WO2022210204A1 - 粉砕方法、高分子ブロック製造方法及び粉砕装置 - Google Patents

粉砕方法、高分子ブロック製造方法及び粉砕装置 Download PDF

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WO2022210204A1
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pulverizing
porous polymer
pulverization
amino acid
section
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和人 福永
伸彦 加藤
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Fujifilm Corp
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Fujifilm Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B02—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING; PREPARATORY TREATMENT OF GRAIN FOR MILLING
    • B02C—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING IN GENERAL; MILLING GRAIN
    • B02C18/00—Disintegrating by knives or other cutting or tearing members which chop material into fragments
    • B02C18/06—Disintegrating by knives or other cutting or tearing members which chop material into fragments with rotating knives
    • B02C18/08—Disintegrating by knives or other cutting or tearing members which chop material into fragments with rotating knives within vertical containers
    • B02C18/086—Disintegrating by knives or other cutting or tearing members which chop material into fragments with rotating knives within vertical containers specially adapted for disintegrating plastics, e.g. cinematographic films
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B02—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING; PREPARATORY TREATMENT OF GRAIN FOR MILLING
    • B02C—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING IN GENERAL; MILLING GRAIN
    • B02C19/00—Other disintegrating devices or methods
    • B02C19/18—Use of auxiliary physical effects, e.g. ultrasonic waves or irradiation, for disintegrating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/12—Powdering or granulating
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B02—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING; PREPARATORY TREATMENT OF GRAIN FOR MILLING
    • B02C—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING IN GENERAL; MILLING GRAIN
    • B02C19/00—Other disintegrating devices or methods
    • B02C19/06—Jet mills

Definitions

  • the present disclosure relates to a pulverizing method, a polymer block manufacturing method, and a pulverizing apparatus.
  • Regenerative medicine is a medical technology that uses the three factors of cells, scaffolds, and growth factors to recreate the same form and function as the original tissue in living tissue that cannot be restored by the body's natural healing ability alone. be.
  • bone regeneration in the field of orthopedics or dentistry is known as one of the fields that are attracting attention in the field of regenerative medicine.
  • QOL Quality of Life
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 55-092667 discloses a method of pulverizing at an ultra-low temperature using liquid nitrogen.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-000176 discloses a method of wet pulverizing by mixing with a liquid.
  • the present disclosure provides a pulverizing method, a polymer block manufacturing method, and a pulverizing apparatus that can suppress scorching that occurs when pulverizing a polymeric porous body.
  • a first aspect of the present disclosure is a pulverization method, which includes a pulverization step of pulverizing a porous polymer body and a static elimination step of eliminating static electricity from the porous polymer body being pulverized in the pulverization step.
  • static electricity may be removed from the porous polymer body by irradiating the porous polymer body with radiation.
  • the radiation may be at least one of X-rays and ultraviolet rays.
  • the radiation may be X-rays having a radiation source with a tube voltage of 4 kV or more and 50 kV or less.
  • a fifth aspect of the present disclosure is that, in the static elimination step according to the second to fourth aspects, the 70 ⁇ m dose equivalent rate of the radiation irradiated to the porous polymer body is 1 mSv/h or more and 200 Sv/h or less. may be
  • a sixth aspect of the present disclosure is that, in the static elimination step according to the above aspect, the static elimination time required for the potential to change from +1000 V to +100 V in at least a part of the pulverizing unit that pulverizes the porous polymer body is 0.01 second or more. , 10 seconds or less.
  • the porous polymer body may be pulverized using a pulverizing unit that performs dry pulverization.
  • the crushing section may include a screen and a rotating impeller.
  • a ninth aspect of the present disclosure is the seventh aspect or the eighth aspect, wherein the crushing unit is ventilated at a ventilation frequency of 1 ⁇ 10 4 times/h or more and 1 ⁇ 10 7 times/h or less. good.
  • static electricity may be eliminated from the porous polymer body by irradiating at least part of the pulverized portion with radiation.
  • the porous polymer body may contain protein.
  • the porous polymer body may contain the following peptide (A), (B) or (C).
  • A A peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • B A peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are modified in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having biocompatibility.
  • C consisting of an amino acid sequence having a partial sequence having 80% or more sequence identity with the partial amino acid sequence consisting of the 4th to 192nd amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and biocompatibility Peptides with
  • the size of the porous polymer body before pulverization may be 0.1 mm or more and 50 mm or less.
  • the size of the pulverized porous polymer body may be 0.01 mm or more and 10 mm or less.
  • a fifteenth aspect of the present disclosure is a method for producing a polymer block, comprising: a pulverization step of pulverizing a porous polymer body; .
  • a sixteenth aspect of the present disclosure is a pulverizing apparatus comprising: a pulverizing unit for pulverizing a porous polymer body; and an irradiation unit for irradiating at least part of the pulverizing unit with radiation.
  • the porous polymer material being pulverized in the pulverizing section is neutralized by the radiation emitted from the pulverizing section.
  • the crushing device further includes a ventilation part for ventilating the crushing part, and the ventilation frequency of the crushing part by the ventilation part is 1 ⁇ 10 4 times/h or more, It may be 1 ⁇ 10 7 times/h or less.
  • step is used not only for independent steps, but also for cases where the intended effect of this step is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other steps. included.
  • the pulverization method, the polymer block production method, and the pulverization apparatus of the present disclosure can suppress scorching that occurs when pulverizing the porous polymer body.
  • a method for pulverizing a porous polymer material includes a pulverizing step of pulverizing the porous polymer material and a static elimination step of eliminating static electricity from the porous polymer material being pulverized in the pulverizing process.
  • a pulverizing step of pulverizing the porous polymer material includes a static elimination step of eliminating static electricity from the porous polymer material being pulverized in the pulverizing process.
  • the polymer porous body after pulverization in the pulverization step is referred to as "polymer block”.
  • the method according to the present exemplary embodiment performs a pulverization step of pulverizing the porous polymer material and a static elimination step of removing static electricity from the porous polymer material being pulverized in the pulverization process.
  • the pulverization method and the polymer block manufacturing method according to the present exemplary embodiment will be collectively referred to as the “method of the present disclosure”.
  • the pulverization step and the static elimination step may be repeated again.
  • the number of times the pulverization step and the static elimination step are performed is preferably 1 to 4 times, more preferably 2 to 3 times.
  • the method of the present disclosure includes a pulverization step of pulverizing the porous polymeric body.
  • pulverization is to break up solids and aggregates of solids by applying mechanical energy.
  • pulverization means in the method of the present disclosure include dry pulverization and wet pulverization, but dry pulverization is preferably used from the viewpoint of saving the labor and cost required for drying and the like for separating and removing the liquid.
  • the pulverization can be performed by a pulverizing section (details will be described later) provided in the pulverizing device.
  • the method of the present disclosure includes a charge removal step of removing charges from the porous polymer material being crushed in the crushing step.
  • static elimination means removing static electricity from a charged substance. Examples of static elimination methods in the method of the present disclosure include a radiation irradiation method, a corona discharge method, an antistatic agent addition method, a humidification method, and the like. Moreover, you may combine two or more of these static elimination methods suitably.
  • the radiation irradiation method and the corona discharge method are preferable from the viewpoint of not requiring the addition of an antistatic agent or the like and the formation of a high-humidity environment that may affect the friction coefficient of the material to be pulverized.
  • the radiation irradiation method it is possible to enhance the static elimination ability. Irradiation of radiation can be performed by an irradiation unit (details will be described later) provided in the pulverization device.
  • the "radiation" irradiated to the porous polymer material in the static elimination process includes particle beams such as alpha rays and beta rays, electromagnetic waves such as X rays and gamma rays, and non-ionizing radiation such as infrared rays, visible rays and ultraviolet rays.
  • the radiation is preferably at least one of X-rays and ultraviolet rays from the viewpoint that the porous polymer material to be irradiated is unlikely to be denatured.
  • an X-ray source with a tube voltage of 4 kV or more and 50 kV or less (so-called soft X-ray). X-rays of 20 kV or less are particularly preferred.
  • the 70 ⁇ m dose equivalent rate of the radiation is preferably 1 mSv/h or more and 200 Sv/h or less, more preferably 2 mSv/h or more and 200 Sv/h or less.
  • the exposure dose of radiation can be measured by, for example, a survey meter.
  • the 70 ⁇ m dose equivalent rate of radiation is a value measured based on the method described in (Measurement of irradiation dose) in Example 1 below. In the static elimination step, it is preferable that the radiation continues to be irradiated during the pulverization of the porous polymer body in the pulverization step.
  • the static elimination ability can be evaluated using a charge plate monitor (also called a charge plate monitor, an ionizer performance tester, etc.).
  • a charge plate monitor also called a charge plate monitor, an ionizer performance tester, etc.
  • an ANSI/ESD-STM 3.1 compliant charge plate monitor such as MODEL 156A (manufactured by Trek) or the like can be used.
  • the static elimination time In a charged electrode having a specific electrostatic capacity, the time required to change from a specific initial potential to a specific potential due to static elimination is called the static elimination time. By measuring this, the time required for static elimination can be evaluated. can.
  • the time until the initial potential of +1000 V changes to a potential of +100 V is measured as the neutralization time.
  • the static elimination time measured by this method is preferably 0.01 seconds or more and 10 seconds or less, more preferably 0.01 seconds or more and 2 seconds or less, in at least a part of the grinding section of the grinding device. .
  • the method of the present disclosure may further include a classification step of classifying the polymer block (porous polymer body after pulverization).
  • “Classification” is an operation of separating polymer blocks having different properties according to their properties. Properties of the polymer block include size, shape, density, magnetism, color and chemical composition. Examples of the method for classifying polymer blocks according to the size thereof include fluid classification performed by interposing a fluid, and sieving to separate polymer blocks larger than the mesh of the sieve and polymer blocks smaller than the mesh by using a sieve. . A cyclone may be applied as the fluid classification. Sieves, meshes, filters and the like may be applied for sieving.
  • the classification step may be performed simultaneously with the pulverization step and/or the static elimination step, or may be performed after the pulverization step and/or the static elimination step.
  • the classification step by sieving can be performed using a sieve for classification provided in the pulverizer (details will be described later).
  • the porous polymer material during pulverization may be charged and attached to the pulverization section due to static electricity generated by friction with the pulverization section and/or other porous polymer bodies. If the porous polymer material during pulverization is electrically charged and adheres to the pulverized portion, the friction time increases and the amount of frictional heat also increases, making scorching more likely to occur.
  • the term "friction time” as used herein refers to the time during which the porous polymer material during pulverization is subjected to frictional force due to friction with the pulverized portion and/or other porous polymer material.
  • Electrostatic adhesion is determined by the difference between the force of adhesion due to electrostatic force, etc., and the force of desorption due to gravity, etc., so the lower the density of an object, the smaller the detachment force compared to the adhesion force, and the easier it is for electrostatic adhesion to occur. Therefore, a porous polymer material having a lower density than a non-porous polymer material tends to be easily charged and adhered to the pulverized portion, and tends to be easily scorched.
