mdx. La Figura 7 muestra el efecto in vivo del compuestos AHK2 sobre la función anormal del SNC en ratones mdx distróficos:
A) Muestra las trayectorias durante 1 minuto de los ratones control (Ctl), mdx (mdx) y mdx tratados con AHK2 (mdx AHK2), tras una breve inmovilización de 15 segundos.
B) Muestra la respuesta defensiva exacerbada tras un estrés agudo expresada como porcentaje de tiempo que el ratón realiza Freezing durante 1 minuto. (Barras grises): periodos de inmovilidad tónica de al menos 1 segundo con una sensibilidad de inmovilidad del 90%; (Barras negras): porcentaje de tiempo de freezing en animales no immovilizados.
*P < 0.05 (t-test no pareado); #p < 0.05 (t-test pareado); ns, no significativo; n > 5 ratones por grupo, barras de error ± sem.
La Figura 8 muestra el efecto in vivo del compuestos AFD 2 sobre la cardiomiopatía de los ratones mdx inducida por isoproterenol. Panel superior: imágenes representativas de cortes de corazón de ratones control BL10 (Ctl), de ratones mdx (mdx) y de ratones mdx tratados con AFD 2 (mdx AFD 2). Barra de calibración, lmm. La captación de Evans Blue se visualiza mediante microscopía de fluorescencia.
Gráfico inferior: muestra el porcentaje de área dañada en el corazón de los ratones control (Ctl), de ratones mdx (mdx) y de ratones mdx tratados con AFD 2 (mdx AHK2). N= 2 ratones por grupo fueron analizados; barras de error ± sem.
Descripción detallada de la invención La presente invención aporta nuevos compuestos triazólicos que son capaces de tratar o prevenir trastornos o enfermedades asociadas a la desregulación de calcio intracelular o la disfunción de receptores RyR.
Así, tal como se ha menciona previamente, el primer aspecto de la presente invención se dirige a un compuesto de fórmula (I): N-N m
R3
(I)
en el cual:
R es un birradical alquileno C1-C4 opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionado independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-4, arilo C6-io, F, Cl, CN y N02;
R2 es un birradical alquileno Ci-C6, en el cual 1, 2 ó 3 grupos -CH2- pueden estar opcionalmente reemplazados por grupos seleccionados entre -O- y -S-; y en el que el birradical alquileno Ci-C6 puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre alquilo C1-4, alilo, propargilo, hidroximetilo, 1- hidroxi etilo, 2-hidroxi etilo, 3-aminopropilo, 4-aminobutilo, 3-guanidilpropilo, 3- indolilmetilo, arilo C6-io, bencilo, 4-hidroxibencilo, heteroarilo C6-io, F, Cl, OH, 0(alquilo CM), CN, N02, CO(alquilo CM), C02(alquilo CM), -CO H(alquilo CM), - CON(alquilo CM)2; R3 is un grupo seleccionado independientemente entre H, alquilo C1-4, arilo C6-io, F, Cl,
Br, I; m se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4; n se selecciona entre 0, 1, 2;
X se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en OH, 0(alquilo C1 -4), 0(arilo C6-io), OCF3, S(alquilo CM), S(arilo C6-io), alquilo Ci-6, CF3, HC(0)(alquilo C1-4) y halógeno; o dos grupos X pueden representar un birradical metilendioxi, etilenedioxi o propilendioxi; e
Y se selecciona del grupo que consiste en -OH, -C02H, -C02(alquilo C1 -4), -C02(alilo), -C02(bencilo), -S03H, - H2, - H(alquilo CM), -N(alquilo Ci-4)2 y N(alquilo CM)3 y - N(heterociclilo o heteroarilo), donde dicho heterociclilo o heteroarilo se encuentra opcionalmente sustituido por un grupo alquilo C1 -4 y donde el átomo N forma parte del heterociclilo o heteroarilo; o un estereoisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado del mismo marcado isotópicamente, o un profármaco del mismo.
En el contexto de la presente invención, los siguientes términos encontrados en los compuestos de fórmula (I) tienen el significado indicado a continuación: El término "birradical alquileno" se refiere a un birradical formado por una cadena lineal o ramificada hidrocarbonada consistente en átomos de carbono e hidrógeno, que no presenta insaturación y que se encuentra unido en sus extremos al resto de la molécula a través de enlaces sencillos, tal como por ejemplo, metileno, etileno, propileno, butileno, etc. La mención a birradical alquileno C1-C4 se refiere a cuando dicho birradical tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, mientras que la mención a birradical alquileno Ci-C6 se refiere a cuando dicho birradical tiene entre 1 y 6 átomos de carbono. El birradical alquileno puede encontrarse sustituido según se especifica en las definiciones de los sustituyentes R1 y R2 en el compuesto de fórmula (I).
El término "alquilo" se refiere a un radical formado por una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, la cual no contiene ninguna saturación y está enlazada al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, etc. La mención a alquilo C1-C4 se refiere a cuando dicho radical tiene entre 1 y 4 átomos de carbono. El término "arilo Ce-Cw" se refiere a un radical formado por un anillo aromático de entre 6 y 10 miembros consistente en átomos de carbono e hidrógeno, siendo de forma preferida un radical fenilo.
El término "heteroarilo Ce-Cw" se refiere a un radical formado por un anillo aromático de entre 6 y 10 miembros consistente en átomos de carbono e hidrógeno y uno o más heteroátomos seleccionados entre O, N y S.
El término "-N(heterociclilo)" se refiere a un radical formado por un ciclo de entre 5 y 7 miembros consistente en átomos de carbono e hidrógeno y uno o más heteroátomos seleccionados entre O, N y S, siendo al menos uno de ellos N y estando éste unido directamente al radical R2. El término "-N(heteroarilo)" se refiere a un radical formado por un anillo aromático de entre 6 y 10 miembros consistente en átomos de carbono e hidrógeno y uno o más heteroátomos seleccionados entre O, N y S, siendo al menos uno de ellos N y estando éste unido directamente al radical R2.
El término "alilo" se refiere a un radical de fórmula -CH2-CH=CH2. El término "halógeno" se refiere a F, Cl, Br o I.
La expresión "derivado marcado isotópicamente" se refiere a un compuesto de fórmula (I) en el cual al menos uno de sus átomos se encuentra isotópicamente enriquecido. Por ejemplo, compuestos de fórmula (I) en los que un hidrógeno se reemplaza por un deuterio o tritio, un carbono se reemplaza por un átomo enriquecido 13C o 14C, o un nitrógeno se reemplaza por un átomo enriquecido 15N, están dentro del alcance de esta invención.
El término "sales o solvatos farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal, éster, solvato farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, en su administración al receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de fórmula (I) tal y como descrito en el presente documento. La preparación de sales puede ser llevada a cabo mediante métodos conocidos en el estado de la técnica.
Por ejemplo, las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos proporcionados en el presente documento son sintetizadas a partir del compuesto descrito anteriormente que contenga una unidad básica o ácida mediante métodos químicos convencionales. En general, tales sales son preparadas, por ejemplo, reaccionando las formas ácidas o básicas libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de ambos. En general, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de las sales de adición ácidas incluyen sales de adición de ácidos minerales tales como, por ejemplo, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, sulfato, nitrato, fosfato, y sales de adición de ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluensulfonato. Ejemplos de sales de adición alcalinas incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y sales alcalinas orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, Ν,Ν-dialquilenetanolamina, glucamina y sales aminoácidas básicas.
Los solvatos se refieren a una sal del compuesto de fórmula (I) en la que las moléculas de un disolvente farmacéuticamente adecuado se incorporan en la red cristalina. Los métodos de solvatación en general son conocidos en el estado de la técnica. Ejemplos de disolventes farmacéuticamente adecuados son etanol, agua y similares. En una realización particular el solvato es un hidrato.
Los compuestos de fórmula (I) o sus sales o solvatos están preferiblemente en forma farmacéuticamente aceptable o en forma substancialmente pura. Como forma farmacéuticamente aceptable se entiende, ínter alia, que tienen un nivel farmacéuticamente aceptable de pureza, excluyendo aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y excipientes, y sin incluir ningún material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el fármaco están preferiblemente por encima del 50%, más preferiblemente por encima del 70%, y aún más preferiblemente por encima del 90%. En una realización preferida está por encima del 95% del compuesto de fórmula (I), o de sus sales o solvatos.
Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula (I) arriba descrita pueden incluir cualquier estereisómero dependiendo de la presencia de centros quirales, incluyendo enantiómeros y diastereoisómeros. Los isómeros individuales, enantiómeros o diastereómeros y mezclas de los mismos están dentro del alcance de la presente invención.
El término "profármaco" se utiliza en su acepción más amplia y engloba aquellos derivados que se convierten in vivo en los compuestos de la invención. Tales derivados incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la molécula y sin limitación, ésteres, ésteres de amino ácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonatos de sales metálicas, carbamatos y amidas. Ejemplos de métodos para producir un profármaco de un compuesto activo dado son conocidos por un experto en la materia y pueden encontrarse, por ejemplo, en Krogsgaard-Larsen et al. "Textbook of Drugdesign and Discovery" Taylor & Francis (april 2002).
En una variante (A) de la presente invención, el radical R1 es -CH2-. En una realización preferente de dicha variante (A), R2 es un birradical alquileno C1-4 opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, isopropilo, alilo, propargilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo, hidroximetilo, 1-hidroxi etilo, 2-hidroxietilo, 3- aminopropilo, 4-aminobutilo, 3-guanidilpropilo, 3-indolilmetilo, fenilo, 1-naftilo, 2- naftilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, y heteroarilo C6-io- De forma más preferida, R2 es un birradical -CH2- o -CH2-CH2-, opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en metilo, isopropilo, isobutilo y bencilo. De forma aún más preferida, R2 es un birradical -CH2- opcionalmente sustituido con dos sustituyentes metilo o con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en isopropilo, isobutilo y bencilo, o R2 es un birradical -CH2-CH2-. En una forma también preferida, R2 es un birradical -CH2- o -CH2-CH2-.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (A), R3 es H.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (A), m es 1.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (A), n es 0. En otra forma de realización preferente de dicha variante (A), X es -0(alquilo C1-4) o halógeno, más preferiblemente es un grupo metoxi en posición meta o para o cloro.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (A), Y se selecciona del grupo que consiste en C02H, C02Me, H2, - HMe, - Me2, - Me3, - HEt, - Et2, - Et3,
(alquilo C-,_4) — -v ,(a|quilo C1 -4)
W CJ ' "~N / >
Figure imgf000017_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de dichos grupos.
