WO2022092018A1 - Ｌ－アミノ酸の製造法 - Google Patents

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公太 井上
和之 林
康介 横田
美加 守屋
智子 鈴木
嘉知 門倉
健 長彦
明梨 田代
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    • C12Y401/02009—Phosphoketolase (4.1.2.9)
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    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/04—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a disulfide as acceptor (1.2.4)
    • C12Y102/04001—Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring) (1.2.4.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L-amino acids such as L-glutamic acid by a fermentation method using bacteria.
  • L-amino acids are industrially useful as raw materials for seasonings and the like.
  • the L-amino acid is industrially produced by, for example, a fermentation method using a microorganism such as a bacterium having an L-amino acid-producing ability (Non-Patent Document 1).
  • a microorganism such as a bacterium having an L-amino acid-producing ability
  • a microorganism for example, a strain isolated from the natural world or a mutant strain thereof is used.
  • recombinant DNA technology can improve the ability of microorganisms to produce L-amino acids.
  • An object of the present invention is to develop a novel technique for improving the L-amino acid production ability of a bacterium and to provide an efficient method for producing L-amino acid.
  • the present inventor modifies the coryneform bacterium so as to have one or more modifications selected from the modifications (A) to (E) below. By doing so, it was found that the L-amino acid production ability of the bacterium could be improved, and the present invention was completed: (A) Modifications that increase the activity of acetate kinase; (B) Modifications that increase the activity of fructose-1,6-bisphosphatase; (C) Modifications that reduce the activity of pyruvate dehydrogenase; (D) Modifications that reduce the activity of aspartate transaminase; (E) Modifications that reduce the activity of malic enzyme.
  • the present invention can be exemplified as follows.
  • a method for producing L-amino acids Culturing a coryneform bacterium capable of producing L-amino acids in a medium and accumulating L-amino acids in the medium and / or in the cells of the bacterium, and the L-amino acids from the medium and / or the cells.
  • the L-amino acid is a glutamic acid-based L-amino acid.
  • the method wherein the bacterium has the following (X) and / or (Y) modifications: (X) Modifications that improve the availability of carbon sources via the phosphoketolase pathway; (Y) Modification that increases the intracellular oxaloacetate pool. [2] The method, wherein the bacterium has at least the modification of (X).
  • the modification of (X) is one or more modifications selected from the modifications of (A), (B), and (C) below;
  • the modification of (Y) is one or more modifications selected from the modifications of (D) and (E) below, the method: (A) Modifications that increase the activity of acetate kinase; (B) Modifications that increase the activity of fructose-1,6-bisphosphatase; (C) Modifications that reduce the activity of pyruvate dehydrogenase; (D) Modifications that reduce the activity of aspartic acid transaminase; (E) Modification that reduces the activity of Malik Enzyme. [4] A method for producing L-amino acids.
  • the L-amino acid is a glutamic acid-based L-amino acid.
  • the method, wherein the bacterium has one or more modifications selected from the modifications (A)-(E) below.
  • A Modifications that increase the activity of acetate kinase
  • B Modifications that increase the activity of fructose-1,6-bisphosphatase
  • C Modifications that reduce the activity of pyruvate dehydrogenase
  • D Modifications that reduce the activity of aspartic acid transaminase
  • E Modification that reduces the activity of Malik Enzyme.
  • the aspartic acid transaminase is encoded by the aspT gene;
  • the malic enzyme is encoded by the malE gene;
  • the pyruvate dehydrogenase is encoded by the poxB gene;
  • a method in which the acetate kinase is encoded by the ack gene; and / or the fructose-1,6-bisphosphatase is encoded by the glpX gene.
  • the activity of the aspartic acid transaminase is reduced by reducing the expression of the gene encoding the aspartic acid transaminase or by disrupting the gene;
  • the activity of the malic enzyme is reduced by reducing the expression of the gene encoding the malic enzyme or by disrupting the gene;
  • the activity of the pyruvate dehydrogenase is reduced by reducing the expression of the gene encoding the pyruvate dehydrogenase or by disrupting the gene;
  • the activity of the acetate kinase is increased by increasing the expression of the gene encoding the acetate kinase; and / or the activity of the fructose-1,6-bisphosphatase encodes fructose-1,6-bisphosphatase.
  • the aspartic acid transaminase is the protein according to (1a), (1b), or (1c) below: (1a) Protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (1b) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein containing an amino acid sequence containing substitutions, deletions, insertions, and / or additions of 1 to 10 amino acid residues and having aspartic acid transaminase activity; (1c) A protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having aspartic acid transaminase activity;
  • the malic enzyme is the protein according to (2a), (2b), or (2c) below: (2a) Protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4; (2b) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a protein containing an amino acid sequence containing substitutions, deletions, insertions, and / or additions of 1 to 10 amino acid residues
  • the method wherein the bacterium is further modified to increase the activity of the phosphoketolase as compared to an unmodified strain.
  • the phosphoketolase is D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase and / or fructose-6-phosphate phosphoketolase.
  • the bacterium is a Corynebacterium bacterium.
  • the method, wherein the bacterium is Corynebacterium glutamicum.
  • the glutamic acid-based L-amino acid is one or more L-amino acids selected from L-glutamic acid, L-glutamine, L-proline, L-arginine, L-citrulline, and L-ornithine. ..
  • the glutamic acid-based L-amino acid is L-glutamic acid.
  • the L-glutamic acid is ammonium L-glutamic acid or sodium L-glutamic acid.
  • the method of the present invention comprises culturing a coryneform bacterium capable of producing L-amino acids in a medium and accumulating L-amino acids in the medium and / or in the cells of the bacterium, and the medium and / or the bacterium.
  • a method for producing an L-amino acid which comprises collecting the L-amino acid from a body, wherein the bacterium has been modified to have specific properties. Bacteria used in this method are also referred to as "bacteria of the present invention".
  • Bacteria of the present invention is a coryneform bacterium having an L-amino acid-producing ability, which has been modified to have specific properties.
  • Bacteria capable of producing L-amino acids are the extent to which the desired L-amino acids can be produced and recovered when cultured in a medium. Bacteria that have the ability to accumulate in the medium and / or in the cells.
  • the bacterium capable of producing L-amino acids may be a bacterium capable of accumulating a larger amount of the target L-amino acid in the medium and / or in the cells than the unmodified strain.
  • Unmodified strain means a control strain that has not been modified to have specific properties. That is, examples of the unmodified strain include wild strains and parent strains.
  • the bacterium having an L-amino acid-producing ability is a bacterium capable of accumulating the target L-amino acid in a medium in an amount of preferably 0.5 g / L or more, more preferably 1.0 g / L or more. You may.
  • the L-amino acid produced in the present invention is a glutamic acid-based L-amino acid (L-amino acid of glutamate family).
  • Glutamic acid-based L-amino acid is a general term for L-amino acids that are biosynthesized using L-glutamic acid and L-glutamic acid as intermediates.
  • Examples of the L-amino acid biosynthesized using L-glutamic acid as an intermediate include L-glutamine, L-proline, L-arginine, L-citrulline, and L-ornithine.
  • Examples of the glutamic acid-based L-amino acid include L-glutamic acid.
  • the bacterium of the present invention may have the ability to produce only one type of L-amino acid, or may have the ability to produce two or more types of L-amino acid.
  • amino acid means L-amino acid unless otherwise specified.
  • L-amino acid means a free L-amino acid, a salt thereof, or a mixture thereof, unless otherwise specified. The salt will be described later.
  • coryneform bacteria examples include bacteria belonging to genera such as Corynebacterium, Brevibacterium, and Microbacterium.
  • coryneform bacterium include the following species. Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium crenatum Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) Brevibacterium album Brevibacterium
  • coryneform bacterium examples include Corynebacterium glutamicum (former name: Brevibacterium lactofermentum).
  • coryneform bacterium include the following strains. Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium crenatum AS1.542 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020 Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)
  • coryneform bacteria examples include Brevibacterium glutamicum (new name: Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869.
  • Corynebacterium stationis includes bacteria that were previously classified as Corynebacterium ammoniagenes, but have been reclassified into Corynebacterium stationis by 16S rRNA nucleotide sequence analysis, etc. (Int. J. .Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)).
  • strains can be sold from, for example, the American Type Culture Collection (Address 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA20108, United States of America). That is, a registration number corresponding to each strain is assigned, and this registration number can be used for distribution (see http://www.atcc.org/). The registration number for each strain can be found in the American Type Culture Collection catalog. In addition, these strains can be obtained, for example, from the depositary institution where each strain was deposited.
  • the bacterium of the present invention may be one that originally has an L-amino acid-producing ability, or may be one that has been modified to have an L-amino acid-producing ability.
  • Bacteria having L-amino acid-producing ability can be obtained, for example, by imparting L-amino acid-producing ability to the above-mentioned bacteria, or by enhancing the L-amino acid-producing ability of the above-mentioned bacteria. ..
  • L-amino acid-producing ability can be carried out by a method conventionally adopted for breeding amino acid-producing bacteria such as coryneform bacteria or Escherichia bacterium (Amino Acid Fermentation, Amino Acid Publishing Center, 1986). First edition published on May 30, 2014, see pages 77-100). Such methods include, for example, acquisition of an auxotrophic mutant strain, acquisition of an analog-resistant strain of L-amino acid, acquisition of a metabolic control mutant strain, and recombination in which the activity of an L-amino acid biosynthetic enzyme is enhanced. The creation of stocks can be mentioned.
  • the properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic control mutation imparted may be single, or may be two or more.
  • the L-amino acid biosynthetic enzyme whose activity is enhanced may be a single enzyme or two or three or more.
  • the impartation of properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic control mutation may be combined with the enhancement of the activity of biosynthetic enzymes.
  • the parent strain or the wild strain is subjected to normal mutation treatment, and the auxotrophic and analog strains obtained are obtained. It can be obtained by selecting one that exhibits resistance or metabolic control mutation and has L-amino acid-producing ability.
  • Normal mutation treatment includes irradiation with X-rays or ultraviolet rays, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethylmethane sulphonate (EMS), methyl methane sulphonate (MMS), etc. Treatment with a mutant agent can be mentioned.
  • the addition or enhancement of the L-amino acid producing ability can also be performed by enhancing the activity of the enzyme involved in the biosynthesis of the target L-amino acid.
  • Enzyme activity can be enhanced, for example, by modifying the bacterium so that the expression of the gene encoding the enzyme is enhanced. Methods for enhancing gene expression are described in WO00 / 18935, EP1010755A and the like. The detailed method for enhancing the enzyme activity will be described later.
  • the addition or enhancement of the L-amino acid producing ability is also carried out by reducing the activity of the enzyme that catalyzes the reaction of branching from the biosynthetic pathway of the target L-amino acid to produce a compound other than the target L-amino acid. It can be carried out.
  • the "enzyme that catalyzes the reaction that branches from the biosynthetic pathway of the target L-amino acid to produce a compound other than the target L-amino acid” includes an enzyme involved in the decomposition of the target amino acid. Is done. The method for reducing the enzyme activity will be described later.
  • the L-amino acid-producing bacteria and the method for imparting or enhancing the L-amino acid-producing ability will be specifically exemplified.
  • the properties of the L-amino acid-producing bacteria and the modifications for imparting or enhancing the L-amino acid-producing ability as exemplified below may be used alone or in combination as appropriate.
  • Examples of the method for imparting or enhancing the ability to produce L-glutamic acid include a method of modifying a bacterium so as to increase the activity of one or more enzymes selected from L-glutamic acid biosynthetic enzymes. Be done.
  • Such enzymes are not particularly limited, but are limited to glutamic acid dehydrogenase (gdhA), glutamine synthase (glnA), glutamic acid synthase (gltBD), isocitrate dehydrogenase (icdA), aconitate hydratase (acnA, acnB), and citrate synthase.
  • GltA methyl citrate synthase (prpC), pyruvate carboxylase (pyc), pyruvate dehydrogenase (aceEF, lpdA), pyruvate kinase (pykA, pykF), phosphoenolpyruvate synthase (ppsA), enolase (eno) , Phosphoglyceromase (pgmA, pgmI), Phosphoglycerate kinase (pgk), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapA), Triosephosphate synthase (tpiA), Fructose bisphosphate aldolase (fbp), Glucosephosphate isomerase (Pgi), 6-phosphogluconate dehydratase (edd), 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase (eda), transhydrogenas
  • the numbers in parentheses are examples of genes encoding the enzyme (the same applies to the following description).
  • these enzymes it is preferable to enhance the activity of one or more enzymes selected from, for example, glutamate dehydrogenase, citrate synthase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and methyl citrate synthase.
  • Examples of the coryneform bacterium modified so as to increase the expression of the glutamate synthase gene (gltBD) include those disclosed in WO99 / 07853.
  • an enzyme selected from an enzyme that catalyzes a reaction for producing a compound other than L-glutamic acid by branching from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid 1 Also included are methods of modifying the bacterium so that the activity of the species or higher enzyme is reduced.
  • Such enzymes are not particularly limited, but are, but are not limited, isocitrate lyase (aceA), ⁇ -ketoglutaric acid dehydrogenase (sucA, odhA), acetolactate synthase (ilvI), formic acid acetyltransferase (pfl), lactate dehydrogenase (ldh), Examples include alcohol dehydrogenase (adh), glutamate decarboxylase (gadAB), and succinate dehydrogenase (sdhABCD). Among these enzymes, for example, it is preferable to reduce or delete the ⁇ -ketoglutaric acid dehydrogenase activity.
  • Coryneform bacteria with reduced or deficient ⁇ -ketoglutaric acid dehydrogenase activity and methods for obtaining them are described in WO 2008/075483.
  • Specific examples of the coryneform bacterium with reduced or deficient ⁇ -ketoglutaric acid dehydrogenase activity include the following strains. Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) L30-2 strain (Japanese Patent Laid-Open No.
  • examples of the L-glutamic acid-producing bacterium or the parent strain for inducing it include strains in which both ⁇ -ketoglutaric acid dehydrogenase (sucA) activity and succinate dehydrogenase (sdh) activity are reduced or deficient (Japanese Patent Laid-Open No. 2010). -041920).
  • specific examples of such a strain include the odhAsdhA double-deficient strain (Corynebacterium glutamicum 8L3G ⁇ SDH strain) of the Corynebacterium glutamicum ATCC14067 strain (Japanese Patent Laid-Open No. 2010-041920).
  • L-glutamic acid excretion genes such as the yhfK gene (WO2005 / 085419) and the ybjL gene (WO2008 / 133161) can be mentioned. Be done.
  • a method for imparting or enhancing L-glutamic acid-producing ability for coryneform bacteria a method for imparting resistance to organic acid analogs, respiratory inhibitors, etc., and a method for imparting sensitivity to cell wall synthesis inhibitors are also mentioned. Be done. Specific examples of such a method include a method for imparting monofluoroacetic acid resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 50-113209), a method for imparting adenine resistance or thymine resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 57-065198), and urease. Method of weakening (Japanese Patent Laid-Open No.
  • resistant or susceptible bacteria include the following strains. Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ3949 (FERM BP-2632; JP-A 50-113209) Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736; JP-A-57-065198) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11355 (FERM P-5007; JP-A 56-1889) Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020; JP-A 56-1889) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11217 (FERM P-4318; JP-A 57-2689) Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319; JP-A 57-2689) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11564 (FERM P-54
  • a method for imparting or enhancing L-glutamic acid-producing ability in a coryneform bacterium a method for enhancing the expression of the yggB gene and a method for introducing a mutant yggB gene in which a mutation is introduced into the coding region can be mentioned.
  • the bacterium of the present invention may be modified so as to increase the expression of the yggB gene, or may be modified to retain (have) the mutant yggB gene.
  • the yggB gene is a gene that encodes a mechanosensitive channel.
  • Examples of the yggB gene include the yggB gene of a coryneform bacterium.
  • Specific examples of the yggB gene of corynebacterium include the yggB gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14967, and Corynebacterium melassecola ATCC17965 (WO2006 / 070944).
  • the yggB gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 corresponds to the complementary sequence of the sequence of 1,336,091 to 1,337,692 in the genomic sequence registered in the NCBI database with GenBank Accession No. NC_003450, and is also called NCgl1221.
  • the YggB protein encoded by the yggB gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 is registered as GenBank accession No. NP_600492.
  • the nucleotide sequence of the yggB gene of Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC13869) and the amino acid sequence of the YggB protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 15 and 16, respectively.
  • the yggB gene having a "specific mutation” described later is also referred to as a mutant yggB gene, and the protein encoded by the gene is also referred to as a mutant YggB protein.
  • the yggB gene having no "specific mutation” described later is also referred to as a wild-type yggB gene, and the protein encoded by the wild-type YggB gene is also referred to as a wild-type YggB protein.
  • a change in the amino acid sequence caused by a "specific mutation" in the yggB gene is also referred to as a "specific mutation".
  • wild type as used herein is a description for convenience to distinguish it from the "variant type”, and is not limited to naturally obtained ones as long as it does not have a "specific mutation".
  • wild-type YggB protein examples include the above-exemplified YggB protein, for example, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • examples of the wild-type YggB protein include conservative variants (variants in which the original function is maintained) of the YggB protein exemplified above, which do not have a “specific mutation”.
  • the "original function" of the YggB protein may be, for example, a function as a mechanosensitive channel, and the ability of the coryneform bacterium to produce L-glutamic acid when its expression is increased in the coryneform bacterium. It may be a property that improves.
  • the “specific mutation” is not particularly limited as long as it is a mutation that changes the amino acid sequence of the wild-type YggB protein as described above and improves the L-glutamic acid production ability of the coryneform bacterium.
  • Specific mutations include C-terminal mutations and transmembrane domain mutations (WO2006 / 070944). Moreover, the “specific mutation” may be a combination of those mutations.
  • the C-terminal mutation is a mutation in the region encoding the amino acid residue at positions 419 to 533 of the wild-type YggB protein in the wild-type yggB gene.
  • the C-terminal mutation may be introduced at one or more sites in the same region.
  • the type of amino acid sequence change caused by the C-terminal mutation is not particularly limited.
  • C-terminal mutations cause, for example, amino acid residue substitution (missense mutation), amino acid residue insertion, amino acid residue deletion, stop codon appearance (nonsense mutation), frameshift mutation, or a combination thereof. It may be a thing.
  • insertion of a base sequence such as an insertion sequence (hereinafter, also referred to as “IS”) or a transposon is preferable.
  • (1-1) Insertion of base sequence As the C-terminal mutation, for example, a mutation in which the base sequence is inserted at the position encoding the valine residue at position 419 of the wild-type YggB protein (2A-1 type mutation) can be mentioned. Be done.
  • the 2A-1 type mutation may, for example, cause the deletion or substitution of some or all of the amino acid residues at positions 419 to 533 of the wild-type YggB protein.
  • As a mutant yggB gene having a 2A-1 type mutation specifically, for example, IS is inserted after the "G" at position 1255 of SEQ ID NO: 15 from the original wild-type YggB protein (SEQ ID NO: 16).
  • the yggB gene which encodes a mutant YggB protein with a short total length of 423 amino residues.
  • the nucleotide sequence of this mutant yggB gene (V419 :: IS) and the amino acid sequence of the mutant YggB protein (V419 :: IS) encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 17 and 18, respectively.
  • positions 1 to 1269 are CDS of the mutant YggB protein (V419 :: IS).
  • Specific examples of the L-glutamic acid-producing bacterium having the mutant yggB gene (V419 :: IS) include C. glutamicum 2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * strain (WO2014 / 185430).
  • proline residues of the C-terminal mutation include a mutation in which the proline residue present at positions 419 to 533 of the wild-type YggB protein is replaced with another amino acid.
  • proline residues include wild-type YggB proteins at positions 424, 437, 453, 457, 462, 469, 484, 489, 497, 515, 529, and 533.
  • the "other amino acid” is not particularly limited as long as it is a natural amino acid other than proline.
  • “Other amino acids” include Lys, Glu, Thr, Val, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, Met, Phe, Trp, Tyr, Gly, Ala and His.
  • the proline residue at position 424 may preferably be replaced with a hydrophobic amino acid (Ala, Gly, Val, Leu, or Ile), more preferably a branched chain amino acid (Leu, Val, or Ile). It's okay.
  • the proline residue at position 437 may be preferably substituted with an amino acid having a hydroxyl group in the side chain (Thr, Ser, or Tyr), and more preferably with Ser.
