WO2025100511A1 - 融合ペプチド - Google Patents

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WO2025100511A1
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fusion peptide
formula
peptide
adrenomedullin
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逸樹 味岡
貴博 村岡
央子 宮内
和雄 北村
秀雄 西村
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University of Miyazaki NUC
Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology
Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Institute of Science Tokyo
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University of Miyazaki NUC
Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology
Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Institute of Science Tokyo
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the present invention relates to a fusion peptide, a gelling composition, a sustained-release gel, a pharmaceutical composition, a method for producing a gel, a method for promoting angiogenesis, a method for inhibiting neurodegeneration, a method for treating nerve tissue damage and/or ischemia, and a method for treating cerebral infarction, etc.
  • cerebral infarction blood vessels in the brain become blocked, and reduced blood flow causes dysfunction of brain nerve cells. Patients with cerebral infarction exhibit severe symptoms such as hemiplegia, sensory impairment, aphasia, and impaired consciousness.
  • cerebral infarction affects approximately 200,000 people annually. Many patients who suffer from cerebral infarction have difficulty recovering their neurological functions, and approximately 25% of them are classified as requiring nursing care level 4 or 5. As a result, medical expenses currently amount to approximately 1 trillion yen per year, and there are concerns that medical expenses will increase further as the aging population continues to progress.
  • Non-Patent Document 1 Cell transplantation therapy is a treatment method that restores brain and nerve function by transplanting cells such as nerve cells into the site of cerebral infarction. Research using animal models has shown that stem cell transplantation can improve brain function by replacing nerve cells, promoting angiogenesis, and providing neuroprotection.
  • the object of the present invention is to provide a new method for treating cerebral infarction without relying on cell transplantation.
  • Gelling agents such as collagen and amphipathic peptides consisting of alternating hydrophilic and hydrophobic amino acids are known to be able to solidify from a sol state in water or an aqueous solution under specific temperature and pressure conditions to become a gel, and are collectively known as self-assembling peptides. By fusing self-assembling peptides with proteins and other substances that have specific biological functions, they may be used as regenerative medical materials that combine biofunctional molecules.
  • AM-JigSAP fusion peptide by linking jigsaw-shaped self-assembling peptide (JigSAP) with adrenomedullin (hereinafter also referred to as "AM").
  • Adrenomedullin is a physiologically active peptide that was discovered to have a strong vasodilatory antihypertensive effect, and is known to have a variety of pharmacological effects, including cardiovascular protection, anti-inflammatory, angiogenic, and tissue repair promotion effects.
  • Adrenomedullin has a relatively short amino acid sequence, and therefore the AM-JigSAP fusion peptide fused with JigSAP also has a short sequence. This allows for chemical synthesis, which has low production costs, rather than production in cells, which requires enormous production costs. Another advantage of adrenomedullin is that it is highly safe and has already been applied clinically.
  • adrenomedullin is known to have low stability in the blood. Therefore, it is difficult to achieve effects such as angiogenesis, which require sustained effects over a long period of time, using adrenomedullin alone.
  • the inventors complexed the above-mentioned fusion peptide with a gel composed of jigsaw self-assembling peptide (JigSAP) not complexed with adrenomedullin, and administered the complex to a mouse cerebral infarction model.
  • JigSAP jigsaw self-assembling peptide
  • a fusion peptide comprising adrenomedullin or an active fragment thereof linked to a self-assembling peptide.
  • the adrenomedullin is (i) an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 36 to 41; (ii) an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acid residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 36 to 41; or (iii) an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 36 to 41.
  • the self-assembling peptide is (a) a compound of formula I: Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa (Formula I) wherein Xaa is independently Ile or Met, Yaa is independently Asp, Glu, Lys, or Arg, and Zaa is independently Ala or Gly.
  • a gelling composition comprising the fusion peptide according to any one of (1) to (4) as an active ingredient.
  • a sustained release gel comprising the gelling composition according to (10).
  • a pharmaceutical composition comprising the gelling composition according to (10).
  • the pharmaceutical composition according to (16), wherein the nerve tissue damage is cerebral infarction, stroke, or traumatic brain injury.
  • a method for producing a gel comprising the steps of: A method for producing a gel, comprising: a mixing step of mixing the gelling composition according to (10) with water or an aqueous solution; and a gelling step of gelling the mixture obtained after the mixing step by maintaining the mixture at a temperature equal to or lower than the gelling temperature.
  • a method for producing a gel comprising: a mixing step of mixing the gelling composition according to (10) with water or an aqueous solution; and a gelling step of gelling the mixture obtained after the mixing step by maintaining the mixture at a temperature equal to or lower than the gelling temperature.
  • one or more anions selected from the group consisting of bicarbonate ions, carbonate ions, citrate ions, tartrate ions, and sulfate ions are further mixed.
  • the concentration of the fusion peptide in the gel is 0.4% by weight to 10% by weight.
  • the method according to (18), wherein the gel is implantable and/or sustained release.
  • the present invention provides a new method for treating cerebral infarction without relying on cell transplantation.
  • FIG. 1 shows the structure and activity of the AM-JigSAP fusion peptide.
  • FIG. 1A shows a schematic diagram of the structure of the AM-JigSAP fusion peptide.
  • adrenomedullin AM
  • FIG. 1B shows the results of measuring the activity of adrenomedullin (AM) not fused to JigSAP and the AM-JigSAP fusion peptide.
  • Fig. 2 shows the method for analyzing gait function in a mouse cerebral infarction model.
  • Fig. 2A shows a mouse with its hind legs slipping off the net.
  • Fig. 2B shows normal gait.
  • FIG. 3A shows the results of gait function analysis of a mouse cerebral infarction model.
  • Fig. 3B shows the results of gait function analysis of a mouse cerebral infarction model administered with the AM-JigSAP/JigSAP composition or the JigSAP composition into the brain.
  • Figures showing gene expression in mouse brains after administration of various compositions show the results of comparing gene expression in mouse brains administered with the VEGF-JigSAP/JigSAP composition with gene expression in mouse brains administered with PBS (VEGF-JigSAP vs PBS).
  • Figure 4B shows the results of comparing gene expression in mouse brains administered with the AM-JigSAP/JigSAP composition with gene expression in mouse brains administered with the JigSAP composition (AM-JigSAP vs JigSAP).
  • a first aspect of the present invention is a fusion peptide.
  • the fusion peptide of this aspect is a peptide formed by linking adrenomedullin or an active fragment thereof to a self-assembling peptide.
  • the fusion peptide of this aspect can provide angiogenesis-promoting function based on adrenomedullin in the fusion peptide.
  • adrenomedullin is stabilized by being linked to the self-assembling peptide, and the angiogenesis-promoting function is maintained for a long period of time.
  • self-assembly refers to the spontaneous assembly of small molecules in a dispersion medium through intermolecular interactions and the like to form a three-dimensional structure.
  • Substances that gel by self-assembly are often referred to as “gelators” in this specification.
  • the self-assembling peptides in this specification are a type of gelator.
  • self-assembling peptide refers to a peptide that can solidify from a sol state dissolved in water or an aqueous solution to a gel state under specific temperature and pressure conditions.
  • peptides include collagen (including glue, gelatin, and jelly), (RADA) 4 peptide (SEQ ID NO: 35), and JigSAP, which will be described in the Examples below.
  • gel refers to a solid state in which colloidal particles self-organize in a dispersion medium, lose fluidity, and solidify.
  • gel state refers to a state in which colloidal particles self-organize in a dispersion medium, lose fluidity, and solidify. This generally refers to a state in which a sol solidifies as a result of lowering the temperature.
  • Gelation is a phase transition phenomenon from a sol state to a gel state.