De forma más preferente, Y se selecciona del grupo que consiste en C02H, C02Me, H2, -NHMe, -NMe2, -NMe3, -NHEt, -NEt2, -NEt3, pirrolidin-l-ilo, piperidin-l-ilo, morfolin-4-ilo, 4-piperazin-l-ilo, 4-metil-piperazin-l-ilo, piridin-l-ilo, más preferiblemente C02H y -NMe2, aún más preferiblemente Y es -C02H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Dentro de la variante (A), los compuestos de fórmula (I) se seleccionan del grupo que consiste en: l-carboximetil-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, l-[2-(N,N-dimetilamino)etil]-4 4-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, l-carboximetil-4-[4-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, (S)-l-(l -carboxi-2-feniletil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, (R)-l-(l-carboxi-2-feniletil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, (S)-l-(l -carboxi-3 -metilbutil)-4- [3 -(metoxi)fenilti ometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, (R)- 1 -( 1 -carboxi-3 -metilbutil)-4- [3 -(metoxi)fenilti ometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, (S)-l-(l -carboxi-2-metilpropil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, (R)-l-(l-carboxi-2-metilpropil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, 1 -( 1 -carboxi- 1 -metiletil)-4-[3 -(metoxi)feniltiometil]- 1H- 1 ,2,3 -triazol, l-(2-hidroxietil)-4-[4-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, l-metoxicarbonilmetil-4-(fenilsulfinilmetil)-lH-l,2,3-triazol, y l-carboximetil-4-[3-(metoxi)fenilsulfonilmetil]-lH-l,2,3-triazol, 1 -carboximetil-4- [3 -(cloro)feniltiometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, o una sal del mismo. En una variante (B) de la presente invención, el radical R1 es -CH2-.
En una realización preferente de dicha variante (B), R2 es un birradical alquileno C1-4 en el cual uno o dos grupos -CH2- se encuentran reemplazados por -O-, y donde dicho birradical alquileno C1-C4 está opcionalmente sustituido con uno o dos grupos alquilo C1-C4, preferiblemente seleccionados entre metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo y tert-butilo.
De forma más preferida, R2 es un birradical -CH2- o -CH2-CH2-, opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en metilo, isopropilo e isobutilo. De forma aún más preferida, R2 es un birradical -CH2- opcionalmente sustituido con dos sustituyentes metilo o con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en isopropilo e isobutilo, o R2 es un birradical -CH2-CH2-.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (B), R3 es H. En otra forma de realización preferente de dicha variante (B), m es 1.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (B), n es 0.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (B), X es -0(alquilo C1-4) o halógeno, más preferiblemente es un grupo metoxi en posición meta o para o cloro. En otra forma de realización preferente de dicha variante (B), Y se selecciona del grupo que consiste en H2, - H(alquilo C1-C4), -N(alquilo Ci-C4)2, -N(alquilo Ci-C4)3,
Figure imgf000019_0001
Más preferiblemente Y se selecciona entre - H2, - HMe, - Me2, - Me3, - HEt, - Et2, - Et3, pirrolidin-l-ilo, piperidin-l-ilo, morfolin-4-ilo, 4-piperazin-l-ilo, 4-metil- piperazin-l-ilo, piridin-l-ilo o una sal farmacéuticamente aceptable de dichos grupos. De forma más preferente, Y es - Me2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una variante (C) de la presente invención, el radical R1 es -CH2-.
En una realización preferente de dicha variante (C), R2 es un birradical alquileno C1-4 opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, isopropilo, alilo, propargilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo, hidroximetilo, 1-hidroxi etilo, 2-hidroxietilo, 3- aminopropilo, 4-aminobutilo, 3-guanidilpropilo, 3-indolilmetilo, fenilo, 1-naftilo, 2- naftilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, y heteroarilo C6-io- De forma más preferida, R2 es un birradical -CH2- o -CH2-CH2-, opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en metilo, isopropilo, isobutilo y bencilo. De forma aún más preferida, R2 es un birradical -CH2- opcionalmente sustituido con dos sustituyentes metilo o con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en isopropilo, isobutilo y bencilo, o R2 es un birradical -CH2-CH2-. En una forma también preferida, R2 es un birradical -CH2- o -CH2-CH2-.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (C), R3 es H.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (C), m es 1. En otra forma de realización preferente de dicha variante (C), n es 0.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (C), X es -0(alquilo C1-4) o halógeno, más preferiblemente es un grupo metoxi en posición meta o para o cloro.
En otra forma de realización preferente de dicha variante (C), Y se selecciona del grupo que consiste en C02H, C02(alquilo C1-C4), H2, - H(alquilo C1-C4), -N(alquilo Ci- C4)2, -N(alquilo Ci-C4)3,
Figure imgf000020_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de dichos grupos.
Más preferiblemente Y se selecciona entre - H2, - HMe, - Me2, - Me3, - HEt, - Et2, - Et3, pirrolidin-l-ilo, piperidin-l-ilo, morfolin-4-ilo, 4-piperazin-l-ilo, 4-metil- piperazin-l-ilo, piridin-l-ilo o una sal farmacéuticamente aceptable de dichos grupos.
De forma más preferente, Y se selecciona del grupo que consiste en C02H y - Me2 o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Procedimiento de obtención de los compuestos de la invención
Los compuestos de fórmula (I) de la presente invención pueden prepararse mediante un procedimiento que comprende hacer reaccionar un alquino de fórmula (II) con una azida de fórmula (III):
Figure imgf000020_0002
en donde R1, R2, R3, m, n y X en los compuestos de fórmulas (II)-(III) son según se han definido para los compuestos de fórmula (I), y en donde Y es un grupo según se ha definido para los compuestos de fórmula (I), opcionalmente protegido con un grupo protector de carboxilo, un grupo protector de hidroxilo o un grupo protector de amino, dependiendo de la naturaleza de dicho grupo Y.
Esta reacción se puede llevar a cabo en presencia de un catalizador de cobre, como por ejemplo, sulfato de cobre(II)/ascorbato sódico, yoduro de cobre(I) o acetato de cobre(I).
Además, en una realización preferente, la reacción entre el compuesto de fórmula (II) y el compuesto de fórmula (III) se realiza en presencia de una base, como por ejemplo, acetato sódico, diisopropilamina o trietilamina. En una realización particular, cuando n es 0, el compuesto de fórmula (I) obtenido según el procedimiento anterior puede ser tratado con un agente oxidante para dar un compuesto de fórmula (I) en el que n es 1 o 2.
Ejemplos de agentes oxidantes incluyen, por ejemplo, ácido 3-cloroperbenzóico o hidroperóxido de tere-butilo. En otra realización particular, cuando el compuesto de fórmula (I) obtenido según el procedimiento anterior tiene un grupo Y protegido con un grupo protector, dicho grupo protector es eliminado para dar un compuesto de fórmula (I) en donde R1, R2, R3, m, n, X e Y son según se han definido para el compuesto de fórmula (I). La eliminación del grupo protector puede realizarse siguiendo procedimientos comúnmente conocidos para un experto en síntesis orgánica.
Composiciones farmacéuticas
La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I), o un estereoisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado del mismo marcado isotópicamente, o un profármaco del mismo; y uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
El vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición y no perjudicial para el receptor del mismo. Dicho vehículo farmacéuticamente aceptable puede seleccionarse de entre materiales orgánicos e inorgánicos que se usan en formulaciones farmacéuticas y que se incorporan como agentes analgésicos, reguladores de pH, ligantes, disgregantes, diluyentes, emulsificantes, cargas, deslizantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes de suspensión, agentes de tonicidad y espesantes. Pueden adicionarse además aditivos farmacéuticos tales como antioxidantes, agentes aromáticos, colorantes, agentes de mejora del aroma, conservantes y edulcorantes.
Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, carboximetilcelulosa, celulosa cristalina, glicerina, goma arábiga, lactosa, estearato de magnesio, metilcelulosa, solución salina, alginato de sodio, sacarosa, almidón, talco y agua.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se preparan por procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (I) se mezclan con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, como una suspensión o solución. La elección del vehículo se determina por la solubilidad y la naturaleza química de los compuestos, la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica estándar.
La administración de los compuestos o composiciones de la presente invención a un sujeto humano o animal puede ser mediante cualquier procedimiento conocido incluyendo, sin limitación, administración oral, administración sublingual o bucal, administración parenteral, absorción transdérmica, por vía de inhalación o instilación nasal, administración vaginal, rectal e intramuscular.
En una realización particular, la administración se realiza por vía parenteral, tal como por ejemplo mediante inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección intravenosa. Para la administración parenteral, los compuestos de la invención se combinan con una solución acuosa estéril que es isotónica con la sangre del sujeto. Una formulación de este tipo se prepara disolviendo el ingrediente activo sólido en agua que contiene sustancias fisiológicamente compatibles, tales como cloruro sódico, glicina y similares, y que tiene un pH tamponado compatible con condiciones fisiológicas. Dicha formulación se presenta en recipientes de dosis unitaria o múltiple, tales como ampollas o viales cerrados.
En otra realización particular, la administración se realiza por vía oral. En ese caso, la formulación de los compuestos de la invención se puede presentar en forma de cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos, o como una suspensión o solución. Dicha formulación puede incluir aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón, etc.; aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz o gelatinas; disgregantes, tales como almidón de maíz y almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio.
Aplicaciones Los compuestos de la presente invención han resultado adecuados para modular los receptores RyR que regulan la función del calcio en células animales o humanas, por lo que son capaces de tratar o prevenir trastornos o enfermedades asociadas a la desregularización de calcio intracelular ocasionado fundamentalmente como consecuencia de la disfunción de los receptores RyR. Por "desregularización de calcio intracelular" debe entenderse una regulación anormal de los niveles de calcio y los flujos de calcio en las células.