  • transmembrane domain It is presumed that the YggB protein has 5 transmembrane domains.
  • the transmembrane regions are positions 1 to 23 (first transmembrane region), 25 to 47 (second transmembrane region), 62 to 84 (third transmembrane region), and 86 to 108, respectively, of the wild-type YggB protein. It corresponds to the amino acid residues at positions (4th transmembrane domain) and 110-132th positions (5th transmembrane domain).
  • Mutations in transmembrane regions are mutations in the regions encoding these transmembrane regions in the wild-type yggB gene. Mutations in the transmembrane domain may be introduced at one or more locations in the domain.
  • Mutations in the transmembrane domain are preferably those that cause substitutions, deletions, additions, insertions, or inversions of one or several amino acids, without frameshift and nonsense mutations.
  • "1 or several" means preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3.
  • Mutations in the transmembrane region include a mutation in the wild YggB protein that inserts one or several amino acids (eg, Cys-Ser-Leu) between the leucine residue at position 14 and the tryptophan residue at position 15, 100.
  • a mutation that replaces the alanine residue at position with another amino acid residue eg, an amino acid having a hydroxyl group in the side chain (Thr, Ser, or Tyr), preferably Thr
  • another amino acid residue eg, an amino acid having a hydroxyl group in the side chain (Thr, Ser, or Tyr), preferably Thr
  • Thr, Ser, or Tyr an amino acid having a hydroxyl group in the side chain
  • Thr an amino acid having a hydroxyl group in the side chain
  • Thr Ser, or Tyr
  • Thr amino acid having a hydroxyl group in the side chain
  • amino acid residue at position X of the wild-type YggB protein means an amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position X in SEQ ID NO: 16 unless otherwise specified.
  • the "X-position” in the amino acid sequence means the X-th position counted from the N-terminal of the same amino acid sequence, and the amino acid residue at the N-terminal is the amino acid residue at the 1-position.
  • the positions of amino acid residues indicate relative positions, and their absolute positions may change due to deletion, insertion, addition, etc. of amino acids.
  • amino acid residue at position 419 of the wild-type YggB protein means an amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position 419 in SEQ ID NO: 16, and is one amino acid residue on the N-terminal side of position 419. If is deleted, it is assumed that the 418th amino acid residue from the N-terminal is the "amino acid residue at position 419 of the wild-type YggB protein". When one amino acid residue is inserted on the N-terminal side of the 419th position, it is assumed that the 420th amino acid residue from the N-terminal is the "419th amino acid residue of the wild-type YggB protein".
  • the amino acid residues at positions 419 to 529 correspond to the amino acid residues at positions 419 to 533 of the wild-type YggB protein.
  • amino acid sequence of any YggB protein which amino acid residue is the "amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position X in SEQ ID NO: 16" is determined by the amino acid sequence of the YggB protein and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. It can be determined by aligning with. Alignment can be performed using, for example, known gene analysis software. Specific software includes DNASIS manufactured by Hitachi Solutions and GENETYX manufactured by Genetics (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1), 72-96, 1991; Barton GJet. al., Journal of molecular biology, 198 (2), 327-37. 1987).
  • the mutant yggB gene can be obtained by modifying the wild-type yggB gene so as to have the above-mentioned "specific mutation".
  • the DNA can be modified by a known method. Specifically, for example, as a site-specific mutation method for introducing a target mutation into a target site of DNA, a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds. , Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • the mutant yggB gene can also be obtained by chemical synthesis.
  • Modifying the bacterium to have the mutant yggB gene can be achieved by introducing the mutant yggB gene into the bacterium.
  • modifying the bacterium to have the mutant yggB gene can also be achieved by introducing a mutation into the yggB gene possessed by the bacterium by natural mutation or mutagen treatment.
  • the method of imparting or enhancing the production ability of L-glutamic acid is an L-amino acid biosynthesized using L-glutamic acid as an intermediate (for example, L-glutamine, L-proline, L-arginine, L-citrulline, L).
  • L-It may also be effective for imparting or enhancing the production capacity of (ornithine). That is, the bacterium having the ability to produce L-amino acids biosynthesized using these L-glutamic acid as an intermediate may appropriately have the above-mentioned properties of the L-glutamic acid-producing bacterium.
  • these bacteria capable of producing L-amino acids biosynthesized using L-glutamic acid as an intermediate may be modified so as to reduce the activity of ⁇ -ketoglutaric acid dehydrogenase and / or succinate dehydrogenase.
  • Examples of methods for imparting or enhancing L-glutamine-producing ability include a method of modifying a bacterium so as to increase the activity of one or more enzymes selected from L-glutamine biosynthetic enzymes. Be done.
  • Such enzymes include, but are not limited to, glutamic acid dehydrogenase (gdhA) and glutamine synthesizer (glnA).
  • the activity of glutamine synthesizer may be enhanced by disruption of the glutamine adenyltransferase gene (glnE) or the PII regulatory protein gene (glnB) (EP1229121).
  • an enzyme selected from an enzyme that catalyzes a reaction for producing a compound other than L-glutamine by branching from the biosynthetic pathway of L-glutamine 1 Also included are methods of modifying the bacterium so that the activity of the species or higher enzyme is reduced. Examples of such an enzyme include, but are not limited to, glutaminase.
  • L-glutamine-producing bacterium or the parent strain for inducing it include, for example, coryneform bacteria (EP1229121, EP1424398) having enhanced activity of glutamate dehydrogenase (gdhA) and / or glutamine synthesizer (glnA).
  • coryneform bacteria having reduced glutaminase activity (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-187684).
  • coryneform bacteria As a method for imparting or enhancing L-glutamine-producing ability of coryneform bacteria, a method for imparting 6-diazo-5-oxo-norleucine resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 3-232497), purine analog resistance and methionine sulfoxide resistance. (Japanese Patent Laid-Open No. 61-202694) and a method of imparting ⁇ -ketomalonic acid resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 56-151495). Specific examples of the coryneform bacterium having the ability to produce L-glutamine include the following strains.
  • Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11573 (FERM P-5492; JP-A 56-151495) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11576 (FERM BP-10381; JP-A 56-151495) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12212 (FERM P-8123; Japanese Patent Laid-Open No. 61-202694)
  • Examples of the method for imparting or enhancing the ability to produce L-proline include a method of modifying a bacterium so as to increase the activity of one or more enzymes selected from L-proline biosynthetic enzymes. Be done.
  • Such enzymes include glutamic acid-5-kinase (proB), ⁇ -glutamyl-phosphate reductase, and pyrrolin-5-carboxylate reductase (putA).
  • the proB gene German Patent No. 3127361
  • glutamate-5-kinase from which feedback inhibition by L-proline has been released can be preferably used.
  • a method for imparting or enhancing L-proline production ability for example, a method of modifying a bacterium so that the activity of an enzyme involved in L-proline decomposition is reduced can be mentioned.
  • Such enzymes include proline dehydrogenase and ornithine aminotransferase.
  • Examples of the method for imparting or enhancing the ability to produce L-arginine include a method of modifying a bacterium so as to increase the activity of one or more enzymes selected from L-arginine biosynthetic enzymes. Be done.
  • Such enzymes are not particularly limited, but are limited to N-acetylglutamate synthase (argA), N-acetylglutamate kinase (argB), N-acetylglutamyl phosphate reductase (argC), acetylornithine transaminase (argD), and acetylornithine.
  • Examples thereof include deacetylase (argE), ornithine carbamoyl kinase (argF, argI), argininosuccinic acid synthase (argG), argininosuccinic acid lyase (argH), ornithine acetyltransferase (argJ), and carbamoyl phosphate synthase (carAB).
  • argE deacetylase
  • argF, argI ornithine carbamoyl kinase
  • argG argininosuccinic acid synthase
  • argH argininosuccinic acid lyase
  • argJ ornithine acetyltransferase
  • carbamoyl phosphate synthase carbamoyl phosphate synthase
  • L-arginine-producing bacterium or the parent strain for inducing it a strain lacking the arginine repressor ArgR (US2002-0045223A) and a strain having increased intracellular glutamine synthetase activity (US2005-0014236A).
  • Corine-type bacteria such as are also mentioned.
  • examples of the L-arginine-producing bacterium or the parent strain for inducing the L-arginine-producing bacterium include a mutant strain of a coryneform bacterium having resistance to amino acid analogs and the like.
  • Such strains include, for example, a strain having L-histidine, L-proline, L-threonine, L-isoleucine, L-methionine, or L-tryptophane requirement in addition to 2-thiazole-alanine resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 54-44096); Strain resistant to ketomalonic acid, fluoromalonic acid, or monofluoroacetic acid (Japanese Patent Laid-Open No.
  • L-citrulline and L-ornithine-producing bacteria are intermediates in the L-arginine biosynthetic pathway.
  • one or more enzymes selected from L-arginine biosynthetic enzymes are increased in activity.
  • Such enzymes are not particularly limited, but for L-citrulin, N-acetylglutamate synthase (argA), N-acetylglutamate kinase (argB), N-acetylglutamylphosphate reductase (argC), acetylornithine transaminase (argC) ( argD), acetylornithine deacetylase (argE), ornithine carbamoyltransferase (argF, argI), ornithine acetyltransferase (argJ), carbamoyl phosphate synthase (carAB).
  • argA N-acetylglutamate synthase
  • argB N-acetylglutamate kinase
  • argC N-acetylglutamylphosphate reductase
  • argC acetylornithine transaminase
  • the enzyme is not particularly limited, but for L-ornithine, N-acetylglutamate synthase (argA), N-acetylglutamate kinase (argB), N-acetylglutamylphosphate reductase (argC), and acetylornithine.
  • argA N-acetylglutamate synthase
  • argB N-acetylglutamate kinase
  • argC N-acetylglutamylphosphate reductase
  • argJ acetylornithine
  • Transaminase argD
  • acetylornithine deacetylase argE
  • argJ ornithine acetyltransferase
  • the L-citrulline-producing bacterium can be easily obtained from, for example, any L-arginine-producing bacterium by reducing the activity of the argininosuccinate synthase encoded by the argG gene.
  • the L-ornithine-producing bacterium can be easily obtained from any L-arginine-producing bacterium, for example, by reducing the activity of the ornithine carbamoyl transferase encoded by both the argF and argI genes.
  • a method of imparting or enhancing the L-amino acid producing ability for example, a method of modifying a bacterium so that the activity of excreting the L-amino acid from the bacterial cell is increased can be mentioned.
  • the activity of excreting L-amino acids can be increased, for example, by increasing the expression of the gene encoding the protein that excretes L-amino acids.
  • Examples of the gene encoding a protein that excretes various amino acids include b2682 gene (ygaZ), b2683 gene (ygaH), b1242 gene (ychE), and b3434 gene (yhgN) (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-300874).
  • a method for imparting or enhancing L-amino acid production ability for example, a method for modifying a bacterium so as to increase the activity of a protein involved in glucose metabolism or a protein involved in energy metabolism can be mentioned.
  • proteins involved in glucose metabolism include proteins involved in sugar uptake and glycolytic enzymes.
  • Genes encoding proteins involved in glucose metabolism include glucose 6-phosphate isomerase gene (pgi; WO01 / 02542), pyruvate carboxylase gene (pyc; WO99 / 18228, EP1092776A), and phosphoglucomase gene (pgm; WO03).
  • fructose diphosphate aldolase gene pfkB, fbp; WO03 / 04664
  • transaldolase gene talB; WO03 / 008611
  • fumarase gene fum; WO01 / 02545
  • non-PTS sucrose uptake gene csc; EP1149911A
  • scrAB operon US Pat. No. 7,179,623
  • Examples of the gene encoding a protein involved in energy metabolism include a transhydrogenase gene (pntAB; US Patent No. 5,830,716) and a cytochrome bo type oxidase gene (cyoB; EP1070376A).
  • pntAB transhydrogenase gene
  • cyoB cytochrome bo type oxidase gene
  • a method for imparting or enhancing the production ability of a useful substance such as L-amino acid for example, a method of modifying a bacterium so as to increase the activity of phosphoketolase can be mentioned (WO2006 / 016705). That is, the bacterium of the present invention may be modified so as to increase the activity of phosphoketolase. This method may be particularly effective for imparting or enhancing the ability to produce glutamic acid-based L-amino acids such as L-glutamic acid.
  • the phosphoketolase include D-xylulose-5-phosphate-phosphoketolase and fructose-6-phosphate phosphoketolase. D-xylulose-5-phosphate-phosphoketolase activity and fructose-6-phosphate phosphoketolase activity may be enhanced by either one or both.
  • D-xylulose-5-phosphate-phosphoketolase activity is the consumption of phosphoric acid, which converts xylulose-5-phosphate into glyceraldehyde-3-phosphate and acetylphosphate, resulting in a single molecule of H 2 O. Means the activity of releasing. This activity is measured by the method described in Goldberg, M. et al. (Methods Enzymol., 9, 515-520 (1966)) or L. Meile (J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936). Can be measured.
  • D-xylrose-5-phosphate phosphoketrase examples include bacteria belonging to the genus Acetbacter, Bifidobacterium, Lactobacillus, Thiobacillus, Streptococcus, Methylococcus, Butirivibrio, or Fibrobacter, and Candida. Examples thereof include D-xylrose-5-phosphate phosphoketrase of yeasts belonging to the genera Rhodotorula, Rhodospolidium, Pikia, Yarrowia, Hansenula, Kluyberomyces, Saccharomyces, Tricosporon, or Wingea. Specific examples of D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase and the genes encoding it are disclosed in WO2006 / 016705.
  • Fructose-6-phosphate phosphoketrase activity is the activity of consuming phosphate to convert fructose-6-phosphate into erythrose-4-phosphate and acetyl phosphate, releasing a single molecule of H 2 O. Means activity. This activity was measured by the method described in Racker, E. (Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962)) or L. Meile (J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936). can do.
  • Fructose-6-phosphate phosphoketrase includes bacteria belonging to the genus Acetbacta, Bifidobacterium, Chlorobium, Brucella, Methylococcus, or Gardnerella, and yeasts belonging to the genus Rhodotorula, Candida, Saccharomyces, etc. Fructose-6-phosphate phosphoketolase can be mentioned. Specific examples of fructose-6-phosphate phosphoketolase and the genes encoding it are disclosed in WO2006 / 016705.
  • Both phosphoketolase activities may be retained by a single enzyme (D-xylulose-5-phosphate / fructose-6-phosphate phosphoketolase).
  • the genes and proteins used for breeding L-amino acid-producing bacteria may have, for example, the base sequences and amino acid sequences of known genes and proteins such as the above-exemplified genes and proteins, respectively.
  • the genes and proteins used for breeding L-amino acid-producing bacteria may be conservative variants of known genes and proteins such as the above-exemplified genes and proteins, respectively.
  • a gene used for breeding an L-amino acid-producing bacterium is one or a number at one or several positions in the amino acid sequence of a known protein as long as the original function is maintained.
  • the amino acid may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence substituted, deleted, inserted or added.
  • the description of target genes and conservative variants of target proteins described below can be applied mutatis mutandis.
  • the bacterium of the present invention has been modified to have specific properties.
  • the bacterium of the present invention can be obtained by modifying a bacterium having an L-amino acid-producing ability so as to have a specific property.
  • the bacterium of the present invention can also be obtained by modifying the bacterium so as to have a specific property and then imparting or enhancing the L-amino acid-producing ability.
  • the bacterium of the present invention may have acquired L-amino acid-producing ability by being modified to have specific properties.
  • the bacterium of the present invention may appropriately have the properties of the L-amino acid-producing bacteria as described above, for example. Modifications for constructing the bacterium of the present invention can be made in any order.
  • the L-amino acid production ability of the bacterium can be improved, that is, the L-amino acid production by the bacterium can be increased.
  • “increased L-amino acid production” include improvement (increase) in the amount of L-amino acid accumulated in the medium.
  • OAA intracellular oxaloacetate
  • OAA intracellular oxaloacetate
  • modifications that improve the availability of carbon sources via the phosphoketolase pathway include modifications that improve the availability of carbon sources via the phosphoketolase pathway.
  • "Improved availability of carbon sources via the phosphoketolase pathway” means that the flux of the phosphoketolase pathway (ie, the amount of metabolism of the carbon source via the phosphoketolase pathway) increases and / or via the phosphoketolase pathway. It may mean that the amount of by-products that can be produced from the metabolized carbon source is reduced.
  • Acetic acid is mentioned as a by-product. Acetic acid can accumulate, for example, by increasing the flux of the phosphoketolase pathway.
  • Modifications that improve the availability of carbon sources via the phosphoketolase pathway include modifications that increase the flux of the phosphoketolase pathway and modifications that improve the assimilation of acetic acid.
  • specific properties include the following modifications (A) to (E): (A) Modifications that increase the activity of acetate kinase; (B) Modifications that increase the activity of fructose-1,6-bisphosphatase; (C) Modifications that reduce the activity of pyruvate dehydrogenase; (D) Modifications that reduce the activity of aspartate transaminase; (E) Modifications that reduce the activity of malic enzyme.
  • the modifications (D) and (E) above may be an example of modifications in which the intracellular oxaloacetate (OAA) pool is increased.
  • the modifications (A), (B), and (C) above may be an example of modifications that improve the availability of carbon sources via the phosphoketolase pathway.
  • the modifications (A) and (C) above may be examples of modifications that improve the assimilation property of acetic acid.
  • the modification of (B) above may be an example of a modification in which the flux of the phosphoketolase pathway is increased.
  • the bacterium of the present invention may have one or more properties selected from the above-exemplified properties.
  • the bacterium of the present invention may have, for example, a modification that increases the intracellular oxaloacetate (OAA) pool and / or a modification that improves the availability of a carbon source via the phosphoketolase pathway.
  • the bacterium of the present invention may have, for example, at least a modification that improves the availability of a carbon source via the phosphoketolase pathway. That is, the bacterium of the present invention specifically passes through the phosphoketolase pathway, for example, among modifications that increase the intracellular oxaloacetate (OAA) pool and modifications that improve the availability of carbon sources via the phosphoketolase pathway. It may have only modifications that improve the availability of the carbon source, a combination of modifications that improve the availability of the carbon source via the phosphoketolase pathway and modifications that increase the intracellular oxaloacetate (OAA) pool. You may have.
  • the bacterium of the present invention may have, for example, a modification that increases the intracellular oxaloacetate (OAA) pool, a modification that increases the flux of the phosphoketolase pathway, and / or a modification that improves the assimilation of acetic acid.
  • the bacterium of the present invention may have, for example, at least a modification that improves the assimilation property of acetic acid. That is, the bacterium of the present invention specifically includes, for example, a modification that increases the intracellular oxaloacetate (OAA) pool, a modification that increases the flux of the phosphoketolase pathway, and a modification that improves the assimilation property of acetic acid.
  • the bacterium of the present invention may, for example, modify one or more selected from the modifications (A) to (E) above, for example, one, two, three, four, or all five. You may have.
  • the bacterium of the present invention is, for example, (A), (B), (C), (D), (E), (A) + (B), (A) + (C), ( A) + (D), (A) + (E), (B) + (C), (B) + (E), (C) + (D), (C) + (E), (D) + (E), (A) + (B) + (C), (A) + (B) + (D), (A) + (B) + (E), ( A) + (C) + (D), (A) + (B) + (E), ( A) + (C) + (D), (A) + (D) + (E), (B) + (C) + (E), (B) + (D) + (E), (A) + (B) + (C), (A
  • Modification of (A) + (B) means a combination of modification of (A) and modification of (B). This description can be applied mutatis mutandis to other combinations.
  • the bacterium of the present invention may have, for example, at least the modification of (A) above. That is, specifically, the bacterium of the present invention may have only the modification of (A) above among the modifications of (A) to (E) above, and specifically, the modification of (A) above. It may have one or more combinations of modifications selected from the modifications (B) to (E) above, for example, one, two, three, or all four. Further, the bacterium of the present invention may have, for example, at least the modification of (B) above.
  • Aspartate transaminase may mean a protein having an activity of catalyzing an amino group transamination reaction of aspartic acid and / or glutamic acid (for example, EC 2.6.1.1). This activity is also referred to as “aspartic acid transaminase activity”.
  • the aspartic acid transaminase activity may be specifically an activity that catalyzes a reaction of converting L-aspartic acid and ⁇ -ketoglutaric acid to oxaloacetate and / or vice versa.
  • Aspartate transaminase is also referred to as "glutamic-oxaloacetic transaminase".