  • the term "sol” refers to colloidal particles dispersed in a dispersion medium, resulting in a liquid state with fluidity.
  • a gel in which a colloid made of a gelling agent is fluidized in the dispersion medium by heating the gel is an example of this.
  • the "sol state” refers to a liquid state in which colloidal particles are dispersed in a dispersion medium and have fluidity.
  • this includes a state in which a gelling agent is dispersed in a dispersion medium such as water or an aqueous solution, or a state in which a gel is fluidized by heating.
  • “Solation” is a phase transition phenomenon from a gel state to a sol state.
  • gelation temperature refers to the temperature at which a gelling agent undergoes a phase transition from a sol state to a gel state.
  • “Solation temperature” refers to the temperature at which a gelling agent undergoes a phase transition from a gel state to a sol state.
  • peptide refers to an amino acid polymer having one or more peptide bonds.
  • the term “peptide” is not limited by the number of amino acid residues it contains.
  • “peptide” includes everything from oligopeptides, such as dipeptides and tripeptides, that contain a few amino acid residues, to polypeptides that contain many amino acid residues. Thus, it includes not only so-called proteins, but also fragmented peptides and peptides that are linked to other peptides by peptide bonds.
  • fusion peptide refers to a self-assembling peptide to which a functional peptide such as adrenomedullin is linked.
  • the link between the self-assembling peptide and the functional peptide may be a covalent bond or a supramolecular interaction.
  • the covalent bond is not limited, and examples include a peptide bond and a disulfide bond.
  • the functional peptide is linked to the N-terminus and/or C-terminus of the self-assembling peptide, and furthermore, the bond is preferably a covalent bond, and a preferred covalent bond is a peptide bond.
  • the term "functional peptide” refers to a peptide that has a specific biological function in or outside of a living body, or inside or outside of a cell.
  • the term “specific biological function” is not limited to any function that can have any effect on a biomolecule such as a protein or nucleic acid, a cell, a tissue, or an individual.
  • the specific biological function may be natural or unnatural, and examples include a cell adhesion function, a signal transduction function, a binding function, a linking function, a labeling function, and a metabolic function.
  • An example of a functional peptide is adrenomedullin.
  • biocompatibility refers to the property of being capable of being introduced into a living organism. In particular, it refers to the property of a material having no toxicity or side effects to the living organism, or if it does have such effects, they are extremely minor, and/or the property of not being recognized as a foreign body in the living organism and not being eliminated.
  • a peptide having biocompatibility refers, for example, to a peptide that is free of biological contamination and therefore has no or very little risk of causing allergies or unknown infectious diseases in the human body. Examples of biocompatible peptides include chemically synthesized peptides.
  • the term "living body” refers to a cell (including cultured cells), tissue, organ, or individual.
  • examples include, but are not limited to, cells, tissue, or organs derived from a human or non-human individual, or cells derived from a human or non-human individual, such as cells or tissues obtained by differentiation from ES cells or iPS cells.
  • the cells are derived from a human, tissue or organ composed of cells derived from a human, or an individual human.
  • physiological conditions refers to conditions such as temperature and pH that do not substantially impair the structure or activity of biomolecules, the structure or function of cells or tissues, or the activity or survival of an individual. More specifically, it refers to conditions that may exist in a living body or inside a cell.
  • physiological conditions refer to conditions under which biomolecules such as proteins do not denature or are difficult to denature.
  • physiological pH is not limited to any pH at which biomolecules such as proteins do not denature or are difficult to denature. For example, it is within the range of pH 4.0 to 10.0, pH 5.0 to 9.0, pH 6.0 to 8.0, or pH 6.5 to 7.5, such as pH 7.4.
  • physiological temperature is not limited to any temperature at which biomolecules such as proteins do not denature or are difficult to denature.
  • it is a temperature within the range of 0 to 65°C, 4 to 60°C, 20 to 50°C, or 30 to 40°C, such as 37°C.
  • sustained release refers to the gradual release of a substance into space. In this specification, it particularly refers to the gradual dissipation of a substance contained in a gel from the gel. For example, it refers to dissipation at a slower rate than the rate at which the substance would dissipate if it were not encapsulated in the gel.
  • the functional molecule is slowly released from a gel implanted in a living body, the functional molecule is present in the surrounding space (for example, the diseased site, damaged site, tissue, or organ in which the gel is embedded) for a long period of time, providing its function.
  • long-term or “long-term” means a period longer than the period during which a substance continues to be released under normal conditions. Specifically, it means a period longer than the period during which a substance not encapsulated in a gel continues to be released under the same conditions.
  • the specific period varies depending on the type of substance, but examples of such periods include 1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more, 6 hours or more, half a day or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 1 week or more, 2 weeks or more, 1 month or more, 2 months or more, 3 months or more, 4 months or more, 6 months or more, or 1 year or more.
  • amino acid includes both natural and unnatural amino acids.
  • Unnatural amino acids are, for example, amino acids that have any chemically modified group or substituent.
  • amino acids include any optical isomers, and may be either D- or L-isomers.
  • hydrophobic amino acid refers to an amino acid that has hydrophobicity or has high hydrophobicity.
  • examples include alanine (Ala/A), glycine (Gly/G), proline (Pro/P), valine (Val/V), leucine (Leu/L), isoleucine (Ile/I), methionine (Met/M), cysteine (Cys/C), phenylalanine (Phe/F), tyrosine (Tyr/Y), and tryptophan (Trp/W).
  • cysteine has low hydrophobicity, and is therefore sometimes classified as a hydrophilic amino acid.
  • hydrophilic amino acid refers to an amino acid that has hydrophilicity or has high hydrophilicity. Examples include aspartic acid (Asp/D), glutamic acid (Glu/E), lysine (Lys/K), histidine (His/H), and arginine (Arg/R).
  • multiple refers to, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 5, 2 to 3, or 2.
  • severe refers to 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, or 1 to 2.
  • amino acid identity refers to the percentage (%) of the number of identical amino acid residues in the total number of amino acid residues when the amino acid sequences of the two peptides being compared are aligned by inserting appropriate gaps into one or both of them as necessary to maximize the number of identical amino acid residues. Alignment of two amino acid sequences to calculate amino acid identity can be performed using known programs such as Blast, FASTA, and ClustalW.
  • amino acid substitution refers to substitution within a conservative amino acid group that has similar properties such as charge, side chain, polarity, and aromaticity among the 20 types of amino acids that make up natural proteins.
  • substitutions within the uncharged polar amino acid group with low polarity side chains (Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr), branched chain amino acids (Leu, Val, Ile), neutral amino acids (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), neutral amino acids with hydrophilic side chains (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), and aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp) are examples. Amino acid substitutions within these groups are preferred because they are known to be less likely to cause changes in the properties of peptides.
  • the configuration of the fusion peptide of this embodiment will be specifically explained below.
  • the fusion peptide of this embodiment is a peptide comprising adrenomedullin or an active fragment thereof linked to a self-assembling peptide.
  • adrenomedullin (hereinafter also referred to as "AM”) is a physiologically active peptide that was discovered to have a strong vasodilatory antihypertensive effect.
  • Adrenomedullin is known to have a variety of pharmacological effects, including cardiovascular protection, anti-inflammatory effects, angiogenesis, and tissue repair promotion.
  • adrenomedullin examples include human-derived adrenomedullin (human AM) that contains or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36. Further specific examples include porcine-derived adrenomedullin that consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37, dog-derived adrenomedullin that consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38, bovine-derived adrenomedullin that consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39, rat-derived adrenomedullin that consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40, and mouse-derived adrenomedullin that consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41.
  • adrenomedullin includes adrenomedullin variants, adrenomedullin mutants, and adrenomedullin orthologues of other species that have activity functionally equivalent to that of the adrenomedullin shown in SEQ ID NOs: 36 to 41.
  • amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 36 to 41 or adrenomedullin variants, adrenomedullin mutants, or adrenomedullin orthologues that have 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more amino acid identity to the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 36 to 41.
  • an "active fragment" of adrenomedullin refers to a fragment of any of the above adrenomedullins that has physiological activity such as angiogenic activity, for example, a fragment having 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the activity of any of the above adrenomedullins, or an activity equivalent to or greater than that.
  • the amino acid length of the peptide constituting the active fragment is not particularly limited, but may be, for example, a region of 20 or more, 30 or more, 40 or more, or 50 or more consecutive amino acids in any of the above adrenomedullins.
  • cysteine residues corresponding to positions 16 and 21 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 in adrenomedullin form a disulfide bond, or the disulfide bond is substituted with a linking group such as an ethylene group.
  • adrenomedullin or an active fragment thereof includes a glycine (Gly) residue added to its C-terminus.
  • the self-assembling peptide contained in the fusion peptide of this embodiment is not limited to a particular type, so long as it is a peptide that can be solidified under specific temperature and pressure conditions from a sol state dissolved in water or an aqueous solution to a gel state.
  • the self-assembling peptide contained in the fusion peptide of this embodiment is an amphipathic peptide in which hydrophilic and hydrophobic amino acid residues are alternately linked, such as a peptide that includes or consists of any of the following amino acid sequences (a) to (c): (a) a compound of formula I: Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa (Formula I) wherein Xaa is independently Ile or Met, Yaa is independently Asp, Glu, Lys, or Arg, and Zaa is independently Ala or Gly.
  • a self-assembling peptide consisting of the amino acid sequence shown in the above formula I can be gelled.
  • Specific examples of the amino acid sequence shown in the above formula I include IRARMDADI (SEQ ID NO: 1), IRADMRADI (SEQ ID NO: 2), IRADMDARI (SEQ ID NO: 3), IDARMRADI (SEQ ID NO: 4), IDARMDARI (SEQ ID NO: 5), IDADMRARI (SEQ ID NO: 6), IRGDIRGDI (SEQ ID NO: 7), IRGDMRGDI (SEQ ID NO: 8), IRADIRADM (SEQ ID NO: 9), IDARMRADM (SEQ ID NO: 10), MDARIDARI (SEQ ID NO: 11), MDADMRARI (SEQ ID NO: 12), IRGDMRADI (SEQ ID NO: 13), IRADMRGDI (SEQ ID NO: 14), IRGDIRGDI (SEQ ID NO: 15), IRGDIRADI (SEQ ID NO: 16),
  • Arg is linked to the N-terminus and/or C-terminus of a self-assembling peptide comprising the amino acid sequence shown in formula I above. In a further embodiment, Arg is linked to both of the two amino acids at the N-terminus and/or C-terminus of a self-assembling peptide comprising the amino acid sequence shown in formula I above.
  • Examples of self-assembling peptides containing the amino acid sequence shown in formula I above in which the N-terminus and C-terminus are Arg include RIRARMDADIR (SEQ ID NO:18), RIRADMRADIR (SEQ ID NO:19), RIRADMDARIR (SEQ ID NO:20), RIDARMRADIR (SEQ ID NO:21), RIDARMDARIR (SEQ ID NO:22), RIDADMRARIR (SEQ ID NO:23), RIRGDIRGDIR (SEQ ID NO:24), RIRGDMRGDIR (SEQ ID NO:25), RIRADIRADMR (SEQ ID NO:26), RIDARMRADMR (SEQ ID NO:27), RMDARIDARIR (SEQ ID NO:28), RMDADMRARIR (SEQ ID NO:29), RIRGDMRADIR (SEQ ID NO:30), RIRADMRGDIR (SEQ ID NO:31), RIRGDIRGDIR (SEQ ID NO:32), RIRGDIRADIR (SEQ ID NO:
  • a self-assembling peptide consisting of the amino acid sequence shown in formula V above, where p 4, is known as a RADA16 peptide, and is known to be capable of gelation.
  • p in formula V above is an integer of 1 or more, and is, but is not limited to, for example, 2 or more, 3 or more, or 4 or more, and/or 8 or less, 7 or less, 6 or less, or 5 or less.
  • the self-assembling peptide contained in the fusion peptide of this embodiment contains at least one amino acid sequence shown in any one of formulas I to V, or consists of one or more amino acid sequences shown in any one of formulas I to V.
  • the self-assembling peptide contained in the fusion peptide of this embodiment may contain one or two amino acid sequences shown in any one of formulas I to V.
  • the self-assembling peptide contained in the fusion peptide of this embodiment contains two amino acid sequences shown in any one of formulas I to V
  • the two or more amino acid sequences shown in any one of formulas I to V may consist of the same amino acid sequence or may consist of different amino acid sequences.
  • the self-assembling peptide contained in the fusion peptide of this embodiment may or may not contain additional amino acid residues on the N-terminal and/or C-terminal side of the amino acid sequence shown in any one of formulas I to V.
  • Amino acids other than glycine that constitute the self-assembling peptide contained in the fusion peptide of this embodiment can be used regardless of their optical isomers. That is, either the D-form or the L-form may be used. For example, all amino acids other than glycine that constitute the self-assembling peptide may be D-form or L-form.
  • the total length of the amino acid sequence constituting the self-assembling peptide contained in the fusion peptide of this embodiment is, but is not limited to, for example, 50 amino acids or less or 25 amino acids or less.
  • Specific examples of amino acid lengths include 20 amino acids or less, 15 amino acids or less, or 10 amino acids or less, and/or 4 amino acids or more, 5 amino acids or more, 6 amino acids or more, 7 amino acids or more, or 8 amino acids or more, for example, 16 amino acids, 15 amino acids, 14 amino acids, 13 amino acids, 12 amino acids, 11 amino acids, 10 amino acids, or 9 amino acids.
  • the fusion peptide of this aspect may include a peptide consisting of one amino acid residue or multiple amino acid residues at the N-terminus and/or C-terminus of the self-assembling peptide.
  • the amino acid residues at the N-terminus and/or C-terminus of the self-assembling peptide may be hydrophilic amino acids.
  • the link between adrenomedullin or an active fragment thereof and the self-assembling peptide is a covalent bond or a supramolecular interaction.
  • the covalent bond is not limited to, and is, for example, a peptide bond or a disulfide bond.
  • adrenomedullin or an active fragment thereof and the self-assembling peptide are linked via a linker.
  • the specific structure of the linker is not limited, but for example, it is a peptide linker.
  • the length of the peptide linker is not limited, but examples include a length of 1 to 50 amino acids, preferably 5 to 20 amino acids. Peptides containing many amino acids with relatively small side chains, such as serine and glycine, are often used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue of the fusion peptide of this embodiment and the carboxyl group of the C-terminal amino acid residue may have any modification group added thereto.
  • an acetyl group may be added to the N-terminus of the fusion peptide of this embodiment.
  • an NH2 amide may be added to the C-terminus of the modified peptide of this embodiment.
  • the fusion peptide of this embodiment is linked to adrenomedullin or an active fragment thereof, as well as other functional peptides.
  • the type of such functional peptide is not limited, and may be, for example, a peptide that supports the activity of adrenomedullin, VEGF that has an angiogenesis promoting effect similar to adrenomedullin, a peptide with a labeling function, or a peptide tag for purification.
  • the peptide with a labeling function may be, for example, a fluorescent protein such as GFP, a luminescent protein such as luciferin or aequorin, or an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (AP).
  • the peptide tag is an artificially synthesized oligopeptide consisting of several to a dozen amino acids, and examples of such peptide tags include epitope tags such as FLAG tags, histidine tags, HA tags, and DAP tags, as well as His tags, GST tags, and Halo tags.