Así, un aumento en la concentración intracelular de calcio (Ca2+) bajo condiciones de reposo contribuye al daño de células musculares (miofibras) tóxicas y a la activación simultánea de proteasas dependientes de Ca2+, tales como la calpaína. Puesto que la actividad de la calpaína se incrementa en fibras musculares necróticas de ratones mdx y la disfunción de la calpaína contribuye a la miodistrofia de cintura y extremidades, la prevención de la actividad de las proteasas dependientes de calcio inhibiendo las elevaciones intracelulares de Ca2+ permite evitar la atrofia muscular y, por tanto, tratar enfermedades tales como la miodistrofia de Duchenne o la miodistrofia de Becker. Los ensayos in vitro realizados con los compuestos de la invención han mostrado la capacidad de éstos para revertir los incrementos de calcio intracelular en fibras musculares, sugiriéndose que estos compuestos llevan a cabo esta reversión a través de un mecanismo que implica la modulación de canales RyR. Además, dichos compuestos también han mostrado capacidad para reducir a la mitad el número de genes sobreexpresados en músculo distrófico mdx, alguno de los cuales está relacionado con la pérdida de músculo esquelético o atrofia.
Los receptores RyR que regulan la función del calcio intracelular incluyen RyRl, RyR2 y RyR3, así como una proteína RyR o un análogo de RyR. Un análogo de RyR se refiere a una variante funcional de proteína RyR con actividad biológica que tiene una homología del 60% o superior en la secuencia de aminoácidos con la proteína RyR. En el contexto de la presente invención, por "actividad biológica de RyR" debe entenderse la actividad de la proteína o péptido que demuestra una capacidad para asociarse físicamente con, o unirse a, FKBP 12 (calstabina-1) en el caso de RyRl y RyR3, y a FKBP12.6 (calstabina-2) en el caso de RyR2 bajo las condiciones de los ensayos descritos en el presente documento.
Los compuestos de la presente invención se pueden emplear para limitar o evitar una disminución en el nivel de FKBP (calstabina) unida a RyR en las células de un sujeto. En base a lo descrito en el párrafo anterior, FKBP unida a RyR se refiere a FKBP 12 unida a RyRl (calstabina-1), FKBP 12.6 unida a RyR2 (calstabina-2) y FKBP 12 unida a RyR3 (casltabina-1).
Una disminución en el nivel de FKBP unida a RyR en las células de un sujeto se limita o evita cuando dicha disminución está, de cualquier modo, detenida, obstaculizada, impedida, obstruida o reducida por la administración de los compuestos de la invención, de modo que el nivel de FKBP unida a RyR en las células de un sujeto sea mayor de lo que sería de otro modo en ausencia del compuesto administrado.
El nivel de FKBP unida a RyR en un sujeto se detecta por ensayos o técnicas estándar conocidos por un experto en la materia, tales como técnicas inmunológicas, análisis de hibridación, inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western, técnicas de imagen de fluorescencia y/o detección de radiación, así como cualquier otro como el divulgado en la parte experimental del presente documento.
En una realización particular, la disminución en el nivel de FKBP (calstabina) unida a RyR se produce como consecuencia de someter las células de un sujeto a estrés nitro- oxidativo. De hecho, los ensayos experimentales realizados con los compuestos de la invención han puesto de manifiesto que éstos permiten minimizar los efectos degenerativos del estrés nitro-oxidativo sobre miotubos humanos sanos a través de un incremento de la afinidad de la interacción RyRl -calstabina-1.
En consecuencia, se ha demostrado que los compuestos de la invención evitan trastornos o afecciones que implican la modulación de los receptores RyR o el incremento de calcio intracelular, permitiendo así regularizar los niveles del mismo. Ejemplos de dichos trastornos o afecciones incluyen trastornos y enfermedades del músculo esquelético (relacionados con la modulación de RyRl), trastornos y enfermedades cardíacos (relacionados con la modulación de RyR2) y trastornos y enfermedades del sistema nervioso (relacionados con la modulación de RyRl, RyR2 o RyR3).
Por tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I), o un estereoisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado del mismo marcado isotópicamente, o un profármaco del mismo, en la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento y/o prevención de trastornos y enfermedades del músculo esquelético, trastornos y enfermedades cardíacos y trastornos y enfermedades del sistema nervioso. En una realización particular, los trastornos y enfermedades del músculo esquelético se seleccionan entre distrofias musculares, miopatías congénitas, miopatías metabólicas y atrofia muscular. De forma preferida, dicho trastorno o enfermedad del músculo esquelético es distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker.
En otra realización particular, los trastornos y enfermedades cardíacos se seleccionan entre insuficiencia cardíaca, isquemia cardíaca, arritmias cardíacas y cardiomiopatías.
En otra realización particular, los trastornos y enfermedades del sistema nervioso se seleccionan entre accidente cerebral, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal y deterioro cognitivo.
En una realización preferente, los compuestos según la variante (A) de la presente invención son los utilizados en la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento de trastornos y enfermedades del músculo esquelético, así como al tratamiento de trastornos y enfermedades cardíacos, como los descritos anteriormente.
En otra realización preferente, los compuestos según la variante (B) de la presente invención son los utilizados en la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento de trastornos y enfermedades del sistema nervioso como los descritos anteriormente.
Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un compuesto de fórmula (I), o un estereoisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado del mismo marcado isotópicamente, o un profármaco del mismo, para su uso en el tratamiento y/o prevención de trastornos y enfermedades del músculo esquelético, trastornos y enfermedades cardíacos y trastornos y enfermedades del sistema nervioso.
Otro aspecto de la invención se dirige a un método para el tratamiento y/o prevención de trastornos y enfermedades del músculo esquelético, trastornos y enfermedades cardíacos y trastornos y enfermedades del sistema nervioso, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I), o un estereisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado del mismo marcado isotópicamente, o un profármaco del mismo. Por cantidad "terapéuticamente eficaz" debe entenderse la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, siendo la respuesta preventiva y/o terapéutica, evitando o sustancialmente atenuando efectos secundarios no deseados.
En una realización particular, los compuestos de la presente invención se administran a un sujeto en cantidad efectiva para modular concentraciones anormales de calcio intracelular. Esta cantidad puede ser determinada fácilmente por un experto en el área empleando procedimientos conocidos. Por ejemplo, la liberación de calcio intracelular a través de canales de RyR se puede cuantificar empleando colorantes fluorescentes sensibles al calcio, tales como Fluo-3 o Fura-2, y monitorizando las señales de fluorescencia dependientes de calcio con un tubo fotomultiplicador y un software adecuado (Brillantes, et al. Cell, 1994, 77, 513-523, "Stabilization of calcium reléase channel (ryanodine receptor) f nction by FK506-binding protein"; Gillo, et al. Blood, 1993, 81, 783-792).
La concentración de los compuestos de la invención en suero de un sujeto humano o animal puede determinarse siguiendo métodos conocidos en la técnica (Thebis, M. et al. Drug Test. Analysis 2009, 1, 32-42 "Screening for the calstabin-ryanodine receptor complex stabilizers JTV-519 and S-107 in doping control analysis"). La cantidad administrada de compuestos de Fórmula (I) que es efectiva para limitar o prevenir niveles anormales de calcio intracelular dependerá de la eficacia relativa del compuesto elegido, la severidad del trastorno tratado y del peso del afectado. No obstante, típicamente los compuestos serán administrados una o más veces al día, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 veces diarias, con dosis diarias típicas totales en el intervalo de aproximadamente, entre 1 mg/Kg/día y 100 mg/Kg/día, y más preferiblemente entre 10 mg/Kg/día y 40 mg/Kg/día, o bien una cantidad suficiente para conseguir niveles en suero entre, aproximadamente, 1 ng/mL y 500 ng/mL.
Los compuestos de Fórmula (I) se pueden usar solos, combinados entre sí, o combinados con otros fármacos que tienen actividad terapéutica incluyendo, aunque no limitado a, potenciadores de salto de exón de mRNA, moduladores de transcripción génica, diuréticos, anti coagulantes, agentes plaquetarios, antiarrítmicos, agentes inotrópicos, agentes cronotrópicos, α y β bloqueadores, inhibidores de angiotensina y vasodilatadores. Dichos fármacos pueden formar parte de la misma composición, o ser proporcionados como una composición separada, para su administración al mismo tiempo o en un momento diferente.
La presente invención también incluye un método in vitro para determinar la capacidad de un compuesto para modular los niveles de calcio intracelular y prevenir la disociación de calstabina del complejo proteico RyR, donde dicho método comprende: (a) obtener o generar un cultivo celular conteniendo receptores RyR; (b) poner en contacto las células con el compuesto a ensayar; (c) exponer las células a una o más condiciones conocidas que alteran la regulación de calcio intracelular o generan modificaciones postraduccionales en el receptor RyR; (d) determinar si dicho compuesto modula los niveles de calcio intracelular; y (e) determinar si dicho compuesto limita o previene la disociación de calstabina del complejo proteico de RyR.
En una realización particular, las condiciones que alteran la regulación de calcio intracelular o generan modificaciones postraduccionales en el receptor RyR son estrés oxidativo o estrés nitrosativo. La presente invención también contempla un método de diagnóstico de un trastorno o enfermedad, donde dicho método comprende: obtener una muestra de tejido o células de un sujeto que contenga receptores RyR;
incubar la muestra de tejido o células obtenidas en la etapa a) con un compuesto de fórmula (I) , y
determinar: (a) si se produce un incremento en la interacción entre RyR y calstabina con respecto a la interacción entre RyR y calstabina en células o tejido control;
o
(b) si se produce una disminución en los niveles de calcio intracelulares comparado con una ausencia de tal disminución en las células o tejido control; donde un aumento en la interacción entre RyR y calstabina en (a) o una disminución en los niveles de calcio intracelulares en (b), indica la presencia de un trastorno o enfermedad en el sujeto.
En una realización particular, el compuesto de formula (I) empleado en el método de diagnóstico es un compuesto según la variante (C) de la presente invención.
En otra realización particular, la muestra de tejido es una muestra de tejido muscular.
En una realización particular, cuando RyR es RyRl, el trastorno o enfermedad a diagnosticar es un trastorno o enfermedad del músculo esquelético.
En una realización particular, cuando RyR es RyR2, el trastorno o enfermedad a diagnosticar es un trastorno o enfermedad cardíaca.