  • the gene encoding the aspartic acid transaminase is also referred to as "aspartic acid transaminase gene".
  • the aspartic acid transaminase gene examples include the aspT gene.
  • the nucleotide sequence of the aspartic acid transaminase gene such as the aspT gene possessed by the modified bacterium and the amino acid sequence of the aspartic acid transaminase such as the AspT protein encoded by them can be obtained from a public database such as NCBI.
  • the nucleotide sequence of the aspT gene (CGBL_0102840) of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • malic enzyme may mean a protein having the activity of catalyzing the oxidative decarboxylation reaction of malic acid (eg, EC EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.39, or EC 1.1.1.40). ). This activity is also called “malic enzyme activity”. Specifically, the malic enzyme activity may be an activity that catalyzes a reaction of decarboxylating malic acid to produce pyruvic acid in the presence of an electron acceptor. Examples of the electron acceptor include NAD + and NADP + . The malic enzyme only needs to be able to utilize at least one electron acceptor.
  • the malic enzyme may further have an activity to catalyze the decarboxylation reaction of oxaloacetate (specifically, the reaction of converting oxaloacetate to pyruvate and carbon dioxide).
  • Malate dehydrogenase is also called “malate dehydrogenase”.
  • the gene encoding the malic enzyme is also called the "malic enzyme gene”. Examples of the malic enzyme gene include the malE gene.
  • the nucleotide sequence of the malic enzyme gene such as the malE gene possessed by the modified bacterium and the amino acid sequence of the malic enzyme such as the MalE protein encoded by them can be obtained from a public database such as NCBI.
  • the nucleotide sequence of the malE gene (CGBL_0129850) of Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • “Pyruvate dehydrogenase” may mean a protein having an activity of catalyzing the oxidative decarboxylation reaction of pyruvate (for example, EC 1.2.5.1). This activity is also referred to as “pyruvate dehydrogenase activity". Specifically, the pyruvate dehydrogenase activity may be an activity that catalyzes a reaction of decarboxylating pyruvate to produce acetic acid in the presence of an electron acceptor. Examples of the electron acceptor include quinones such as ubiquinone. Pyruvate dehydrogenase may utilize at least one electron acceptor.
  • the gene encoding pyruvate dehydrogenase is also referred to as "pyruvate dehydrogenase gene".
  • Examples of the pyruvate dehydrogenase gene include the poxB gene.
  • the nucleotide sequence of the pyruvate dehydrogenase gene such as the poxB gene possessed by the modified bacterium and the amino acid sequence of the pyruvate dehydrogenase such as the PoxB protein encoded by them can be obtained from a public database such as NCBI.
  • the nucleotide sequence of the poxB gene (CGBL_0125410) of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.
  • Acetate kinase may mean a protein having an activity of catalyzing the phosphorylation reaction of acetic acid (for example, EC 2.7.2.1). This activity is also referred to as “acetate kinase activity". Specifically, the acetic acid kinase activity may be an activity that catalyzes a reaction of phosphorylating acetic acid to produce acetyl phosphate in the presence of a phosphate group donor. Examples of the phosphate group donor include ATP. Acetate kinase need only have at least one phosphate group donor available. The gene encoding acetate kinase is also called “acetate kinase gene”.
  • Examples of the acetate kinase gene include the ack gene.
  • Examples of the acetate kinase gene such as the ack gene include genes of various organisms such as coryneform bacteria and bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae. Specific examples of the ack gene include the ack gene of Corynebacterium glutamicum and E. coli.
  • the nucleotide sequences of acetate kinase genes such as the ack gene of various organisms and the amino acid sequences of acetate kinases such as the Ack protein encoded by them can be obtained from public databases such as NCBI.
  • the nucleotide sequence of the ack gene (CGBL_0126910) of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively.
  • the nucleotide sequence of the ack gene of E. coli MG1655 and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively.
  • fructose-1,6-bisphosphatase may mean a protein having the activity of catalyzing the dephosphorylation reaction of fructose-1,6-bisphosphate (eg, EC). 3.1.3.11). This activity is also referred to as “fructose-1,6-bisphosphatase activity".
  • the fructose-1,6-bisphosphatase activity may be specifically an activity that catalyzes the reaction of converting fructose-1,6-bisphosphate to fructose-6-phosphate.
  • the gene encoding fructose-1,6-bisphosphatase is also referred to as "fructose-1,6-bisphosphatase gene”.
  • fructose-1,6-bisphosphatase gene examples include the glpX gene.
  • examples of the fructose-1,6-bisphosphatase gene such as the glpX gene include genes of various organisms such as coryneform bacteria and bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae. Specific examples of the glpX gene include Corynebacterium glutamicum and E. coli's glpX gene.
  • the nucleotide sequences of fructose-1,6-bisphosphatase genes such as glpX genes of various organisms and the amino acid sequences of fructose-1,6-bisphosphatases such as GlpX protein encoded by them can be obtained from public databases such as NCBI.
  • the nucleotide sequence of the glpX gene (NCgl0976) of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively.
  • the nucleotide sequence of the glpX gene of E. coli MG1655 and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively.
  • the method for reducing the activity of the protein will be described later.
  • the activity of a protein can be reduced, for example, by reducing the expression of the gene encoding the protein or by disrupting the gene. Such a method for reducing the activity of a protein can be used alone or in combination as appropriate.
  • the activity of a protein can be increased, for example, by increasing the expression of the gene encoding the protein.
  • Gene expression can be increased, for example, by increasing the number of copies of the gene or by modifying the expression regulatory sequence of the gene. Techniques for increasing the activity of such proteins can be used alone or in combination as appropriate.
  • target protein Proteins whose activity decreases or increases in a specific property are collectively referred to as "target protein”. Genes encoding target proteins are collectively referred to as “target genes”.
  • the target gene may be, for example, a gene having the base sequence of the above-exemplified target gene (for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, or 13).
  • the target protein may be, for example, a protein having an amino acid sequence of the above-exemplified target protein (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, or 14).
  • the expression "having a (amino acid or base) sequence” means "including the (amino acid or base) sequence" and includes the case of “consisting of the (amino acid or base) sequence" unless otherwise specified. do.
  • the target gene is a variant of the above-exemplified target gene (eg, a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, or 13) as long as the original function is maintained. You may.
  • the target protein is a target protein exemplified above (eg, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, or 14) as long as the original function is maintained. It may be a variant. A variant in which such an original function is maintained may be referred to as a "conservative variant".
  • amino acid sequence refers to the above exemplified aspT gene, malE gene, poxB gene, ack gene, and glpX gene, respectively.
  • those conservative variants shall be included.
  • amino acid sequence refers to the above-exemplified AspT protein, MalE protein, PoxB protein, Ack protein, and In addition to the GlpX protein, those conservative variants shall be included.
  • Conservative variants include, for example, homologs of the above-exemplified target genes and target proteins, and artificial variants.
  • the original function is maintained means that the variant of the gene or protein has a function (for example, activity or property) corresponding to the function (for example, activity or property) of the original gene or protein.
  • maintaining the original function" of a gene is meant that the variant of the gene encodes a protein that retains its original function. That is, “the original function is maintained” for each target gene means that the variant of the gene is the activity of each target protein: aspartic acid transaminase activity for aspartic acid transaminase; malic enzyme activity for malic enzyme; pyruvate dehydrogenase.
  • each target protein may mean encoding a protein having pyruvate dehydrogenase activity; acetic acid kinase activity for acetate kinase; fructose-1,6-bisphosphatase activity for fructose-1,6-bisphosphatase;
  • the original function is maintained for each target protein means that the variant of the protein is the activity of each target protein: aspartic acid transaminase activity for aspartic acid transaminase; malicenzyme activity for malicenzyme; pyruvate dehydrogenase.
  • pyruvate dehydrogenase activity acetic acid kinase activity for acetate kinase
  • fructose-1,6-bisphosphatase activity for fructose-1,6-bisphosphatase
  • Aspartic acid transaminase activity for example, incubates the enzyme with the corresponding substrate (eg, L-aspartic acid and ⁇ -ketoglutaric acid) to produce the enzyme and the corresponding substrate-dependent product (eg, oxaloacetate and L-glutamic acid). By measuring, it can be measured.
  • the corresponding substrate eg, L-aspartic acid and ⁇ -ketoglutaric acid
  • the corresponding substrate-dependent product eg, oxaloacetate and L-glutamic acid
  • Malic enzyme activity is measured, for example, by incubating the enzyme with the corresponding substrate (eg malic acid) in the presence of an electron acceptor and measuring the production of the enzyme and the corresponding substrate-dependent product (eg pyruvate). Can be measured.
  • Pyruvate dehydrogenase activity is achieved, for example, by incubating the enzyme with the corresponding substrate (eg pyruvate) in the presence of an electron acceptor and measuring the production of the enzyme and the corresponding substrate-dependent product (eg acetic acid). Can be measured.
  • Acetate kinase activity is measured, for example, by incubating an enzyme with a corresponding substrate (eg, acetic acid) in the presence of a phosphate group donor and measuring the production of the enzyme and the corresponding substrate-dependent product (eg, acetyl phosphate). Can be measured by.
  • a corresponding substrate eg, acetic acid
  • a substrate-dependent product eg, acetyl phosphate
  • Fructose-1,6-bisphosphatase activity is such that the enzyme is incubated with the corresponding substrate (eg fructose-1,6-bisphosphate) and the enzyme and the corresponding substrate-dependent product (eg fructose-6-phosphate). ) Can be measured by measuring the formation.
  • the corresponding substrate eg fructose-1,6-bisphosphate
  • the enzyme and the corresponding substrate-dependent product eg fructose-6-phosphate
  • the homolog of the target gene or the homolog of the target protein can be easily obtained from a public database by, for example, a BLAST search or a FASTA search using the base sequence of the above-exemplified target gene or the amino acid sequence of the above-exemplified target protein as a query sequence. Can be done. Further, the homologue of the target gene can be obtained, for example, by PCR using chromosomes of various organisms as templates and oligonucleotides prepared based on the base sequences of these known target genes as primers.
  • the target gene is located at one or several positions in the above amino acid sequence (eg, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, or 14) as long as the original function is maintained.
  • One or several amino acids of the gene may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence substituted, deleted, inserted, and / or added.
  • the encoded protein may have its N-terminus and / or C-terminus extended or shortened.
  • the above-mentioned "1 or several” varies depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30. It preferably means 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3.
  • substitutions, deletions, insertions, and / or additions of one or several amino acids described above are conservative mutations that maintain normal protein function.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitutions are polar amino acids between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In some cases, between Gln and Asn, between Lys, Arg and His if it is a basic amino acid, and between Asp and Glu if it is an acidic amino acid, if it is an amino acid with a hydroxyl group. Is a mutation that replaces each other between Ser and Thr.
  • Substitutions that are considered conservative substitutions include, specifically, Ala to Ser or Thr substitutions, Arg to Gln, His or Lys substitutions, Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp substitutions. Asp to Asn, Glu or Gln replacement, Cys to Ser or Ala replacement, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg replacement, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, Ile to Leu, Met, Val or Phe, Leu to Ile, Met, Val or Phe, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg replacement, Met to Ile, Leu, Val or Phe replacement, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu replacement, Ser to Thr or Ala Substitutions include Thr to Ser or Ala, Trp to Phe or Tyr, Tyr to His, Phe
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions may be caused by naturally occurring mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the organism from which the gene is derived. included.
  • the target gene is, for example, 50% or more, 65% or more, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with respect to the entire amino acid sequence. It may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence having an identity of 97% or more, more preferably 99% or more.
  • the target gene is a probe that can be prepared from the above-mentioned base sequence (for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 or 13) as long as the original function is maintained, for example. It may be a gene (for example, DNA) that hybridizes with a complementary sequence to all or part of the above base sequence under stringent conditions.
  • the "stringent condition” refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • DNAs having high identity for example, 50% or more, 65% or more, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, particularly preferably 99.
  • 60 ° C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS which is a condition in which DNAs having an identity of% or more hybridize with each other and DNAs having a lower identity do not hybridize with each other, or normal Southern hybridization washing conditions.
  • the probe used for the above hybridization may be a part of the complementary sequence of the gene.
  • a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing the above-mentioned gene as a template.
  • a DNA fragment having a length of about 300 bp can be used as a probe.
  • the conditions for washing the hybridization include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • the target gene may be a codon in which an arbitrary codon is replaced with an equivalent codon. That is, the target gene may be a variant of the above-exemplified target gene due to the reduction of the genetic code.
  • the target gene may be modified to have the optimum codon depending on the codon usage frequency of the host used.
  • genes and conservative variants of proteins can be applied mutatis mutandis to arbitrary proteins such as L-amino acid biosynthetic enzymes and genes encoding them.
  • “Increased protein activity” means that the activity of the protein is increased as compared with the unmodified strain. By “increasing the activity of a protein”, specifically, it means that the activity of the protein per cell is increased as compared with the unmodified strain.
  • the term "unmodified strain” as used herein means a control strain that has not been modified to increase the activity of the target protein. Examples of the unmodified strain include wild strains and parent strains. Specific examples of the unmodified strain include a reference strain (type strain) of each bacterial species. Further, as the unmodified strain, specifically, the strain exemplified in the description of the bacterium can be mentioned.
  • the activity of the protein may be increased relative to the reference strain (ie, the reference strain of the species to which the bacterium of the invention belongs). Moreover, in another embodiment, the activity of the protein may be increased as compared with the C. glutamicum ATCC 13869 strain. Moreover, in another embodiment, the activity of the protein may be increased as compared with the C. glutamicum ATCC 13032 strain. Further, in another embodiment, the activity of the protein may be increased as compared with C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734). Moreover, in another embodiment, the activity of the protein may be increased as compared with the C. glutamicum YDK010 strain.
  • the reference strain ie, the reference strain of the species to which the bacterium of the invention belongs.
  • the activity of the protein may be increased as compared with the C. glutamicum ATCC 13869 strain.
  • the activity of the protein may be increased as compared with the C. glutamicum ATCC 13032 strain.
  • the activity of the protein may be increased
  • increasing protein activity is also referred to as “enhancing protein activity”.
  • Increased protein activity means more specifically that the number of molecules of the protein per cell is increased and / or per molecule of the protein as compared to the unmodified strain. It may mean that the function is increasing. That is, the "activity” in the case of “increasing the activity of a protein” means not only the catalytic activity of the protein but also the transcription amount (mRNA amount) or the translation amount (protein amount) of the gene encoding the protein. You may.
  • the “number of molecules of the protein per cell” may mean the average value of the number of molecules of the protein per cell.
  • increasing the activity of the protein means not only increasing the activity of the protein in the strain that originally has the activity of the target protein, but also increasing the activity of the protein in the strain that originally does not have the activity of the target protein. It also includes imparting activity. Further, as long as the activity of the protein is increased as a result, the activity of the target protein originally possessed by the host may be reduced or eliminated, and then the activity of the suitable target protein may be imparted.
  • the degree of increase in protein activity is not particularly limited as long as the protein activity is increased as compared with the unmodified strain.
  • the activity of the protein may be increased, for example, 1.5-fold or more, 2-fold or more, or 3-fold or more of that of the unmodified strain.
  • the protein may be produced by introducing a gene encoding the protein. For example, the activity of the protein is measured. It may be produced to the extent possible.
  • Modifications that increase the activity of the protein can be achieved, for example, by increasing the expression of the gene encoding the protein.
  • the expression of a gene is increased means that the expression of the gene is increased as compared with an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain.
  • Increased gene expression specifically means that the per-cell expression level of the gene is increased as compared with the unmodified strain.
  • the "expression level of a gene per cell” may mean the average value of the expression level of the gene per cell.
  • Increased gene expression means, more specifically, an increase in the amount of transcription (mRNA) of a gene and / or an increase in the amount of translation (amount of protein) of a gene. It's okay.
  • increasing gene expression is also referred to as "enhancing gene expression”.
  • the expression of the gene may be increased, for example, 1.5-fold or more, 2-fold or more, or 3-fold or more of that of the unmodified strain.
  • increasing gene expression means not only increasing the expression level of the gene in the strain in which the target gene is originally expressed, but also in the strain in which the target gene is not originally expressed. Expression of the same gene is also included. That is, “the expression of a gene is increased” may mean, for example, introducing the gene into a strain that does not carry the target gene and expressing the gene.
  • Increased gene expression can be achieved, for example, by increasing the number of copies of the gene.
  • the increase in the number of copies of a gene can be achieved by introducing the gene into the chromosome of the host.
  • homologous recombination can be used to introduce a gene into a chromosome (Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • a gene transfer method using homologous recombination for example, the Red-driven integration method (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.
  • a method using a linear DNA a method using a plasmid containing a temperature-sensitive origin of replication, a method using a conjugation-transmissible plasmid, a suicide vector having no origin of replication that functions in the host.
  • a method using a plasmid and a transduction method using a phage can be mentioned.
  • the gene can be introduced onto the chromosome of the host by transforming the host with recombinant DNA containing the target gene and causing homologous recombination with the target site on the chromosome of the host.
  • the structure of the recombinant DNA used for the homologous recombination is not particularly limited as long as the homologous recombination occurs in a desired embodiment.
  • a linear DNA containing a target gene in which the host is transformed with a linear DNA having homologous base sequences upstream and downstream of the target site on the chromosome at both ends of the gene, is used to transform the host upstream of the target site.
  • the target site can be replaced with the gene by causing homologous recombination both downstream and downstream.
  • Recombinant DNA used for homologous recombination may include a marker gene for selecting a transformant. Only one copy of the gene may be introduced, or two copies or more may be introduced.
  • a large number of copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination targeting a base sequence having a large number of copies on the chromosome.
  • Nucleobase sequences having a large number of copies on a chromosome include repetitive DNA sequences and inverted repeats present at both ends of a transposon.
  • homologous recombination may be performed by targeting an appropriate base sequence on the chromosome such as a gene unnecessary for the production of the target substance.
  • the gene can also be randomly introduced onto the chromosome using a transposon or Mini-Mu (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985, US5,882,888, EP805867B1).
  • the method for modifying a chromosome using such homologous recombination is not limited to the introduction of a target gene, and can be used for arbitrary modification of a chromosome such as modification of an expression regulatory sequence.
  • an increase in the number of copies of a gene can also be achieved by introducing a vector containing the gene into the host.
  • a DNA fragment containing a target gene can be ligated with a vector that functions in the host to construct an expression vector for the gene, and the host can be transformed with the expression vector to increase the number of copies of the gene.
  • the DNA fragment containing the target gene can be obtained, for example, by PCR using the genomic DNA of the microorganism having the target gene as a template.
  • a vector capable of autonomous replication in the cell of the host can be used.
  • the vector is preferably a multi-copy vector.
  • the vector preferably has a marker such as an antibiotic resistance gene.
  • the vector may also include a promoter or terminator for expressing the inserted gene.
  • the vector may be, for example, a vector derived from a bacterial plasmid, a vector derived from a yeast plasmid, a vector derived from a bacteriophage, a cosmid, a phagemid or the like.
  • Specific examples of vectors capable of autonomous replication in coryneform bacteria include pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-). 2903 (1984)); A plasmid having an improved drug resistance gene; pCRY30 (Japanese Patent Laid-Open No.
  • pCG4 and pCG11 Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799
  • pVK7 Japanese Patent Laid-Open No. 10-215883
  • pVK9 Japanese Patent Laid-Open No. 10-215883
  • pVC7 Japanese Patent Laid-Open No. 9-070291
  • pVS7 WO2013 / 069634
  • the gene When introducing a gene, the gene may be retained in the host so that it can be expressed. Specifically, the gene may be retained to be expressed under the control of a promoter that functions in the host.
  • the promoter is not particularly limited as long as it functions in the host. "Promoter functioning in a host” means a promoter having promoter activity in the host.
  • the promoter may be a host-derived promoter or a heterologous promoter.
  • the promoter may be a promoter unique to the gene to be introduced, or may be a promoter of another gene. As the promoter, for example, a stronger promoter as described later may be used.
  • a terminator for transcription termination can be placed downstream of the gene.
  • the terminator is not particularly limited as long as it functions in the host.
  • the terminator may be a host-derived terminator or a heterogeneous terminator.
  • the terminator may be a unique terminator of the gene to be introduced, or may be a terminator of another gene.
  • Vectors, promoters, and terminators that can be used in various microorganisms are described in detail in, for example, "Basic Microbiology Course 8 Genetic Engineering, Kyoritsu Shuppan, 1987", and they can be used.