  • the term "charring” refers to a change in properties (for example, coloration) due to oxidation, decomposition, cross-linking and/or Maillard reaction in the porous polymer due to temperature rise due to frictional heat.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the crushing device 10. As shown in FIG.
  • the pulverizing device 10 has the function of performing the pulverizing step, the static elimination step and the classifying step in the method according to the above exemplary embodiment.
  • the crushing device 10 includes a crushing unit 20, at least one irradiation unit 30, and a ventilation unit 40.
  • FIG. 1 shows three irradiating units 30A to 30C as an example of the irradiating unit 30, but hereinafter, the irradiating units 30A to 30C are simply referred to as “irradiating units 30” when not distinguished.
  • the pulverizing device 10 when the porous polymer material is introduced from the charging section 12 , the porous polymer material is pulverized by the pulverizing section 20 and discharged from the discharging section 14 .
  • Each arrow A in FIG. 1 indicates the flow of air ventilated by the ventilation section 40, and the porous polymer material is also transported along this flow.
  • the pulverizing section 20 pulverizes the porous polymer body.
  • a pulverizing function included in various devices for performing known dry pulverization and wet pulverization can be applied.
  • Such equipment includes screen mills, hammer mills, ball mills, bead mills, jet mills, cutter mills, vibrating mills, roller mills, line mills, stamp mills, disc mills, pin mills, grinding mills, rotor mills, cyclone mills, rod mills. , power mills, pot mills, jaw crushers, gyratory crushers, impact crushers, roll crushers and edge runners.
  • FIG. 1 shows a diagram using a grinding function included in a screen mill as a grinding section 20 .
  • the screen mill includes a multi-perforated screen 22 and a rotating impeller 24 as grinding functions.
  • the porous polymer material charged from the charging unit 12 is pressed against the screen 22 using the rotating impeller 24 so that the porous polymer material is reduced to the size of the pores of the screen 22 or less.
  • the rotating impeller is preferably rake-shaped, round or square, more preferably rake-shaped. It should be noted that FIG. 1 omits illustration of a motor for driving the rotating impeller 24 and the like.
  • the hole diameter of the screen 22 is preferably 0.006 inch or more and 0.25 inch or less, and is preferably 0.04 inch or more and 0.04 inch or more. 08 inches or less is more preferable.
  • the rotational speed of the rotary impeller is preferably 100 rpm or more and 6000 rpm or less, more preferably 1000 rpm or more and 3000 rpm or less.
  • the wind speed at the holes of the screen 22 is preferably 5 m/s or more and 20 m/s or less, more preferably 7 m/s or more and 15 m/s or less.
  • the pulverizing section 20 refers to a region where the porous polymer body can actually be pulverized.
  • the screen 22 and the rotary impeller 24 provided in the screen mill correspond to the crushing section 20
  • other components provided in the screen mill do not correspond to the crushing section 20 .
  • the input section and the discharge section provided in a known screen mill correspond to the input section 12 and the discharge section 14 of the pulverizer 10, respectively.
  • the irradiation unit 30 irradiates at least part of the pulverizing unit 20 with radiation to irradiate the porous polymer material being pulverized in the pulverizing unit 20 with radiation, thereby neutralizing the porous polymer material.
  • the air in the pulverizing section 20 is ionized to generate positive and negative ions. That is, ions having charges opposite to those of the porous polymer material charged by static electricity are generated. As a result, the charge of the porous polymer body is neutralized, and the charge of the porous polymer body is eliminated. Since the porous polymer body is agitated in the pulverizing section 20, if the porous polymer body is neutralized in at least a part of the pulverizing section 20, the effect of suppressing the occurrence of charring can be obtained.
  • the irradiation unit 30 may irradiate the input unit 12 and the discharge unit 14 in addition to at least a part of the crushing unit 20 with radiation.
  • the irradiation unit 30 may irradiate the input unit 12 and the discharge unit 14 in addition to at least a part of the crushing unit 20 with radiation.
  • the position of the irradiation units 30 in the pulverization device 10 is not particularly limited as long as at least one of the irradiation units 30 can irradiate at least part of the pulverization unit 20 with radiation.
  • at least one of the irradiation units 30 is preferably provided at an angle of 30 to 90 degrees, more preferably at an angle of 45 to 90 degrees, with respect to the vertical direction of the crushing device 10 .
  • another one of the irradiation units 30 is preferably provided at an angle of 0 to 60 degrees, more preferably at an angle of 0 to 45 degrees, with respect to the vertical direction of the crushing device 10 .
  • the pulverizing device 10 may include a sieve 16 for classifying the polymer blocks pulverized by the pulverizing section 20.
  • a sieve 16 for classifying the polymer blocks pulverized by the pulverizing section 20.
  • the crushing device 10 may perform a ventilation step of ventilating the inside of the crushing unit 20.
  • the ventilating section 40 may ventilate the inside of the pulverizing section 20 by sucking the air inside the pulverizing device 10 as indicated by arrows A in FIG.
  • the ventilation unit 40 By ventilating the inside of the pulverizing unit 20 with the ventilation unit 40, the air in the vicinity of the porous polymer material being pulverized can be exchanged. can be efficiently ionized by the radiation emitted by Therefore, the static elimination effect can be improved.
  • the ventilation frequency of the pulverizing section 20 by the ventilation section 40 is preferably 1 ⁇ 10 4 times/h or more and 1 ⁇ 10 7 times/h or less. Further, the ventilation frequency of the crushing unit 20 by the ventilation unit 40 is more preferably 1 ⁇ 10 5 times/h or more and 1 ⁇ 10 7 times/h or less, and more preferably 2.5 ⁇ 10 5 times/h or more, 1 It is more preferable that it is x10 7 times/h or less.
  • the volume of the pulverizing section 20 is preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 4 m 3 or more and 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m 3 or less, and is preferably 2.0 ⁇ 10 ⁇ 4 m 3 or more and 1.0 ⁇ 10 m 3 or more. -3 m 3 or less is more preferable.
  • the air volume of the ventilation unit 40 is preferably 25 m 3 /h or more and 400 m 3 /h or less, and more preferably 50 m 3 /h or more and 200 m 3 /h or less.
  • the pulverizing section 20 means a region capable of pulverizing the porous polymer material, so the "volume of the pulverizing section 20" is defined as "the volume of the region capable of pulverizing the porous polymer material. ” means.
  • the static elimination effect can be improved if the above ventilation frequency is achieved in the pulverizing section 20 (i.e., the region capable of pulverizing the porous polymer body) of the pulverizing device 10, so other regions (for example, the screen 22 area outside) does not have to meet the above ventilation frequency.
  • the ventilation unit 40 may suck the polymer blocks that have passed through the sieve 16 .
  • a dust collector or the like can be used as appropriate.
  • the pulverizing device 10 includes the pulverizing unit 20 for pulverizing the porous polymer material and the irradiation unit 30 for irradiating at least part of the pulverizing unit 20 with radiation.
  • the porous polymer material being pulverized in the pulverizing section 20 is neutralized by the radiation emitted from the pulverizing section 20 . Therefore, it is possible to suppress the occurrence of scorching even in the pulverization of a porous polymer material that tends to be charged and to scorch due to its low density.
  • Micromolecule refers to a molecule of high molecular weight that has a structure made up of multiple repetitions of units derived substantially or conceptually from molecules of lower molecular weight.
  • macromolecules include polyamines, polysaccharides, polypeptides, proteins, polyamides, polyesters, polyolefins, polyethers, polynucleotides and the like.
  • a "porous body” means a solid having pores (voids) inside. A porous polymer can be obtained, for example, by removing water from a frozen polymer aqueous solution.
  • the polymeric porous body in this exemplary embodiment may contain a biocompatible substance.
  • Biocompatibility means that it does not cause significant adverse reactions such as long-term and chronic inflammatory reactions when it comes into contact with living organisms.
  • biocompatible substances include proteins and polysaccharides.
  • the polymeric porous material in this exemplary embodiment may contain protein.
  • the size of the porous polymer body before pulverization is preferably 0.1 mm or more and 50 mm or less. By setting the size of the porous polymer body before pulverization within the above range, the time required for pulverization can be shortened. In addition, it is more preferable that the size of the porous polymer body before pulverization is 0.1 mm or more and 16 mm or less.
  • the size of the porous polymer body can be defined by the square root of the projected area of the porous polymer body, that is, the length of one side of a square having the same area as the projected area.
  • the pore size of the porous polymer body is preferably 10 ⁇ m or more and 2500 ⁇ m or less, more preferably 40 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less, from the viewpoint of enhancing the affinity with the living body.
  • the pore diameter of the porous polymer material can be measured as the diameter of a circle (equivalent circle diameter) having the same area as the pore when a cut surface near the center of the porous polymer material is observed with a microscope. It can be evaluated as the median value of the equivalent circle diameters of all the holes in the
  • the density of the porous polymer material is preferably 0.01 g/cm 3 or more and 0.3 g/cm 3 or less, more preferably 0.05 g/cm 3 or more and 0.1 g/cm 3 or less. preferable.
  • the density of the porous polymer can be calculated by dividing the mass of the porous polymer by the apparent volume of the porous polymer including internal voids.
  • the porosity of the porous polymer body is preferably 80.00% or more and 99.99% or less, and preferably 92.01% or more and 99.99% or less, from the viewpoint of enhancing the affinity with the living body. is more preferable.
  • the porous polymer body in this exemplary embodiment preferably contains a biodegradable polymer from the viewpoint of being used as a regenerative medicine material.
  • biodegradable polymers include polypeptides such as naturally occurring peptides, recombinant peptides, and chemically synthesized peptides (for example, gelatin etc. described below). Also included are polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid/glycolic acid copolymer (PLGA), hyaluronic acid, glycosaminoglycan, proteoglycan, chondroitin, cellulose, agarose, carboxymethylcellulose, chitin and chitosan.
  • the polymeric porous material in this exemplary embodiment contains a recombinant peptide.
  • non-biodegradable polymers include polytetrafluoroethylene (PTFE), polyurethane, polypropylene, polyester, vinyl chloride, polycarbonate, acrylic, silicone and MPC (2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine).
  • polypeptides such as recombinant peptides or chemically synthesized peptides are not particularly limited as long as they have biocompatibility and biodegradability.
  • polypeptides include gelatin, collagen, elastin, fibronectin, pronectin, laminin, tenascin, fibrin, fibroin, entactin, thrombospondin and retronectin.
  • the porous polymer material in this exemplary embodiment preferably contains gelatin, collagen or atelocollagen, more preferably natural gelatin, recombinant gelatin or chemically synthesized gelatin, and further preferably contains recombinant gelatin. preferable.
  • naturally gelatin as used herein means gelatin made from naturally derived collagen.