En una realización particular, cuando RyR es RyRl, RyR2 o RyR3, el trastorno o enfermedad a diagnosticar es un trastorno o enfermedad del sistema nervioso. Las medidas de incremento en la interacción RyR y calstabina y de disminución de los niveles de calcio intracelular pueden efectuarse mediante técnicas conocidas por un experto, tales como inmunoprecipitación, ensayos de ligación de proximidad in situ (PLA) e imágenes de calcio a tiempo real utilizando sondas fluorescentes.
Ejemplos Los acrónimos de compuestos, reactivos, disolventes o las técnicas empleadas se definen como sigue:
- AHK1 : es un compuesto según la Fórmula (I) que contiene los grupos: R1 = R2 = - CH2-; R3 = H; m = 1 ; n = 0; X = 3-MeO; Y = C02H, - AHK2: es un compuesto según la Fórmula (I) que contiene los grupos: R1 = - CH2-; R2 = -CH2CH2-; R3 = H; m = 1 ; n = 0; X = 4-MeO; Y = Me2,
S-107: compuesto empleado a efectos comparativos en los ensayos biológicos realizados cuya estrucutra se encuentra en los antecedentes de este documento. - 'BuOH: terc-butanol,
- DAPI: 4',6-Diamino-2-fenilindol,
- ESI: Ionización de electrospray,
- EtOAc: Acetato de etilo,
- HRMS: Espectrometría de masas de alta resolución,
- IR: Espectroscopia infrarroja,
- mdx: Modelo animal de Distrofia muscular de Duchenne relacionada al cromosoma X,
- P.fi: Punto de fusión,
- RMN: Resonancia magnética nuclear,
- SIN1 : 3-Morfolino-sidnonimina, agente generador de peroxinitritos y óxido nítrico.
THF: Tetrahidrofurano,
- TBTA: Tris[(l-bencil-lH-l,2,3-triazol-4-il)metil]amina,
Los siguientes ejemplos se aportan a efectos ilustrativos, y no suponen una limitación de la presente invención.
EJEMPLO 1 : l-Metoxicarbonilmetil-4-[4-(metoxi)feniltiometill-lH-1.2.3-triazol.
Figure imgf000029_0001
Se preparó una disolución de l-(4-metoxifeniltio)-2-propino (2 mmol, 356 mg), azidoacetato de metilo (2,00 mmol, 230 mg) y TBTA (catal.) en THF BuOH (1 : 1, 4 mL) bajo atmósfera de nitrógeno. Seguidamente, se le añadieron dos disoluciones acuosas desgasificadas de CuS04 (0,4 mmol, 63 mg) en H20 (1 mL) y ascorbato sódico (0,8 mmol, 158 mg) en H20 (1 mL) y la mezcla de agitó a temperatura ambiente durante una noche. Al completarse la reacción, se evaporó el disolvente, se añadió una disolución al 28% de amoníaco acuoso (10 mL) y el producto se extrajo con CH2CI2 (3 x 20 mL). Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgS04) y el disolvente se evaporó a presión reducida. El producto se purificó por cromatografía de columna (gel de sílice; EtOAc/hexano 1 :3). Rdto: 477 mg (78%). Aceite amarillento. IR (cm"1): 2953, 2837 (C-H), 1750 (C=0), 1219, 1174 (triazol). 1H RMN (500 MHz, CDC13): δ 7,38 (s, 1H), 7,30 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,81 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 5,09 (s, 3H), 4, 12 (s, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,77 (s, 3H). 13C RMN (125 MHz, CDC13): δ 166,7, 159,4, 145,8, 134,0, 125,4, 123,5, 114,7, 55,4, 53, 1, 50,8, 30,9. HRMS (ESI+, m/z) calculado para CnHieNsOsS: 294,0912; hallado: 294,0916.
EJEMPLO 2: l-Metoxicarbonilmetil-4-[3-(metoxi)feniltiometill-lH-1.2.3-triazol.
Figure imgf000030_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de l-(3-metoxifeniltio)-2-propino (2,00 mmol, 356 mg) y azidoacetato de metilo (2,00 mmol, 230 mg). Rdto: 537 mg (88%). Aceite amarillento. IR (cm-1): 2953, 2837 (C-H), 1749 (C=0), 1220, 1180 (triazol). 1H RMN (500 MHz, CDC13): δ 7,51 (s, 1H), 7, 18 (t, 7 = 8,0 Hz, 1H), 6,92 (d, 7 = 7,7 Hz, 1H), 6,90-6,87 (m, 1H), 6,73 (dd, 7 =8,2, 1,8 Hz, 1H) 5, 11 (s, 2H), 4,26 (s, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,77 (s, 3H). 13C RMN (125 MHz, CDC13): δ 166,7, 159,9, 145,7, 136,8, 129,9, 123,6, 121,5, 114,6, 112,5, 55,4, 53, 1, 50,8, 28,7. HRMS (ESI+, m/z) calculado para Ci3Hi6N303S: 294,0912; hallado: 294,0917.
EJEMPLO 3 : (^-l-(l-Metoxicarbonil-2-feniletin-4-[3-(metoxi)feniltiometill-lH-1.2.3- triazol.
Figure imgf000031_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de l-(3-metoxifeniltio)-2-propino (2,00 mmol, 384 mg) y el éster metílico del ácido (,S)-2-azido-3-fenilpropanoico (2,00 mmol, 358 mg). Rdto: 668 mg (87%). Aceite amarillento. [a]D 25 = -56, 1° (c. 1,01 g/100 mL, CH2C12). IR (cm"1): 2952, 2836 (C-H), 1744 (C=0), 1228, 1172 (triazol). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,47 (s, 1H), 7,27-6,62 (m, 9H), 5,50 (dd, J = 8,5, 6,2 Hz, 1H), 4, 12 (q, J = 14,9 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 3,46 (dd, J = 14,0, 5,8 Hz, 1H), 3,36 (dd, J = 13,9, 9,2 Hz, 1H). 13C RMN (101 MHz, CDC13): δ 168,6, 159,9, 145, 1, 136,8, 134,7, 129,9, 128,9, 127,6, 122,4, 121,5, 114,5, 112,5, 64,3, 55,4, 53,2, 38,9, 28,7. HRMS (ESI+, m/z) calculado para C20H22N3O3S: 384, 1382; hallado: 384, 1392.
EJEMPLO 4 : (R)- 1 -( 1 -Metoxicarbonil-2-feniletil)-4-[3 -(metoxi)feniltiometill- IH- 123- triazol.
Figure imgf000031_0002
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de l-(3-metoxifeniltio)-2-propino (2,00 mmol, 384 mg) y el éster metílico del ácido (R)-2-azido-3-fenilpropanoico (2,00 mmol, 358 mg). Rdto: 653 mg (85 %). Aceite amarillento. [a]D 25 = +39,4° (c. 2,71 g/100 mL, CH2CI2). HRMS (ESI+, m/z) calculado para C20H22N3O3S: 384, 1382; hallado: 384, 1382. Los datos de RMN fueron idénticos a los del ejemplo 3.
EJEMPLO 5 : (S)- 1 -( 1 -Metoxicarbonil-3 -metil-butiD-4- [3 -(metoxi)feniltiometill - 1H- L2,3-triazol.
Figure imgf000032_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de l-(3-metoxifeniltio)-2-propino (2,00 mmol, 384 mg) y el éster metílico del ácido (,S)-2-azido-4-metilpentanoico (2,00 mmol, 342 mg). Rdto: 677,9 mg (97 %). Aceite amarillento. [<x]D 25 = +10,7° (c. 1,00 g/100 mL, CH2C12). 1H RMN (500 MHz, CDC13): δ 7,51 (s, 1H), 7, 16 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 6,87 (s, 1H), 6,72 (dd, J = 8,2, 1,8 Hz, 1H), 5,38 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 4,24 (q, J = 14,8 Hz, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 1,94 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1, 19 (dt, J = 13,4, 6,7 Hz, 1H), 0,90 (d, J =6,5 Hz, 3H), 0,84 (d, J = 6,6 Hz, 3H). 13C RMN (125 MHz, CDC13): δ 169,8, 159,9, 145,3, 136,6, 129,8, 122, 1, 115, 1, 112,7, 61, 1, 55,3, 53, 1, 41,4, 29, 1, 24,7, 22,7, 21,3.
EJEMPLO 6 : (R)- 1 -( 1 -Metoxicarbonil-3 -metil-butiD-4- [3 -(metoxi)feniltiometill - 1H- L2,3-triazol.
Figure imgf000032_0002
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de l-(3-metoxifeniltio)-2-propino (2,00 mmol, 384 mg) y el éster metílico del ácido (R)-2-azido-4-metilpentanoico (2.00 mmol, 342 mg). Rdto: 653 mg (93 %). Aceite amarillento. [a]D 25 = -12, 1° (c. 1,03 g/100 mL, CH2CI2). Los datos de RMN fueron idénticos a los del ejemplo 5.
EJEMPLO 7: (S)-l-(l -Metoxicarb onil-2-metil-propiD-4- [3 -(metoxi)feniltiometill-lH- L2,3-triazol.
Figure imgf000033_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de l-(3-metoxifeniltio)-2-propino (2,00 mmol, 384 mg) y el éster metílico del ácido (,S)-2-azido-3-metilbutanoico (2,00 mmol, 314 mg). Rdto: 616 mg (92 %). Aceite amarillento. [<x]D 25 = +21,5° (c. 1,03 g/100 mL, CH2C12). 1H RMN (500 MHz, CDC13): δ 7,63 (s, 1H), 7, 16 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,88 (s, 1H), 6,72 (d, J = 6,8, 1H), 5,06 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,24 (q, J= 14,7 Hz, 2H), 3,76 (s, 6H), 2,44-2,30 (m, 1H), 0,96 (d, J=6,6 Hz, 3H), 0,73 (d, J = 6,6 Hz, 3H). 13C RMN (125 MHz, CDC13): δ 168,8, 159,6, 144,7, 136,3, 129,5, 121,9, 115,0, 112,3, 68,5, 55,0, 52,5, 32,0, 28,8, 18,8, 18, 1.
EJEMPLO 8: (R)-l-(l -Metoxicarb onil-2-metil-propil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometill-lH- 1.2.3-triazol.