  • each gene when introducing two or more genes, it is sufficient that each gene is retained in the host so that it can be expressed.
  • each gene may be all retained on a single expression vector or all on a chromosome.
  • each gene may be separately retained on a plurality of expression vectors, or may be separately retained on a single or a plurality of expression vectors and on a chromosome.
  • an operon may be composed of two or more genes and introduced.
  • introducing two or more genes for example, when introducing a gene encoding two or more proteins (for example, an enzyme), a single protein complex (for example, an enzyme complex) is introduced. Introducing genes encoding two or more subunits, respectively, and combinations thereof.
  • the gene to be introduced is not particularly limited as long as it encodes a protein that functions in the host.
  • the gene to be introduced may be a host-derived gene or a heterologous gene.
  • the gene to be introduced can be obtained by PCR, for example, using a primer designed based on the base sequence of the gene and using a genomic DNA of an organism having the gene, a plasmid carrying the gene, or the like as a template. Further, the gene to be introduced may be totally synthesized, for example, based on the base sequence of the gene (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).
  • the acquired gene can be used as it is or after being appropriately modified. That is, the variant can be obtained by modifying the gene. Genetic modification can be performed by a known method.
  • a site-specific mutation method can be used to introduce a desired mutation at a target site in DNA. That is, for example, site-specific mutagenesis can modify the coding region of a gene such that the encoded protein contains amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and / or additions at specific sites. ..
  • site-specific mutation method a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth .In Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • the gene variant may be totally synthesized.
  • each subunit constituting the complex may be derived from one organism or two or more different organisms as long as the complex has the function of the target protein. That is, for example, a gene derived from the same organism that encodes a plurality of subunits may be introduced into the host, or a gene derived from a different organism may be introduced into the host.
  • “Expression regulatory sequence” is a general term for sites that affect gene expression.
  • Expression regulatory sequences include, for example, a promoter, a Shine-Dalgarno (SD) sequence (also referred to as a ribosome binding site (RBS)), and a spacer region between the RBS and the start codon.
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding site
  • the expression regulatory sequence can be determined using a promoter search vector or gene analysis software such as GENETYX. Modification of these expression control sequences can be performed, for example, by a method using a temperature-sensitive vector or a Red-driven integration method (WO2005 / 010175).
  • Improvement of gene transcription efficiency can be achieved, for example, by replacing the promoter of the gene on the chromosome with a stronger promoter.
  • strong promoter is meant a promoter in which transcription of a gene is improved over a wild-type promoter that originally exists.
  • More potent promoters available in coryneform bacteria include, for example, the artificially redesigned P54-6 promoter (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)), acetic acid in coryneform bacteria.
  • the activity of the promoter can be enhanced by bringing the -35 and -10 regions within the promoter region closer to the consensus sequence (International Publication No. 00/18935).
  • the highly active promoter include various tac-like promoters (Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574) and pnlp8 promoter (WO2010 / 027045). Methods for assessing promoter strength and examples of potent promoters are described in Goldstein et al.'S paper (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)).
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding site
  • Improvement of gene translation efficiency can be achieved, for example, by replacing the Shine-Dalgarno (SD) sequence (also referred to as ribosome binding site (RBS)) of the gene on the chromosome with a stronger SD sequence.
  • strong SD sequence is meant an SD sequence in which the translation of mRNA is improved over the wild-type SD sequence that originally exists. Examples of the stronger SD sequence include RBS of gene 10 derived from phage T7 (Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235).
  • substitution, insertion, or deletion of several nucleotides in the spacer region between the RBS and the start codon, especially the sequence immediately upstream of the start codon (5'-UTR), contributes to mRNA stability and translation efficiency. It is known to have a great effect, and the translation efficiency of genes can be improved by modifying these.
  • Improvement of gene translation efficiency can also be achieved by, for example, modifying codons.
  • the translation efficiency of a gene can be improved by replacing the rare codon present in the gene with a synonymous codon that is used more frequently. That is, the gene to be introduced may be modified to have an optimum codon, for example, depending on the codon usage frequency of the host used. Codon substitution can be performed, for example, by a site-specific mutagenesis method.
  • the gene fragment in which the codon is substituted may be totally synthesized. The frequency of codon usage in various organisms is described in the "Codon Use Database" (http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)). It is disclosed in.
  • Increased gene expression can also be achieved by amplifying regulators that increase gene expression, or by deleting or weakening regulators that reduce gene expression.
  • the above-mentioned method for increasing gene expression may be used alone or in any combination.
  • Modifications that increase the activity of the protein can also be achieved, for example, by enhancing the specific activity of the protein. Enhancement of specific activity also includes desensitization to feedback inhibition. Proteins with enhanced specific activity can be obtained by searching for, for example, various organisms.
  • a highly active form may be obtained by introducing a mutation into a conventional protein.
  • the mutation introduced may be, for example, one or several amino acids substituted, deleted, inserted, and / or added at one or several positions of the protein.
  • the introduction of the mutation can be performed, for example, by the site-specific mutation method as described above. Further, the introduction of the mutation may be carried out by, for example, a mutation treatment.
  • Mutation treatments include X-ray irradiation, UV irradiation, and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethylmethanesulfonate (EMS), and methylmethanesulfonate (MMS). ), Etc., can be mentioned.
  • the DNA may be treated directly with hydroxylamine in vitro to induce random mutations.
  • the enhancement of specific activity may be used alone or in combination with the above-mentioned method for enhancing gene expression.
  • the transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a method for transforming a coryneform bacterium a protoplast method (Gene, 39, 281-286 (1985)), an electroporation method (Bio / Technology, 7, 1067-1070 (1989)), and an electric pulse method (special). Kaihei 2-207791 (Gazette).
  • the increased activity of the protein can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • the increase in protein activity can also be confirmed by confirming that the expression of the gene encoding the protein has increased.
  • the increase in gene expression can be confirmed by confirming that the transcription amount of the gene has increased and that the amount of protein expressed from the gene has increased.
  • Confirmation that the transcription amount of the gene has increased can be confirmed by comparing the amount of mRNA transcribed from the gene with an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain.
  • an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain.
  • methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, microarray, RNA-seq, etc. (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual / Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, etc. Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
  • the amount of mRNA (eg, number of molecules per cell) may be increased, for example, 1.5-fold or more, 2-fold or more, or 3-fold or more of that of the unmodified strain.
  • the amount of protein (eg, number of molecules per cell) may be increased, for example, 1.5-fold or more, 2-fold or more, or 3-fold or more of that of the unmodified strain.
  • the above-mentioned method for increasing the activity of a protein can be used to enhance the activity of an arbitrary protein or the expression of an arbitrary gene.
  • Reduced protein activity means that the activity of the protein is reduced as compared with the unmodified strain.
  • reducing the activity of a protein specifically, it means that the activity of the protein per cell is reduced as compared with the unmodified strain.
  • the term "unmodified strain” as used herein means a control strain that has not been modified to reduce the activity of the target protein. Examples of the unmodified strain include wild strains and parent strains. Specific examples of the unmodified strain include a reference strain (type strain) of each bacterial species. Further, as the unmodified strain, specifically, the strain exemplified in the description of the bacterium can be mentioned.
  • the activity of the protein may be reduced as compared to the reference strain (ie, the reference strain of the species to which the bacterium of the invention belongs). Moreover, in another embodiment, the activity of the protein may be reduced as compared with the C. glutamicum ATCC 13869 strain. Moreover, in another embodiment, the activity of the protein may be reduced as compared with the C. glutamicum ATCC 13032 strain. Further, in another embodiment, the activity of the protein may be reduced as compared with C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734). Moreover, in another embodiment, the activity of the protein may be reduced as compared with the C. glutamicum YDK010 strain.
  • the reference strain ie, the reference strain of the species to which the bacterium of the invention belongs.
  • the activity of the protein may be reduced as compared with the C. glutamicum ATCC 13869 strain.
  • the activity of the protein may be reduced as compared with the C. glutamicum ATCC 13032 strain.
  • the activity of the protein may
  • decreasing the activity of a protein includes the case where the activity of the protein is completely lost. More specifically, “reduced protein activity” means that the number of molecules of the protein per cell is reduced as compared with the unmodified strain, and / or per molecule of the protein. It may mean that the function is deteriorated. That is, the "activity” in the case of “decreasing the activity of a protein” means not only the catalytic activity of the protein but also the transcription amount (mRNA amount) or the translation amount (protein amount) of the gene encoding the protein. May be.
  • the “number of molecules of the protein per cell” may mean the average value of the number of molecules of the protein per cell.
  • the number of molecules of a protein per cell is reduced includes the case where the protein does not exist at all.
  • the function of a protein per molecule is reduced also includes the case where the function of the protein per molecule is completely lost.
  • the degree of decrease in protein activity is not particularly limited as long as the protein activity is decreased as compared with the unmodified strain.
  • the activity of the protein may be reduced, for example, to 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of the unmodified strain.
  • Modifications that reduce the activity of the protein can be achieved, for example, by reducing the expression of the gene encoding the protein.
  • “Reduced gene expression” means that the expression of the gene is reduced as compared with unmodified strains such as wild-type strains and parent strains.
  • “Reduced gene expression” specifically means that the per-cell expression level of the gene is reduced as compared with the unmodified strain.
  • the "expression level of a gene per cell” may mean the average value of the expression level of the gene per cell.
  • Reduced gene expression means, more specifically, a decrease in the transcription amount (mRNA amount) of a gene and / or a decrease in the translation amount (protein amount) of a gene. It's okay.
  • Reduced expression of a gene includes the case where the gene is not expressed at all. It should be noted that “decreased gene expression” is also referred to as “weakened gene expression”. Gene expression may be reduced, for example, to 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of the unmodified strain.
  • the decrease in gene expression may be due to, for example, a decrease in transcription efficiency, a decrease in translation efficiency, or a combination thereof.
  • Decreased gene expression is, for example, modifying expression regulatory sequences such as the gene promoter, Shine-Dalgarno (SD) sequence (also referred to as ribosome binding site (RBS)), and the spacer region between the RBS and the start codon. Can be achieved by.
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding site
  • the expression regulatory sequence is preferably modified at 1 base or more, more preferably 2 bases or more, and particularly preferably 3 bases or more.
  • the reduction in transcription efficiency of a gene can be achieved, for example, by replacing the promoter of the gene on the chromosome with a weaker promoter.
  • weaker promoter is meant a promoter in which transcription of a gene is weaker than the native wild-type promoter.
  • Weaker promoters include, for example, inducible promoters. That is, an inducible promoter can function as a weaker promoter under non-inducible conditions (eg, in the absence of an inducer).
  • a part or all of the region of the expression regulatory sequence may be deleted (deleted).
  • the decrease in gene expression can also be achieved by, for example, manipulating factors involved in expression control. Examples of factors involved in expression control include small molecules (inducing substances, inhibitors, etc.), proteins (transcription factors, etc.), nucleic acids (siRNA, etc.) involved in transcription and translation control.
  • the reduction in gene expression can also be achieved, for example, by introducing a mutation into the coding region of the gene that reduces the expression of the gene.
  • codons in the coding region of a gene can be replaced with synonymous codons that are used less frequently in the host to reduce gene expression.
  • gene expression itself may decrease due to gene disruption as described later.
  • modifications that reduce the activity of the protein can be achieved, for example, by destroying the gene encoding the protein.
  • Gene disruption means that the gene is modified so that it does not produce a normally functioning protein.
  • Do not produce a normally functioning protein means that no protein is produced from the gene, or that the gene produces a protein whose per-molecule function (for example, activity or property) is reduced or eliminated. Included.
  • Gene destruction can be achieved, for example, by deleting (deficient) a gene on a chromosome.
  • Gene deletion means deletion of a part or all of the coding region of a gene.
  • the entire gene may be deleted, including the sequences before and after the coding region of the gene on the chromosome.
  • the sequences before and after the coding region of the gene may include, for example, the expression regulatory sequence of the gene.
  • the regions to be deleted include N-terminal regions (regions encoding the N-terminal side of the protein), internal regions, C-terminal regions (regions encoding the C-terminal side of the protein), and the like. It may be any region.
  • the longer the region to be deleted the more reliable the gene can be inactivated.
  • the region to be deleted is, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more of the total length of the coding region of the gene. Alternatively, it may be a region having a length of 95% or more. Further, it is preferable that the reading frames do not match in the sequences before and after the region to be deleted. Reading frame mismatches can result in frameshifts downstream of the region to be deleted.
  • Gene disruption can be, for example, by introducing an amino acid substitution (missense mutation) into the coding region of a gene on a chromosome, by introducing a stop codon (nonsense mutation), or by adding or deleting one or two bases (a nonsense mutation). It can also be achieved by introducing a frameshift mutation (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 26 116 , 20833-20839 (1991)).
  • gene disruption can be achieved, for example, by inserting another base sequence into the coding region of the gene on the chromosome.
  • the insertion site may be any region of the gene, but the longer the base sequence to be inserted, the more reliable the gene can be inactivated. Further, it is preferable that the reading frames do not match in the arrangement before and after the insertion site. A frameshift can occur downstream of the insertion site due to a leading frame mismatch.
  • the other base sequence is not particularly limited as long as it reduces or eliminates the activity of the encoded protein, and examples thereof include a marker gene such as an antibiotic resistance gene and a gene useful for producing a target substance.
  • Gene disruption may be carried out, in particular, so that the amino acid sequence of the encoded protein is deleted (deleted).
  • modifications that reduce the activity of a protein include, specifically, by deleting the amino acid sequence (a part or all of a region of the amino acid sequence) of the protein, specifically, an amino acid sequence (one of the amino acid sequences). This can be achieved by modifying the gene to encode a protein lacking (part or all regions).
  • deletion of amino acid sequence of protein means deletion of a part or all region of amino acid sequence of protein.
  • “deletion of amino acid sequence of protein” means that the original amino acid sequence does not exist in the protein, and includes the case where the original amino acid sequence is changed to another amino acid sequence.
  • a region changed to another amino acid sequence due to a frame shift may be regarded as a deleted region.
  • Deletion of the amino acid sequence of a protein typically shortens the overall length of the protein, but the overall length of the protein may not change or may be extended.
  • the region encoded by the deleted region can be deleted in the amino acid sequence of the encoded protein.
  • the region encoded by the region downstream from the introduction site can be deleted in the amino acid sequence of the encoded protein.
  • a frameshift in a gene coding region can cause a region encoded by the frameshift site to be deleted.
  • the description of the position and length of the region to be deleted in the deletion of the gene can be applied mutatis mutandis.
  • Modification of a gene on a chromosome as described above is, for example, to prepare a disrupted gene modified so as not to produce a normally functioning protein, and transform the host with recombinant DNA containing the disrupted gene.
  • This can be achieved by substituting the wild gene on the chromosome with the disrupted gene by causing homologous recombination between the disrupted gene and the wild gene on the chromosome.
  • the disrupted gene includes a gene lacking a part or all of the coding region of the gene, a gene introduced with a missense mutation, a gene introduced with a nonsense mutation, a gene introduced with a frame shift mutation, a transposon, a marker gene, etc.
  • the gene into which the insertion sequence of is inserted can be mentioned. Even if the protein encoded by the disrupted gene is produced, it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type protein, and its function is reduced or lost.
  • the structure of the recombinant DNA used for the homologous recombination is not particularly limited as long as the homologous recombination occurs in a desired embodiment.
  • the host in linear DNA containing a disrupted gene, the host is transformed with linear DNA having upstream and downstream sequences of the wild-type gene on the chromosome at both ends, respectively, upstream and downstream of the wild-type gene.
  • the wild-type gene can be replaced with the disruptive gene.
  • Gene disruption by gene replacement using such homologous recombination has already been established, and a method called "Red-driven integration" (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc) . Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645 (2000)), Red driven integration method and ⁇ phage-derived excision system (Cho, E. H., Gumport, R.
  • modifications that reduce the activity of the protein may be performed, for example, by mutation treatment.
  • Mutation treatments include X-ray irradiation, UV irradiation, and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethylmethanesulfonate (EMS), and methylmethanesulfonate (MMS). ), Etc., can be mentioned.
  • all of the plurality of subunits may be modified or only a part thereof may be modified as long as the activity of the protein is reduced as a result. .. That is, for example, all of the plurality of genes encoding those subunits may be destroyed, or only a part of them may be destroyed.
  • all the activities of the plurality of isozymes may be reduced or only a part of the activities may be reduced as long as the activity of the protein is reduced as a result. That is, for example, all of the plurality of genes encoding these isozymes may be destroyed, or only a part of them may be destroyed.
  • the above-mentioned method for reducing the activity of a protein may be used alone or in any combination.
  • the decrease in protein activity can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • the decrease in protein activity can also be confirmed by confirming that the expression of the gene encoding the protein has decreased.
  • the decrease in gene expression can be confirmed by confirming that the transcription amount of the gene has decreased and confirming that the amount of protein expressed from the gene has decreased.
  • RNA-seq RNA-seq
  • the amount of mRNA may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of the unmodified strain.
  • the amount of protein (eg, number of molecules per cell) may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of the unmodified strain.
  • the gene has been disrupted by determining the base sequence of a part or all of the gene, the restriction enzyme map, the total length, etc., depending on the means used for the disruption.
  • the above-mentioned method for reducing the activity of a protein can be used to reduce the activity of an arbitrary protein or the expression of an arbitrary gene.
  • the method of the present invention comprises culturing the bacterium of the present invention in a medium and accumulating the L-amino acid in the medium and / or in the cells of the bacterium.
  • a method for producing an L-amino acid which comprises collecting the L-amino acid from a medium and / or the bacterium.
  • the L-amino acid is as described above. In the present invention, one type of L-amino acid may be produced, or two or more types of L-amino acid may be produced.
  • the medium used is not particularly limited as long as the bacterium of the present invention can grow and the desired L-amino acid is produced.
  • a normal medium used for culturing bacteria such as coryneform bacteria can be used.
  • a medium containing a carbon source, a nitrogen source, a phosphoric acid source, a sulfur source, and other components selected from various organic components and inorganic components can be used, if necessary.
  • the type and concentration of the medium component may be appropriately set according to various conditions such as the type of bacteria used.
  • the carbon source include sugars such as glucose, fructose, sucrose, lactose, galactose, xylose, arabinose, waste sugar honey, starch hydrolyzate, and biomass hydrolyzate, acetic acid, fumaric acid, and citric acid.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, lactose, galactose, xylose, arabinose, waste sugar honey, starch hydrolyzate, and biomass hydrolyzate, acetic acid, fumaric acid, and citric acid.
  • organic acids such as succinic acid, alcohols such as glycerol, crude glycerol and ethanol, and fatty acids.
  • carbon sources include sugars.
  • Carbon sources include, more particularly, glucose and fructose.
  • Sugars such as glucose and fructose may be used as carbon sources alone or in combination with other carbon sources.
  • a sugar having fructose as a constituent sugar may be used.
  • sugars having fructose as a constituent sugar include fructose, sucrose, and fructooligosaccharides.
  • the sugar containing fructose as a constituent sugar may be used as a carbon source alone or in combination with other carbon sources.
  • a plant-derived raw material can be preferably used. Plants include, for example, corn, rice, wheat, soybeans, sugar cane, beets and cotton. Examples of plant-derived raw materials include organs such as roots, stems, trunks, branches, leaves, flowers, and seeds, plants containing them, and decomposition products of those plant organs.
  • the form of use of the plant-derived raw material is not particularly limited, and for example, any form such as an unprocessed product, a squeezed juice, a crushed product, and a refined product can be used.
  • pentacarbon sugar such as xylose, hexacarbonate sugar such as glucose, or a mixture thereof can be obtained from, for example, plant biomass and used.
  • these saccharides can be obtained by subjecting plant biomass to treatments such as steam treatment, concentrated acid hydrolysis, dilute acid hydrolysis, hydrolysis with an enzyme such as cellulase, and alkali treatment.
  • hemicellulose is generally more easily hydrolyzed than cellulose
  • hemicellulose in plant biomass may be hydrolyzed in advance to liberate pentacarbonate sugar, and then cellulose may be hydrolyzed to produce hexacarbonate sugar.
  • xylose may be supplied, for example, by having the bacterium of the present invention possess a conversion route from hexacarbonate sugar such as glucose to xylose and converting from hexacarbonate sugar.
  • the carbon source one type of carbon source may be used, or two or more types of carbon sources may be used in combination.