  • Examples of natural gelatin and its recombinant gelatin include those derived from animals such as fish and mammals, but those derived from mammals are preferred. Examples of mammalian animals include humans, horses, pigs, mice, rats, and the like. When the porous polymer material according to this exemplary embodiment contains recombinant gelatin, the recombinant gelatin is more preferably derived from humans.
  • amino acid sequences constituting polypeptides are represented by one-letter code (e.g., "G” for glycine residue) or three-letter code (e.g., "Gly” for glycine residue) known in the art. express. Also, “%” for the amino acid sequence of a polypeptide is based on the number of amino acid (or imino acid) residues unless otherwise specified.
  • recombinant gelatin Recombinant gelatin having biocompatibility, biodegradability, and ability to regenerate tissues such as bones, which may be included in the porous polymer material in this exemplary embodiment, will be described below.
  • recombinant gelatin means a polypeptide or protein-like substance having an amino acid sequence similar to gelatin produced by genetic recombination technology.
  • the following recombinant gelatin can be used as a tissue repair material that contributes to the formation of tissue at the site when implanted in vivo.
  • tissue repair material is not limited to materials that contribute to the formation of normal tissue that normally exists at the implantation site, but also includes materials that promote the formation of abnormal tissue including scar tissue. .
  • the "tissue” that can be repaired by the tissue repair material may be hard tissue such as teeth and bones, and the following recombinant gelatin is particularly suitable as a base material for bone regeneration.
  • the recombinant gelatin preferably has repeats of the Gly-XY sequence characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • Gly-XY Gly represents a glycine residue
  • X and Y represent any amino acid residue other than glycine residues.
  • X and Y preferably contain many imino acid residues, ie, proline residues or oxyproline residues.
  • the content of such imino acid residues preferably accounts for 10% to 45% of the total gelatin.
  • the content of Gly-XY in gelatin is preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 99% or more.
  • Examples of recombinant gelatin include EP1014176A2, US6992172, WO2004/85473, WO2008/103041, JP2010-519293, JP2010-519252, JP2010-518833, JP2010-519251, WO20710/128672 etc. can be used, but the present invention is not limited to these.
  • the recombinant gelatin preferably has a molecular weight of 2 kDa or more and 100 kDa or less, more preferably 5 kDa or more and 90 kDa or less, and even more preferably 10 kDa or more and 90 kDa or less.
  • the recombinant gelatin preferably further contains a cell adhesion signal, and more preferably has two or more cell adhesion signals per molecule.
  • cell adhesion signals include the RGD sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, LGTIPG sequence, IKVAV sequence and HAV sequence.
  • the RGD sequence is preferred, and among the RGD sequences, the ERGD sequence is even more preferred.
  • the recombinant gelatin sequence preferably satisfies at least one of the following aspects (1-1) to (1-3).
  • the recombinant gelatin may have the following aspects (1-1) to (1-3) alone, or may have two or more aspects in combination.
  • (1-1) does not contain serine and threonine residues;
  • (1-2) does not contain serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine residues;
  • (1-3) Does not contain the amino acid sequence represented by Asp-Arg-Gly-Asp.
  • the recombinant gelatin preferably has a repeating structure of A-[(Gly-XY) n ] m -B.
  • m represents 2 to 10, preferably 3 to 5.
  • a and B represent any amino acid or amino acid sequence.
  • n represents 3 to 100, preferably 15 to 70, more preferably 50 to 65.
  • the recombinant gelatin has the formula: Gly-Ala-Pro-[(Gly-XY) 63 ] 3 -Gly.
  • each of the 63 Xs independently represents any amino acid residue
  • each of the 63 Ys independently represents any of the amino acid residues.
  • the three [(Gly-XY) 63 ] may be the same or different.
  • the recombinant gelatin preferably satisfies at least one of the following aspects (2-1) to (2-4).
  • the recombinant gelatin may have the following aspects (2-1) to (2-4) alone, or may have two or more aspects in combination.
  • (2-1) the carbamoyl group is not hydrolyzed;
  • (2-2) Does not have procollagen. (2-3) does not have a telopeptide;
  • (2-4) A substantially pure collagen-like material prepared with a nucleic acid encoding native collagen.
  • Recombinant gelatin is preferably any one of the following (A) to (C) because of its high tissue repair ability.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 below. GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 G (SEQ ID NO: 1)
  • B A peptide having biocompatibility, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are modified (eg, deleted, substituted or added) in the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • (C) consists of an amino acid sequence having a partial sequence having 80% or more sequence identity with the partial amino acid sequence consisting of the 4th to 192nd amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and biocompatibility Peptides with properties.
  • the number of amino acid residues to be modified varies depending on the total number of amino acid residues of the recombinant gelatin, but is, for example, 2 to 15. is preferred, and 2 to 5 is more preferred.
  • sequence identity with respect to the amino acid sequences of the two peptides to be compared (that is, the peptide (A) and the peptide (C)) is a value calculated by the following formula. Point.
  • the comparison (alignment) of a plurality of peptides shall be performed according to a conventional method so as to maximize the number of identical amino acid residues.
  • Sequence identity (%) [(number of identical amino acid residues) / (alignment length)] x 100
  • the "partial amino acid sequence consisting of the 4th to 192nd amino acid residues” corresponds to the repeating unit in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • a “partial sequence” corresponds to a repeating unit in the sequence (C) above.
  • the peptide of (C) above may contain at least one repeating unit (partial sequence) having a sequence identity of 80% or more with the repeating unit in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and may contain two or more. is preferred.
  • the peptide of (C) above contains a plurality of different repeating units, some of the plurality of repeating units have less than 80% sequence identity with the repeating unit in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. may be However, in the peptide of (C) above, the total number of amino acid residues of repeating units (partial sequences) having 80% or more sequence identity with the repeating units in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is equal to the total number of amino acid residues 80% or more of the cardinal number is preferred.
  • sequence identity between the partial sequence in the peptide (C) and the partial amino acid sequence consisting of the 4th to 192nd amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is from the viewpoint of tissue repair ability. Therefore, it is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the length of the peptide defined in (C) above can be 151 to 2260 amino acid residues, and is preferably 193 or more from the viewpoint of degradability after cross-linking. From the point of view, the number of amino acid residues is preferably 944 or less. More preferably, the number of amino acid residues is 380-756.
  • the above recombinant gelatin can be produced by genetic recombination techniques known to those skilled in the art, and may be produced, for example, according to the methods described in EP1014176A2, US6992172, WO2004/85473 and WO2008/103041. Specifically, a gene encoding an amino acid sequence of a given recombinant gelatin is obtained, incorporated into an expression vector to prepare a recombinant expression vector, and introduced into an appropriate host to prepare a transformant. . Recombinant gelatin is produced by culturing the resulting transformant in an appropriate medium, and the recombinant gelatin used in the present disclosure can be prepared by recovering the recombinant gelatin produced from the culture.
  • tissue repair can be achieved. It can be used as a material, a cell scaffold, a member for transplantation, and the like.
  • the polymeric porous body in this exemplary embodiment is not limited to being made of one material such as recombinant gelatin.
  • it may contain components that promote biological reactions such as growth factors and drugs, and other components that can contribute to tissue repair or regeneration, such as cells.
  • examples of such components include components related to bone regeneration or osteogenesis, such as osteoinductive agents.
  • osteoinductive drugs include BMP (bone morphogenetic factor) and bFGF (basic fibroblast growth factor), but are not particularly limited.
  • the polymer porous body may be applied by being mixed with an inorganic material such as hydroxyapatite or by preparing a composite.
  • the size of the polymer block (that is, the size of the porous polymer body after pulverization) is preferably 0.01 mm or more and 10 mm or less. By setting the polymer block within the above range, a size suitable for the tissue repair material can be obtained. Moreover, it is more preferably 0.1 mm or more and 5 mm or less, and still more preferably 0.3 mm or more and 1.4 mm or less.
  • the size of the polymer block means the size of each polymer block, and means a representative value (for example, average value, median value, etc.) of the sizes of a plurality of polymer blocks. not a thing
  • the size of the polymer block can be defined by the opening of the sieve when the polymer block is sieved. For example, when the polymer blocks passed through a 1.4 mm sieve are passed through a 0.3 mm sieve, the polymer blocks remaining on the sieve are treated as polymer blocks having a size of 0.3 mm or more and 1.4 mm or less. can be
  • the shape of the polymer block is not particularly limited.
  • it may be particulate (granule), amorphous, spherical, powdery, porous, fibrous, spindle-shaped, flattened and sheet-shaped. Particles (granules), amorphous, spherical, powdery and porous are preferred.
  • amorphous means that the surface shape is not uniform, and examples thereof include rock-like irregularities.
  • Example 1 (recombinant gelatin)
  • the recombinant peptide CBE3 was used as the recombinant gelatin contained in the porous polymer material.
  • CBE3 the one described below was used (described in WO2008/103041A1).
  • Molecular weight 51.6 kD Structure: GAP[(GXY) 63 ] 3G Number of amino acids: 571 RGD sequence: 12
  • CBE3 has an ERGD sequence.
  • the amino acid sequence of CBE3 does not contain serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine residues.
  • Isoelectric point 9.34 Hydrophilic repeating unit ratio in polymer: 26.1% Amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) 3G
  • a cylindrical cup-shaped container made of an aluminum alloy (JIS A5056 alloy) was prepared.
  • the container has a closed side surface and a bottom surface and an open top surface when the curved surface is used as a side surface.
  • the bottom surface has a thickness of 5 mm, and the inner circumference of the bottom surface is chamfered with R2 mm.
  • the inside of the side and bottom surfaces is coated with FEP (tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer), resulting in an internal diameter of 104 mm.
  • This container is hereinafter referred to as a "cylindrical container”.
  • a frozen gelatin body was obtained by standing still.
  • the freeze-dried gelatin was freeze-dried using a freeze dryer (DFR-5N-B manufactured by ULVAC, Inc.) to remove moisture, thereby preparing a freeze-dried product.
  • This freeze-dried material is an example of the porous polymer material of the present disclosure.
  • the freeze-dried product had a porosity of 93.9%, a pore size of 50 ⁇ m, and a density of 0.0748 g/cm 3 .
  • the porous polymer material was manually broken into pieces of 20 mm square or less and equilibrated in an environment of 23°C and 50% RH.
  • the porous polymer material after being broken by hand is arranged on a graph paper with a gray ruled line on a black background (both the black background and the gray ruled line are lower in brightness than the porous polymer material), and photographed from the direction perpendicular to the paper surface. did.
  • the photographed image is binarized by image processing so that the porous polymer body region and the rest can be separated, the region corresponding to the porous polymer body (that is, the projected area of the porous polymer body) is specified, and the projected area is determined.
  • ImageJ manufactured by National Institutes of Health
  • a screen 22 with a hole diameter of 0.079 inch was used.
  • the ventilation unit 40 was operated so that the air velocity in the holes of the screen 22 was 8.5 ⁇ 0.1 m/s, and the rotary impeller 24 was rotated at a rotation speed of 1100 ⁇ 10 rpm to implement pulverization.