  • the fusion peptide of this embodiment may be optionally linked to one or more chemical modification groups other than peptide bonds.
  • the structure of the chemical modification group is not particularly limited, but it is a portion that imparts a desired function to the fusion peptide to which it is bound.
  • the desired function include a labeling function, a linker function, a linking function, and a binding function.
  • chemical modification groups that impart a labeling function include chromogenic groups and fluorescent groups (e.g., fluorescein, etc.).
  • chemical modification groups that impart a linker function include any polymer (e.g., alkylene, etc.).
  • Examples of chemical modification groups that impart a binding function include compounds such as biotin.
  • Other examples of chemical modification groups that can be bound to the fusion peptide of this embodiment include lipids, sugars, aptamers, and receptor ligands.
  • lipids examples include cholesterol, lipids such as fatty acids (e.g., vitamin E, vitamin A, vitamin D), fat-soluble vitamins such as vitamin K, intermediate metabolites such as acyl-CoA, glycolipids, glycerides, and derivatives thereof.
  • fatty acids e.g., vitamin E, vitamin A, vitamin D
  • fat-soluble vitamins such as vitamin K
  • intermediate metabolites such as acyl-CoA
  • glycolipids e.g., glycolipids, glycerides, and derivatives thereof.
  • sugars include glucose and sucrose.
  • the fusion peptide of this embodiment can provide angiogenesis-promoting function based on adrenomedullin in vivo. For example, by combining the fusion peptide of this embodiment with a self-assembling peptide not fused to adrenomedullin and administering it to a target site such as a cerebral infarction site, a gel containing the fusion peptide is formed, and the fusion peptide is gradually released from the gel. Based on this sustained release effect, angiogenesis can be promoted for a long period of time around the target site where the gel is implanted.
  • the fusion peptide of this aspect provides a method for treating and/or preventing a disease, comprising administering any of the fusion peptides described above to a subject such as a human.
  • the fusion peptide of this aspect also provides any of the fusion peptides described above for use in treating and/or preventing a disease in a subject such as a human.
  • the present invention also provides any of the fusion peptides described above for use in the manufacture of a medicament for treating and/or preventing a disease.
  • the second aspect of the present invention is a gelling composition.
  • the gelling composition of this aspect contains the fusion peptide described in the first aspect as an essential active ingredient, and also contains a gelling agent, a gelling promoter, and/or a carrier.
  • the gelling composition of this aspect can be gelled by maintaining it in water or an aqueous solution at a temperature below its gelling temperature.
  • composition 2-2-1 Constituent components
  • the gelling composition of the present invention is composed of an active ingredient and other components.
  • the components other than the active ingredient are not particularly limited, but examples thereof include components that can promote the gelling of the gelling composition and carriers.
  • Each of the constituent components will be specifically described below.
  • the gelling composition of this embodiment contains the fusion peptide described in the first embodiment as an essential active ingredient.
  • the amount (content) of the fusion peptide to be incorporated in the gelling composition is not particularly limited.
  • the gelling composition of the present invention When the gelling composition of the present invention is administered to a living body, it may be appropriately determined according to the type and/or effective amount of the fusion peptide and gelling agent contained in the gelling composition, information on the subject, the dosage form of the gelling composition, and the type of carrier or additive described below.
  • the concentration of the fusion peptide in the gelling composition is not limited, but may be, for example, 1/100,000 or more, 1/1000 or more, 1/10 or more, and/or 2 times or less, 1.5 times or less, 1 times or less, 0.8 times or less, 0.5 times or less, or 0.2 times or less of the concentration of the gelling agent (self-assembling peptide) described below.
  • the specific concentration of the fusion peptide is not limited to the following, and may be, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 6 wt % or more, 1 ⁇ 10 ⁇ 5 wt % or more, 1 ⁇ 10 ⁇ 4 wt % or more, 1 ⁇ 10 ⁇ 3 wt % or more, or 1 ⁇ 10 ⁇ 2 wt % or more, and/or 10 wt % or less, 5 wt % or less, 2 wt % or less, 1 wt % or less, 0.5 wt % or less, 0.3 wt % or less, 0.2 wt % or less, 0.1 wt % or less, 0.05 wt % or less, or 0.02 wt % or less.
  • the ratio of the concentration of the fusion peptide to the concentration of the gelling agent (self-assembling peptide) in the gelling composition can be appropriately adjusted depending on the treatment subject, the administration site, etc.
  • the "effective amount” refers to an amount necessary for the fusion peptide to function as an active ingredient in the gelling composition and an amount that gives little or no harmful side effects to the living body to which it is applied. This effective amount may vary depending on various conditions such as information on the subject, the administration route, and the number of administrations.
  • the term "subject” refers to a living body to which the gelling composition or pharmaceutical composition is applied.
  • this includes humans, livestock (cattle, horses, sheep, goats, pigs, chickens, ostriches, etc.), racehorses, pets (dogs, cats, rabbits, etc.), and experimental animals (mice, rats, guinea pigs, monkeys, marmosets, etc.).
  • livestock cattle, horses, sheep, goats, pigs, chickens, ostriches, etc.
  • racehorses pets
  • dogs dogs, cats, rabbits, etc.
  • experimental animals mice, rats, guinea pigs, monkeys, marmosets, etc.
  • subject information refers to various individual information of the living body to which the gelling composition is applied, and in the case of a subject, for example, includes the overall health condition, the progression and severity of a disease or injury if the subject is suffering from such an illness, age, weight, sex, diet, drug sensitivity, the presence or absence of concomitant drugs, and resistance to treatment.
  • the gelling composition of this embodiment can also contain drugs and the like as other active ingredients.
  • drug is a concept that includes low molecular weight compounds, peptides (including enzymes and antibodies), or nucleic acids (including RNAi molecules such as miRNA, siRNA, and shRNA, antisense nucleic acids, aptamers, etc.).
  • Drugs include, but are not limited to, various types of drugs, such as therapeutic medicines intended to treat diseases and alleviate symptoms.
  • the drug contained in the gelling composition of this embodiment may be not only one type, but two or more types.
  • the gelling composition of the present embodiment contains a gelling agent as an optional component.
  • the type of gelling agent contained in the gelling composition of this embodiment is not limited, but it is preferable that the gel formed by the gelling agent can contain the fusion peptide, which is an active ingredient, and can gradually release the fusion peptide.
  • the gelling agent may be a self-assembling peptide, or may be something other than a self-assembling peptide.
  • a specific example of a gelling agent is the self-assembling peptide described in the first embodiment that is not linked to adrenomedullin or an active fragment thereof.
  • the amino acid sequence of the self-assembling peptide described in the first embodiment that is not linked to adrenomedullin or an active fragment thereof may be the same as or different from the amino acid sequence of the self-assembling peptide contained in the fusion peptide, which is an active ingredient, but it is preferable that they have the same amino acid sequence.
  • the self-assembling peptide described in the first embodiment that is not linked to adrenomedullin or an active fragment thereof may be bound to a peptide such as the above-mentioned peptide having a labeling function or a peptide tag for purification.
  • the amount (content) of the gelling agent to be incorporated in the gelling composition is not particularly limited. It may be appropriately determined taking into account the gelling conditions. In addition, when the gelling composition of the present invention is administered to a living body, it may be appropriately determined according to the type and/or effective amount of the gelling agent contained in the gelling composition, information on the subject, the dosage form of the gelling composition, and the type of carrier or additive described below.