Figure imgf000033_0002
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de l-(3-metoxifeniltio)-2-propino (2,00 mmol, 384 mg) y el éster metílico del ácido (R)-2-azido-3-metilbutanoico (2,00 mmol, 314 mg). Rdto: 626 mg (93 %). Aceite amarillento. [a]D 25 = -19.5° (c. 1,06 g/100 mL, CH2CI2). Los datos de RMN fueron idénticos a los del ejemplo 7.
EJEMPLO 9 : 4-[3 -(Metoxi)feniltiometill- 1 -( 1 -metil- 1 -metoxicarboniletil)- IH- 1.2.3 - triazol.
Figure imgf000034_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de l-(3-metoxifeniltio)-2-propino (2,00 mmol, 384 mg) y 2-azidoisobutirato de metilo (2,00 mmol, 386 mg). Rdto: 258 mg (40 %). Aceite amarillento. 1H RMN (400 MHz, CDC13): δ 7,44 (s, 1H), 7, 11 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,67 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4, 17 (s, 2H), 3,69 (s, 3H), 3,62 (s, 3H), 1,82 (s, 6H). 13C RMN (101 MHz, CDC13) δ 171,6, 159,7, 144,3, 136,7, 129,6, 121,6, 121,0, 114,8, 112,3, 64,3, 55, 1, 53, 1, 28,8, 25,5.
EJEMPLO 10: 1 -(2-Hidroxietil)-4-[4-(metoxi)feniltiometill- \H- 1.2.3-triazol.
Figure imgf000034_0002
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de l-(4-metoxifeniltio)-2-propino (2,00 mmol, 384 mg) y 2-azidoetanol (2,00 mmol, 174 mg). Rdto: 520 mg (98 %). Aceite amarillento. 1H RMN (400 MHz, CDC13) δ 7,40 (s, 1H), 7,29 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 6,80 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 4,40 (s, 2H), 4,09 (s, 2H), 3,99 (s, 2H), 3,77 (s, 3H), 3, 18 (s, 1H). 13C RMN (101 MHz, CDC13): δ 159,5, 144,9, 133,9, 125,4, 123,5, 114,8, 61, 1, 55,5, 52,9, 30,9. HRMS (ESI+, m/z) calculado para Ci2Hi5N302S: 266,0963; hallado: 266,0965.
EJEMPLO 11 : l-Carboximetil-4-[4-(metoxi)feniltiometill-lH-1.2.3-triazol.
Figure imgf000034_0003
Se añadió hidróxido de litio monohidrato (2,00 mmol, 84 mg) a una disolución de 1- metoxicarbonilmetil-4-[4-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol (1,00 mmol, 305 mg, ejemplo 1) en THF/H20 (1 : 1, 8 mL) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Se evaporó el disolvente orgánico, la mezcla acuosa resultante se acidificó con 1M HCl, y la disolución se extrajo con EtOAc (2 x 10 mL). Se secaron las fases orgánicas combinadas (MgS04) y el disolvente se evaporó a presión reducida. Rdto: 158 mg (54 %). Sólido blanco. P.f : 163-170 °C. IR (cm"1): 2923, 2848 (C-H), 1730 (C=0), 1223, 1 188 (triazol). 1H RMN (500 MHz, CD3OD): 7,66 (s, 1H), 7,28 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,84 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 5, 19 (s, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,76 (s, 3H). 13C RMN (125 MHz, CD3OD): δ 169,7, 161, 1, 146,3, 135,6, 126,3, 1 15,7, 55,8, 51,6, 31,5. HRMS (ESI+, m/z) calculado para Ci2Hi4N303S: 280,0756; hallado: 280,0760.
EJEMPLO 12: l-Carboximetil-4-[3-(metoxi)feniltiometill-lH-1.2.3-triazol.
Figure imgf000035_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1 1, partiendo de l-metoxicarbonilmetil-4-[3- (metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol (1.00 mmol, 305 mg, ejemplo 2). Rdto: 274 mg (94 %). Sólido blanco. P.f : 1 15-1 19 °C. IR (cm"1): 2999, 2971 (C-H), 1707 (C=0), 1229 (triazol). 1H RMN (500 MHz, CD3OD): δ 7,80 (s, 1H), 7, 18 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 6,96-6,86 (m, 2H), 6,76 (dd, J = 8,3, 1,8 Hz, 1H), 5, 19 (s, 2H), 4,23 (s, 2H), 3,75 (s, 3H). 13C RMN (125 MHz, CD3OD): δ 169,7, 161,4, 146, 1, 138,0, 130,9, 125,9, 123, 1, 1 16, 1, 1 13,6, 55,7, 51,7, 29,3. HRMS (ESI+, m/z) calculado para Ci2Hi4N303S: 280,0756; hallado: 280,0753.
EJEMPLO 13 : (S)- 1 -( 1 -Carboxi-2-feniletil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometill - IH- 1.2.3 - triazol.
Figure imgf000036_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1 1, partiendo de (,S)-l-(l-metoxicarbonil-2- feniletil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol (1,00 mmol, 383 mg, ejemplo 3). Rdto: 318 mg (86 %). Sólido blanco. P.f. : 79-83 °C. [a]D 24= -23.3° (c. 1, 12 g/100 mL, CH2C12). IR (cm"1): 2931 (C-H), 1727 (C=0), 1246, 1229 (triazol). 1H RMN (500 MHz, CD3OD): δ 7,77 (s, 1H), 7,20-6,71 (m, 9H), 5,56 (dd, J = 10,8, 4,6 Hz, 1H), 4, 15 (s, 2H), 3,73 (s, 3H), 3,56 (dd, J = 14,3, 4,5 Hz, 1H), 3,40 (dd, J = 14,3, 10,9 Hz, 1H). 13C RMN (125 MHz, CD3OD): δ 171, 1, 161,4, 145,9, 137,9, 137,2, 130,8, 129,9, 128, 1, 124,8, 122,9, 1 15,9, 1 13,5, 65,8, 55,7, 38,9, 29,0. HRMS (ESI+, m/z) calculado para C20H22N3O3S: 384, 1382; hallado: 384, 1392.
EJEMPLO 14: (R)-l-(l -Carboxi-2-feniletil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometill - IH- 1.2.3 - triazol.
Figure imgf000036_0002
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1 1, partiendo de (R)-l-(l-metoxicarbonil-2- feniletil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol (1,00 mmol, 383 mg, ejemplo 4). Rdto: 280 mg (76 %). Sólido blanco. P.f. : 78-86 °C. HRMS (ESI+, m/z) calculado para C20H22N3O3S: 384, 1382; hallado: 384, 1382. [a]D 24= +16.5° (c. 0,98 g/100 mL, CH2C12). Los datos de RMN fueron idénticos a los del ejemplo 13.
EJEMPLO 15 : (S)- 1 -( 1 -Carboxi-3 -metilbutil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometill - IH- 1.2.3 - triazol.
Figure imgf000037_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1 1, partiendo de (,S)-l-(l-metoxicarbonil-3- metil-butil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol (1,00 mmol, 349 mg, ejemplo 5). Rdto: 265 mg (76 %). Sólido blanco. P.f. : 96-105 °C. [a]D 25 6= +9.3° (c. 1, 1 1 g/100 mL, CH2C12). 1H RMN (500 MHz, CDCI3): δ 1 1,88 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7, 12 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,92-6,77 (m, 2H), 6,70 (dd, J = 8, 1, 1,7 Hz, 1H), 5,38 (dd, J = 10,7, 5,0 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 40,8, 14,9 Hz, 2H), 3,70 (s, 3H), 2,03-1,86 (m, 2H), 1, 17 (dt, J = 19,8, 6,5 Hz, 1H), 0,88 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,82 (d, J = 6,5 Hz, 3H). 13C RMN (125 MHz, CDCI3): 5171,2, 159,8, 144,7, 135,9, 129,8, 122,6, 122,4, 1 15,6, 1 12,9, 61,8, 55,3, 41,2, 28,5, 24,7, 22,6, 21, 1.
EJEMPLO 16: (R)-l-(l -Carboxi-3 -metilbutil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometill - IH- 1.2.3 - triazol.
Figure imgf000037_0002
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1 1, partiendo de (R)-l-(l-metoxicarbonil-3- metil-butil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol (1,00 mmol, 349 mg, ejemplo 6). Rdto: 301 mg (86 %). Sólido blanco. P.f. : 97-104 °C. [a]D 25 4= -12.1° (c. 0,95 g/100 mL, CH2CI2). Los datos de RMN fueron idénticos a los del ejemplo 15.
EJEMPLO 17: (S)- 1 -( 1 -Carboxi-2-metilpropil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometill - IH- 1.2.3 - triazol.
Figure imgf000038_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 11, partiendo de (,S)-l-(l-metoxicarbonil-2- metil-propil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol (1,00 mmol, 335 mg, ejemplo 7). Rdto: 279 mg (87 %). Sólido blanco. P.f. : 1 15-121 °C. [a]D 25 6= +4,5° (c. 1,06 g/100 mL, CH2C12). 1H RMN (500 MHz, CDC13): δ 11,53 (s, 1H), 7,68 (s, 1H), 7, 12 (t, J= 7,8 Hz, 1H), 6,87 (d, J= 7,4 Hz, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,70 (d, J= 6,8 Hz, 1H), 5, 13 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 43,5, 14,5 Hz, 2H), 3,71 (s, 3H), 2,44 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 0,96 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 0,75 (d, J = 6,4 Hz, 3H). 13C RMN (125 MHz, CDC13): δ 170,7, 159,9, 144,6, 136, 1, 129,9, 122,9, 122,8, 115,8, 113,0, 69,3, 55,4, 32,2, 28,7, 19,2, 18,3.
EJEMPLO 18: (R)-l-(l -Carboxi-2-metilpropil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometill - IH- 1.2.3 - triazol.
—
Figure imgf000038_0002
Se siguió el procedimiento del ejemplo 11, partiendo de (R)-l-(l-metoxicarbonil-2- metil-propil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol. (1,00 mmol, 335 mg, ejemplo 8). Rdto: 290 mg (90%). Sólido blanco. P.f. : 114-123 °C. [a]D 25 6= -6.7° (c. 1,01 g/100 mL, CH2CI2). Los datos de RMN fueron idénticos a los del ejemplo 17.