  • the wind speed was measured using a digital anemometer (CW-60 manufactured by Custom Co., Ltd.).
  • a rake type (7A1611) rotary impeller was used.
  • the amount of air sucked by the ventilation unit 40 was 106 m 3 /h, and the ventilation frequency was 2.6 ⁇ 10 5 times/h.
  • the volume of the trapezoidal rotating body area inside the screen 22 was 4.1 ⁇ 10 ⁇ 4 m 3 .
  • a screen 22 with a hole diameter of 0.040 inch was used.
  • the ventilation part 40 was operated so that the air velocity in the holes of the screen 22 was 10.0 ⁇ 0.1 m/s, and the rotating impeller 24 was rotated at a rotation speed of 2200 ⁇ 10 rpm to implement pulverization.
  • the wind speed was measured using a digital anemometer (CW-60 manufactured by Custom Co., Ltd.).
  • a rake type (7A1611) rotary impeller was used.
  • the amount of air sucked by the ventilation unit 40 was 107 m 3 /h, and the ventilation frequency was 2.6 ⁇ 10 5 times/h.
  • the volume of the trapezoidal rotating body area inside the screen 22 was 4.1 ⁇ 10 ⁇ 4 m 3 .
  • the fraction of the polymer block under the sieve with a mesh size of 1.4 mm and above the sieve with a mesh size of 0.3 mm was recovered and placed in a 10 mL glass vial (barrel diameter: 24.3 mm). 5 ⁇ 3.0 mg was filled.
  • the irradiation part 30 irradiated the crushing part 20 with X-rays (soft X-rays) with a tube voltage of 15 kV.
  • X-rays soft X-rays
  • FIG. 1 two irradiation units 30A and 30B are provided at an angle of 60 degrees to the left and right with respect to the vertical direction (one-dot chain line) of the crushing device 10, and the discharge unit 14 side Soft X-rays were applied to the pulverization unit 20 by a total of three irradiation units including the provided irradiation unit 30C.
  • film (hereinafter referred to as "film") was placed and irradiated with soft X-rays.
  • a dedicated kit Panher System manufactured by Hanshin Technical Research Institute Co., Ltd.
  • the film was developed, fixed, and hardened, etc., and a transmission densitometer (310 manufactured by X-Rite) was used to test the film. Transmission density was measured.
  • irradiation with soft X-rays and measurement of transmission density were repeated while changing the irradiation time.
  • Fig. 2 shows a characteristic curve (dashed line) obtained from the measurement results of transmission density at a distance where the irradiation dose is known.
  • the characteristic curve is represented by plotting the relative irradiation dose (logarithm of the relative X-ray dose) on the horizontal axis and the transmission density on the vertical axis. By using this characteristic curve, the relative irradiation dose can be derived from the transmission density.
  • FIG. 2 also shows an approximation straight line (solid line) obtained by linearly approximating the linear region of the characteristic curve.
  • a film similar to the above was placed inside the screen 22 in the pulverizing section 20, and was irradiated with soft X-rays for 6400 seconds by the three irradiation sections 30A to 30C. Further, the film was developed, fixed, hardened, etc. in the same manner as above, and the transmission density of the film was measured. Based on the approximate straight line of the characteristic curve in FIG. was derived. Table 1 shows the result of derivation of the irradiation dose (70 ⁇ m dose equivalent rate) inside the screen 22 . Since the irradiation dose derived in this manner indicates the irradiation dose inside the screen 22 , it can be regarded as the irradiation dose applied to the porous polymer material being pulverized in the pulverizing section 20 .
  • FIG. 3 shows the configuration of the pulverizing device 10 according to the second embodiment.
  • the irradiation angle of the irradiation section 30B with respect to the crushing section 20 is different from that in the first embodiment (see FIG. 1).
  • two irradiation units 30A and 30B provided at angles of 60 degrees and 5 degrees on one side with respect to the vertical direction (one-dot chain line) of the crushing device 10, and a discharge unit
  • the pulverization unit 20 was irradiated with soft X-rays by a total of three irradiation units including the irradiation unit 30C provided on the unit 14 side.
  • Example 1 In order to verify the effects of the irradiation unit 30 in removing static electricity and suppressing scorching, the porous polymer material was pulverized in Example 1 without irradiation with soft X-rays by the irradiation unit 30 .
  • the other apparatus configuration, recombinant gelatin, method for producing porous polymer, method for pulverizing porous polymer, and method for evaluating scorching of polymer blocks are the same as in Example 1 above, so description thereof is omitted. do.
  • Table 1 shows the proportion of glass vials in which scorching was observed in Comparative Example 1.
  • Example 1 As shown in Table 1, the percentage of burning in Example 1 is 60%, the percentage of burning in Example 2 is 33%, and the percentage of burning in Comparative Example 1 is 90%. and 2, it was found that scorching was suppressed. From this, it can be seen that according to the method and pulverization apparatus 10 of the present disclosure, charring that occurs when pulverizing a porous polymer body can be suppressed by irradiating soft X-rays.
  • Burning may be detected, for example, by detecting a colored portion of the polymer block by image inspection. Alternatively, for example, it may be performed by detecting a change in the chemical structure of the polymer block by a spectroscopic technique such as infrared spectroscopy.

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Abstract

高分子多孔質体を粉砕する粉砕工程と、前記粉砕工程において粉砕中の前記高分子多孔質体を除電する除電工程と、を含む粉砕方法。

Description

粉砕方法、高分子ブロック製造方法及び粉砕装置
　本開示は、粉砕方法、高分子ブロック製造方法及び粉砕装置に関する。