  • the concentration of the gelling agent (self-assembling peptide) in the gelling composition is not limited, but may be, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 4 wt% or more, 1 ⁇ 10 ⁇ 3 wt% or more, or 1 ⁇ 10 ⁇ 2 wt% or more, 0.1 wt% or more, 0.2 wt% or more, 0.3 wt% or more, or 0.4 wt% or more, and/or 10 wt% or less, 5 wt% or less, 2 wt% or less, 1 wt% or less, or 0.5 wt% or less, for example, 0.1 wt% or more and 2.0 wt% or less.
  • the final effective amount of the gelling agent and the application amount calculated based on it will ultimately be decided by the judgment of a doctor, dentist, veterinarian, etc., depending on information about each individual subject, etc.
  • the gelling composition of this embodiment may contain a component capable of promoting its gelling, if necessary.
  • the gelling-promoting component is not limited to, but may be, for example, a component having the effect of reducing the solubility of a protein. In general, a component having the effect of reducing the solubility of a protein may promote the gelling of a peptide gelling agent.
  • the components that have the effect of reducing protein solubility are not limited, and examples include cations and anions that have the effect of reducing protein solubility. Cations and anions that have this effect are well known to those skilled in the art as the Hofmeister series. Examples of anions include bicarbonate ions, carbonate ions, citrate ions, tartrate ions, and sulfate ions. Examples of cations include lithium ions, sodium ions, potassium ions, magnesium ions, and calcium ions.
  • the concentrations of cations and anions that have the effect of reducing protein solubility are not particularly limited. For example, they may be 1 mM or more, 5 mM or more, 10 mM or more, 20 mM or more, 30 mM or more, or 40 mM or more.
  • the total concentration of bicarbonate ions and carbonate ions may be 1 mM or more, 5 mM or more, 10 mM or more, 20 mM or more, 30 mM or more, or 40 mM or more, for example, 44 mM.
  • the gelling composition of this embodiment may contain a pharma- ceutically acceptable carrier as necessary.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to an additive that is commonly used in the field of formulation technology. Examples of such an additive include solvents, excipients, fillers, emulsifiers, flow additive regulators, lubricants, and human serum albumin.
  • the solvent may be, for example, water or any other pharma- ceutically acceptable aqueous solution, or a pharma-ceutically acceptable organic solvent, but is preferably water or any other pharma-ceutically acceptable aqueous solution.
  • aqueous solution include physiological saline, an isotonic solution containing glucose or other supplements, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, any medium used in cell culture or tissue culture, etc.
  • the supplements include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, other low-concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, etc.
  • the medium may be a commercially available medium, such as DMEM medium, Ham's F12 medium, DMEM/F12 medium, McCoy's 5A medium, Eagle's MEM medium, ⁇ MEM medium, MEM medium, RPMI1640 medium, Iscove's modified Dulbecco's medium, MCDB131 medium, William's medium E, IPL41 medium, Fischer's medium, etc.
  • DMEM medium Ham's F12 medium, DMEM/F12 medium, McCoy's 5A medium, Eagle's MEM medium, ⁇ MEM medium, MEM medium, RPMI1640 medium, Iscove's modified Dulbecco's medium, MCDB131 medium, William's medium E, IPL41 medium, Fischer's medium, etc.
  • Excipients include, for example, sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides, metal salts, citric acid, tartaric acid, glycine, polyethylene glycol, Pluronic®, kaolin, silicic acid, or combinations thereof.
  • fillers examples include petrolatum, the aforementioned sugars and/or calcium phosphate.
  • emulsifiers examples include sorbitan fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, and propylene glycol fatty acid esters.
  • Examples of flow regulators and lubricants include silicates, talc, stearates, and polyethylene glycol.
  • the composition may appropriately contain solubilizers, suspending agents, diluents, dispersing agents, surfactants, soothing agents, stabilizers, pH regulators, absorption promoters, bulking agents, moisturizing agents, humectants, adsorbents, flavoring agents, disintegration inhibitors, coating agents, colorants, preservatives, antiseptics, antioxidants, fragrances, flavorings, sweeteners, buffers, isotonicity agents, etc. that are commonly used in medicines.
  • Such carriers are primarily used to facilitate the formation of dosage forms and maintain the dosage form and drug efficacy, as well as to make the active ingredient, the gelling agent, less susceptible to degradation by enzymes in the body, and may be used appropriately as needed.
  • the pH of the gelling composition of the present embodiment is not limited.
  • it may be a physiological pH, and may be within the range of pH 4.0 to 10.0, the range of pH 5.0 to 9.0, the range of pH 6.0 to 8.0, or the range of pH 6.5 to 7.5, for example, pH 7.4.
  • the gelling composition of this embodiment can be gelled by being maintained in water or an aqueous solution at a temperature below its gelling temperature.
  • the gelling temperature is essentially based on that of the self-assembling peptide or fusion peptide that constitutes the gelling agent, which is the active ingredient.
  • the gelling composition of this embodiment can gel at a temperature within the range of 4 to 80°C, 10 to 70°C, 15 to 60°C, 20 to 50°C, or 30 to 40°C, for example 37°C, under conditions of 1 atmosphere.
  • the gelling composition of this embodiment can be gelled under physiological conditions without substantially losing the activity of the adrenomedullin that constitutes the fusion peptide, or while retaining at least a portion of that activity. Therefore, after the gelling composition of this embodiment has gelled, the physiological activity of the adrenomedullin that constitutes the fusion peptide, such as the function of promoting angiogenesis, can be exerted.
  • angiogenesis can be induced by transplanting the gelling composition into a living body by a surgical method or the like.
  • the gelling composition of this embodiment After the gelling composition of this embodiment has been introduced into the subject and has sufficiently promoted angiogenesis and formed or regenerated tissues or organs at the administration site, the gelling composition can be removed from the transplant site, for example by incising the target site through a surgical procedure.
  • the dosage form of the gelling composition of this embodiment is not particularly limited.
  • it may be a liquid or solid agent that can be introduced into a target site.
  • the shape is not important.
  • solid dosage forms such as powders, powders, granules, and tablets, it may be in the shape of a transplant member.
  • the application method of the gelling composition of this embodiment is not particularly limited, but is preferably parenteral administration, and more preferably local administration. Local administration includes, for example, intramuscular administration, subcutaneous administration, tissue administration, and organ administration.
  • the gelling composition of this embodiment may be introduced to the target site in a gel state.
  • the target site can be incised by surgical operation and transplanted in a gel state.
  • the gel state is preferably achieved at a soft stage where gel formation has not yet been completed.
  • the dosage may be an amount effective for the active ingredient to take effect. The effective amount is appropriately selected according to the subject information.
  • the gelling composition of this embodiment can be removed from the administration site as necessary.
  • the administration site can be incised by surgical operation and the composition can be surgically removed in a gel state.
  • composition 3-1 Configuration
  • the third aspect of the present invention is a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of this aspect contains the gelling composition of the second aspect. Therefore, the configuration of the pharmaceutical composition of this aspect is similar to that of the second aspect, except for the following configuration.
  • the pharmaceutical composition of this aspect can be used to promote angiogenesis and/or inhibit neurodegeneration.
  • the pharmaceutical composition of this aspect is for transplantation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be transplanted, for example, by making an incision in the target site by surgical operation.
  • Diseases targeted by the pharmaceutical composition of this embodiment include, but are not limited to, nerve tissue damage and/or ischemia.
  • central nervous tissue damage includes brain damage and spinal cord damage.
  • Brain damage includes, for example, traumatic brain injury and cerebrovascular disease. Cerebrovascular disease includes both cerebral infarction (ischemic cerebrovascular disease) and cerebral hemorrhage.
  • Spinal cord damage includes, for example, cervical spinal cord injury, thoracic spinal cord injury, lumbar spinal cord injury, sacral spinal cord injury, etc.