EJEMPLO 19: 1 -( 1 -Carboxi- 1 -metiletil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometill - IH- 1.2.3 -triazol.
Figure imgf000039_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 11, partiendo de 4-[3-(metoxi)feniltiometil]-l- (l-metil-l-metoxicarboniletil)-lH-l,2,3-triazol (0,8 mmol, 258 mg, ejemplo 9). Rdto: 246 mg (100%). Sólido amarillento. P.f. : 109-121 °C 1H RMN (400 MHz, CD3OD) : δ 7,77 (s, 1H), 7,09 (t, J= 8,0 Hz, 1H), 6,82 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,67 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4, 12 (s, 2H), 3,65 (s, 3H), 1,78 (s, 6H). 13C RMN (101 MHz, CD3OD) δ 174,2, 161,3, 145,3, 137,9, 130,8, 123,4, 116,5, 113,7, 65,9, 55,7, 29,5, 25,9.
EJEMPLO 20: l-[2-(N.N-Dimetilamino)etill-4-[4-(metoxi)feniltiometill-lH-1.2.3- triazol.
Figure imgf000039_0002
Se añadió sucesivamente trietilamina (8,80 mmol, 1,22 mL) y cloruro de mesilo (4,39 mmol, 0,34 mL) sobre una disolución de l-(2-hidroxietil)-4-[4-(metoxi)feniltiometil]- lH-l,2,3-triazol (2,92 mmol, 776 mg, ejemplo 10) en THF anhidro (16 mL) enfriado a 0°C bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Seguidamente, se añadió clorhidrato de dimetilamina (8,00 mmol, 652 mg), trietilamina (8,80 mmol, 1,22 mL), Nal (0, 13 mmol, 20 mg) y una cantidad adicional de THF anhidro (8 mL) y la mezcla se agitó a 50°C durante una noche. Tras completar la reacción, los disolventes se evaporaron a presión reducida, el residuo resultante se disuelvió en EtOAc (20 mL) y se lavó sucesivamente con disolución acuosa saturada de NaHC03 (30 mL) y salmuera (10 mL). La capa orgánica se secó (MgS04) y se evaporó a sequedad en vacío. Rdto: 572 mg (84 %). Sólido blanco. P.f : 35-40 °C. IR (cm"1): 2943 (N-H), 2860, 2771 (C-H), 1242 (triazol). 1H RMN (400 MHz, CDC13) δ 7,41 (s, 1H), 7,30 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 6,81 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 4,37 (s, 2H), 4, 11 (s, 2H), 3,77 (s, 3H), 2,71 (s, 2H), 2,25 (s, 6H). láC RMN (101 MHz, CDC13): 159,2, 144,8, 133,7, 125,5, 122,6, 114,5, 58,6, 55,3, 48,0, 45,3, 30,9. HRMS (ESI+, m/z) calculado para Ci4H2iN4OS : 293, 1436 ; hallado: 293, 1440.
EJEMPLO 21 : l-Metoxicarbonilmetil-4-(fenilsulfínilmetil)-lH-1.2.3-triazol.
Figure imgf000040_0001
Se siguió el procedimiento del ejemplo 1, partiendo de feniltio-2-propino (2,00 mmol, 268 mg) y azidoacetato de metilo (2,00 mmol, 230 mg). Rdto: 342 mg (65%). Sólido blanco. P.f. : 70-74 °C. IR (crn-1): 2953, 2837 (C-H), 1749 (C=0), 1220, 1180 (triazol). 1H RMN (400 MHz, CDC13): δ 7,49 (s, 1H), 7,34 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,31 - 7,22 (m, 2H), 7,20 (m, 1H), 5, 11 (s, 2H), 4,27 (s, 2H), 3,78 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, CDC13): δ 166,5, 144,6, 135, 1, 129, 1, 128,6, 126, 1, 123,5, 52,6, 50,3, 28,3. Sobre la disolución resultante de l-(metoxicarbonilmetil)-4-(feniltiometil)-lH-l,2,3-triazol (1,00 mmol, 263 mg) en cloroformo anhidro (30 mL) se añadió ácido w-cloroperbenzoico (1,00 mmol, 172 mg) a 0°C y la mezcla se agitó a la misma temperatura durante 30 min. La mezcla se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía de columna (gel de sílice; MeOH/ CH2C12 5:95). Aceite incoloro. Rdto: 161 mg (58 %). 1H RMN (500 MHz, CDC13): δ 7,72 (s, 1H), 7,49 (s, 5H), 5,24-5, 10 (dd, J = 5, 13 Hz, 2H), 4,29-4, 15 (dd, J = 4,28 Hz, 2H), 3,82 (s, 3H).
EJEMPLO 22: l-Carboximetil-4-[3-(metoxi)fenilsulfonilmetill-lH-1.2.3-triazol.
Figure imgf000040_0002
Sobre una disolución de l-(carboximetil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol (1,00 mmol, 279 mg, ejemplo 12) en una mezcla anhidra 1 : 1 de cloroformo/acetonitrilo (3 mL) se añade ácido w-cloroperbenzóico (2,50 mmol, 437 mg) a 0°C y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se evapora y el residuo se purifica por cromatografía de columna (gel de sílice; MeOH/ CH2CI2 5:95). Rdto: 203 mg (65 %). Sólido blanco. P.f. : 106-115°C. 1H RMN (500 MHz, CDC13): 7,91 (s, 1H), 7,50-7,29 (Ar, 4H), 4,99 (s, 2H), 4,71 (s, 2H), 3,84 (s, 3H). HRMS (ESI+, m/z) calculado para C12H14N3O5S: 312,0654; hallado: 312,0662.
EJEMPLO 23 : l-Carboximetil-4-[3-(cloro)feniltiometill-lH-1.2.3-triazol.
Figure imgf000041_0001
Una disolución de ácido bromoacético (10 mmol, 1,38 g) y azida sódica (40 mmol, 2,60 g) en agua (4 mL) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Seguidamente se neutralizó la disolución con NaOH 3M y se le añadieron sucesivamente acetonitrilo (15 mL), l-(3-clorofeniltio)-2-propino (8 mmol, 1,45 g), acetato sódico (30 mmol, 2,46 g) y acetato de cobre(I) (2 mmol, 242 mg). La mezcla resultante se agitó a 45°C durante 6 h, se evaporó el disolvente, se acidificó con HC1 1M y se extrajo con EtOAc (3 x 20 mL). Se secaron las fases orgánicas combinadas (MgS04) y el disolvente se evaporó a presión reducida. Rdto: 1,49 g (66 %). Sólido blanco. P.f : 146-148 °C. IR (cm"1): 2928, 2850 (C-H), 1731 (C=0), 1224, 1184 (triazol). 1H RMN (500 MHz, CD3OD): 7,86 (s, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,28-7,21 (m, 3H), 5,22 (s, 2H), 4,29 (s, 2H). 13C RMN (125 MHz, CD3OD): δ 168,5, 144, 1, 137,9, 134,4, 130,0, 128,8, 127,6, 126,3, 124,6 50,4, 27,7. HRMS (ESI+, m/z) calculado para C11H10CIN3O2S: 283,0182; hallado: 283,0190.
EJEMPLO 24: Ensayos biológicos de toxicidad in vitro en células humanas.
Estos ensayos se llevaron a cabo en miotubos humanos control LHCN-M2 tras 14 días en medio de diferenciación. Para determinar la toxicidad de los distintos compuestos analizados, en particular AHK1 y AHK2 según la invención, éstos se añadieron al medio de cultivo durante 24 horas a 37°C, a distintas concentraciones (0-2 mM). A efectos comparativos, se realizó el mismo ensayo adicionando el compuesto S-107 de referencia. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo colorimétrico Cytotox 96 (Promega) siguiendo las instrucciones del manual. Los resultados se muestran en la Figura 1 donde se puede apreciar que los compuestos según la invención no muestran toxicidad aguda in vitro frente a miotubos humanos a concentraciones entre 10 nM y 2 mM. El comportamiento de los compuestos AHK1 y AHK2 tras 24 h de incubación contrasta con la toxicidad celular del 100% hallada para el compuesto de referencia S-107 a concentración 1 mM bajo idénticas condiciones. Este resultado demuestra que los compuestos según la invención tienen una menor toxicidad que S-107, sugiriendo que los compuestos AHK pueden ser mejores candidatos para tratamientos terapéuticos de trastornos en humanos que implican homeostasis anormal de calcio.
EJEMPLO 25. Ensayos in vitro para determinar los niveles intracelulares de calcio en fibras musculares de ratón.
Fibras aisladas del músculo flexor digital corto de ratón se cultivaron durante una noche en presencia o ausencia de los compuestos AFD l y AFIK2 a una concentración de 150 nM. Los niveles básales de calcio intracelular se evaluaron mediante incubación de las fibras con el fluorocromo ratiométrico Fura 2-AM (4 μΜ) y ácido plurónico (0,02%) durante 30 minutos a 37°C, en el medio de cultivo. Las fibras se visualizaron con una cámara digital de alta resolución y la [Ca2+] intracelular se estimó mediante el ratio de excitación 340 nm / 380 nm. La Figura 2 muestra el efecto in vitro de los compuestos AFD l y AFIK2 sobre los niveles intracelulares de calcio en estado de reposo en las mencionadas fibras musculares de ratón. Se puede apreciar cómo las fibras distróficas que no fueron tratadas (MDX) mostraron un aumento significativo de los niveles de calcio en comparación con las fibras control (CTRL). El tratamiento durante una noche de las fibras MDX con AFD 1 y AFIK2 rescató los niveles intracelulares de calcio hasta niveles control lo que demuestra la capacidad para revertir los incrementos de calcio intracelular observados en las fibras musculares. A la luz de estos resultados, se postula que los compuestos según la invención llevan a cabo esta reversión a través de un mecanismo que implica la modulación de canales RyR. EJEMPLO 26. Ensayos in vitro sobre interacción de RyRl-calstabina 1
Este ensayo se llevó a cabo en miotubos humanos control LHCN-M2 tras 9 días en medio de diferenciación. Dicho miotubos fueron pre-tratados durante 12 horas con los compuestos AHK1 y AHK2 a concentración de 150 nM. Tras el tratamiento, los miotubos fueron sometidos a estrés nitro-oxidativo por peroxitritos mediante la adición de SIN1 (5 mM) durante 30 minutos.