　現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を計る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織において、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す医療技術である。このうち、整形外科領域又は歯科領域の骨再生は、再生医療領域において注目を集めている領域の一つとして知られている。骨疾患が足及び腰の場合は、疾患に起因して発生した欠損部により、歩行不能となり、歯科の場合は食事摂取が困難となることから、骨疾患は著しいＱＯＬ（Quality of Life）の低下を引き起こす。再生医療の分野では、生体親和性の高いコラーゲン又はゼラチンが基材として用いられている。例えば、国際公開ＷＯ２０１４／１３３０８１号公報には、リコンビナントゼラチンの多孔質体を粉砕することで生体親和性高分子ブロックを得ることが開示されている。
　また、高分子多孔質体の粉砕においては、粉砕時に発生する摩擦熱によって粉砕後の高分子ブロックが焦げてしまうという課題がある。この焦げを抑制する技術として、特開昭５５－０９２６６７号公報には、液体窒素を用いて超低温下で粉砕する方法が開示されている。また、特開平９－０００１７６号公報には、液体と混合して湿式粉砕する方法が開示されている。
　しかしながら、特開昭５５－０９２６６７号公報に記載のような超低温下での粉砕は、冷却のためのコストが増大するという課題がある。また、特開平９－０００１７６号公報に記載のような湿式粉砕では、液体を分離除去するための乾燥に手間がかかるという課題がある。近年、こうした方法に代替可能な、又はこうした方法と組み合わせて使用可能な、焦げの発生を抑制できる高分子多孔質体の新たな粉砕方法が求められている。
　本開示は、高分子多孔質体を粉砕する場合に発生する焦げを抑制できる粉砕方法、高分子ブロック製造方法及び粉砕装置を提供する。
　本開示の第１の態様は、粉砕方法であって、高分子多孔質体を粉砕する粉砕工程と、粉砕工程において粉砕中の高分子多孔質体を除電する除電工程と、を含む。
　本開示の第２の態様は、上記第１の態様における除電工程において、高分子多孔質体に放射線を照射することで、高分子多孔質体を除電してもよい。
　本開示の第３の態様は、上記第２の態様において、放射線は、エックス線及び紫外線のうち少なくとも一方であってもよい。
　本開示の第４の態様は、上記第３の態様において、放射線は、線源の管電圧が４ｋＶ以上、５０ｋＶ以下のエックス線であってもよい。
　本開示の第５の態様は、上記第２の態様から第４の態様における除電工程において、高分子多孔質体に照射される放射線の７０μｍ線量当量率は、１ｍＳｖ／ｈ以上、２００Ｓｖ／ｈ以下であってもよい。
　本開示の第６の態様は、上記態様における除電工程において、高分子多孔質体を粉砕する粉砕部の少なくとも一部における電位が＋１０００Ｖから＋１００Ｖに変化するまでの除電時間は、０．０１秒以上、１０秒以下であってもよい。
　本開示の第７の態様は、上記態様における粉砕工程において、乾式粉砕を行う粉砕部を用いて、高分子多孔質体を粉砕してもよい。
　本開示の第８の態様は、上記第７の態様において、粉砕部は、スクリーン及び回転インペラを備えてもよい。
　本開示の第９の態様は、上記第７の態様又は第８の態様において、粉砕部は、１×１０４回／ｈ以上、１×１０７回／ｈ以下の換気回数で換気されてもよい。
　本開示の第１０の態様は、上記第９の態様における除電工程において、粉砕部の少なくとも一部に放射線を照射することで、高分子多孔質体を除電してもよい。
　本開示の第１１の態様は、上記態様において、高分子多孔質体は、タンパク質を含んでいてもよい。
　本開示の第１２の態様は、上記第１１の態様において、高分子多孔質体は、下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドを含んでいてもよい。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド。
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列中、第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド。
　本開示の第１３の態様は、上記態様において、粉砕前の高分子多孔質体の大きさは、０．１ｍｍ以上、５０ｍｍ以下であってもよい。
　本開示の第１４の態様は、上記態様において、粉砕後の高分子多孔質体の大きさは、０．０１ｍｍ以上、１０ｍｍ以下であってもよい。
　本開示の第１５の態様は、高分子ブロック製造方法であって、高分子多孔質体を粉砕する粉砕工程と、粉砕工程において粉砕中の高分子多孔質体を除電する除電工程と、を含む。
　本開示の第１６の態様は、粉砕装置であって、高分子多孔質体を粉砕する粉砕部と、粉砕部の少なくとも一部に放射線を照射する照射部と、を備え、照射部により照射される放射線によって、粉砕部において粉砕中の高分子多孔質体を除電する。
　本開示の第１７の態様は、上記第１６の態様において、粉砕装置は、粉砕部を換気する換気部を更に備え、換気部による粉砕部の換気回数は、１×１０４回／ｈ以上、１×１０７回／ｈ以下であってもよい。
　なお、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の効果が達成されれば、本用語に含まれる。
　上記態様によれば、本開示の粉砕方法、高分子ブロック製造方法及び粉砕装置は、高分子多孔質体を粉砕する場合に発生する焦げを抑制できる。
粉砕装置の構成の一例を示す概略構成図である。 エックス線フィルムの特性曲線である。 粉砕装置の構成の一例を示す概略構成図である。
　以下、本開示の技術を実施するための形態例を、詳細に説明する。
［高分子多孔質体の粉砕方法］
　本例示的実施形態に係る高分子多孔質体の粉砕方法は、高分子多孔質体を粉砕する粉砕工程と、上記粉砕工程において粉砕中の上記高分子多孔質体を除電する除電工程と、を含む。以下、粉砕工程により粉砕された後の高分子多孔質体を「高分子ブロック」という。換言すれば、本例示的実施形態に係る方法は、高分子多孔質体を粉砕する粉砕工程と、前記粉砕工程において粉砕中の高分子多孔質体を除電する除電工程と、を実行することで、高分子ブロックを製造する方法である。以下、本例示的実施形態に係る粉砕方法と、高分子ブロック製造方法と、を総称して「本開示の方法」という。なお、本開示の方法は、粉砕工程と除電工程を行ったのち、再度粉砕工程と除電工程を繰り返すものであってもよい。粉砕工程と除電工程を行う回数としては、１～４回が好ましく、２～３回がより好ましい。
（粉砕工程）
　上述したように、本開示の方法は、高分子多孔質体を粉砕する粉砕工程を含む。本明細書において、「粉砕」とは、機械的エネルギーを与えることで固体及び固体の集合体を細分化することである。本開示の方法における粉砕手段の一例としては、乾式粉砕と湿式粉砕が挙げられるが、液体を分離除去するための乾燥等にかかる手間及びコストを省く観点から、乾式粉砕を用いることが好ましい。粉砕は、粉砕装置に備えられた粉砕部（詳細は後述）により行うことができる。
（除電工程）
　上述したように、本開示の方法は、上記粉砕工程において粉砕中の高分子多孔質体を除電する除電工程を含む。本明細書において、「除電」とは、帯電した物質から静電気を除去することを意味する。本開示の方法における除電方法の一例としては、放射線照射方法、コロナ放電方法、帯電防止剤添加方法及び加湿方法等が挙げられる。また、これらの除電方法のうち二つ以上を適宜組み合わせてもよい。なかでも、帯電防止剤等の添加、及び被粉砕物の摩擦係数に影響を与える可能性のある高湿度環境の形成等が不要という観点から、放射線照射方法及びコロナ放電方法が好ましい。特に、放射線照射方法によれば、除電能力を高めることができる。放射線の照射は、粉砕装置に備えられた照射部（詳細は後述）により行うことができる。
　除電工程において高分子多孔質体に照射される「放射線」は、アルファ線及びベータ線等の粒子線、エックス線及びガンマ線等の電磁波、並びに赤外線、可視光線及び紫外線等の非電離放射線等を含む。ただし、照射対象の高分子多孔質体の変性を起こしにくいという観点から、放射線はエックス線及び紫外線のうち少なくとも一方とすることが好ましい。また、透過性により高分子多孔質体の内部の空気をイオン化し、高分子多孔質体の内部からも除電できるとの観点から、エックス線とすることがより好ましい。また、高分子多孔質体の変性を起こしにくいという観点から、線源の管電圧が４ｋＶ以上、５０ｋＶ以下のエックス線（いわゆる軟エックス線）とすることがさらに好ましく、線源の管電圧が４ｋＶ以上、２０ｋＶ以下のエックス線とすることが特に好ましい。
　上記放射線の７０μｍ線量当量率は、１ｍＳｖ／ｈ以上、２００Ｓｖ／ｈ以下であることが好ましく、２ｍＳｖ／ｈ以上、２００Ｓｖ／ｈ以下であることがより好ましい。放射線の照射線量は、例えば、サーベイメータにより測定できる。また、放射線の７０μｍ線量当量率は、後述の実施例１における（照射線量の測定）に記載の方法に基づいて測定した値である。除電工程において、放射線は、粉砕工程における高分子多孔質体の粉砕中、照射され続けることが好ましい。
　除電能力は、チャージプレートモニタ（帯電プレートモニタ及びイオナイザパフォーマンステスタ等とも呼ばれる）を用いて評価することができる。例えば、ＭＯＤＥＬ１５６Ａ（トレック社製）のようなＡＮＳＩ／ＥＳＤ－ＳＴＭ３．１に準拠したチャージプレートモニタか、それに類するものを使用することができる。特定の静電容量をもつ帯電電極において、除電により特定の初期電位から特定の電位に変化するまでの時間を除電時間と呼び、これを測定することによって、除電に要する所要時間を評価することができる。例えば、２０±１ピコファラッドの静電容量をもつ１ｉｎｃｈ角チャージプレート（トレック社製１５６Ｐ－Ｃ２５Ｘ２５－Ｓ３Ｍ）において、＋１０００Ｖの初期電位から＋１００Ｖの電位に変化するまでの時間を除電時間として測定することができる。この方法で測定した除電時間は、粉砕装置の粉砕部の少なくとも一部において、０．０１秒以上、１０秒以下であることが好ましく、０．０１秒以上、２秒以下であることがより好ましい。
（分級工程）
　本開示の方法は、さらに高分子ブロック（粉砕後の高分子多孔質体）を分級する分級工程を含んでいてもよい。「分級」とは、性状の異なる高分子ブロックをそれらの性状に応じて分別する操作のことである。高分子ブロックの性状としては、大きさ、形状、密度、磁性、色及び化学成分等が挙げられる。高分子ブロックの大きさによって分級する方法としては、流体を介在させて行う流体分級、及びふるいによってふるいの網より大きな高分子ブロックとそれ以下の大きさの高分子ブロックに分けるふるい分け等が挙げられる。流体分級としては、サイクロンを適用してもよい。ふるい分けには、ふるい、メッシュ及びフィルタ等を適用してもよい。分級工程は、粉砕工程及び／又は除電工程と同時に行われてもよく、粉砕工程及び／又は除電工程の後に行われてもよい。ふるい分けによる分級工程は、粉砕装置に備えられた分級のためのふるい（詳細は後述）により行うことができる。
　上述したような各工程を含む本開示の方法によれば、高分子多孔質体の粉砕時に発生する摩擦熱による焦げを抑制することができる。この要因を、本発明者らは以下のように推測している。
　粉砕中の高分子多孔質体は、粉砕部及び／又は他の高分子多孔質体との摩擦で生じる静電気によって、粉砕部に帯電付着する場合がある。粉砕中の高分子多孔質体が粉砕部に帯電付着すると、摩擦時間が増加するため摩擦熱の量も増加し、焦げが発生しやすくなる。なお、ここでの「摩擦時間」とは、粉砕中の高分子多孔質体が粉砕部及び／又は他の高分子多孔質体との摩擦による摩擦力を受けている時間をいう。
　帯電付着は、静電気力等により付着する力と重力等により脱着する力との差し引きによって決まるため、密度が小さい物体ほど付着する力に比べて脱着する力が小さく、帯電付着が起こりやすい。したがって、多孔質ではない高分子体よりも密度が小さい高分子多孔質体は、粉砕部に帯電付着しやすく、焦げが発生しやすい傾向にある。なお、「焦げ」とは、摩擦熱による温度上昇により、高分子多孔質体において酸化、分解、架橋及び／又はメイラード反応等が起こり、性質が変化（例えば、着色）することをいう。
　そこで、本開示の方法は、粉砕部で粉砕中の高分子多孔質体を除電する。これにより、高分子多孔質体が粉砕部に帯電付着することを抑制し、摩擦時間を短縮して摩擦熱の量を低減させることができると推測される。したがって、密度が小さいために帯電付着しやすく、焦げが発生しやすい高分子多孔質体の粉砕においても、焦げの発生を抑制できる。
［粉砕装置］
　次に、本開示の別の例示的実施形態としての粉砕装置について説明する。図１を参照して、本例示的実施形態に係る粉砕装置１０の構成の一例を説明する。図１は、粉砕装置１０の構成を示す概略図である。粉砕装置１０は、上記の例示的実施形態に係る方法における粉砕工程、除電工程及び分級工程を実行する機能を有する。
　図１に示すように、粉砕装置１０は、粉砕部２０と、少なくとも１台の照射部３０と、換気部４０と、を備える。図１では、照射部３０の一例として３台の照射部３０Ａ～３０Ｃを図示しているが、以下、照射部３０Ａ～３０Ｃを区別しない場合は単に「照射部３０」という。粉砕装置１０において、高分子多孔質体が投入部１２から投入されると、粉砕部２０により高分子多孔質体が粉砕され、排出部１４から排出される。図１における各矢印Ａは、換気部４０により換気される空気の流れを示しており、高分子多孔質体もこの流れに沿って輸送される。