  • Peripheral nervous tissue damage includes damage to any peripheral nervous tissue. Examples include damage to motor nerves, sensory nerves, and autonomic nerves.
  • ischemia refers to ischemia in any organ or tissue.
  • examples include lower limb ischemia (e.g., arteriosclerosis obliterans and its severe form, severe lower limb ischemia), ischemic heart disease (e.g., myocardial infarction, etc.), and the above-mentioned cerebrovascular disorders.
  • treatment includes, but is not limited to, curative treatment and preventive treatment. Prevention also includes prevention of onset, prevention of progression, and prevention of recurrence.
  • cerebrovascular disorders can be detected by imaging tests such as CT scans and MRI scans, and the onset of such disorders can be prevented by the pharmaceutical composition of the present invention.
  • cerebrovascular disorders such as cerebral infarction have a high recurrence rate, but the pharmaceutical composition of the present invention can also prevent such recurrence.
  • the fourth aspect of the present invention is a gel preparation method. According to the gel preparation method of this aspect, it is possible to prepare a gel (e.g., a sustained-release gel) containing a fusion peptide containing adrenomedullin or an active fragment thereof that maintains at least a part of its activity.
  • a gel e.g., a sustained-release gel
  • a fusion peptide containing adrenomedullin or an active fragment thereof that maintains at least a part of its activity.
  • the method for producing a gel of the present invention includes a mixing step and a gelling step as essential steps.
  • the mixing step is a step of mixing the gelling composition according to the second embodiment with water or an aqueous solution.
  • the water or aqueous solution may be, for example, a medium such as a cell culture medium.
  • the medium may be appropriately selected from known media.
  • any liquid medium for animal cell culture may be used as a basal medium, and other components (serum, serum replacement reagent, growth factor, etc.; N2 supplement, B27(R) supplement, insulin, bFGF, activin A, heparin, ROCK inhibitor, and/or GSK-3 inhibitor, etc.) may be appropriately added as necessary to prepare the medium.
  • the medium examples include DMEM medium, Ham's F12 medium, DMEM/F12 medium, McCoy's 5A medium, Eagle's MEM medium, ⁇ MEM medium, MEM medium, RPMI1640 medium, Iscove's modified Dulbecco's medium, MCDB131 medium, William's medium E, IPL41 medium, Fischer's medium, etc.
  • the mixing method in this step is not particularly limited, and the medium may be mixed sufficiently by stirring or the like.
  • a component that can promote gelation in the gelation step described below may be further mixed.
  • the gelation-promoting component is not limited to, but may be, for example, a component that has the effect of reducing the solubility of proteins.
  • the anions that have this effect are as described above in the second embodiment.
  • the concentration of the fusion peptide contained in the gelling composition subjected to this process is not limited, and may be, for example, 1/100,000 or more, 1/10,000 or more, 1/100 or more, 1/10 or more, and/or 2 times or less, 1.5 times or less, 1 times or less, 0.8 times or less, 0.5 times or less, or 0.2 times or less of the concentration of the gelling agent.
  • concentrations of the fusion peptide are not limited to the following, but may be, for example, 1 ⁇ 10 -6 wt% or more, 1 ⁇ 10 -5 wt% or more, 1 ⁇ 10 -4 wt% or more, 1 ⁇ 10 -3 wt% or more, or 1 ⁇ 10 -2 wt% or more, and/or 10 wt% or less, 5 wt% or less, 2 wt% or less, 1 wt% or less, 0.5 wt% or less, 0.3 wt% or less, 0.2 wt% or less, 0.1 wt% or less, 0.05 wt% or less, or 0.02 wt% or less, for example, 0.4 wt% to 10 wt%.
  • the ratio of the concentration of the fusion peptide to the concentration of the gelling agent (self-assembling peptide) in the gelling composition can be appropriately adjusted depending on the subject to be treated, the administration site, etc.
  • the gelling step is a step in which the mixture obtained after the mixing step is gelled by maintaining the mixture at a temperature equal to or lower than the gelling temperature.
  • the time for carrying out this step and the temperature used in this step vary depending on the type of fusion peptide and self-assembling peptide in the gelling composition mixed in the mixing step, so they may be appropriately determined according to the type.
  • the gelling composition after the mixing step may be maintained at a temperature within the range of 4 to 80°C, 10 to 70°C, 15 to 60°C, 20 to 50°C, or 30 to 40°C, for example 37°C, for 1 minute or more, 10 minutes or more, or 1 hour or more.
  • a temperature condition in which the activity of the adrenomedullin or active fragment constituting the fusion peptide is not lost or at least a part of its activity remains is preferable, and for example, a temperature condition within the range of 4 to 80°C, 10 to 70°C, 15 to 60°C, 20 to 50°C, or 30 to 40°C, for example 37°C, may be used. Gelation may be performed under 5% CO2 conditions under any of the above temperature conditions (for example, 37°C).
  • the method for controlling the temperature used in this step is not particularly limited, and examples include a method of placing the adrenomedullin or active fragment in a thermostatic bath, etc.
  • the pH conditions used for gelation in this process are not limited.
  • the pH may be within the range of pH 4.0 to 10.0, pH 5.0 to 9.0, pH 6.0 to 8.0, or pH 6.5 to 7.5, e.g., pH 7.4.
  • a gel for transplantation and/or sustained release can be produced. Furthermore, according to the gel production method of the present invention, gelation can be performed under physiological conditions that do not impair the activity of adrenomedullin or an active fragment thereof contained in the fusion peptide, and further, the fusion peptide containing adrenomedullin or an active fragment thereof can be sustained released from the gel.
  • the gel produced by the gel production method of the present invention has a high uptake efficiency of the fusion peptide containing adrenomedullin or an active fragment thereof and has excellent sustained release properties.
  • Example 1 Preparation of AM-JigSAP fusion peptide and activity measurement (the purpose)
  • JigSAP jigsaw-shaped self-assembling peptide
  • AM adrenomedullin
  • AM-JigSAP fusion peptide ( Figure 1A; hereinafter, also referred to as "fusion peptide” or "AM-JigSAP") consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 42) in which adrenomedullin (AM) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 is fused to the C-terminus of JigSAP consisting of the amino acid sequence (RIDARMRADIR) shown in SEQ ID NO: 21 was prepared by entrusting its production to the Peptide Institute, Inc.
  • fusion peptide (SEQ ID NO: 42) in which adrenomedullin (AM) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 is fused to the C-terminus of JigSAP consisting of the amino acid sequence (RIDARMRADIR) shown in SEQ ID NO: 21 was prepared by entrusting its production to the Peptide Institute, Inc.
  • AM1 adrenomedullin receptor type 1
  • non-fused AM adrenomedullin not fused to JigSAP (SEQ ID NO: 36; hereinafter, also referred to as "non-fused AM” or simply "AM”) was produced by Peptide Institute, Inc. in the same manner as in (1) above, and the cAMP production ability of the non-fused AM was measured.
  • Example 2 Verification of the effectiveness of cerebral infarction treatment based on AM-JigSAP (the purpose)
  • the AM-JigSAP fusion peptide will be administered into the brain of a mouse model of cerebral infarction to verify its therapeutic effect on gait disturbance.
  • AM-JigSAP/JigSAP composition A composition containing the AM-JigSAP fusion peptide and JigSAP (hereinafter referred to as "AM-JigSAP/JigSAP composition") was prepared by adding 10 ⁇ L of an aqueous solution containing 6 ⁇ g/ ⁇ L of the AM-JigSAP fusion peptide prepared in Example 1 to 10 ⁇ L of the solution containing 1.0 wt % JigSAP prepared in (1) above.
  • the AM-JigSAP/JigSAP composition contains the AM-JigSAP fusion peptide in a molar ratio of 1/2 to JigSAP.