La colocalización de RyRl-calstabina se analizó mediante la técnica de ligación de proximidad in situ (in situ PLA) para lo que se utilizó el kit de Sigma Duolink II Red Fluorescence Kit, y anticuerpos específicos frente a RyRl y calstabina 1. Esta técnica permite detectar la ubicación exacta de dos antígenos que se encuentren a una distancia menor de 40nm entre sí. Para determinar la colocalización de RyRl con calstabina 1, se cuantificaron 3 fotografías por cada condición con aproximadamente 9 miotubos por campo, utilizando el software informático Image J (http ://r sb . inf o . ni h . gov/ij /dowrs 1 oad . ht mi) . En cada imagen, el área de colocalización se normalizó con el área de expresión de miosina, que se determinó mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo específico conjugado a fluoresceína.
Según se muestra en la Figura 3, los compuestos AHK1 y AHK2 según la invención presentan capacidad para recuperar parcialmente la disminución de la interacción de RyRl-calstabinal en cultivos de miotubos humanos sanos tras ser sometidos a estrés nitro-oxidativo. El análisis de la interacción RyRl -Calstl mediante la técnica de PLA demostró que en presencia de SIN1 se produce la disociación del complejo RyRl- Calstl y que dicha disociación puede prevenirse parcialmente con el pretratamiento con los compuestos AHK1 y AHK2. En el panel superior de la Figure 3 se muestra la cuantificación de las imágenes de PLA con ImageJ, mientras que en el panel inferior se muestran imágenes representativas de PLA de cada condición, donde los puntos representan la interacción RyRl -Calstl (barra de calibración 50 μπι). Por lo tanto, los compuestos ensayados según la invención no solo mejoran la funcionalidad de miotubos distróficos de tipo Duchenne o Becker, sino que también minimizan los efectos degenerativos del estrés nitro-oxidativo sobre miotubos humanos sanos a través de un incremento de la afinidad de la interacción RyRl-calstabinal . Según estos resultados, los compuestos de la invención pueden ser útiles como agentes terapéuticos frente a enfermedades causadas por la disminución de la afinidad RyRl- calstabinal bajo condiciones de estrés nitro-oxidativo.
EJEMPLO 27. Ensayos biológicos in vivo en ratones
Se utilizaron ratones distróficos mdx macho de un mes de edad suministrados por la compañía Jackson Laboratory (http s : //www j ax . org/strain/001801). Los ensayos biológicos para medir el efecto de los compuestos Ahulken (AHK) sobre la función muscular se realizaron con ratones de un mes de edad, mientras que en los ensayos in vivo para determinar el efecto sobre el corazón y el SNC se realizaron con ratones de cuatro meses de edad. Los ratones de un mes de edad se trataron con el compuesto AHK1 o con el compuesto AHK2 durante 5 semanas, donde dichos compuestos se administraron en el agua de bebida a una concentración de 0.25 mg/mL. Semanalmente, se midió la fuerza muscular de las patas delanteras empleando un medidor de fuerza de agarre y el valor obtenido se normalizó por el peso corporal del animal. Para ello, se siguieron las indicaciones descritas en el protocolo de la TREAT- MD Neuromuscular Network (http://\\fww.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/ DMDJVI.2.2.001.pdf). Los ratones distróficos mostraron una disminución significativa de la fuerza de agarre. Sin embargo, tras 2 semanas de tratamiento, la fuerza aumentó significativamente en ratones mdx tratados con AHK1 o con AHK2 en comparación a sus compañeros de carnada no tratados. Tras 5 semanas de tratamiento la fuerza muscular aumentó significativamente en un 20% (Figura 4).
Estos datos sugieren que los compuestos según la invención pueden ser efectivos para tratar pacientes con distrofias musculares mediante la mejora de la función muscular o previniendo la debilidad muscular.
Tras concluir el tratamiento de 5 semanas, se obtuvo el músculo tibial anterior, que se procesó para su posterior análisis bioquímico e inmunohistológico para determinar el grado de daño muscular. La regeneración derivada de la muerte celular se determinó en criosecciones de músculo mediante la cuantificación del porcentaje de núcleos centrales, utilizando técnicas de immunofluorescencia estándar para detectar el colágeno IV y los núcleos celulares. La Figura 5 muestra cortes de criostato representativos de diafragmas de ratones control y de ratones distróficos marcados para ver el colágeno IV y DAPI para ver los núcleos. El tratamiento de 5 semanas de ratones mdx con AHKl y AHK2 redujo significativamente el porcentaje de núcleos centrales, lo que pone de manifiesto la capacidad de dichos compuestos para reducir marcadores histopatológicos de distrofia muscular tras las 5 semanas de tratamiento. Estos resultados sugieren que los compuestos según la invención son efectivos in vivo y alcanzan el músculo esquelético.
Por su parte, el análisis bioquímico del músculo tibial anterior se realizó mediante extracción de ARN y análisis del patrón de expresión en ratones control, en ratones mdx y en ratones sometidos a los distintos tratamientos. Para ello, se utilizó el RT2 Profiler PCR Array específico de músculo esquelético humano, miogénesis y miopatía (PAHS- 099Z, QIAGEN), empleando mezclas de cADN de al menos 3 ratones por grupo. Se analizó así el perfil de expresión de 84 genes involucrados en mecanismos fisiopatológicos del músculo esquelético. Los experimentos se realizaron en el equipo 7300 Real-Time PCR (Applied Biosystems) y los resultados obtenidos se analizaron utilizando el software online de QIAGEN
(http://www.sabiosciences.com/dataanalysis.php).
El tratamiento de ratones mdx con el compuesto AHKl durante 5 semanas rescata parcialmente el patrón de expresión génica de ratones mdx, como se muestra mediante la comparación de la expresión génica de ratones WT y mdx en la Figura 5. El número de genes cuya expresión estaba aumentada en ratones mdx respecto a control fue de 40, la cual se vio reducida a 20 en ratones tratados con AHKl (MDX + AHKl). Se consideró que un gen estaba sobre-expresado cuando su expresión aumentaba al menos 1,75 veces respecto del control. En la tabla I se muestra la lista de los genes cuya expresión está aumentada en ratones mdx y que disminuye a valores control, la cual disminuye parcialmente o no cambia con el tratamiento de AHKl .
Tabla 1
Símbolo Unigene RefSeq Ratio de cambio vs. control
MDX MDX + AHKl
Genes sobreexpresados cuya expresión se normaliza con AHKl
Aktl Mm.6645 NM_009652 2,63 1,42
Bcl2 Mm.257460 NM_009741 1,94 1,05 Cast Mm.441995 NM_009817 1,86 1,49
Cav3 Mm.3924 NM_007617 3,28 1,68
Cryab Mm.178 NM_009964 3,08 1,50
Ctnnb 1 Mm.291928 NM_007614 1,79 1,27
Dagl Mm.491797 NM_010017 2,27 1,23
Des Mm.6712 NM_010043 2, 14 1,53
Dysf Mm.220982 NM_021469 2, 15 1,28
Foxo3 Mm.391700 NM_019740 1,76 1, 14
Igfbp3 Mm.29254 NM_008343 1,77 1,34
Igfbp5 Mm.405761 NM_010518 2,52 1,43
Ikbkb Mm.277886 NM_010546 2,72 1,62
Mapk3 Mm.8385 NM_01 1952 2,61 1,69
Myodl Mm.1526 NM_010866 4,27 1,28
Nfkbl Mm.256765 NM_008689 2,45 1,67
Ppargclb Mm.415302 NMJ33249 1,77 1,23
Prkaal Mm.207004 NM_001013367 2,33 1,55
Rpsókbl Mm.446624 NM_028259 1,77 1,25
Utrn Mm.418026 NM_01 1682 2,03 1,35
Genes sobreexpresados que se normalizan parcialmente con AHKl
Casp3 Mm.34405 NM_009810 10,28 5,27
Igf2 Mm.3862 NM_010514 22,31 9,78
11 Ib Mm.222830 NM_008361 17,77 2,82
116 Mm.1019 NM_031168 32,72 9,76
Lmna Mm.471227 NM_019390 5,29 2,52
Mmp9 Mm.4406 NM_013599 4,51 2,01
Myog Mm.16528 NM_031 189 17,36 3,24
Tgfbl Mm.248380 NM_01 1577 6,51 3,61
Tnncl Mm.439921 NM_009393 25,00 4,53
Tnntl Mm.358643 NM_011618 12,09 3,37
Genes sobreexpresados cuya expresión no varía con AHKl
Bmp4 Mm.6813 NM_007554 1^93 2,08
Capn2 Mm.19306 NM_009794 2,90 1,75
Igfl Mm.268521 NM_010512 2,87 2,07
Tnf Mm.1293 NM_013693 15,01 10,27
Prkag3 Mm.453463 NM_153744 2,52 2,68
Rhoa Mm.318359 NM_016802 2,30 1,80
Pax3 Mm.1371 NM_008781 2, 16 2,48
Pax7 Mm.218760 NM_01 1039 3,82 2,55 Musk Mm.16148 NM_010944 3,51 2,00
Myf5 Mm.4984 NM_008656 3,40 2,13
En concreto, los resultados ponen de manifiesto que los compuestos según la invención muestran capacidad para reducir a la mitad el número de genes sobreexpresados en músculo distrófico mdx. Los genes susceptibles de ser modulados mediante los compuestos AHK incluyen, pero no se limitan a, Aktl, Bcl2, Casp3, Cast, Cav3, Cryab, Ctnnbl, Dagl, Des, Dysf, Foxo3, Igfbp3, Igfbp5, Ikbkb, Mapk3, Myodl, Nfkbl, Ppargclb, Prkaal, Rpsókbl, Utr, Casp3, Igf2, Illb, 116, Lmna, Mmp9, Myog, Tgfbl, Tnncl y Tnntl . Dentro de esta lista, Aktl, Illb, Mapk3, Mmp9 y Utr son genes relacionados con la pérdida de músculo esquelético o atrofia. Para determinar el efecto de los compuestos según la invención sobre el SNC y el corazón, se trataron ratones de cuatro meses de edad durante 5 semanas con el compuesto AHK2 en el agua de bebida a una concentración de 0.25 mg/mL. Los ratones mdx de cuatro meses de edad muestran una respuesta defensiva exacerbada tras un estrés agudo que es independiente de los déficit motores, cardiacos y respiratorios, y que está controlada por mecanismos centrales (Figura 7). El estrés agudo se realizó mediante inmovilizaciones manuales durante 15 segundos, en una postura que se utiliza habitualmente para realizar inyecciones intraperitoneales. Tras el estrés agudo, los ratones se monitorizan durante 1 minuto y se calcula el % del tiempo de freezing, o periodos de inmovilidad tónica de al menos 1 segundo con una sensibilidad de inmovilidad del 90%. No se observaron diferencias en el freezing de ratones no sometidos a estrés, lo que indica que la respuesta defensiva exacerbada que muestran los ratones mdx es independiente de déficits motores. El tratamiento de AHK2 durante 5 semanas mejoran significativamente el fenotipo de SNC de los ratones mdx relacionado con una respuesta defensiva exacerbada. Estos resultados sugieren que los compuestos según la invención son efectivos in vivo para el tratamiento de alteraciones en la función cerebral y alcanzan el SNC.