　粉砕部２０は、高分子多孔質体を粉砕する。粉砕部２０としては、公知の乾式粉砕及び湿式粉砕を行う各種装置に含まれる粉砕機能を適用できる。このような装置としては、スクリーンミル、ハンマーミル、ボールミル、ビーズミル、ジェットミル、カッターミル、振動ミル、ローラーミル、ラインミル、スタンプミル、ディスクミル、ピンミル、グラインディングミル、ローターミル、サイクロンミル、ロッドミル、パワーミル、ポットミル、ジョークラッシャー、ジャイレトリクラッシャー、インパクトクラッシャー、ロールクラッシャー及びエッジランナーが挙げられる。なかでも、液体を分離除去するための乾燥等にかかる手間及びコストを省く観点から、乾式粉砕を行う装置を用いることが好ましい。
　特に、一定の大きさに粉砕されたものから随時回収されることにより、粒径分布のばらつきが小さいとの観点から、乾式粉砕を行う装置の一例であるスクリーンミルを用いることが好ましい。スクリーンミルとしては、例えば、クアドロ社製コーミルが挙げられる。図１は、粉砕部２０としてスクリーンミルに含まれる粉砕機能を用いた図を示している。スクリーンミルは、複数の孔が設けられたスクリーン２２と、回転インペラ２４と、を粉砕機能として含んでいる。スクリーンミルにおいては、投入部１２から投入された高分子多孔質体を回転インペラ２４を用いてスクリーン２２に押し当てることで、高分子多孔質体をスクリーン２２の孔の大きさ以下となるように粉砕し、排出部１４から排出する。回転インペラはレーキ型、丸形、角形であることが好ましく、レーキ型であることがより好ましい。なお、図１では回転インペラ２４を駆動させるモータ等の記載を省略している。
　高分子ブロックを組織修復材（詳細は後述）に適した大きさにする観点から、スクリーン２２の孔径は、０．００６ｉｎｃｈ以上、０．２５ｉｎｃｈ以下とすることが好ましく、０．０４ｉｎｃｈ以上、０．０８ｉｎｃｈ以下とすることがより好ましい。効率よく粉砕する観点から、回転インペラの回転数は、１００ｒｐｍ以上、６０００ｒｐｍ以下とすることが好ましく、１０００ｒｐｍ以上、３０００ｒｐｍ以下とすることがより好ましい。スクリーン２２の孔における風速は、５ｍ／ｓ以上、２０ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、７ｍ／ｓ以上、１５ｍ／ｓ以下とすることがより好ましい。
　なお、本明細書において、粉砕部２０とは、実際に高分子多孔質体を粉砕し得る領域のことをいい、例えば、図１の場合、スクリーン２２の内側である台形回転体の領域を指す。粉砕装置１０において公知のスクリーンミルを適用する場合、スクリーンミルが備えるスクリーン２２及び回転インペラ２４が粉砕部２０に該当し、スクリーンミルが備えるその他の構成要素は、粉砕部２０には該当しない。例えば、公知のスクリーンミルが備える投入部及び排出部は、それぞれ粉砕装置１０の投入部１２及び排出部１４に該当する。
　照射部３０は、粉砕部２０の少なくとも一部に放射線を照射することで、粉砕部２０において粉砕中の高分子多孔質体に放射線を照射し、高分子多孔質体を除電する。放射線を粉砕部２０の少なくとも一部に照射することにより、粉砕部２０内の空気が電離されて正負のイオンが生成される。すなわち、静電気により帯電している高分子多孔質体の電荷と逆の電荷を持つイオンが生成される。これにより、高分子多孔質体の電荷が中和され、高分子多孔質体は除電される。なお、粉砕部２０内において高分子多孔質体は攪拌されるため、粉砕部２０の少なくとも一部において高分子多孔質体が除電されれば、焦げの発生を抑制するという効果が得られる。
　また、照射部３０は、粉砕部２０の少なくとも一部の他、投入部１２及び排出部１４に放射線を照射してもよい。投入部１２及び排出部１４に放射線を照射することで、高分子多孔質体及び高分子ブロックが投入部１２及び排出部１４に帯電付着することを抑制できるので、高分子ブロックの収率を向上させることができる。
　粉砕装置１０における照射部３０の位置は、照射部３０の少なくとも一つが、粉砕部２０の少なくとも一部に放射線を照射できる位置であれば特に限定されない。ただし、照射部３０の少なくとも一つを、粉砕装置１０の鉛直方向に対して３０～９０度の角度に設けることが好ましく、４５～９０度の角度に設けることがより好ましい。また、照射部３０の別の一つを、粉砕装置１０の鉛直方向に対して０～６０度の角度に設けることが好ましく、０～４５度の角度に設けることがより好ましい。
　また、図１に示すように、粉砕装置１０は、粉砕部２０により粉砕した高分子ブロックの分級のためのふるい１６を備えていてもよい。高分子ブロックをふるい１６にかけ、ふるい１６上に残留した高分子ブロックのみを抽出する（すなわち、ふるい１６を通過した高分子ブロックは除外する）ことにより、粒径分布のばらつきが小さい高分子ブロックを得ることができる。
　また、粉砕装置１０は、粉砕部２０の内部を換気する換気工程を実行してもよい。具体的には、換気部４０が、図１の各矢印Ａに示すように粉砕装置１０内の空気を吸引することで、粉砕部２０の内部を換気してもよい。換気部４０によって粉砕部２０の内部を換気することで、粉砕中の高分子多孔質体の近傍の空気を入れ換えることができるので、粉砕中の高分子多孔質体の近傍の空気を照射部３０が照射する放射線により効率的にイオン化させることができる。したがって、除電効果を向上させることができる。
　換気部４０による粉砕部２０の換気回数は、１×１０４回／ｈ以上、１×１０７回／ｈ以下であることが好ましい。また、換気部４０による粉砕部２０の換気回数は、１×１０５回／ｈ以上、１×１０７回／ｈ以下であることがより好ましく、２．５×１０５回／ｈ以上、１×１０７回／ｈ以下であることが更に好ましい。「換気回数」とは、以下の式で計算される値を指す。
換気回数（回／ｈ）＝（換気部４０による一時間あたりの風量（ｍ３／ｈ））
　　　　　　　　　　／（粉砕部２０の容積（ｍ３））
　粉砕部２０の容積は、１．０×１０－４ｍ３以上、１．０×１０－２ｍ３以下であることが好ましく、２．０×１０－４ｍ３以上、１．０×１０－３ｍ３以下であることがより好ましい。換気部４０による風量は、２５ｍ３／ｈ以上、４００ｍ３／ｈ以下であることが好ましく、５０ｍ３／ｈ以上、２００ｍ３／ｈ以下であることがより好ましい。
　上述したように、粉砕部２０とは高分子多孔質体を粉砕し得る領域のことを意味するため、「粉砕部２０の容積」とは、「高分子多孔質体を粉砕し得る領域の容積」を意味する。例えば、図１のスクリーンミルの場合、スクリーン２２の内側である台形回転体の領域の容積である。なお、粉砕装置１０のうち、粉砕部２０（すなわち高分子多孔質体を粉砕し得る領域）において上記の換気回数となれば除電効果を向上させることができるので、他の領域（例えば、スクリーン２２の外側の領域）においては上記の換気回数を満たさなくてもよい。
　また、換気部４０が、ふるい１６を通過した高分子ブロックを吸引してもよい。換気部４０としては、集塵機等を適宜用いることができる。
　以上説明したように、粉砕装置１０は、高分子多孔質体を粉砕する粉砕部２０と、粉砕部２０の少なくとも一部に放射線を照射する照射部３０と、を備え、照射部３０により照射される放射線によって、粉砕部２０において粉砕中の高分子多孔質体を除電する。したがって、密度が小さいために帯電付着しやすく、焦げが発生しやすい高分子多孔質体の粉砕においても、焦げの発生を抑制できる。
［高分子多孔質体］
　次に、本例示的実施形態において用いられる高分子多孔質体について説明する。「高分子」とは、分子量が大きい分子で、分子量が小さい分子から実質的又は概念的に得られる単位の多数回の繰り返しで構成した構造を有する分子を言う。高分子の例としては、ポリアミン、ポリサッカライド、ポリペプチド、タンパク質、ポリアミド、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリエーテル及びポリヌクレオチド等が挙げられる。「多孔質体」とは、内部に孔（空隙）をもつ固体を意味する。高分子多孔質体は、例えば、高分子水溶液凍結体から水分を除去することにより得られる。
　また、本例示的実施形態における高分子多孔質体は、生体親和性のある物質を含んでいてもよい。「生体親和性」とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応等のような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。生体親和性のある物質の例としては、タンパク質及び多糖類が挙げられる。本例示的実施形態における高分子多孔質体は、タンパク質を含んでいてもよい。
　粉砕される前の高分子多孔質体の大きさは、０．１ｍｍ以上、５０ｍｍ以下であることが好ましい。粉砕前の高分子多孔質体の大きさを上記の範囲内にすることで、粉砕にかかる時間を短縮できる。なお、粉砕前の高分子多孔質体の大きさを０．１ｍｍ以上、１６ｍｍ以下とすることがより好ましい。高分子多孔質体の大きさは、高分子多孔質体の投影面積の平方根、すなわち投影面積と同じ面積をもつ正方形の一辺の長さで定義できる。
　高分子多孔質体の孔径は、生体との親和性を高めるとの観点から、１０μｍ以上、２５００μｍ以下であることが好ましく、４０μｍ以上、１０００μｍ以下であることがより好ましい。高分子多孔質体の孔径は、高分子多孔質体の中央付近の切断面を顕微鏡で観察した場合の、孔部分と同じ面積をもつ円の直径（円相当径）として計測でき、観察領域内のすべての孔部分の円相当径の中央値として評価できる。
　高分子多孔質体の密度は、０．０１ｇ／ｃｍ３以上、０．３ｇ／ｃｍ３以下であることが好ましく、０．０５ｇ／ｃｍ３以上、０．１ｇ／ｃｍ３以下であることがより好ましい。高分子多孔質体の密度は、高分子多孔質体の質量を、内部の空隙も含む高分子多孔質体の見かけの体積で除することで算出できる。
　高分子多孔質体の空隙率は、生体との親和性を高めるとの観点から、８０．００％以上、９９．９９％以下であることが好ましく、９２．０１％以上、９９．９９％以下であることがより好ましい。「空隙率」は、以下の式で計算される値を指す。
空隙率（％）
　＝１００－１００×質量（ｇ）÷体積（ｃｍ３）÷真比重（ｇ／ｃｍ３）
　また、本例示的実施形態における高分子多孔質体は、再生医療材料として用いるとの観点から、生分解性高分子を含んでいることが好ましい。生分解性高分子の例としては、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチド及び化学合成ペプチド等のポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）が挙げられる。また、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン及びキトサン等が挙げられる。上記の中でも、本例示的実施形態における高分子多孔質体は、リコンビナントペプチドを含んでいることが特に好ましい。なお、非生分解性高分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、シリコーン及びＭＰＣ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等が挙げられる。
　リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチド等のポリペプチドの種類は、生体親和性及び生分解性を有するものであれば特に限定されない。このようなポリペプチドとしては、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン及びレトロネクチン等が挙げられる。なかでも、本例示的実施形態における高分子多孔質体は、ゼラチン、コラーゲン又はアテロコラーゲンを含むことが好ましく、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン又は化学合成セラチンを含むことがより好ましく、リコンビナントゼラチンを含むことが更に好ましい。ここでいう天然ゼラチンとは、天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
　天然ゼラチン及びそのリコンビナントゼラチンの例としては、魚類、哺乳類等の動物に由来するものが挙げられるが、哺乳類の動物に由来するものであることが好ましい。哺乳類の動物の例としては、ヒト、ウマ、ブタ、マウス及びラット等が挙げられる。本例示的実施形態に係る高分子多孔質体がリコンビナントゼラチンを含む場合、そのリコンビナントゼラチンは、ヒトに由来するものであることがより好ましい。
　以下、ポリペプチドを構成するアミノ酸配列を、当業界で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇｌｙ」）を用いて表現する。また、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸（又はイミノ酸）残基の個数を基準とする。
（リコンビナントゼラチン）
　以下、本例示的実施形態における高分子多孔質体が含み得る、生体親和性及び生分解性を有し、骨等の組織再生能を有するリコンビナントゼラチンについて説明する。本開示において、リコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。下記のリコンビナントゼラチンは、生体内に埋植されることにより当該部位における組織の形成に寄与する組織修復材料として用いることができる。なお、「組織修復材料」とは、埋植部位に通常存在する正常組織の形成に寄与するものに限定されず、瘢痕組織等を含む非正常組織の形成を促進する材料も包含するものである。また、組織修復材料により修復可能な「組織」は、例えば歯及び骨等の硬組織であってもよく、下記のリコンビナントゼラチンは特に骨再生用基材として好適である。