  • the nitrogen source include ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, meat extract and soybean protein decomposition products, ammonia and urea.
  • Ammonia gas or ammonia water used for pH adjustment may be used as a nitrogen source.
  • the nitrogen source one type of nitrogen source may be used, or two or more types of nitrogen sources may be used in combination.
  • the phosphoric acid source examples include phosphates such as potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate, and phosphoric acid polymers such as pyrophosphoric acid.
  • phosphates such as potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate
  • phosphoric acid polymers such as pyrophosphoric acid.
  • the phosphoric acid source one kind of phosphoric acid source may be used, or two or more kinds of phosphoric acid sources may be used in combination.
  • the sulfur source include inorganic sulfur compounds such as sulfates, thiosulfates and sulfites, and sulfur-containing amino acids such as cysteine, cystine and glutathione.
  • the sulfur source one type of sulfur source may be used, or two or more types of sulfur sources may be used in combination.
  • organic and inorganic components include inorganic salts such as sodium chloride and potassium chloride; trace metals such as iron, manganese, magnesium and calcium; vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6 and nicotine. Vitamins such as acids, nicotinic acid amides and vitamin B12; amino acids; nucleic acids; organic components such as peptone, casamino acid, yeast extract and soybean protein degradation products containing these can be mentioned. As various other organic components and inorganic components, one kind of component may be used, or two or more kinds of components may be used in combination.
  • biotin in the medium It is also preferable to limit the amount of biotin in the medium and to add a surfactant or penicillin to the medium.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as the bacterium of the present invention can grow and the desired L-amino acid is produced. Culturing can be carried out under normal conditions used for culturing bacteria such as coryneform bacteria.
  • the culture conditions may be appropriately set according to various conditions such as the type of bacteria used.
  • Culturing can be performed using a liquid medium.
  • the bacterium of the present invention cultured in a solid medium such as an agar medium may be directly inoculated into a liquid medium, or the bacterium of the present invention seed-cultured in a liquid medium may be used as a liquid for main culture. It may be inoculated into the medium. That is, the culture may be divided into a seed culture and a main culture. In that case, the culture conditions of the seed culture and the main culture may or may not be the same.
  • the amount of the bacterium of the present invention contained in the medium at the start of culturing is not particularly limited.
  • the main culture may be carried out, for example, by inoculating the medium of the main culture with 1 to 50% (v / v) of the seed culture solution.
  • the culture can be carried out by batch culture (batch culture), fed-batch culture (Fed-batch culture), continuous culture (continuous culture), or a combination thereof.
  • the medium at the start of culture is also referred to as "initial medium”.
  • the medium supplied to the culture system (fermenter) in fed-batch culture or continuous culture is also referred to as "fed-batch medium”.
  • supplying a fed-batch medium to a culture system in fed-batch culture or continuous culture is also referred to as "fed-batch”.
  • both the seed culture and the main culture may be carried out by batch culture.
  • seed culture may be performed by batch culture
  • main culture may be performed by fed-batch culture or continuous culture.
  • each medium component may be contained in the initial medium, the fed-batch medium, or both.
  • the type of component contained in the initial medium may or may not be the same as the type of component contained in the fed-batch medium.
  • the concentration of each component contained in the initial medium may or may not be the same as the concentration of each component contained in the fed-batch medium.
  • two or more fed-batch media having different types and / or concentrations of the contained components may be used. For example, when multiple feedings are performed intermittently, the types and / or concentrations of the components contained in each feeding medium may or may not be the same.
  • the concentration of the carbon source in the medium is not particularly limited as long as the bacterium of the present invention can grow and L-amino acids are produced.
  • the concentration of the carbon source in the medium may be, for example, as high as possible without inhibiting the production of L-amino acids.
  • the concentration of the carbon source in the medium may be, for example, 1 to 30 w / v%, preferably 3 to 10 w / v%, as the initial concentration (concentration in the initial medium).
  • an additional carbon source may be added to the medium as appropriate. For example, additional carbon sources may be added to the medium depending on the consumption of the carbon source as the fermentation progresses.
  • Culturing can be performed under aerobic conditions, for example.
  • the aerobic condition means that the dissolved oxygen concentration in the liquid medium is 0.33 ppm or more, which is the detection limit by the oxygen membrane electrode, and preferably 1.5 ppm or more.
  • the oxygen concentration may be controlled to, for example, about 5 to 50%, preferably about 10% with respect to the saturated oxygen concentration.
  • the culture under aerobic conditions can be performed by aeration culture, shaking culture, stirring culture, or a combination thereof.
  • the pH of the medium may be, for example, pH 3-10, preferably pH 4.0-9.5. During culturing, the pH of the medium can be adjusted as needed.
  • the pH of the medium is various alkaline or acidic substances such as ammonia gas, aqueous ammonia, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, etc. Can be adjusted using.
  • the culture temperature may be, for example, 20 to 40 ° C, preferably 25 ° C to 37 ° C.
  • the culture period may be, for example, 10 hours to 120 hours. Culturing may be continued, for example, until the carbon source in the medium is consumed, or until the activity of the bacterium of the invention is depleted. By culturing the bacterium of the present invention under such conditions, L-amino acids are accumulated in the medium and / or in the cells.
  • L-glutamic acid it is also possible to culture while precipitating L-glutamic acid in the medium using a liquid medium adjusted to the conditions for precipitating L-glutamic acid.
  • the conditions for precipitating L-glutamic acid include pH 5.0 to 4.0, preferably pH 4.5 to 4.0, more preferably pH 4.3 to 4.0, and particularly preferably pH 4.0 (EP1078989A).
  • crystallization can be performed more efficiently by adding pantothenic acid to the medium (WO2004 / 111258).
  • crystallization can be performed more efficiently by adding L-glutamic acid crystals as seed crystals to the medium (EP1233069A). Further, when a liquid medium adjusted to the condition for precipitating L-glutamic acid is used, crystallization can be performed more efficiently by adding L-glutamic acid crystals and L-lysine crystals as seed crystals to the medium (EP1624069A). ..
  • the culture step may be carried out so that the bicarbonate ion and / or the carbonate ion becomes a counter ion of the basic amino acid.
  • Such a form of fermentation is also referred to as "carbonate fermentation”.
  • basic amino acids can be fermented and produced while reducing the amount of sulfate ion and / or chloride ion conventionally used as counter ions of basic amino acids.
  • Carbonate fermentation can be carried out, for example, as described in US2002-025564A, EP1813677A, JP-A-2002-65287.
  • the fermented liquid can be treated with, for example, a liquid cyclone.
  • a liquid cyclone for example, one having a general shape and a cylindrical portion diameter of 10 to 110 mm, made of ceramic, stainless steel, or resin can be used.
  • the feed amount of the fermented liquid to the liquid cyclone can be set, for example, according to the cell concentration or the L-amino acid concentration in the fermented liquid.
  • the feed amount of the fermented liquid to the liquid cyclone may be, for example, 2 to 1200 L / min.
  • L-amino acid can be confirmed by a known method used for detection or identification of a compound.
  • Such techniques include, for example, HPLC, LC / MS, GC / MS, NMR. These methods can be used alone or in combination as appropriate.
  • Recovery of L-amino acids from the fermentation broth can be performed by a known method used for separation and purification of compounds.
  • a known method used for separation and purification of compounds examples include an ion exchange resin method (Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39 (16), 3691-3710), a precipitation method, and a membrane separation method (Japanese Patent Laid-Open No. 9-164323, JP-A-9-164323). Japanese Patent Laid-Open No. 9-173792), crystallization method (WO2008 / 078448, WO2008 / 078646) can be mentioned. These methods can be used alone or in combination as appropriate.
  • L-amino acids When L-amino acids are accumulated in the cells, for example, the supernatant obtained by crushing the cells by ultrasonic waves and removing the cells by centrifugation is subjected to L- by an ion exchange resin method or the like. Amino acids can be recovered.
  • the recovered L-amino acid may be a free form, a salt thereof, or a mixture thereof.
  • the salt include sulfates, hydrochlorides, carbonates, ammonium salts, sodium salts and potassium salts.
  • the recovered L-glutamic acid is specifically, for example, free-form L-glutamic acid, sodium L-glutamic acid (for example, monosodium L-glutamate; MSG), ammonium L-glutamate (for example, for example). It may be monoammonium L-glutamate) or a mixture thereof.
  • sodium L-glutamate (MSG) can be obtained by adding an acid to crystallize ammonium L-glutamate in a fermentation broth and adding equimolar sodium hydroxide to the crystals. Activated carbon may be added before and after crystallization to decolorize (see Industrial Crystallization of Monosodium Glutamic Acid, Journal of the Japan Society of Sea Water Science, Vol.
  • Sodium L-glutamate crystals can be used, for example, as an umami seasoning.
  • the sodium L-glutamate crystals may be mixed with nucleic acids such as sodium guanylate and sodium inosinate, which also have an umami taste, and used as a seasoning.
  • L-amino acid is deposited in the medium, it can be recovered by centrifugation, filtration, or the like. Further, the L-amino acid precipitated in the medium may be isolated together after crystallization of the L-amino acid dissolved in the medium.
  • the recovered L-amino acid may contain components such as bacterial cells, medium components, water, and bacterial metabolic by-products.
  • the L-amino acid may be purified to the desired degree.
  • the purity of the recovered L-amino acid may be, for example, 50% (w / w) or more, preferably 85% (w / w) or more, and particularly preferably 95% (w / w) or more (JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358, USP6,238,714, US2005 / 0025878).
  • CGBL_0125410 Construction of vector for poxB gene deletion 5'upstream of poxB gene (CGBL_0125410) encoding pyruvate dehydrogenase by PCR using chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC 13869 as a template and primers appropriately designed. Amplifies a DNA fragment of about 1 kbp and a DNA fragment of about 1 kbp downstream on the 3'side. By inserting the amplified DNA fragment into the SmaI site of pBS5T (WO2006 / 057450) by infusion reaction, a vector for poxB gene deletion is obtained.
  • ack gene expression vector DNA containing the ack gene (CGBL_0126910) encoding acetate kinase by PCR using the chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC 13869 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 19 and 20.
  • the fragment was amplified.
  • the amplified DNA fragment and pVK9 (US2006-0141588) cleaved with bamHI and pstI were ligated by an infusion reaction to obtain the ack gene expression vector pVK9-Plac ackA.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC 13869 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 21 and 22, and DNA containing the upstream sequence of the msrA gene derived from C. glutamicum (including the promoter region, 369 bp). The fragment was amplified.
  • a DNA fragment containing the ack gene (CGBL_0126910) was amplified by PCR using the chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC 13869 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 23 and 20.
  • pVS7-xfp is an expression vector for the phosphoketolase gene (xfp) derived from B. longum JCM1217 (US2018-0282773).
  • a control strain was obtained by introducing pVK9 alone or in combination with pVS7-xfp (US2018-0282773) into the C. glutamicum 2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * strain (WO2014 / 185430).
  • the C. glutamicum 2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * strain is an L-glutamic acid-producing strain derived from the C. glutamicum 2256 strain (ATCC 13869), lacks the ldhA and sucA genes, and has an IS mutation in the yggB gene (V419 :: IS).
  • the nucleotide sequence of this mutant yggB gene (V419 :: IS) and the amino acid sequence of the mutant YggB protein (V419 :: IS) encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 17 and 18, respectively.
  • L-glutamic acid production culture was carried out using each of the constructed strains (that is, the control strain and its ack gene expression-enhanced strain and glpX gene expression-enhanced strain).
  • the composition of the medium used is shown in Table 1.
  • a medium having a carbon source of Glucose is also referred to as "Glc medium”
  • a medium having a carbon source of Fructose is also referred to as "Frc medium”.
  • Each strain was inoculated into 5 mL of the above medium (including 50 g / L calcium carbonate) placed in a thick test tube, and cultured with shaking at 120 rpm using a box shaker (ABLE ML-190) at 31.5 ° C. Sampling of the culture medium was performed 25 or 30 hours after the start of the culture. The concentration of L-glutamic acid in the culture solution was quantified using a biotech analyzer AS-310 (Sakura SAI), and the yield of L-glutamic acid with respect to sugar was calculated.
  • ack gene expression-enhanced strains (2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * / pVK9-Plac ackA / pVS7-xfp, 2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * / pVK9-PmsrA ackA / pVS7- xfp , 2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * / pVK9-P ackA) is 2256 ⁇ sucA for the corresponding control strains (2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * / pVK9-Plac ackA / pVS7-xfp and 2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * / pVK9-PmsrA ackA / pVS7-xfp) when glucose is used as the carbon source .
  • the glpX gene expression-enhanced strain (2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * / pVK9-Plac glpX / pVS7-xfp) is higher than the corresponding control strain (2256 ⁇ sucA ⁇ ldhA yggB * / pVK9 / pVS7-xfp) when fructose is used as a carbon source. It showed a high amount of L-glutamic acid accumulated (Fig.
  • the L-glutamic acid production is improved by carrying out the L-glutamic acid production culture for the aspT gene-deficient strain, the malE gene-deficient strain, and the poxB gene-deficient strain in the same procedure.
  • the ability of coryneform bacteria to produce L-amino acids can be improved, and L-amino acids can be efficiently produced.
  • SEQ ID NO: 1 Base of aspT gene of Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of AspT protein of Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)
  • SEQ ID NO: 3 Base of malE gene of Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of MalE protein of Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)
  • SEQ ID NO: 5 Base sequence of poxB gene of Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)
  • SEQ ID NO: 6 PoxB protein of Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)
  • SEQ ID NO: 8 Ack protein of Ack

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Abstract

Ｌ－グルタミン酸等のＬ－アミノ酸の製造法を提供する。下記（A）～（E）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有するように改変されたＬ－アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養し、該培地および／または該細菌の菌体よりＬ－アミノ酸を採取することにより、Ｌ－アミノ酸を製造する： （A）酢酸キナーゼの活性が増大する改変； （B）フルクトース-1,6-ビスホスファターゼの活性が増大する改変； （C）ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が低下する改変； （D）アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性が低下する改変； （E）マリックエンザイムの活性が低下する改変。

Description

Ｌ－アミノ酸の製造法
　本発明は、細菌を用いた発酵法によるＬ－グルタミン酸等のＬ－アミノ酸の製造法に関する。Ｌ－アミノ酸は、調味料原料等として産業上有用である。
　Ｌ－アミノ酸は、例えば、Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌等の微生物を用いた発酵法により工業生産されている（非特許文献１）。そのような微生物としては、例えば、自然界から分離した菌株やそれらの変異株が用いられている。また、組換えＤＮＡ技術により微生物のＬ－アミノ酸生産能を向上させることができる。
明石邦彦ら著　アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５～２１５頁、１９８６年
　本発明は、細菌のＬ－アミノ酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なＬ－アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、下記（A）～（E）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有するようにコリネ型細菌を改変することにより同細菌のＬ－アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた：
（A）酢酸キナーゼ（acetate kinase）の活性が増大する改変；
（B）フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ（fructose 1,6-bisphosphatase）の活性が増大する改変；
（C）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase）の活性が低下する改変；
（D）アスパラギン酸トランスアミナーゼ（aspartate transaminase）の活性が低下する改変；
（E）マリックエンザイム（malic enzyme）の活性が低下する改変。
　すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
　Ｌ－アミノ酸の製造方法であって、
　Ｌ－アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にＬ－アミノ酸を蓄積すること、および
　前記培地および／または前記菌体より前記Ｌ－アミノ酸を採取すること、
　を含み、
　前記Ｌ－アミノ酸が、グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸であり、
　前記細菌が、下記（X）および／または（Y）の改変を有する、方法：
（X）ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変；
（Y）細胞内のオキサロ酢酸プールが増大する改変。
［２］
　前記細菌が、少なくとも、前記（X）の改変を有する、前記方法。
［３］
　前記方法であって、
　前記（X）の改変が、下記（A）、（B）、および（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変であり；
　前記（Y）の改変が、下記（D）および（E）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変である、方法：
（A）酢酸キナーゼの活性が増大する改変；
（B）フルクトース-1,6-ビスホスファターゼの活性が増大する改変；
（C）ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が低下する改変；
（D）アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性が低下する改変；
（E）マリックエンザイムの活性が低下する改変。
［４］
　Ｌ－アミノ酸の製造方法であって、
　Ｌ－アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にＬ－アミノ酸を蓄積すること、および
　前記培地および／または前記菌体より前記Ｌ－アミノ酸を採取すること、
　を含み、
　前記Ｌ－アミノ酸が、グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸であり、
　前記細菌が、下記（A）～（E）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、方法：
（A）酢酸キナーゼの活性が増大する改変；
（B）フルクトース-1,6-ビスホスファターゼの活性が増大する改変；
（C）ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が低下する改変；
（D）アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性が低下する改変；
（E）マリックエンザイムの活性が低下する改変。
［５］
　前記細菌が、少なくとも、前記（A）の改変を有する、前記方法。