El miocardio de los ratones distróficos mdx de cuatro meses de edad es muy susceptible al estrés mecánico y el compuesto isoproterenol induce una cardiomiopatía en estos ratones (Figura 8). La integridad del sarcolema de los cardiomiocitos se determinó mediante la medición de la captación del tinte Evans Blue, que se acumula en los cardiomiocitos que tienen daño membranal. El Evans Blue se administró 24 h antes de la extracción de los corazones, a una concentración 10 mg/ml mediante inyección intraperitoneal (10 ul/g de peso corporal). El daño con isoproterenol se realizó mediante 3 inyecciones intraperitoneales secuenciales de beta-i soproterenol (350 ng/g de peso corporal), tras 18, 20 y 22 h de la administración de Evans Blue para determinar el grado de daño muscular. La regeneración derivada de la muerte celular se determinó en criosecciones de músculo mediante la cuantificación del porcentaje de núcleos centrales, utilizando técnicas de immunofluorescencia estándar para detectar el colágeno IV y los núcleos celulares. La Figura 8 muestra cortes de criostato representativos de corazones de ratones control y de ratones distróficos inyectados con Evans Blue para ver el daño cardiaco generado por el isoproterenol. El tratamiento de 5 semanas de ratones mdx con AFIK2 aumenta la integridad del sarcolema de los cardiomiocitos de los ratones mdx y protege el miocardio del daño inducido por isoproterenol, lo que indica que dicho compuesto alcanza el músculo cardiaco, es capaz de modular el receptor de rianodina tipo 2 (RyR2) y es efectivo in vivo para prevenir cardiomiopatías.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de Fórmula (I):
Figure imgf000049_0001
(I)
donde
R1 es un birradical alquileno C1-4 opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1 -4, arilo C6-io, F, Cl, CN y N02;
R2 es un birradical alquileno Ci-6, en el cual 1 , 2 ó 3 grupos -CH2- pueden estar opcionalmente reemplazados por grupos seleccionados entre -O- y -S-; y en el que el birradical alquileno Ci-C6 puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1 -4, alilo, propargilo, hidroximetilo, 1-hidroxi etilo, 2-hidroxi etilo, 3-aminopropilo, 4-aminobutilo, 3-guanidilpropilo, 3-indolilmetilo, arilo C6-io, bencilo, 4-hidroxibencilo, heteroarilo C6- io, F, Cl, OH, 0(alquilo CM), CN, N02, CO(alquilo CM), C02(alquilo CM), - CO H(alquilo CM) y -CON(alquilo Ci-4)2;
R3 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-4, arilo C6-io, F, Cl, Br e I; m se selecciona entre 0, 1, 2 y 3, 4; n se selecciona entre 0, 1 y 2;
X se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, 0(alquilo C1 -4), 0(arilo C6-io), OCF3, S(alquilo CM), S(arilo C6-io), alquilo Ci-6, CF3, HC(0)(alquilo Ci-4) y halógeno; o dos grupos X pueden representar un birradical metilendioxi, etilendioxi o propilendioxi; e
Y se selecciona del grupo que consiste en -OH, -C02H, -C02(alquilo C1 -4), -C02(alilo), -C02(bencilo), -S03H, - H2, - H(alquilo CM), -N(alquilo CM)2, N(alquilo CM)3 y - N(heterociclilo o heteroarilo), donde dicho heterociclilo o heteroarilo se encuentra opcionalmente sustituido por un grupo alquilo C1-4 y donde el átomo N forma parte del heterociclilo o heteroarilo, o un estereoisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado marcado isotópicamente o un profármaco del mismo.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en donde R1 es -CH2-
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde R2 es un birradical alquileno C1-4 opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, isopropilo, alilo, propargilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo, hidroximetilo, 1- hidroxi etilo, 2-hidroxi etilo, 3-aminopropilo, 4-aminobutilo, 3-guanidilpropilo, 3- indolilmetilo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, heteroarilo C6-io-
4. Compuesto según la reivindicación 3, en donde R2 es un birradical -CH2- o -CH2- CH2-, opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en metilo, isopropilo, isobutilo y bencilo.
5. Compuesto según la reivindicación 4, en donde R2 es un birradical -CH2- opcionalmente sustituido con dos sustituyentes metilo o con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en isopropilo, isobutilo y bencilo, o en donde R2 es un birradical -CH2-CH2-.
6. Compuesto según la reivindicación 5, en donde R2 es un birradical -CH2- o -CH2- CH2-.
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde R3 es H.
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde m 1.
9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde n es 0.
10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X es 0(alquilo C1-4) o halógeno.
11. Compuesto según la reivindicación 10, en donde X es un grupo metoxi en posición meta o para o cloro.
12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Y se selecciona del grupo que consiste en C02H, C02Me, H2, - HMe, - Me2, - Me3, - HEt, - Et2, - Et3,
Figure imgf000051_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de dichos grupos.
13. Compuesto según reivindicación 12, en donde Y se selecciona del grupo que consiste en C02H, C02Me, H2, -NHMe, -NMe2, -NMe3, -NHEt, -NEt2, -NEt3, pirrolidin- l-ilo, piperi din- l-ilo, morfolin-4-ilo, 4-piperazin- l-ilo, 4-metil-piperazin-l- ilo y piri din- l-ilo o una sal farmacéuticamente aceptable de dichos grupos.
14. Compuesto según la reivindicación 13, en donde Y se selecciona del grupo que consiste en C02H y -NMe2.
15. Compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en: l-carboximetil-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, l-[2-(N,N-dimetilamino)etil]-4-[4-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, l-carboximetil-4-[4-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, (S)-l-(l -carboxi-2-feniletil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, (R)- 1 -( 1 -carboxi-2-feniletil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, (S)-l-(l -carboxi-3 -metilbutil)-4- [3 -(metoxi)fenilti ometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, (R)- 1 -( 1 -carboxi-3 -metilbutil)-4- [3 -(metoxi)fenilti ometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, (S)-l-(l -carboxi-2-metilpropil)-4- [3 -(metoxi)feniltiometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, (R)-l-(l-carboxi-2-metilpropil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, 1 -( 1 -carboxi- 1 -metiletil)-4-[3 -(metoxi)feniltiometil]- 1H- 1 ,2,3 -triazol, l-(2-hidroxietil)-4-[4-(metoxi)feniltiometil]-lH-l,2,3-triazol, l-metoxicarbonilmetil-4-(fenilsulfinilmetil)-lH-l,2,3-triazol, y l-carboximetil-4-[3-(metoxi)fenilsulfonilmetil]-lH-l,2,3-triazol, 1 -carboximetil-4- [3 -(cloro)feniltiometil] - 1 H- 1 ,2, 3 -triazol, o una sal del mismo.
16. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula (I) según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, y uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16 para su administración por vía oral o parenteral.
18. Uso de un compuesto de fórmula (I) según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para preparar un medicamento.
19. Uso de un compuesto de fórmula (I) según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para preparar un medicamento destinado al tratamiento y/o prevención de trastornos y enfermedades del músculo esquelético, trastornos y enfermedades cardíacos y trastornos y enfermedades del sistema nervioso.
20. Uso según reivindicación 19, donde los trastornos y enfermedades del músculo esquelético se seleccionan entre distrofias musculares, miopatías congénitas, miopatías metabólicas, atrofia muscular y sarcopenia.
21. Uso según reivindicación 20, donde el trastorno o enfermedad del músculo esquelético es distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker.
22. Uso según reivindicación 19, donde los trastornos y enfermedades cardiacos se seleccionan entre insuficiencia cardíaca, isquemia cardíaca, arritmias cardíacas y cardiomiopatías.
23. Uso según reivindicación 19, donde los trastornos y enfermedades del sistema nemoso se seleccionan entre accidente cerebral, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal y deterioro cognitivo.
24. Un método para la síntesis de un compuesto de Fórmula (I) según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende: a) hacer reaccionar un alquino de fórmula (II) con una azida de Fórmula (III),
Figure imgf000052_0001
(II) (III) opcionalmente en presencia de un catalizador de cobre y, opcionalmente, en presencia de una base para dar un compuesto de fórmula (I), en donde: los grupos R1, R2, R3, m, n y X en los compuestos de fórmulas (II)-(III) son según se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, e
Y es un grupo según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, opcionalmente protegido con un grupo protector de carboxilo, un grupo protector de hidroxilo o un grupo protector de amino; cuando n es 0 en el compuesto de fórmula (I) obtenido en la etapa a), opcionalmente tratar dicho compuesto de fórmula (I) con un agente oxidante para dar un compuesto de fórmula (I) en donde n es 1 o 2, R1, R2, R3, m y X son según se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, e Y es un grupo según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, opcionalmente protegido con un grupo protector de carboxilo, un grupo protector de hidroxilo o un grupo protector de amino; y cuando el compuesto de fórmula (I) obtenido en la etapa a) o b) tiene un grupo
Y protegido con un grupo protector, eliminar dicho grupo protector para dar un compuesto de fórmula (I) en donde R1, R2, R3, m, n, X e Y son según se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
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