　リコンビナントゼラチンは、コラーゲンで特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であってもよく、異なってもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙにおいて、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ｘ及びＹはグリシン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。Ｘ及びＹとしては、イミノ酸残基、即ちプロリン残基又はオキシプロリン残基が多く含まれることが好ましい。このようなイミノ酸残基の含有率は、ゼラチン全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。ゼラチン中のＧｌｙ－Ｘ－Ｙの含有率としては、全体の８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９９％以上であることが更に好ましい。
　リコンビナントゼラチンとしては、例えば、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３、ＷＯ２００８／１０３０４１、特表２０１０－５１９２９３、特表２０１０－５１９２５２、特表２０１０－５１８８３３、特表２０１０－５１９２５１、ＷＯ２０１０／１２８６７２及びＷＯ２０１０／１４７１０９等に開示されているものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
　リコンビナントゼラチンは、２ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以下の分子量であることが好ましく、５ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以下の分子量であることがより好ましく、１０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以下の分子量であることが更に好ましい。
　また、リコンビナントゼラチンは、生体親和性の観点から、細胞接着シグナルを更に含むものであることが好ましく、細胞接着シグナルを一分子中に２つ以上有することものであることがより好ましい。このような細胞接着シグナルとしては、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列の各配列が挙げられる。なかでも、ＲＧＤ配列であることが好ましく、ＲＧＤ配列のうちＥＲＧＤ配列であることがより更に好ましい。
　ただし、リコンビナントゼラチンの配列は、以下の態様（１－１）～（１－３）のうち少なくとも一つを満たすことが好ましい。なお、リコンビナントゼラチンは、以下の態様（１－１）～（１－３）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものであってもよい。
　（１－１）セリン残基及びスレオニン残基を含まない。
　（１－２）セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基及びシステイン残基を含まない。
　（１－３）Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐで示されるアミノ酸配列を含まない。
　リコンビナントゼラチンは、Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂの繰返し構造を有することが好ましい。ｍは、２～１０を表し、３～５を表すことが好ましい。Ａ及びＢは、任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を表す。ｎは３～１００を表し、１５～７０を表すことが好ましく、５０～６５を表すことがより好ましい。
　より好ましくは、リコンビナントゼラチンは、式：Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙで示される。上記の式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸残基の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸残基の何れかを示す。なお、３個の［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
　リコンビナントゼラチンは、以下の態様（２－１）～（２－４）のうち少なくとも一つを満たすことが好ましい。なお、リコンビナントゼラチンは、以下の態様（２－１）～（２－４）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものであってもよい。
　（２－１）カルバモイル基が加水分解されていない。
　（２－２）プロコラーゲンを有さない。
　（２－３）テロペプタイドを有さない。
　（２－４）天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料である。
　リコンビナントゼラチンは、組織修復能の高さから、以下（Ａ）～（Ｃ）の何れかとすることが好ましい。
　（Ａ）下記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G（配列番号１）
　（Ｂ）上記配列番号１のアミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸残基が改変（例えば、欠失、置換又は付加）されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド。
　（Ｃ）上記配列番号１のアミノ酸配列中、第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド。
　上記（Ｂ）で規定されるペプチドにおいて、改変（例えば、欠失、置換又は付加）されるアミノ酸残基数は、リコンビナントゼラチンの総アミノ酸残基数によって異なるが、例えば、２～１５個であることが好ましく、２～５個であることがより好ましい。
　上記（Ｃ）において、対比される２種のペプチド（すなわち上記（Ａ）のペプチドと上記（Ｃ）のペプチド）のアミノ酸配列に関する「配列同一性」とは、以下の式で計算される値を指す。なお、複数のペプチドの対比（アライメント）は、同一となるアミノ酸残基の数が最も多くなるように常法に従って行うものとする。
配列同一性（％）
　＝［（同一となるアミノ酸残基の数）／（アライメント長）］×１００
　上記（Ｃ）において、「第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列における繰返し単位に相当する。「部分配列」は、上記（Ｃ）の配列における繰返し単位に相当する。上記（Ｃ）のペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列中の繰返し単位との配列同一性が８０％以上となる繰返し単位（部分配列）を少なくとも１つ含めばよく、２つ以上含むことが好ましい。
　なお、上記（Ｃ）のペプチドが複数の異なる繰返し単位を含む場合、複数の繰返し単位のうちの一部は、配列番号１で示されるアミノ酸配列中の繰返し単位との配列同一性が８０％未満となってもよい。ただし、上記（Ｃ）のペプチドにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列中の繰返し単位と８０％以上の配列同一性を有する繰返し単位（部分配列）の合計のアミノ酸残基数が、全アミノ酸残基数の８０％以上となることが好ましい。
　また、上記（Ｃ）のペプチドにおける部分配列と、配列番号１のアミノ酸配列中の第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と、の配列同一性は、組織修復能の観点から、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
　上記（Ｃ）で規定されるペプチドの長さとしては、１５１～２２６０個のアミノ酸残基数とすることができ、架橋後の分解性の観点から１９３個以上であることが好ましく、安定性の観点から９４４個以下のアミノ酸残基数であることが好ましい。また、３８０～７５６個のアミノ酸残基数であることがより好ましい。
　以上のリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造でき、例えば、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３及びＷＯ２００８／１０３０４１等に記載の方法に準じて製造してもよい。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本開示で用いるリコンビナントゼラチンを調製できる。
　以上のようにして製造したリコンビナントゼラチンを含む高分子多孔質体を、上記例示的実施形態において説明した粉砕装置１０により粉砕することで、種々の大きさの高分子ブロックを製造すれば、組織修復材、細胞足場及び移植用部材等として用いることができる。
　なお、本例示的実施形態における高分子多孔質体は、リコンビナントゼラチン等の一つの材料からなるものに限らない。例えば、リコンビナントゼラチンに加えて、増殖因子及び薬剤のような生体の反応を促す成分、並びに細胞等の、組織の修復又は再生に寄与しうる他の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、骨誘導薬剤等の骨再生又は骨新生に関する成分を挙げることができる。骨誘導薬剤としては、例えばＢＭＰ（骨形成因子）やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が挙げられるが、特に限定はされない。また、高分子多孔質体は、ハイドロキシアパタイト等の無機材料と混合、ないしコンポジットを作製して適用してもよい。
［高分子ブロック］
　高分子ブロックの大きさ（すなわち、粉砕された後の高分子多孔質体の大きさ）は、０．０１ｍｍ以上、１０ｍｍ以下であることが好ましい。高分子ブロックを上記の範囲内にすることで、組織修復材に適した大きさとすることができる。また、０．１ｍｍ以上、５ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以上、１．４ｍｍ以下であることが更に好ましい。なお、高分子ブロックの大きさとは、一つ一つの高分子ブロックの大きさを意味するものであり、複数の高分子ブロックの大きさの代表値（例えば平均値及び中央値等）を意味するものではない。
　高分子ブロックの大きさは、高分子ブロックをふるいにかけた際のふるいの目開きで定義することができる。例えば、１．４ｍｍのふるいにかけ、通過した高分子ブロックを０．３ｍｍのふるいにかけた場合にふるいの上に残る高分子ブロックを、０．３ｍｍ以上、１．４ｍｍ以下の大きさの高分子ブロックとすることができる。
　なお、高分子ブロックの形状は特に限定されない。例えば、粒子状（顆粒）、不定形、球状、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状及びシート状であってもよい。好ましくは、粒子状（顆粒）、不定形、球状、粉状及び多孔質状である。「不定形」とは、表面形状が均一でないものを意味し、例えば、岩のような凹凸を有するものが挙げられる。
　次に、実施例を挙げて本開示の技術を詳細に説明する。なお、本開示の技術は下記の各実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（リコンビナントゼラチン）
　本実施例においては、高分子多孔質体が含むリコンビナントゼラチンとして、リコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いた。ＣＢＥ３としては、以下に記載のものを用いた（ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１に記載）。
　　分子量：５１．６ｋＤ
　　構造：　ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
　　アミノ酸数：５７１個
　　ＲＧＤ配列：１２個
　　イミノ酸含量：３３％
　　ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。
　　ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
　　ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基及びシステイン残基は含まれていない。
　　等電点：９．３４
　　高分子中の親水性繰返し単位比率：２６．１％
　　アミノ酸配列（配列番号１）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
（凍結時に使用した容器）
　アルミニウム合金（ＪＩＳ　Ａ５０５６合金）製の円筒カップ状容器を用意した。容器は、曲面を側面としたとき、側面及び底面が閉鎖され、上面は開放された形をしている。底面は厚さ５ｍｍであり、底面内周がＲ２ｍｍで面取りされている。側面及び底面の内部が、ＦＥＰ（テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体）でコートされ、結果として容器の内径は１０４ｍｍとなっている。以下、この容器を「円筒形容器」という。