  • a composition was prepared by adding 10 ⁇ L of phosphate buffer to 10 ⁇ L of a solution containing 1.0 wt% JigSAP prepared in (1) above, but not containing the AM-JigSAP fusion peptide (hereafter referred to as the "JigSAP composition"), which served as a comparative control for the AM-JigSAP/JigSAP composition.
  • the mouse cerebral infarction model used was the distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO) model previously reported by the present inventors (Oshikawa, M. et al., Adv Healthc Mater. 2017;6(11):10.1002/adhm.201700183, PMID: 28488337).
  • dMCAO distal middle cerebral artery occlusion
  • infarcts are formed in brain regions where blood supply from the middle cerebral artery is cut off.
  • a foot-fault test was performed as a pre-administration gait function analysis (first gait function analysis; Fig. 3A, "gait function analysis 1").
  • the foot-fault test was performed according to the method described in a previous paper by the present inventors (Jinnou, H., et al., Cell Stem Cell., 2018, 22(1), 128-137.e9., PMID: 29276142). Specifically, mice trained to walk on a wire mesh for 10 minutes on the 6th day after the onset of cerebral infarction were subjected to a 10-minute walking test on the wire mesh, during which the mice's feet were videotaped from below.
  • a glass needle (Drummond, Wiretrol II) filled with the AM-JigSAP/JigSAP composition or JigSAP composition prepared in (2) above was inserted into the 2 mm diameter hole made in the skull during the preparation of the dMCAO model, and the amount of glass needle inserted was adjusted using a micromanipulator (Narishige). 2 ⁇ L of the AM-JigSAP/JigSAP composition prepared in (2) above was administered in small amounts over a period of 5 minutes into the damaged area near the middle cerebral artery (Fig. 3A, "Injection").
  • the gel was kept at around 0°C on ice before administration, at room temperature of 25°C in the needle just before administration, and at around 37°C, the mouse's internal temperature, during administration.
  • the amount administered was 2 ⁇ L per mouse.
  • Seven days after administration 14 days after the preparation of the cerebral infarction model, a second gait function analysis was performed (Fig. 3A, "Gait function analysis 2").
  • the "recovery rate” was calculated as the percentage of steps in which the foot slipped out of the total number of steps in walking function analysis 1 compared to the percentage of steps in which the foot slipped out of the total number of steps in walking function analysis 2.
  • Example 3 Analysis of gene expression changes based on AM-JigSAP (the purpose)
  • AM-JigSAP fusion peptide The purpose
  • VEGF-JigSAP fusion peptide the changes in gene expression in a mouse cerebral infarction model administered VEGF-JigSAP fusion peptide, in which vascular endothelial growth factor (VEGF) is fused to the C-terminus of JigSAP.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF-JigSAP fusion polypeptide and VEGF-JigSAP/JigSAP composition
  • a VEGF-JigSAP fusion peptide (SEQ ID NO: 43) consisting of an amino acid sequence in which mouse VEGF was fused to the N-terminus of JigSAP consisting of the amino acid sequence (RIDARMRADIR) shown in SEQ ID NO: 21 was prepared in the same manner as in (1) of Example 1.
  • a composition containing the VEGF-JigSAP fusion peptide and JigSAP (hereinafter referred to as "VEGF-JigSAP/JigSAP composition”) was prepared in the same manner as in (2) of Example 2.
  • the VEGF-JigSAP/JigSAP composition contains the VEGF-JigSAP fusion peptide in a molar ratio of 1/105 to JigSAP.
  • FIG. 4 shows the results of comparing gene expression in the brains of mice administered with the VEGF-JigSAP/JigSAP composition with that in the brains of mice administered with PBS (FIG. 4A, "VEGF-JigSAP VS PBS") and the results of comparing gene expression in the brains of mice administered with the AM-JigSAP/JigSAP composition with that in the brains of mice administered with the JigSAP composition (FIG. 4B, "AM-JigSAP VS JigSAP").
  • the group of genes whose expression increased in the brains of mice administered with the AM-JigSAP/JigSAP composition showed high similarity to the group of genes whose expression increased in the brains of mice administered with the VEGF-JigSAP/JigSAP composition. This result suggests that the AM-JigSAP/JigSAP composition achieves brain function recovery through a mechanism similar to the brain function recovery mechanism based on the administration of the VEGF-JigSAP/JigSAP composition.

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Abstract

細胞移植に依らず脳梗塞を治療するための新たな方法を提供することを課題とする。　アドレノメデュリン又はその活性断片と自己組織化ペプチドとを連結してなる融合ペプチドを提供する。

Description

融合ペプチド
　本発明は、融合ペプチド、ゲル化組成物、徐放性ゲル、医薬組成物、ゲル作製方法、血管新生促進方法、神経変性抑制方法、神経組織損傷及び／又は虚血の治療方法、並びに脳梗塞治療方法等に関する。
　脳梗塞では、脳血管が閉塞し、血流の減少により脳神経細胞の機能障害が引き起こされる。脳梗塞患者は、半身麻痺、感覚障害、失語症、意識障害等の重篤な症状を示す。
　日本国内では、脳梗塞は年間約20万人が発症する。脳梗塞を発症した患者の多くでは神経機能の回復が困難であり、その約25％は要介護度4又は5となる。その結果、現在では年間約1兆円の医療費が発生しており、高齢化のさらなる進展によって医療費がさらに増大することが懸念されている。
　近年、脳梗塞に対する新たな治療方法として、細胞移植療法が注目を集めている（非特許文献１）。細胞移植療法は、神経細胞等の細胞を脳梗塞部位に移植することにより、脳神経機能を回復させる治療方法である。動物モデルを用いた研究では、幹細胞移植は、神経細胞の代替や、血管新生の促進、神経保護等によって脳機能を改善できることが示されている。
　細胞移植療法は、人工多能性幹細胞の作製技術や分化誘導技術の開発によって、実現可能性が高まっている。しかしながら、細胞を扱うことに起因して、煩雑な操作を要する点や品質維持が困難である点は大きな問題である。また、大量生産できないために低コスト化が難しい点も問題である。
　したがって、脳梗塞治療をより簡便に達成するため、細胞移植に依らない新たな治療方法が嘱望されている。
Olle Lindvall and Zaal Kokaia, Stroke (2011), 42(8):2369-75.