［６］
　前記方法であって、
　前記アスパラギン酸トランスアミナーゼがaspT遺伝子にコードされ；
　前記マリックエンザイムがmalE遺伝子にコードされ；
　前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼがpoxB遺伝子にコードされ；
　前記酢酸キナーゼがack遺伝子にコードされ；且つ／又は
　前記フルクトース-1,6-ビスホスファターゼがglpX遺伝子にコードされる、方法。
［７］
　前記方法であって、
　前記アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性が、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
　前記マリックエンザイムの活性が、マリックエンザイムをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
　前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
　前記酢酸キナーゼの活性が、酢酸キナーゼをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大し；且つ／又は
　前記フルクトース-1,6-ビスホスファターゼの活性が、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大した、方法。
［８］
　前記方法であって、
　酢酸キナーゼをコードする遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇し；且つ／又は
　フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、方法。
［９］
　前記方法であって、
　前記アスパラギン酸トランスアミナーゼが、下記（１ａ）、（１ｂ）、または（１ｃ）に記載のタンパク質であり：
（１ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性を有するタンパク質；
（１ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性を有するタンパク質；
　前記マリックエンザイムが、下記（２ａ）、（２ｂ）、または（２ｃ）に記載のタンパク質であり：
（２ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、マリックエンザイム活性を有するタンパク質；
（２ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、マリックエンザイム活性を有するタンパク質；
　前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼが、下記（３ａ）、（３ｂ）、または（３ｃ）に記載のタンパク質であり：
（３ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（３ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
　前記酢酸キナーゼが、下記（４ａ）、（４ｂ）、または（４ｃ）に記載のタンパク質であり：
（４ａ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（４ｂ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質；
（４ｃ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質；且つ／又は
　前記フルクトース-1,6-ビスホスファターゼが、下記（５ａ）、（５ｂ）、または（５ｃ）に記載のタンパク質である、方法：
（５ａ）配列番号１２または１４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（５ｂ）配列番号１２または１４に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性を有するタンパク質；
（５ｃ）配列番号１２または１４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性を有するタンパク質。
［１０］
　前記細菌が、さらに、非改変株と比較して、ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変されている、前記方法。
［１１］
　前記ホスホケトラーゼが、Ｄ－キシルロース－５－リン酸ホスホケトラーゼおよび／またはフルクトース６－リン酸ホスホケトラーゼである、前記方法。
［１２］
　前記細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、前記方法。
［１３］
　前記細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記方法。
［１４］
　前記グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸が、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、およびＬ－オルニチンから選択される１種またはそれ以上のＬ－アミノ酸である、前記方法。
［１５］
　前記グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸が、Ｌ－グルタミン酸である、前記方法。
［１６］
　前記Ｌ－グルタミン酸が、Ｌ－グルタミン酸アンモニウムまたはＬ－グルタミン酸ナトリウムである、前記方法。
グルコースを炭素源とした場合の対照株およびack遺伝子の発現増強株のＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す図。 グルコースを炭素源とした場合の対照株およびack遺伝子の発現増強株のＬ－グルタミン酸の対糖収率を示す図。 フルクトースを炭素源とした場合の対照株およびglpX遺伝子の発現増強株のＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す図。 グルコースを炭素源とした場合の対照株およびglpX遺伝子の発現増強株のＬ－グルタミン酸の対糖収率を示す図。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の方法は、Ｌ－アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にＬ－アミノ酸を蓄積すること、および前記培地および／または前記菌体より前記Ｌ－アミノ酸を採取すること、を含むＬ－アミノ酸の製造方法であって、前記細菌が特定の性質を有するように改変されている、方法である。同方法に用いられる細菌を、「本発明の細菌」ともいう。
＜１＞本発明の細菌
　本発明の細菌は、特定の性質を有するように改変された、Ｌ－アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌である。
＜１－１＞Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌
　本発明において、「Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするＬ－アミノ酸を生成し、回収できる程度に培地中および／または菌体内に蓄積する能力を有する細菌をいう。Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするＬ－アミノ酸を培地中および／または菌体内に蓄積することができる細菌であってよい。「非改変株」とは、特定の性質を有するように改変されていない対照株をいう。すなわち、非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的とするＬ－アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
　本発明において製造されるＬ－アミノ酸は、グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸（L-amino acid of glutamate family）である。「グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸」とは、Ｌ－グルタミン酸、およびＬ－グルタミン酸を中間体として生合成されるＬ－アミノ酸の総称である。Ｌ－グルタミン酸を中間体として生合成されるＬ－アミノ酸としては、Ｌ－グルタミン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－オルニチンが挙げられる。グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸としては、特に、Ｌ－グルタミン酸が挙げられる。本発明の細菌は、１種のＬ－アミノ酸の生産能のみを有していてもよく、２種またはそれ以上のＬ－アミノ酸の生産能を有していてもよい。
　本発明において、「アミノ酸」という用語は、特記しない限り、Ｌ－アミノ酸を意味する。また、本発明において、「Ｌ－アミノ酸」という用語は、特記しない限り、フリー体のＬ－アミノ酸、その塩、またはそれらの混合物を意味する。塩については後述する。
　コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属等の属に属する細菌が挙げられる。
　コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・クレナタム（Corynebacterium crenatum）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
　コリネ型細菌としては、特に、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（旧名称：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum））が挙げられる。
　コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
　コリネ型細菌として、さらに特には、Brevibacterium lactofermentum (新名称：Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869が挙げられる。
　なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
　これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
　本発明の細菌は、本来的にＬ－アミノ酸生産能を有するものであってもよく、Ｌ－アミノ酸生産能を有するように改変されたものであってもよい。Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にＬ－アミノ酸生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のＬ－アミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。
　Ｌ－アミノ酸生産能の付与又は増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７～１００頁参照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ－アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ－アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。Ｌ－アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、Ｌ－アミノ酸生産菌の育種において、活性が増強されるＬ－アミノ酸生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
　Ｌ－アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つＬ－アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
　また、Ｌ－アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ－アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935やEP1010755A等に記載されている。酵素活性を増強する詳細な手法については後述する。
　また、Ｌ－アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ－アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ－アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的のＬ－アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ－アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性を低下させる手法については後述する。
　以下、Ｌ－アミノ酸生産菌、およびＬ－アミノ酸生産能を付与又は増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するようなＬ－アミノ酸生産菌が有する性質およびＬ－アミノ酸生産能を付与又は増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。
＜Ｌ－グルタミン酸生産菌＞
　Ｌ－グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ－グルタミン酸生合成系酵素から選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ（glnA）、グルタミン酸シンターゼ（gltBD）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（icdA）、アコニテートヒドラターゼ（acnA, acnB）、クエン酸シンターゼ（gltA）、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyc）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（aceEF, lpdA）、ピルビン酸キナーゼ（pykA, pykF）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ppsA）、エノラーゼ（eno）、ホスホグリセロムターゼ（pgmA, pgmI）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（pgk）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（gapA）、トリオースリン酸イソメラーゼ（tpiA）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（fbp）、グルコースリン酸イソメラーゼ（pgi）、６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（edd）、２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ（eda）、トランスヒドロゲナーゼ（pntAB）が挙げられる。なお、カッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の一例である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼから選択される１種またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。
　グルタミン酸シンターゼ遺伝子（gltBD）の発現が増大するように改変されたコリネ型細菌としては、WO99/07853に開示されたものが挙げられる。
　また、Ｌ－グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ－グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ－グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、イソクエン酸リアーゼ（aceA）、α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA, odhA）、アセト乳酸シンターゼ（ilvI）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（pfl）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ldh）、アルコールデヒドロゲナーゼ（adh）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（gadAB）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（sdhABCD）が挙げられる。これらの酵素の中では、例えば、α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
　α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したコリネ型細菌、及びそれらの取得方法は、WO2008/075483に記載されている。α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したコリネ型細菌として、具体的には、例えば、下記の株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium lactofermentum）L30-2株（特開2006-340603）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium lactofermentum）ΔS株（WO95/34672）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium lactofermentum）AJ12821（FERM BP-4172；フランス特許第9401748号公報）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ12822（FERM BP-4173；フランス特許第9401748号公報）
Corynebacterium glutamicum AJ12823（FERM BP-4174；フランス特許第9401748号公報）
　また、Ｌ－グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA）活性およびコハク酸デヒドロゲナーゼ（sdh）活性の両方が低下または欠損した株も挙げられる（特開2010-041920）。そのような株として、具体的には、例えば、Corynebacterium glutamicum ATCC14067株のodhAsdhA二重欠損株（Corynebacterium glutamicum 8L3GΔSDH株）が挙げられる（特開2010-041920）。
　また、Ｌ－グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、yhfK遺伝子（WO2005/085419）やybjL遺伝子（WO2008/133161）等のＬ－グルタミン酸排出遺伝子の発現を増強することも挙げられる。
　また、コリネ型細菌について、Ｌ－グルタミン酸生産能を付与又は増強する方法としては、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。そのような方法として、具体的には、例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロン類またはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）が挙げられる。
　このような耐性菌または感受性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ3949（FERM BP-2632；特開昭50-113209）
Corynebacterium glutamicum AJ11628（FERM P-5736；特開昭57-065198）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ11355（FERM P-5007；特開昭56-1889）
Corynebacterium glutamicum AJ11368（FERM P-5020；特開昭56-1889）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ11217（FERM P-4318；特開昭57-2689）
Corynebacterium glutamicum AJ11218（FERM P-4319；特開昭57-2689）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ11564（FERM P-5472；特開昭56-140895）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ11439（FERM P-5136；特開昭56-35981）
Corynebacterium glutamicum H7684（FERM BP-3004；特開平04-88994）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium lactofermentum）AJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890）
Corynebacterium glutamicum AJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium lactofermentum）AJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192）
　また、コリネ型細菌について、Ｌ－グルタミン酸生産能を付与又は増強する方法としては、yggB遺伝子の発現を増強する方法やコード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法も挙げられる（WO2006/070944）。すなわち、本発明の細菌は、yggB遺伝子の発現が増大するように改変されていてもよく、変異型yggB遺伝子を保持する（有する）ように改変されていてもよい。
　yggB遺伝子は、メカノセンシティブチャネル（mechanosensitive channel）をコードする遺伝子である。yggB遺伝子としては、コリネ型細菌のyggB遺伝子が挙げられる。コリネ型細菌のyggB遺伝子として、具体的には、例えば、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14967、Corynebacterium melassecola ATCC17965のyggB遺伝子が挙げられる（WO2006/070944）。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank Accession No. NC_003450で登録されているゲノム配列中、1,336,091～1,337,692の配列の相補配列に相当し、NCgl1221とも呼ばれる。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子にコードされるYggBタンパク質は、GenBank accession No. NP_600492として登録されている。また、Corynebacterium glutamicum 2256（ATCC 13869）のyggB遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするYggBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５および１６に示す。
　本発明において、後述する「特定の変異」を有するyggB遺伝子を変異型yggB遺伝子、それによりコードされるタンパク質を変異型YggBタンパク質ともいう。また、本発明において、後述する「特定の変異」を有さないyggB遺伝子を野生型yggB遺伝子、それによりコードされるタンパク質を野生型YggBタンパク質ともいう。なお、YggBタンパク質にあっては、yggB遺伝子における「特定の変異」により引き起こされるアミノ酸配列の変化を「特定の変異」ともいう。ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。野生型YggBタンパク質としては、上記例示したYggBタンパク質、例えば配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、が挙げられる。また、野生型YggBタンパク質としては、上記例示したYggBタンパク質の保存的バリアント（元の機能が維持されたバリアント）であって、「特定の変異」を有しないものも挙げられる。YggBタンパク質についての「元の機能」とは、例えば、メカノセンシティブチャネル（mechanosensitive channel）としての機能であってもよく、コリネ型細菌において発現を上昇させた際にコリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させる性質であってもよい。
　「特定の変異」は、上述したような野生型YggBタンパク質のアミノ酸配列を変化させ、コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させる変異であれば、特に制限されない。「特定の変異」としては、C末端側変異や膜貫通領域の変異が挙げられる（WO2006/070944）。また、「特定の変異」は、それらの変異の組み合わせであってもよい。
（１）C末端側変異
　C末端側変異は、野生型yggB遺伝子中の、野生型YggBタンパク質の419～533位のアミノ酸残基をコードする領域における変異である。C末端側変異は、同領域中の１またはそれ以上の箇所に導入されてよい。C末端側変異により引き起こされるアミノ酸配列の変化の種類は特に制限されない。C末端側変異は、例えば、アミノ酸残基の置換（ミスセンス変異）、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、ストップコドンの出現（ナンセンス変異）、フレームシフト変異、またはそれらの組み合わせを引き起こすものであってよい。C末端側変異としては、例えば、インサーションシーケンス（以下、「IS」ともいう）やトランスポゾン等の塩基配列の挿入が好ましい。
（１－１）塩基配列の挿入
　C末端側変異としては、例えば、野生型YggBタンパク質の419位のバリン残基をコードする箇所に塩基配列が挿入される変異（2A-1型変異）が挙げられる。2A-1型変異は、例えば、野生型YggBタンパク質の419～533位のアミノ酸残基の一部または全部の欠失または置換を引き起こすものであってよい。2A-1型変異を有する変異型yggB遺伝子として、具体的には、例えば、配列番号１５の1255位の「G」の次にＩＳが挿入され、元の野生型YggBタンパク質（配列番号１６）よりも短い全長423アミノ残基の変異型YggBタンパク質をコードするyggB遺伝子が挙げられる。この変異型yggB遺伝子（V419::IS）の塩基配列、及び同遺伝子がコードする変異型YggBタンパク質（V419::IS）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および１８に示す。配列番号１７中、1～1269位が変異型YggBタンパク質（V419::IS）のＣＤＳである。変異型yggB遺伝子（V419::IS）を有するＬ－グルタミン酸生産菌として、具体的には、例えば、C. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*株（WO2014/185430）が挙げられる。
（１－２）プロリン残基の置換
　C末端側変異としては、例えば、野生型YggBタンパク質の419～533位に存在するプロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異も挙げられる。そのようなプロリン残基としては、野生型YggBタンパク質の424位、437位、453位、457位、462位、469位、484位、489位、497位、515位、529位、および533位のプロリン残基が挙げられる。中でも、424位および／または437位のプロリン残基を他のアミノ酸に置換するのが好ましい。「他のアミノ酸」は、プロリン以外の天然型アミノ酸であれば特に制限されない。「他のアミノ酸」としては、Lys、Glu、Thr、Val、Leu、Ile、Ser、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、Met、Phe、Trp、Tyr、Gly、Ala、Hisが挙げられる。例えば、424位のプロリン残基は、好ましくは疎水性アミノ酸（Ala、Gly、Val、Leu、またはIle）に置換されてよく、より好ましくは分岐鎖アミノ酸（Leu、Val、またはIle）に置換されてよい。また、例えば、437位のプロリン残基は、好ましくは側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Thr、Ser、またはTyr）に置換されてよく、より好ましくはSerに置換されてよい。
（２）膜貫通領域の変異
　YggBタンパク質は、５個の膜貫通領域を有していると推測される。膜貫通領域はそれぞれ、野生型YggBタンパク質の1～23位（第１膜貫通領域）、25～47位（第２膜貫通領域）、62～84位（第３膜貫通領域）、86～108位（第４膜貫通領域）、110～132位（第５膜貫通領域）のアミノ酸残基に相当する。膜貫通領域の変異は、野生型yggB遺伝子中の、これら膜貫通領域をコードする領域における変異である。膜貫通領域の変異は、同領域中の１またはそれ以上の箇所に導入されてよい。膜貫通領域の変異は、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入、又は逆位を引き起こすものであって、且つ、フレームシフト変異およびナンセンス変異を伴わないものが好ましい。「１若しくは数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。膜貫通領域の変異としては、野生型YggBタンパク質の、１４位のロイシン残基と１５位のトリプトファン残基間に１又は数個のアミノ酸（例えば、Cys-Ser-Leu）を挿入する変異、１００位のアラニン残基を他のアミノ酸残基（例えば、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Thr、Ser、またはTyr）、好ましくはThr）へ置換する変異、１１１位のアラニン残基を他のアミノ酸残基（例えば、Valまたは側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Thr、Ser、またはTyr）、好ましくはValまたはThr）へ置換する変異などが挙げられる。
　本発明において、「野生型YggBタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とは、特記しない限り、配列番号１６におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。アミノ酸配列における「Ｘ位」とは、同アミノ酸配列のN末端から数えてＸ番目の位置を意味し、N末端のアミノ酸残基が１位のアミノ酸残基である。なお、アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその絶対的な位置は前後することがある。例えば、「野生型YggBタンパク質の419位のアミノ酸残基」とは、配列番号１６における419位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味し、419位よりもN末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から418番目のアミノ酸残基が「野生型YggBタンパク質の419位のアミノ酸残基」であるものとする。また、419位よりもN末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、N末端から420番目のアミノ酸残基が「野生型YggBタンパク質の419位のアミノ酸残基」であるものとする。具体的には、例えば、Corynebacterium glutamicum ATCC14967株のYggBタンパク質においては、419～529位のアミノ酸残基が、野生型YggBタンパク質の419～533位のアミノ酸残基に相当する。
　任意のYggBタンパク質のアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号１６におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該YggBタンパク質のアミノ酸配列と配列番号１６のアミノ酸配列とのアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
　変異型yggB遺伝子は、野生型yggB遺伝子を上述の「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。ＤＮＡの改変は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、ＤＮＡの目的部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、変異型yggB遺伝子は、化学合成によっても取得できる。
　変異型yggB遺伝子を有するように細菌を改変することは、変異型yggB遺伝子を細菌に導入することにより達成できる。また、変異型yggB遺伝子を有するように細菌を改変することは、自然変異や変異原処理により細菌が有するyggB遺伝子に変異を導入することによっても達成できる。
　なお、Ｌ－グルタミン酸の生産能を付与又は増強する方法は、Ｌ－グルタミン酸を中間体として生合成されるＬ－アミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－オルニチン）の生産能を付与又は増強するためにも有効であり得る。すなわち、これらＬ－グルタミン酸を中間体として生合成されるＬ－アミノ酸の生産能を有する細菌は、上記のようなＬ－グルタミン酸生産菌が有する性質を適宜有していてよい。例えば、これらＬ－グルタミン酸を中間体として生合成されるＬ－アミノ酸の生産能を有する細菌は、α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼおよび／またはコハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されていてもよい。
＜Ｌ－グルタミン生産菌＞
　Ｌ－グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ－グルタミン生合成系酵素から選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）やグルタミンシンセターゼ（glnA）が挙げられる。なお、グルタミンシンセターゼの活性は、グルタミンアデニリルトランスフェラーゼ遺伝子（glnE）の破壊やPII制御タンパク質遺伝子（glnB）の破壊によって増強してもよい（EP1229121）。
　また、Ｌ－グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ－グルタミンの生合成経路から分岐してＬ－グルタミン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミナーゼが挙げられる。
　Ｌ－グルタミン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）および／またはグルタミンシンセターゼ（glnA）の活性を増強したコリネ型細菌（EP1229121, EP1424398）やグルタミナーゼ活性が低下したコリネ型細菌（特開2004-187684）が挙げられる。
　また、コリネ型細菌について、Ｌ－グルタミン生産能を付与又は増強する方法としては、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法（特開平3-232497）、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法（特開昭61-202694）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭56-151495）が挙げられる。Ｌ－グルタミン生産能を有するコリネ型細菌として、具体的には、例えば、以下の株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ11573（FERM P-5492；特開昭56-151495）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ11576（FERM BP-10381；特開昭56-151495）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ12212（FERM P-8123；特開昭61-202694）
＜Ｌ－プロリン生産菌＞
　Ｌ－プロリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ－プロリン生合成系酵素から選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、グルタミン酸－５－キナーゼ（proB）、γ‐グルタミル－リン酸レダクターゼ、ピロリン－５－カルボキシレートレダクターゼ（putA）が挙げられる。酵素活性の増強には、例えば、Ｌ－プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタミン酸－５－キナーゼをコードするproB遺伝子（ドイツ特許第3127361号）が好適に利用できる。
　また、Ｌ－プロリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ－プロリン分解に関与する酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、プロリンデヒドロゲナーゼやオルニチンアミノトランスフェラーゼが挙げられる。
＜Ｌ－アルギニン生産菌＞
　Ｌ－アルギニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ－アルギニン生合成系酵素から選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ－アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、Ｎ－アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF, argI）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）遺伝子としては、例えば、野生型の１５位～１９位に相当するアミノ酸残基が置換され、Ｌ－アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子を用いると好適である（EP1170361A）。
　また、Ｌ－アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株（US2002-0045223A）や細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株（US2005-0014236A）等のコリネ型細菌も挙げられる。
　また、Ｌ－アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノ酸アナログなどへの耐性を有するコリネ型細菌の変異株も挙げられる。そのような株としては、例えば、２－チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、またはＬ－トリプトファン要求性を有する株（特開昭54-44096）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸、又はモノフルオロ酢酸に耐性を有する株（特開昭57-18989）；アルギニノールに耐性を有する株（特公昭62-24075）；Ｘ－グアニジン（Ｘは脂肪鎖又はその誘導体）に耐性を有する株（特開平2-186995）；アルギニンヒドロキサメート及び６－アザウラシルに耐性を有する株（特開昭57-150381）が挙げられる。Ｌ－アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ11169（FERM BP-6892）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium lactofermentum）AJ12092（FERM BP-6906）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ11336（FERM BP-6893）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum）AJ11345（FERM BP-6894）
Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium lactofermentum）AJ12430（FERM BP-2228）
＜Ｌ－シトルリン生産菌およびＬ－オルニチン生産菌＞