（高分子多孔質体の作製）
　上記リコンビナントゼラチンを含む溶液を精製後、３０℃にて４．０質量％まで限外ろ過により濃縮した。得られたゼラチン水溶液を凍結乾燥した後、凍結乾燥体に注射用水を加えて３０分かけて３７℃まで昇温して再溶解し、７．５質量％のゼラチン水溶液を改めて得た。このゼラチン水溶液を、円筒形容器に約２０ｇ流し込んだ後、約－３５℃に予冷した３５０×６３４×２０ｍｍアルミ板上に１ｍｍ厚のガラス板を介して１４個設置し、蓋をして１時間静置することによって凍結したゼラチン凍結体を得た。このゼラチン凍結体を、凍結乾燥機（（株）アルバック製ＤＦＲ－５Ｎ－Ｂ）を用いて凍結乾燥して水分を除去することにより、凍結乾燥体を作製した。この凍結乾燥体が、本開示の高分子多孔質体の一例である。また、この凍結乾燥体について、空隙率は９３．９％、孔径は５０μｍ、密度は０．０７４８ｇ／ｃｍ３であった。
　高分子多孔質体を２０ｍｍ角以下の大きさに手で割り、２３℃、５０％ＲＨの環境で平衡化した。手で割った後の高分子多孔質体を黒地にグレー罫線（黒地及びグレー罫線は、共に高分子多孔質体よりも明度が低い）が設けられた方眼紙に並べ、紙面に対する垂直方向から撮影した。撮影画像を、画像処理により高分子多孔質体領域とそれ以外が分けられるように二値化し、高分子多孔質体にあたる領域（すなわち高分子多孔質体の投影面積）を特定し、該投影面積の平方根を高分子多孔質体の粉砕前の大きさとして算出した。その結果、中央値は１０.６ｍｍ、最小値は６．７ｍｍ、最大値は１４.５ｍｍであった。なお、画像処理のソフトウェアとしては、ＩｍａｇｅＪ（National Institutes of Health製）を用いた。
（高分子多孔質体の粉砕）
　上記のようにして手で割った高分子多孔質体約４０ｇを、図１に示す構成の粉砕装置１０により粉砕した。粉砕部２０としてはスクリーンミル（クアドロ社製コーミルＵ１０）の粉砕部を用いた。照射部３０としては軟エックス線照射装置（浜松ホトニクス（株）製Ｌ１４４７１）を用いた。換気部４０としては集塵機（チコーエアテック（株）製ＣＫＵ－４５０ＡＴ－ＨＣ）を用いた。粉砕は、それぞれ孔径が異なるスクリーン２２を用いて、２回行った。
　１回目の粉砕では、スクリーン２２として孔径が０．０７９ｉｎｃｈのものを用いた。この際、スクリーン２２の孔における風速が８．５±０．１ｍ／ｓとなるように換気部４０を操作し、回転インペラ２４を１１００±１０ｒｐｍの回転数で回転させて粉砕を実施した。風速はデジタル風速計（（株）カスタム製ＣＷ－６０）を用いて測定した。回転インペラはレーキ型（７Ａ１６１１）を用いた。換気部４０による吸引風量は１０６ｍ３／ｈであり、換気回数は２．６×１０５回／ｈであった。また、スクリーン２２の内側である台形回転体の領域（すなわち、高分子多孔質体を粉砕し得る領域）の容積は４．１×１０－４ｍ３であった。
　２回目の粉砕では、スクリーン２２として孔径が０．０４０ｉｎｃｈのものを用いた。この際、スクリーン２２の孔における風速が１０．０±０．１ｍ／ｓとなるように換気部４０を操作し、回転インペラ２４を２２００±１０ｒｐｍの回転数で回転させて粉砕を実施した。風速はデジタル風速計（（株）カスタム製ＣＷ－６０）を用いて測定した。回転インペラはレーキ型（７Ａ１６１１）を用いた。換気部４０による吸引風量は１０７ｍ３／ｈであり、換気回数は２．６×１０５回／ｈであった。また、スクリーン２２の内側である台形回転体の領域（すなわち、高分子多孔質体を粉砕し得る領域）の容積は４．１×１０－４ｍ３であった。
　２回目の粉砕後、目開き１．４ｍｍのふるい下、かつ、目開き０．３ｍｍのふるい上の画分の高分子ブロックを回収し、１０ｍＬのガラスバイアル（胴径２４．３ｍｍ）に８９．５±３．０ｍｇずつ充填した。
　上記１回目及び２回目の高分子多孔質体の粉砕処理と並行して、照射部３０により粉砕部２０に対して管電圧１５ｋＶのエックス線（軟エックス線）を照射した。具体的には、図１に示すように、粉砕装置１０の鉛直方向（一点鎖線）に対して左右それぞれ６０度の角度に設けられた２台の照射部３０Ａ及び３０Ｂと、排出部１４側に設けられた照射部３０Ｃと、の合計３台の照射部によって、粉砕部２０に対して軟エックス線を照射した。
（高分子ブロックの焦げの評価）
　ガラスバイアルに充填された高分子ブロックを、ガラスバイアルの底からルーペで観察し、ガラスバイアルを揺すりながら焦げ（すなわち着色）の有無を目視で検査した。高分子ブロックを充填した３０本のガラスバイアルのうち、焦げを認めたガラスバイアルの割合を、表１に示す。
（照射線量の測定）
　図１の構成において、３台の照射部３０Ａ～３０Ｃにより高分子多孔質体に照射される照射線量を評価するため、上記の高分子多孔質体の粉砕とは別途、照射線量の測定を行った。まず、照射部３０による照射線量が既知の位置（９００ｍｍにおいて７０μｍ線量当量率が７０２ｍＳｖ/ｈ）に、２４×３０ｍｍの歯科用Ｄ感度エックス線インスタントフィルム（（株）阪神技術研究所製ＤＩＣ－１００）（以下、「フィルム」という）を設置し、軟エックス線を照射した。専用のキット（（株）阪神技術研究所製プッシャーシステム）を用いて、フィルムの現像、定着及び硬膜化処理等を実施し、透過濃度計（Ｘ－Ｒｉｔｅ社製３１０）を用いてフィルムの透過濃度を測定した。同様に、別のフィルムを用いて、照射時間を変えながら軟エックス線の照射及び透過濃度の測定を繰り返し行った。
　図２に、照射線量が既知の距離における透過濃度の測定結果から得られた特性曲線（破線）を示す。図２に示すように、特性曲線は、横軸に相対照射線量（相対エックス線量の対数）、縦軸に透過濃度をとって表したものである。この特性曲線を利用することで、透過濃度から相対照射線量を導出できる。また、図２には、特性曲線の線形領域を線形近似した近似直線（実線）も図示している。
　粉砕部２０におけるスクリーン２２の内部に、上記と同様のフィルムを配置し、３台の照射部３０Ａ～３０Ｃにより軟エックス線を６４００秒間照射した。また、上記と同様にフィルムの現像、定着及び硬膜化処理等を実施し、フィルムの透過濃度を測定し、図２の特性曲線の近似直線に基づいて、透過濃度からスクリーン２２内部の照射線量を導出した。スクリーン２２内部の照射線量（７０μｍ線量当量率）の導出結果を表１に示す。このようにして導出された照射線量は、スクリーン２２内部における照射線量を示すので、粉砕部２０において粉砕中の高分子多孔質体に照射される照射線量とみなすことができる。
（除電時間の測定）
　図１の構成において、３台の照射部３０Ａ～３０Ｃが粉砕部２０を除電する能力を評価するため、上記の高分子多孔質体の粉砕とは別途、除電時間の測定を行った。粉砕部２０におけるスクリーン２２の内部に、チャージプレートモニタ（トレック社製ＭＯＤＥＬ１５６Ａ）の１ｉｎｃｈ角チャージプレート（トレック社製１５６Ｐ－Ｃ２５Ｘ２５－Ｓ３Ｍ）を配置し、３台の照射部３０Ａ～３０Ｃにより軟エックス線を照射した状態で、プレート電圧が＋１０００Ｖから＋１００Ｖへ変化するまでの除電時間を測定した。スクリーン２２内部の除電時間の測定結果を表１に示す。
［実施例２］
　図３に、本実施例２に係る粉砕装置１０の構成を示す。図３に示すように、本実施例２においては、上記実施例１（図１参照）とは照射部３０Ｂの粉砕部２０に対する照射角度が変わっている。具体的には、図３に示すように、粉砕装置１０の鉛直方向（一点鎖線）に対して片側にそれぞれ６０度及び５度の角度に設けられた２台の照射部３０Ａ及び３０Ｂと、排出部１４側に設けられた照射部３０Ｃと、の合計３台の照射部によって、粉砕部２０に対して軟エックス線を照射した。
　その他の装置構成、リコンビナントゼラチン、高分子多孔質の作製方法、高分子多孔質体の粉砕方法、高分子ブロックの焦げの評価方法、照射線量の測定方法、及び除電時間の測定方法については、上記実施例１と同様であるので、説明を省略する。本実施例２において、焦げを認めたガラスバイアルの割合、スクリーン２２内部の照射線量の導出結果、及びスクリーン２２内部の除電時間の測定結果を、表１に示す。
［比較例１］
　照射部３０による除電及び焦げ抑制の効果を検証するため、上記実施例１において、照射部３０による軟エックス線の照射を行わずに、高分子多孔質体の粉砕を行った。その他の装置構成、リコンビナントゼラチン、高分子多孔質の作製方法、高分子多孔質体の粉砕方法、及び高分子ブロックの焦げの評価方法については、上記実施例１と同様であるので、説明を省略する。本比較例１において、焦げを認めたガラスバイアルの割合を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
　表１に記載のように、実施例１の焦げの割合は６０％、実施例２の焦げの割合は３３％であり、比較例１の焦げの割合が９０％であることから、実施例１及び２では焦げが抑制されていることが分かった。このことから、本開示の方法及び粉砕装置１０によれば、軟エックス線を照射することで、高分子多孔質体を粉砕する場合に発生する焦げを抑制できることが分かる。
　また、上記各実施例においては、高分子ブロックの焦げの検出方法として、目視による検査を行う形態について説明したが、これに限らない。焦げの検出は、例えば、画像検査により高分子ブロックの着色部位を検出することで行われてもよい。また例えば、赤外分光法等の分光学的手法により高分子ブロックの化学構造の変化を検出することで行われてもよい。
　２０２１年３月３１日に出願された日本国特許出願２０２１－０６０９１０号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願及び技術規格は、個々の文献、特許出願及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (17)

  1. 　高分子多孔質体を粉砕する粉砕工程と、
    　前記粉砕工程において粉砕中の前記高分子多孔質体を除電する除電工程と、
    　を含む粉砕方法。
  2. 　前記除電工程において、前記高分子多孔質体に放射線を照射することで、前記高分子多孔質体を除電する
    　請求項１に記載の粉砕方法。
  3. 　前記放射線は、エックス線及び紫外線のうち少なくとも一方である
    　請求項２に記載の粉砕方法。
  4. 　前記放射線は、線源の管電圧が４ｋＶ以上、５０ｋＶ以下のエックス線である
    　請求項３に記載の粉砕方法。
  5. 　前記除電工程において、前記高分子多孔質体に照射される前記放射線の７０μｍ線量当量率は、１ｍＳｖ／ｈ以上、２００Ｓｖ／ｈ以下である
    　請求項２から請求項４の何れか１項に記載の粉砕方法。
  6. 　前記除電工程において、前記高分子多孔質体を粉砕する粉砕部の少なくとも一部における電位が＋１０００Ｖから＋１００Ｖに変化するまでの除電時間は、０．０１秒以上、１０秒以下である
    　請求項１から請求項５の何れか１項に記載の粉砕方法。
  7. 　前記粉砕工程において、乾式粉砕を行う粉砕部を用いて、前記高分子多孔質体を粉砕する
    　請求項１から請求項６の何れか１項に記載の粉砕方法。
  8. 　前記粉砕部は、スクリーン及び回転インペラを備える
    　請求項７に記載の粉砕方法。
  9. 　前記粉砕部は、１×１０４回／ｈ以上、１×１０７回／ｈ以下の換気回数で換気される
    　請求項７又は請求項８に記載の粉砕方法。
  10. 　前記除電工程において、前記粉砕部の少なくとも一部に放射線を照射することで、前記高分子多孔質体を除電する
    　請求項９に記載の粉砕方法。
  11. 　前記高分子多孔質体は、タンパク質を含む
    　請求項１から請求項１０の何れか１項に記載の粉砕方法。
  12. 　前記高分子多孔質体は、下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドを含む
    　請求項１１に記載の粉砕方法。
    （Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
    （Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド。
    （Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列中、第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド。
  13. 　粉砕前の前記高分子多孔質体の大きさは、０．１ｍｍ以上、５０ｍｍ以下である
    　請求項１から請求項１２の何れか１項に記載の粉砕方法。
  14. 　粉砕後の前記高分子多孔質体の大きさは、０．０１ｍｍ以上、１０ｍｍ以下である
    　請求項１から請求項１３の何れか１項に記載の粉砕方法。
  15. 　高分子多孔質体を粉砕する粉砕工程と、
    　前記粉砕工程において粉砕中の前記高分子多孔質体を除電する除電工程と、
    　を含む高分子ブロック製造方法。
  16. 　高分子多孔質体を粉砕する粉砕部と、
    　前記粉砕部の少なくとも一部に放射線を照射する照射部と、
    　を備え、
    　前記照射部により照射される前記放射線によって、前記粉砕部において粉砕中の前記高分子多孔質体を除電する
    　粉砕装置。
  17. 　前記粉砕部を換気する換気部を更に備え、
    　前記換気部による前記粉砕部の換気回数は、１×１０４回／ｈ以上、１×１０７回／ｈ以下である
    　請求項１６に記載の粉砕装置。
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