　Ｌ－シトルリンおよびＬ－オルニチンは、Ｌ－アルギニン生合成経路における中間体である。よって、Ｌ－シトルリンおよび／またはＬ－オルニチンの生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ－アルギニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｌ－シトルリンについて、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ－アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、Ｎ－アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF, argI）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。また、そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｌ－オルニチンについて、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ－アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、Ｎ－アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）が挙げられる。
　また、Ｌ－シトルリン生産菌は、例えば、任意のＬ－アルギニン生産菌から、argG遺伝子にコードされるアルギニノコハク酸シンターゼの活性を低下させることにより容易に得ることができる。また、Ｌ－オルニチン生産菌は、例えば、任意のＬ－アルギニン生産菌から、argF及びargI両遺伝子によりコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの活性を低下させることにより容易に得ることができる。
　また、Ｌ－アミノ酸生産能を付与又は増強する方法としては、例えば、細菌の細胞からＬ－アミノ酸を排出する活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。Ｌ－アミノ酸を排出する活性は、例えば、Ｌ－アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。各種アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、b2682遺伝子（ygaZ）、b2683遺伝子（ygaH）、b1242遺伝子（ychE）、b3434遺伝子（yhgN）が挙げられる（特開2002-300874）。
　また、Ｌ－アミノ酸生産能を付与又は増強する方法としては、例えば、糖代謝に関与するタンパク質やエネルギー代謝に関与するタンパク質の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。
　糖代謝に関与するタンパク質としては、糖の取り込みに関与するタンパク質や解糖系酵素が挙げられる。糖代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、グルコース６－リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；WO01/02542）、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pyc；WO99/18228, EP1092776A）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；WO03/04598）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkB, fbp；WO03/04664）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB；WO03/008611）、フマラーゼ遺伝子（fum；WO01/02545）、non-PTSスクロース取り込み遺伝子（csc；EP1149911A）、スクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；米国特許第7,179,623号）が挙げられる。
　エネルギー代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB；米国特許第5,830,716号）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochrome bo type oxidase）遺伝子（cyoB；EP1070376A）が挙げられる。
　また、Ｌ－アミノ酸等の有用物質の生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、ホスホケトラーゼの活性が増大するように細菌を改変する方法も挙げられる（WO2006/016705）。すなわち、本発明の細菌は、ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変されていてよい。同方法は、特に、Ｌ－グルタミン酸等のグルタミン酸系Ｌ－アミノ酸の生産能を付与又は増強するために有効であり得る。ホスホケトラーゼとしては、Ｄ－キシルロース－５－リン酸－ホスホケトラーゼやフルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼが挙げられる。Ｄ－キシルロース－５－リン酸－ホスホケトラーゼ活性及びフルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ活性はいずれか一方を増強してもよいし、両方を増強してもよい。
　Ｄ－キシルロース－５－リン酸－ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、キシルロース－５－リン酸をグリセルアルデヒド－３－リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Goldberg, M.らの文献（Methods Enzymol., 9, 515-520 (1966)）またはL. Meileの文献（J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936）に記載の方法によって測定することができる。Ｄ－キシルロース－５－リン酸ホスホケトラーゼとしては、アセトバクター属、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、チオバチルス属、ストレプトコッカス属、メチロコッカス属、ブチリビブリオ属、またはフィブロバクター属に属する細菌や、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、ピキア属、ヤロウイア属、ハンセヌラ属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、トリコスポロン属、またはウィンゲア属に属する酵母のＤ－キシルロース－５－リン酸ホスホケトラーゼが挙げられる。Ｄ－キシルロース－５－リン酸ホスホケトラーゼおよびそれをコードする遺伝子の具体例は、WO2006/016705に開示されている。
　また、フルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、フルクトース６－リン酸をエリスロース－４－リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Racker, E.の文献（Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962)）またはL. Meileの文献（J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936）に記載の方法によって測定することができる。フルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼとしては、アセトバクター属、ビフィドバクテリウム属、クロロビウム属、ブルセラ属、メチロコッカス属、またはガードネレラ属に属する細菌や、ロドトルラ属、カンジダ属、サッカロミセス属等に属する酵母のフルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼが挙げられる。フルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼおよびそれをコードする遺伝子の具体例は、WO2006/016705に開示されている。
　両ホスホケトラーゼ活性が、単一の酵素（Ｄ－キシルロース－５－リン酸／フルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ）によって保持される場合もありうる。
　Ｌ－アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、例えば、上記例示した遺伝子およびタンパク質等の公知の遺伝子およびタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列を有していてよい。また、Ｌ－アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、上記例示した遺伝子およびタンパク質等の公知の遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントであってもよい。具体的には、例えば、Ｌ－アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されている限り、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、後述する標的遺伝子および標的タンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
＜１－２＞特定の性質
　本発明の細菌は、特定の性質を有するように改変されている。本発明の細菌は、Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌を、特定の性質を有するように改変することにより取得できる。また、本発明の細菌は、特定の性質を有するように細菌を改変した後に、Ｌ－アミノ酸生産能を付与または増強することによっても取得できる。なお、本発明の細菌は、特定の性質を有するように改変されたことにより、Ｌ－アミノ酸生産能を獲得したものであってもよい。本発明の細菌は、特定の性質を有するように改変されていることに加えて、例えば、上記のようなＬ－アミノ酸生産菌が有する性質を適宜有していてよい。本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
　特定の性質を有するように細菌を改変することによって、細菌のＬ－アミノ酸生産能を向上させることができ、すなわち同細菌によるＬ－アミノ酸生産を増大させることができる。「Ｌ－アミノ酸生産の増大」としては、Ｌ－アミノ酸の培地中での蓄積量の向上（増大）が挙げられる。
　特定の性質としては、細胞内のオキサロ酢酸（OAA）プールが増大する改変が挙げられる。「細胞内のオキサロ酢酸（OAA）プールが増大する」とは、細胞内のオキサロ酢酸（OAA）の蓄積量が増大することを意味してよい。
　また、特定の性質としては、ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変が挙げられる。「ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する」とは、ホスホケトラーゼ経路のフラックス（すなわち、ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の代謝量）が増大すること、および／または、ホスホケトラーゼ経路を経由して代謝された炭素源から生成し得る副生物の蓄積量が低下することを意味してよい。副生物としては、酢酸が挙げられる。酢酸は、例えば、ホスホケトラーゼ経路のフラックスの増大により蓄積し得る。ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変としては、ホスホケトラーゼ経路のフラックスが増大する改変や酢酸の資化性が向上する改変が挙げられる。
　また、特定の性質としては、以下の（A）～（E）の改変が挙げられる：
（A）酢酸キナーゼ（acetate kinase）の活性が増大する改変；
（B）フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ（fructose 1,6-bisphosphatase）の活性が増大する改変；
（C）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase）の活性が低下する改変；
（D）アスパラギン酸トランスアミナーゼ（aspartate transaminase）の活性が低下する改変；
（E）マリックエンザイム（malic enzyme）の活性が低下する改変。
　上記（D）および（E）の改変は、細胞内のオキサロ酢酸（OAA）プールが増大する改変の一例であり得る。上記（A）、（B）、および（C）の改変は、ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変の一例であり得る。上記（A）および（C）の改変は、具体的には、酢酸の資化性が向上する改変の一例であり得る。上記（B）の改変は、具体的には、ホスホケトラーゼ経路のフラックスが増大する改変の一例であり得る。
　本発明の細菌は、上記例示した性質から選択される１つまたはそれ以上の性質を有していてよい。
　本発明の細菌は、例えば、細胞内のオキサロ酢酸（OAA）プールが増大する改変および／またはホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変を有していてよい。本発明の細菌は、例えば、少なくとも、ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変を有していてよい。すなわち、本発明の細菌は、具体的には、例えば、細胞内のオキサロ酢酸（OAA）プールが増大する改変およびホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変の内、ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変のみを有していてもよく、ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変と細胞内のオキサロ酢酸（OAA）プールが増大する改変の組み合わせを有していてもよい。
　本発明の細菌は、例えば、細胞内のオキサロ酢酸（OAA）プールが増大する改変、ホスホケトラーゼ経路のフラックスが増大する改変、および／または酢酸の資化性が向上する改変を有していてよい。本発明の細菌は、例えば、少なくとも、酢酸の資化性が向上する改変を有していてよい。すなわち、本発明の細菌は、具体的には、例えば、細胞内のオキサロ酢酸（OAA）プールが増大する改変、ホスホケトラーゼ経路のフラックスが増大する改変、および酢酸の資化性が向上する改変の内、酢酸の資化性が向上する改変のみを有していてもよく、酢酸の資化性が向上する改変と細胞内のオキサロ酢酸（OAA）プールが増大する改変および／またはホスホケトラーゼ経路のフラックスが増大する改変の組み合わせを有していてもよい。
　本発明の細菌は、例えば、上記（A）～（E）の改変から選択される１つまたはそれ以上、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ全て、の改変を有していてよい。本発明の細菌は、具体的には、例えば、（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（A）＋（B）、（A）＋（C）、（A）＋（D）、（A）＋（E）、（B）＋（C）、（B）＋（D）、（B）＋（E）、（C）＋（D）、（C）＋（E）、（D）＋（E）、（A）＋（B）＋（C）、（A）＋（B）＋（D）、（A）＋（B）＋（E）、（A）＋（C）＋（D）、（A）＋（D）＋（E）、（B）＋（C）＋（D）、（B）＋（C）＋（E）、（B）＋（D）＋（E）、（C）＋（D）＋（E）、（A）＋（B）＋（C）＋（D）、（A）＋（B）＋（C）＋（E）、（A）＋（B）＋（D）＋（E）、（A）＋（C）＋（D）＋（E）、（B）＋（C）＋（D）＋（E）、（A）＋（B）＋（C）＋（D）＋（E）の改変を有していてよい。「（A）＋（B）の改変」とは、（A）の改変と（B）の改変の組み合わせを意味する。この説明は、他の組み合わせにも準用できる。本発明の細菌は、例えば、少なくとも、上記（A）の改変を有していてよい。すなわち、本発明の細菌は、具体的には、例えば、上記（A）～（E）の改変の内、上記（A）の改変のみを有していてもよく、上記（A）の改変と上記（B）～（E）の改変から選択される１つまたはそれ以上、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ全て、の改変の組み合わせを有していてもよい。また、本発明の細菌は、例えば、少なくとも、上記（B）の改変を有していてもよい。
　「アスパラギン酸トランスアミナーゼ（aspartate transaminase）」とは、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸のアミノ基転移反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（例えば、EC 2.6.1.1）。同活性を、「アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性」ともいう。アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性は、具体的には、Ｌ－アスパラギン酸とα－ケトグルタル酸をオキサロ酢酸とＬ－グルタミン酸に変換する反応および／またはその逆反応を触媒する活性であってよい。アスパラギン酸トランスアミナーゼを、「グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（glutamic-oxaloacetic transaminase）」ともいう。アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子を「アスパラギン酸トランスアミナーゼ遺伝子」ともいう。アスパラギン酸トランスアミナーゼ遺伝子としては、aspT遺伝子が挙げられる。改変される細菌が有するaspT遺伝子等のアスパラギン酸トランスアミナーゼ遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるAspTタンパク質等のアスパラギン酸トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、例えば、NCBI等の公開データベースから取得できる。Corynebacterium glutamicum ATCC 13869のaspT遺伝子（CGBL_0102840）の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。
　「マリックエンザイム（malic enzyme）」とは、リンゴ酸の酸化的脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（例えば、EC EC 1.1.1.38、EC 1.1.1.39、またはEC 1.1.1.40）。同活性を、「マリックエンザイム活性」ともいう。マリックエンザイム活性は、具体的には、電子受容体の存在下でリンゴ酸を脱炭酸してピルビン酸を生成する反応を触媒する活性であってよい。電子受容体としては、ＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋が挙げられる。マリックエンザイムは、少なくとも１つの電子受容体を利用できればよい。マリックエンザイムは、さらに、オキサロ酢酸の脱炭酸反応（具体的には、オキサロ酢酸をピルビン酸と二酸化炭素に変換する反応）を触媒する活性を有していてもよい。マリックエンザイムを「リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）」ともいう。マリックエンザイムをコードする遺伝子を「マリックエンザイム遺伝子」ともいう。マリックエンザイム遺伝子としては、malE遺伝子が挙げられる。改変される細菌が有するmalE遺伝子等のマリックエンザイム遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるMalEタンパク質等のマリックエンザイムのアミノ酸配列は、例えば、NCBI等の公開データベースから取得できる。Corynebacterium glutamicum ATCC 13869のmalE遺伝子（CGBL_0129850）の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および４に示す。
　「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase）」とは、ピルビン酸の酸化的脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（例えば、EC 1.2.5.1）。同活性を、「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」ともいう。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は、具体的には、電子受容体の存在下でピルビン酸を脱炭酸して酢酸を生成する反応を触媒する活性であってよい。電子受容体としては、ユビキノン等のキノンが挙げられる。ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、少なくとも１つの電子受容体を利用できればよい。ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」ともいう。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、poxB遺伝子が挙げられる。改変される細菌が有するpoxB遺伝子等のピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるPoxBタンパク質等のピルビン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、例えば、NCBI等の公開データベースから取得できる。Corynebacterium glutamicum ATCC 13869のpoxB遺伝子（CGBL_0125410）の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５および６に示す。
　「酢酸キナーゼ（acetate kinase）」とは、酢酸のリン酸化反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（例えば、EC 2.7.2.1）。同活性を、「酢酸キナーゼ活性」ともいう。酢酸キナーゼ活性は、具体的には、リン酸基供与体の存在下で酢酸をリン酸化してアセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性であってよい。リン酸基供与体としては、ATPが挙げられる。酢酸キナーゼは、少なくとも１つのリン酸基供与体を利用できればよい。酢酸キナーゼをコードする遺伝子を「酢酸キナーゼ遺伝子」ともいう。酢酸キナーゼ遺伝子としては、ack遺伝子が挙げられる。ack遺伝子等の酢酸キナーゼ遺伝子としては、コリネ型細菌や腸内細菌科に属する細菌等の各種生物の遺伝子が挙げられる。ack遺伝子として、具体的には、Corynebacterium glutamicumやE. coliのack遺伝子が挙げられる。各種生物のack遺伝子等の酢酸キナーゼ遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるAckタンパク質等の酢酸キナーゼのアミノ酸配列は、例えば、NCBI等の公開データベースから取得できる。Corynebacterium glutamicum ATCC 13869のack遺伝子（CGBL_0126910）の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および８に示す。E. coli MG1655のack遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９および１０に示す。
　「フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ（fructose 1,6-bisphosphatase）」とは、フルクトース-1,6-ビスリン酸の脱リン酸化反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（例えば、EC 3.1.3.11）。同活性を、「フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性」ともいう。フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性は、具体的には、フルクトース-1,6-ビスリン酸をフルクトース-6-リン酸に変換する反応を触媒する活性であってよい。フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする遺伝子を「フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ遺伝子」ともいう。フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ遺伝子としては、glpX遺伝子が挙げられる。glpX遺伝子等のフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ遺伝子としては、コリネ型細菌や腸内細菌科に属する細菌等の各種生物の遺伝子が挙げられる。glpX遺伝子として、具体的には、Corynebacterium glutamicumやE. coliのglpX遺伝子が挙げられる。各種生物のglpX遺伝子等のフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるGlpXタンパク質等のフルクトース-1,6-ビスホスファターゼのアミノ酸配列は、例えば、NCBI等の公開データベースから取得できる。Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のglpX遺伝子（NCgl0976）の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１および１２に示す。E. coli MG1655のglpX遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３および１４に示す。
　タンパク質の活性を低下させる手法については後述する。タンパク質の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または同遺伝子を破壊することにより低下させることができる。このようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、用いることができる。
　タンパク質の活性を増大させる手法については後述する。タンパク質の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより増大させることができる。遺伝子の発現は、例えば、遺伝子のコピー数を高めることにより、または遺伝子の発現調節配列を改変することにより、上昇させることができる。このようなタンパク質の活性を増大させる手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、用いることができる。
　特定の性質において活性が低下または増大するタンパク質を総称して、「標的タンパク質」ともいう。標的タンパク質をコードする遺伝子を総称して、「標的遺伝子」ともいう。
　標的遺伝子は、例えば、上記例示した標的遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、標的タンパク質は、例えば、上記例示した標的タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。
　標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示した標的遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、標的タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示した標的タンパク質（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「aspT遺伝子」、「malE遺伝子」、「poxB遺伝子」、「ack遺伝子」、および「glpX遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したaspT遺伝子、malE遺伝子、poxB遺伝子、ack遺伝子、およびglpX遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「AspTタンパク質」、「MalEタンパク質」、「PoxBタンパク質」、「Ackタンパク質」、および「GlpXタンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したAspTタンパク質、MalEタンパク質、PoxBタンパク質、Ackタンパク質、およびGlpXタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した標的遺伝子や標的タンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
　「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（例えば活性や性質）に対応する機能（例えば活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。すなわち、各標的遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、各標的タンパク質の活性：アスパラギン酸トランスアミナーゼについてアスパラギン酸トランスアミナーゼ活性；マリックエンザイムについてマリックエンザイム活性；ピルビン酸デヒドロゲナーゼについてピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性；酢酸キナーゼについて酢酸キナーゼ活性；フルクトース-1,6-ビスホスファターゼについてフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性；を有するタンパク質をコードすることを意味してよい。また、各標的タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、各標的タンパク質の活性：アスパラギン酸トランスアミナーゼについてアスパラギン酸トランスアミナーゼ活性；マリックエンザイムについてマリックエンザイム活性；ピルビン酸デヒドロゲナーゼについてピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性；酢酸キナーゼについて酢酸キナーゼ活性；フルクトース-1,6-ビスホスファターゼについてフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性；を有することを意味してよい。
　アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性は、例えば、酵素を対応する基質（例えばＬ－アスパラギン酸とα－ケトグルタル酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な対応する産物（例えばオキサロ酢酸とＬ－グルタミン酸）の生成を測定することにより、測定することができる。
　マリックエンザイム活性は、例えば、電子受容体の存在下で酵素を対応する基質（例えばリンゴ酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な対応する産物（例えばピルビン酸）の生成を測定することにより、測定することができる。
　ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、電子受容体の存在下で酵素を対応する基質（例えばピルビン酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な対応する産物（例えば酢酸）の生成を測定することにより、測定することができる。
　酢酸キナーゼ活性は、例えば、リン酸基供与体の存在下で酵素を対応する基質（例えば酢酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な対応する産物（例えばアセチルリン酸）の生成を測定することにより、測定することができる。
　フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性は、例えば、酵素を対応する基質（例えばフルクトース-1,6-ビスリン酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な対応する産物（例えばフルクトース-6-リン酸）の生成を測定することにより、測定することができる。
　以下、保存的バリアントについて例示する。
　標的遺伝子のホモログまたは標的タンパク質のホモログは、例えば、上記例示した標的遺伝子の塩基配列または上記例示した標的タンパク質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、標的遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、これら公知の標的遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
　標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
　また、標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　また、標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子（例えばDNA）であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。
　上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
　また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、標的遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、標的遺伝子は、遺伝コードの縮重による上記例示した標的遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、標的遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
　なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味する。また、塩基配列間の「同一性」とは、blastnによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出される塩基配列間の同一性を意味する。
　なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、Ｌ－アミノ酸生合成系酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
＜１－３＞タンパク質の活性を増大させる手法
　以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
　「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して増大することを意味する。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して増大することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が増大するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、細菌の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち本発明の細菌が属する種の基準株）と比較して増大してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13869株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734)と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum YDK010株と比較して増大してもよい。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。「タンパク質の細胞当たりの分子数」とは、同タンパク質の分子数の細胞当たりの平均値を意味してよい。また、「タンパク質の活性が増大する」ことには、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することも包含される。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
　タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその活性が測定できる程度に生産されていてよい。
　タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成できる。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の細胞当たりの発現量」とは、同遺伝子の発現量の細胞当たりの平均値を意味してよい。「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを意味してもよい。
　遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
　遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。具体的には、標的遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換し、宿主の染色体上の標的部位と相同組み換えを起こすことにより、該遺伝子を宿主の染色体上に導入することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、標的遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、該遺伝子の両端に染色体上の標的部位の上流および下流に相同な塩基配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、標的部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、標的部位を該遺伝子に置換することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を備えていてよい。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する塩基配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する塩基配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な塩基配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。なお、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の導入に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。
　染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
　また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；pCRY30（特開平3-210184）；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX（特開平2-72876、米国特許5,185,262号）；pCRY2およびpCRY3（特開平1-191686）；pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844（特開昭58-192900）；pCG1（特開昭57-134500）；pCG2（特開昭58-35197）；pCG4およびpCG11（特開昭57-183799）；pVK7（特開平10-215883）；pVK9（US2006-0141588）；pVC7（特開平9-070291）；pVS7（WO2013/069634）が挙げられる。
　遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に宿主に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、宿主で機能するプロモーターによる制御を受けて発現するように保持されていればよい。プロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
　遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。
　各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８　遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
　また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上のタンパク質（例えば酵素）をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一のタンパク質複合体（例えば酵素複合体）を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
　導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的の部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。あるいは、遺伝子のバリアントを全合成してもよい。
　なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が標的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
　また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
　遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターとしては、例えば、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
　遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235）。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
　遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、部位特異的変異法により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
　また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
　上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
　また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の脱感作（desensitization to feedback inhibition）も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
　形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。コリネ型細菌の形質転換の方法としては、プロトプラスト法（Gene, 39, 281-286(1985)）、エレクトロポレーション法（Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報）が挙げられる。
　タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
　タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-seq等が挙げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
　タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
　上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質の活性増強や任意の遺伝子の発現増強に利用できる。
＜１－４＞タンパク質の活性を低下させる手法
　以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
　「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して低下することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、細菌の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち本発明の細菌が属する種の基準株）と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13869株と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032株と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734)と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum YDK010株と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。「タンパク質の細胞当たりの分子数」とは、同タンパク質の分子数の細胞当たりの平均値を意味してよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含される。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含される。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の細胞当たりの発現量」とは、同遺伝子の発現量の細胞当たりの平均値を意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も包含される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部の領域を欠失（欠損）させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（例えば活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が包含される。
　遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失をいう。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。遺伝子のコード領域の前後の配列には、例えば、遺伝子の発現調節配列が含まれてよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ得る。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１～２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
　遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失をいう。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることをいい、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含される。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。タンパク質のアミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
　染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した破壊型遺伝子を作製し、該破壊型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、破壊型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子が挙げられる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、破壊型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することができる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。なお、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の破壊に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
　なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
　上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-seq等が挙げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
　上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質の活性低下や任意の遺伝子の発現低下に利用できる。
＜２＞本発明のＬ－アミノ酸の製造方法
　本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にＬ－アミノ酸を蓄積すること、および前記培地および／または前記菌体より前記Ｌ－アミノ酸を採取すること、を含むＬ－アミノ酸の製造方法である。Ｌ－アミノ酸については上述した通りである。本発明においては、１種のＬ－アミノ酸が製造されてもよく、２種またはそれ以上のＬ－アミノ酸が製造されてもよい。
　使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、目的のＬ－アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、コリネ型細菌等の細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、使用する細菌の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
　炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、特に、糖類が挙げられる。炭素源として、さらに特には、グルコースやフルクトースが挙げられる。グルコースやフルクトース等の糖類は、単独で、あるいは他の炭素源と組み合わせて、炭素源として用いられてよい。炭素源としては、例えば、フルクトースを構成糖とする糖が用いられてもよい。フルクトースを構成糖とする糖としては、フルクトース、スクロース、フルクトオリゴ糖が挙げられる。フルクトースを構成糖とする糖は、単独で、あるいは他の炭素源と組み合わせて、炭素源として用いられてよい。なお、炭素源としては、植物由来原料を好適に用いることができる。植物としては、例えば、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿が挙げられる。植物由来原料としては、例えば、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物が挙げられる。植物由来原料の利用形態は特に制限されず、例えば、未加工品、絞り汁、粉砕物、精製物等のいずれの形態でも利用できる。また、キシロース等の五炭糖、グルコース等の六炭糖、またはそれらの混合物は、例えば、植物バイオマスから取得して利用できる。具体的には、これらの糖類は、植物バイオマスを、水蒸気処理、濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼ等の酵素による加水分解、アルカリ処理等の処理に供することにより取得できる。なお、ヘミセルロースは一般的にセルロースよりも加水分解されやすいため、植物バイオマス中のヘミセルロースを予め加水分解して五炭糖を遊離させ、次いで、セルロースを加水分解して六炭糖を生成してもよい。また、キシロースは、例えば、本発明の細菌にグルコース等の六炭糖からキシロースへの変換経路を保有させて、六炭糖からの変換により供給してもよい。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
　窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
　リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
　硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
　その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
　また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。
　また、培地中のビオチン量を制限することや、培地に界面活性剤またはペニシリンを添加することも好ましい。
　培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、目的のＬ－アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、コリネ型細菌等の細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する細菌の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
　培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の細菌を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の細菌を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の細菌の量は特に制限されない。本培養は、例えば、本培養の培地に、種培養液を1～50％（v/v）植菌することにより行ってよい。
　培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
　本発明において、各培地成分は、初発培地、流加培地、またはその両方に含有されていてよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および／または濃度の異なる２種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各回の流加培地に含有される成分の種類および／または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
　培地中の炭素源の濃度は、本発明の細菌が増殖でき、Ｌ－アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培地中の炭素源の濃度は、例えば、Ｌ－アミノ酸の生産が阻害されない範囲で可能な限り高くしてよい。培地中の炭素源の濃度は、例えば、初発濃度（初発培地中の濃度）として、１～３０w/v%、好ましくは３～１０w/v%であってよい。また、適宜、炭素源を追加で培地に添加してもよい。例えば、発酵の進行に伴う炭素源の消費に応じて、炭素源を追加で培地に添加してもよい。
　培養は、例えば、好気条件で行うことができる。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である0.33 ppm以上であることをいい、好ましくは1.5 ppm以上であることであってよい。酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度に対して5～50％、好ましくは10％程度に制御されてもよい。好気条件での培養は、具体的には、通気培養、振盪培養、撹拌培養、またはそれらの組み合わせで行うことができる。培地のpHは、例えば、pH3～10、好ましくはpH4.0～9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20～40℃、好ましくは25℃～37℃であってよい。培養期間は、例えば、10時間～120時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の細菌の活性がなくなるまで、継続してもよい。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、培地中および／または菌体内にＬ－アミノ酸が蓄積する。
　また、Ｌ－グルタミン酸を製造する場合、Ｌ－グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ－グルタミン酸を析出させながら培養を行うこともできる。Ｌ－グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、pH5.0～4.0、好ましくはpH4.5～4.0、さらに好ましくはpH4.3～4.0、特に好ましくはpH4.0の条件が挙げられる（EP1078989A）。また、Ｌ－グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地を用いる場合、パントテン酸を培地に添加することにより、より効率よく晶析できる（WO2004/111258）。また、Ｌ－グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地を用いる場合、Ｌ－グルタミン酸の結晶を種晶として培地に添加することにより、より効率よく晶析できる（EP1233069A）。また、Ｌ－グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地を用いる場合、Ｌ－グルタミン酸の結晶およびＬ－リジンの結晶を種晶として培地に添加することにより、より効率よく晶析できる（EP1624069A）。
　また、塩基性アミノ酸を製造する場合、培養工程（発酵工程）は、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが塩基性アミノ酸のカウンタイオンとなるように実施してもよい。そのような発酵形態を「炭酸塩発酵」ともいう。炭酸塩発酵によれば、塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして従来利用されていた硫酸イオン及び／又は塩化物イオンの使用量を削減しつつ、塩基性アミノ酸を発酵生産することができる。炭酸塩発酵は、例えば、US2002-025564A、EP1813677A、特開2002-65287に記載されているように実施することができる。
　発酵液は、例えば、液体サイクロンで処理することができる。液体サイクロンとしては、例えば、一般的形状で、円筒部直径が10～110 mmの、セラミック製、ステンレス鋼製、または樹脂製のものを用いることができる。液体サイクロンへの発酵液のフィード量は、例えば、発酵液中の菌体濃度やＬ－アミノ酸濃度に応じて設定することができる。液体サイクロンへの発酵液のフィード量は、例えば、2～1200 L/minであってよい。
　Ｌ－アミノ酸が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
　発酵液からのＬ－アミノ酸の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法（Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323、特開平9-173792）、晶析法（WO2008/078448、WO2008/078646）が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内にＬ－アミノ酸が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってＬ－アミノ酸を回収することができる。回収されるＬ－アミノ酸は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。Ｌ－グルタミン酸を製造する場合、回収されるＬ－グルタミン酸は、具体的には、例えば、フリー体のＬ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム（例えばmonosodium L-glutamate；ＭＳＧ）、Ｌ－グルタミン酸アンモニウム（例えばmonoammonium L-glutamate）、またはそれらの混合物であってもよい。例えば、発酵液中のＬ－グルタミン酸アンモニウムを酸を加えて晶析させ、結晶に等モルの水酸化ナトリウムを添加することでＬ－グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）が得られる。なお、晶析前後に活性炭を加えて脱色してもよい（グルタミン酸ナトリウムの工業晶析　日本海水学会誌　56巻　5号　川喜田哲哉参照）。Ｌ－グルタミン酸ナトリウム結晶は、例えば、うま味調味料として用いることができる。Ｌ－グルタミン酸ナトリウム結晶は、同様にうま味を有するグアニル酸ナトリウムやイノシン酸ナトリウム等の核酸と混合して調味料として用いてもよい。
　また、Ｌ－アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ－アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ－アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
　尚、回収されるＬ－アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸以外に、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。Ｌ－アミノ酸は、所望の程度に精製されていてもよい。回収されるＬ－アミノ酸の純度は、例えば、50％（w/w）以上、好ましくは85％（w/w）以上、特に好ましくは95%（w/w）以上であってよい（JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358, USP6,238,714, US2005/0025878）。
　以下、非限定的な実施例を参照して本発明をさらに具体的に説明する。
＜１＞Corynebacterium glutamicumの改変株の構築
＜１－１＞aspT遺伝子欠損用ベクターの構築
　C. glutamicum ATCC 13869の染色体DNAを鋳型として、適宜デザインしたプライマーを用いたPCRにより、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードするaspT遺伝子（CGBL_0102840）の5’側上流約1 kbpのDNA断片と3’側下流約1 kbpのDNA断片をそれぞれ増幅する。増幅したDNA断片をインフュージョン反応によりpBS5T（WO2006/057450）のSmaI部位に挿入することによって、aspT遺伝子欠損用ベクターを得る。
＜１－２＞malE遺伝子欠損用ベクターの構築
　C. glutamicum ATCC 13869の染色体DNAを鋳型として、適宜デザインしたプライマーを用いたPCRにより、マリックエンザイムをコードするmalE遺伝子（CGBL_0129850）の5’側上流約1 kbpのDNA断片と3’側下流約1 kbpのDNA断片をそれぞれ増幅する。増幅したDNA断片をインフュージョン反応によりpBS5T（WO2006/057450）のSmaI部位に挿入することによって、malE遺伝子欠損用ベクターを得る。
＜１－３＞poxB遺伝子欠損用ベクターの構築
　C. glutamicum ATCC 13869の染色体DNAを鋳型として、適宜デザインしたプライマーを用いたPCRにより、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードするpoxB遺伝子（CGBL_0125410）の5’側上流約1 kbpのDNA断片と3’側下流約1 kbpのDNA断片をそれぞれ増幅する。増幅したDNA断片をインフュージョン反応によりpBS5T（WO2006/057450）のSmaI部位に挿入することによって、poxB遺伝子欠損用ベクターを得る。
＜１－４＞ack遺伝子の発現ベクターの構築
　C. glutamicum ATCC 13869の染色体DNAを鋳型として、配列番号１９および２０のプライマーを用いたPCRにより、酢酸キナーゼをコードするack遺伝子（CGBL_0126910）を含むDNA断片を増幅した。増幅したDNA断片とbamHIおよびpstIで切断したpVK9（US2006-0141588）とをインフュージョン反応で連結することによって、ack遺伝子の発現ベクターpVK9-Plac ackAを得た。
　また、C. glutamicum ATCC 13869の染色体DNAを鋳型として、配列番号２１と２２のプライマーを用いてPCRを行い、C. glutamicum由来のmsrA遺伝子の上流配列（プロモーター領域を含む、369 bp）を含むDNA断片を増幅した。別途、C. glutamicum ATCC 13869の染色体DNAを鋳型として、配列番号２３および２０のプライマーを用いたPCRにより、ack遺伝子（CGBL_0126910）を含むDNA断片を増幅した。増幅した両DNA断片とbamHIおよびpstIで切断したpVK9（US2006-0141588）とをインフュージョン反応で連結することによって、ack遺伝子の発現ベクターpVK9-PmsrA ackAを得た。
＜１－５＞glpX遺伝子の発現ベクターの構築
　E. coli K-12 MG1655（ATCC 47076）の染色体DNAを鋳型として、配列番号２４と２５のプライマーを用いたPCRにより、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードするglpX遺伝子を含むDNA断片を増幅した。増幅したDNA断片とbamHIおよびpstIで切断したpVK9（US2006-0141588）とをインフュージョン反応で連結することによって、glpX遺伝子の発現ベクターpVK9-Plac glpXを得た。
＜１－６＞Corynebacterium glutamicumの改変株の構築
　構築した各遺伝子欠損用ベクターでC. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*株（WO2014/185430）を形質転換する。得られた形質転換体からWO2006/057450に記載の方法に従って菌株の選択を行い、aspT遺伝子欠損株、malE遺伝子欠損株、およびpoxB遺伝子欠損株を得る。
　構築したackA遺伝子の発現ベクターpVK9-Plac ackAまたはpVK9-PmsrA ackAを単独で、またはpVS7-xfp（US2018-0282773）と組み合わせてC. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*株（WO2014/185430）に導入することで、ack遺伝子の発現増強株を得た。pVS7-xfpは、B. longum JCM1217由来のホスホケトラーゼ遺伝子（xfp）の発現ベクターである（US2018-0282773）。
　構築したglpX遺伝子の発現ベクターpVK9-Plac glpXとpVS7-xfp（US2018-0282773）をC. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*株（WO2014/185430）に導入することで、glpX遺伝子の発現増強株を得た。
　pVK9を単独で、またはpVS7-xfp（US2018-0282773）と組み合わせてC. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*株（WO2014/185430）に導入し、対照株を得た。
　C. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*株は、C. glutamicum 2256株（ATCC 13869）から誘導されたＬ－グルタミン酸生産株であり、ldhA遺伝子とsucA遺伝子を欠損し、yggB遺伝子にIS変異（V419::IS）を有する。この変異型yggB遺伝子（V419::IS）の塩基配列、及び同遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質（V419::IS）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および１８に示す。
＜２＞Ｌ－グルタミン酸生産培養
　構築した各菌株（すなわち、対照株ならびにそのack遺伝子の発現増強株およびglpX遺伝子の発現増強株）を用いてＬ－グルタミン酸生産培養を実施した。使用した培地の組成を表１に示す。炭素源がGlucoseである培地を「Glc培地」、炭素源がFructoseである培地を「Frc培地」ともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　各菌株を太試験管に張り込んだ上記培地（50 g/L炭酸カルシウムを含む）5 mLに植菌し、31.5℃のボックスシェーカー（ABLE ML-190）を用いて120 rpmで振盪培養した。培養開始25または30時間後に培養液のサンプリングを実施した。培養液中のＬ－グルタミン酸濃度をバイオテックアナライザーAS-310（サクラエスアイ）を用いて定量し、Ｌ－グルタミン酸の対糖収率を算出した。
　結果を図１～４に示す。ack遺伝子の発現増強株（2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Plac ackA/pVS7-xfp、2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-PmsrA ackA/pVS7-xfp、2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Plac ackA、および2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-PmsrA ackA）は、グルコースを炭素源とした場合に、対応する対照株（2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Plac ackA/pVS7-xfpと2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-PmsrA ackA/pVS7-xfpについて2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9/pVS7-xfp；2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Plac ackAと2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-PmsrA ackAについて2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9）よりも高いＬ－グルタミン酸の蓄積量およびＬ－グルタミン酸の対糖収率を示した（図１および２）。また、glpX遺伝子の発現増強株（2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Plac glpX/pVS7-xfp）は、フルクトースを炭素源とした場合に、対応する対照株（2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9/pVS7-xfp）よりも高いＬ－グルタミン酸の蓄積量を示し（図３）、グルコースを炭素源とした場合に、対応する対照株（2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9/pVS7-xfp）よりも高いＬ－グルタミン酸の対糖収率を示した（図４）。
　また、aspT遺伝子欠損株、malE遺伝子欠損株、およびpoxB遺伝子欠損株について同様の手順でＬ－グルタミン酸生産培養を実施することにより、Ｌ－グルタミン酸生産の向上を確認する。
　本発明によれば、コリネ型細菌のＬ－アミノ酸生産能を向上させることができ、Ｌ－アミノ酸を効率よく製造することができる。
〔配列表の説明〕
配列番号１：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のaspT遺伝子の塩基配列
配列番号２：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のAspTタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のmalE遺伝子の塩基配列
配列番号４：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のMalEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のpoxB遺伝子の塩基配列
配列番号６：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のPoxBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のack遺伝子の塩基配列
配列番号８：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のAckタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：Escherichia coli K-12 MG1655のack遺伝子の塩基配列
配列番号１０：Escherichia coli K-12 MG1655のAckタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のglpX遺伝子の塩基配列
配列番号１２：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のGlpXタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３：Escherichia coli K-12 MG1655のglpX遺伝子の塩基配列
配列番号１４：Escherichia coli K-12 MG1655のGlpXタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のyggB遺伝子の塩基配列
配列番号１６：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のYggBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)の変異型yggB遺伝子（V419::IS）の塩基配列
配列番号１８：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)の変異型YggBタンパク質（V419::IS）のアミノ酸配列
配列番号１９～２５：プライマー

Claims (16)

  1. 　Ｌ－アミノ酸の製造方法であって、
    　Ｌ－アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にＬ－アミノ酸を蓄積すること、および
    　前記培地および／または前記菌体より前記Ｌ－アミノ酸を採取すること、
    　を含み、
    　前記Ｌ－アミノ酸が、グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸であり、
    　前記細菌が、下記（X）および／または（Y）の改変を有する、方法：
    （X）ホスホケトラーゼ経路を経由する炭素源の利用性が向上する改変；
    （Y）細胞内のオキサロ酢酸プールが増大する改変。
  2. 　前記細菌が、少なくとも、前記（X）の改変を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 　請求項１または２に記載の方法であって、
    　前記（X）の改変が、下記（A）、（B）、および（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変であり；
    　前記（Y）の改変が、下記（D）および（E）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変である、方法：
    （A）酢酸キナーゼの活性が増大する改変；
    （B）フルクトース-1,6-ビスホスファターゼの活性が増大する改変；
    （C）ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が低下する改変；
    （D）アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性が低下する改変；
    （E）マリックエンザイムの活性が低下する改変。
  4. 　Ｌ－アミノ酸の製造方法であって、
    　Ｌ－アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にＬ－アミノ酸を蓄積すること、および
    　前記培地および／または前記菌体より前記Ｌ－アミノ酸を採取すること、
    　を含み、
    　前記Ｌ－アミノ酸が、グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸であり、
    　前記細菌が、下記（A）～（E）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、方法：
    （A）酢酸キナーゼの活性が増大する改変；
    （B）フルクトース-1,6-ビスホスファターゼの活性が増大する改変；
    （C）ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が低下する改変；
    （D）アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性が低下する改変；
    （E）マリックエンザイムの活性が低下する改変。
  5. 　前記細菌が、少なくとも、前記（A）の改変を有する、請求項３または４に記載の方法。
  6. 　請求項３～５のいずれか一項に記載の方法であって、
    　前記アスパラギン酸トランスアミナーゼがaspT遺伝子にコードされ；
    　前記マリックエンザイムがmalE遺伝子にコードされ；
    　前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼがpoxB遺伝子にコードされ；
    　前記酢酸キナーゼがack遺伝子にコードされ；且つ／又は
    　前記フルクトース-1,6-ビスホスファターゼがglpX遺伝子にコードされる、方法。
  7. 　請求項３～６のいずれか一項に記載の方法であって、
    　前記アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性が、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
    　前記マリックエンザイムの活性が、マリックエンザイムをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
    　前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
    　前記酢酸キナーゼの活性が、酢酸キナーゼをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大し；且つ／又は
    　前記フルクトース-1,6-ビスホスファターゼの活性が、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大した、方法。
  8. 　請求項７に記載の方法であって、
    　酢酸キナーゼをコードする遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇し；且つ／又は
    　フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、方法。
  9. 　請求項３～８のいずれか一項に記載の方法であって、
    　前記アスパラギン酸トランスアミナーゼが、下記（１ａ）、（１ｂ）、または（１ｃ）に記載のタンパク質であり：
    （１ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （１ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性を有するタンパク質；
    （１ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性を有するタンパク質；
    　前記マリックエンザイムが、下記（２ａ）、（２ｂ）、または（２ｃ）に記載のタンパク質であり：
    （２ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （２ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、マリックエンザイム活性を有するタンパク質；
    （２ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、マリックエンザイム活性を有するタンパク質；
    　前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼが、下記（３ａ）、（３ｂ）、または（３ｃ）に記載のタンパク質であり：
    （３ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （３ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
    （３ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
    　前記酢酸キナーゼが、下記（４ａ）、（４ｂ）、または（４ｃ）に記載のタンパク質であり：
    （４ａ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （４ｂ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質；
    （４ｃ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質；且つ／又は
    　前記フルクトース-1,6-ビスホスファターゼが、下記（５ａ）、（５ｂ）、または（５ｃ）に記載のタンパク質である、方法：
    （５ａ）配列番号１２または１４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （５ｂ）配列番号１２または１４に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性を有するタンパク質；
    （５ｃ）配列番号１２または１４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性を有するタンパク質。
  10. 　前記細菌が、さらに、非改変株と比較して、ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記ホスホケトラーゼが、Ｄ－キシルロース－５－リン酸ホスホケトラーゼおよび／またはフルクトース６－リン酸ホスホケトラーゼである、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸が、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、およびＬ－オルニチンから選択される１種またはそれ以上のＬ－アミノ酸である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸が、Ｌ－グルタミン酸である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　前記Ｌ－グルタミン酸が、Ｌ－グルタミン酸アンモニウムまたはＬ－グルタミン酸ナトリウムである、請求項１４または１５に記載の方法。
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