　本発明の目的は、細胞移植に依らず脳梗塞を治療するための新たな方法を提供することである。
　コラーゲン等のゲル化剤や、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸を交互に連結した両親媒性ペプチドは、水又は水溶液に溶解したゾル状態から、固有の温度及び圧力条件下で固化し、ゲル状態になり得ることが知られており、自己組織化ペプチドと総称される。自己組織化ペプチドは、特定の生物学的機能を有するタンパク質等と融合させることによって、生体機能分子を複合化した再生医療材料として利用できる可能性がある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、ジグソー型自己組織化ペプチド（jigsaw-shaped self-assembling peptide、JigSAP）とアドレノメデュリン（Adrenomedullin；以下、「AM」とも表記する）とを連結した新たな融合ペプチドとして、AM-JigSAP融合ペプチドを作製した。
　アドレノメデュリンは、強力な血管拡張性の降圧作用を有するペプチドとして見出された生理活性ペプチドであり、心血管保護作用、抗炎症作用、血管新生作用、及び組織修復促進作用等、多様な薬理作用を有することが知られている。アドレノメデュリンは、比較的短いアミノ酸配列長を有するため、JigSAPと融合したAM-JigSAP融合ペプチドも配列長が短い。それ故、莫大な製造コストを要する細胞での製造ではなく、製造コストの低い化学合成が可能である。また、アドレノメデュリンは安全性が高く、既に臨床応用されている点も有利である。
　一方、アドレノメデュリンは血中安定性が低いことが知られている。そのため、アドレノメデュリン単独では、長期間に亘って持続的な効果が必要となる血管新生等の効果を得ることは難しい。
　本発明者らは、上記の融合ペプチドを、アドレノメデュリンと複合化されていないジグソー型自己組織化ペプチド（JigSAP）で構成されるゲルと複合化してマウス脳梗塞モデルに投与した。その結果、融合ペプチドに含まれるアドレノメデュリンに基づく血管形成促進機能が、ゲルからの徐放効果に基づいて長期に亘って提供され、脳梗塞で生じる歩行機能障害の回復を顕著に促進する効果が得られることを見出した。本発明は、上記研究成果に基づくものであって、以下を提供する。
（１）アドレノメデュリン又はその活性断片と自己組織化ペプチドとを連結してなる融合ペプチド。
（２）前記アドレノメデュリンが、
　（ｉ）配列番号36～41のいずれかで示すアミノ酸配列、
　（ｉｉ）配列番号36～41のいずれかで示すアミノ酸配列において1～15個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、又は
　（ｉｉｉ）配列番号36～41のいずれかで示すアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列
からなる、（１）に記載の融合ペプチド。
（３）前記アドレノメデュリンにおいて、配列番号36で示すアミノ酸配列の16位及び21位に対応するシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成しているか、又は前記ジスルフィド結合がエチレン基によって置換されている、（１）に記載の融合ペプチド。
（４）前記アドレノメデュリン又はその活性断片が、そのC末端に付加されたグリシン残基を含む、（１）に記載の融合ペプチド。
（５）前記自己組織化ペプチドが、
　（ａ）以下の式I：
　　Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa　（式I）
　　（式中、Xaaは独立してIle又はMetであり、Yaaは独立してAsp、Glu、Lys、又はArgであり、Zaaは独立してAla又はGlyである）
で示すアミノ酸配列、
　（ｂ）以下の式II～式IV：
　　Arg-Gly-Asp-Ala-(Arg-Ala-Asp-Ala)3　（式II）、
　　(Arg-Ala-Asp-Ala)3-Arg-Gly-Asp-Ala　（式III）、又は
　　(Arg-Ala-Asp-Ala)3-Arg-Ala-Asp-Gly　（式IV）
のいずれかで示すアミノ酸配列、又は
　（ｃ）以下の式V：
　　(Arg-Ala-Asp-Ala)p　（式V）
　　（式中、pは1以上の整数である）
で示すアミノ酸配列
を含む、（１）～（４）のいずれかに記載の融合ペプチド。
（６）前記式I、前記式II～式IV、又は前記式Vで示すアミノ酸配列のN末端側及び／又はC末端側にArgが付加されている、又は前記式I、前記式II～式IV、又は前記式Vで示すアミノ酸配列のN末端側及び／又はC末端側に2アミノ酸のArgが付加されている、（５）に記載の融合ペプチド。
（７）前記アドレノメデュリン又はその活性断片が、前記自己組織化ペプチドのC末端側及び／又はN末端側に連結されている、（１）～（４）のいずれかに記載の融合ペプチド。
（８）前記アドレノメデュリン又はその活性断片と前記自己組織化ペプチドとがリンカーを介して連結されている、（１）～（４）のいずれかに記載の融合ペプチド。
（９）C末端がアミド化されている、（１）～（４）のいずれかに記載の融合ペプチド。
（１０）（１）～（４）のいずれかに記載の融合ペプチドを有効成分として含む、ゲル化組成物。
（１１）（１０）に記載のゲル化組成物を含む、徐放性ゲル。
（１２）前記アドレノメデュリン又はその活性断片と連結されていない前記自己組織化ペプチドをさらに含む、（１０）に記載のゲル化組成物。
（１３）炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択されるいずれか１種以上の陰イオンをさらに含む、（１０）に記載のゲル化組成物。
（１４）（１０）に記載のゲル化組成物を含む、医薬組成物。
（１５）血管新生促進及び／又は神経変性抑制のための、（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）神経組織損傷及び／又は虚血の治療及び／又は予防に用いるための、（１４）に記載の医薬組成物。
（１７）前記神経組織損傷が脳梗塞、脳卒中、又は外傷性脳損傷である、（１６）に記載の医薬組成物。
（１８）ゲル作製方法であって、
　（１０）に記載のゲル化組成物を水又は水溶液と混合する、混合工程、及び
　前記混合工程後に得られる混合物をゲル化温度以下の温度に維持することによりゲル化させる、ゲル化工程
を含むゲル作製方法。
（１９）前記混合工程で、炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択されるいずれか１種以上の陰イオンをさらに混合する、（１８）に記載の方法。
（２０）前記ゲル中の前記融合ペプチドの濃度が0.4重量％～10重量％である、（１８）に記載の方法。
（２１）前記ゲルが移植用及び／又は徐放性である、（１８）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2023-192464号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、細胞移植に依らず脳梗塞を治療するための新たな方法が提供される。
AM-JigSAP融合ペプチドの構造と活性を示す図である。図1Aは、AM-JigSAP融合ペプチドの構造を模式的に示す。AM-JigSAP融合ペプチドでは、アドレノメデュリン（AM）がJigSAPのC末端側に融合している。図1Bは、JigSAPと融合していないアドレノメデュリン（AM）、及びAM-JigSAP融合ペプチドの活性を測定した結果を示す。 マウス脳梗塞モデルの歩行機能解析方法を示す図である。図2Aは、マウスが網から後ろ足を滑らせた様子を示す。図2Bは正常な歩行を示す。 マウス脳梗塞モデルの歩行機能解析結果を示す図である。図3Aは、マウス脳梗塞モデルの歩行機能解析方法を示す図である。図3Bは、AM-JigSAP/JigSAP組成物又はJigSAP組成物を脳内に投与したマウス脳梗塞モデルの歩行機能解析の結果を示す図である。 各種組成物投与後のマウス脳における遺伝子発現を示す図である。図4Aは、VEGF-JigSAP/JigSAP組成物を投与したマウス脳における遺伝子発現を、PBSを投与したマウス脳における遺伝子発現と比較した結果（VEGF-JigSAP vs PBS）を示す。図4Bは、AM-JigSAP/JigSAP組成物を投与したマウス脳における遺伝子発現を、JigSAP組成物を投与したマウス脳における遺伝子発現と比較した結果（AM-JigSAP vs JigSAP）を示す。
１．融合ペプチド
１－１．概要
　本発明の第1の態様は、融合ペプチドである。本態様の融合ペプチドは、アドレノメデュリン又はその活性断片と自己組織化ペプチドとを連結してなるペプチドである。本態様の融合ペプチドは、融合ペプチド中のアドレノメデュリンに基づく血管形成促進機能を提供することができる。また、本態様の融合ペプチドでは、アドレノメデュリンが自己組織化ペプチドと連結されることによって安定化し、血管形成促進機能が長期間に亘って持続する。
１－２．用語の定義
　本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
　本明細書において「自己組織化（Self-assembly）」とは、小分子が分散媒中で分子間相互作用等により自発的に集合し、３次元立体構造を形成することをいう。自己組織化によりゲル化する物質を、本明細書ではしばしば「ゲル化剤」と表記する。本明細書における自己組織化ペプチドは、ゲル化剤の一種である。
　本明細書において「自己組織化ペプチド（Self-assembling peptide）」とは、水又は水溶液に溶解したゾル状態から、固有の温度及び圧力条件下で固化し、ゲル状態になり得るペプチドをいう。例えば、コラーゲン（膠、ゼラチン、ゼリーを含む）や(RADA)4ペプチド（配列番号35）、及び後述する実施例のJigSAP等が該当する。
　本明細書において「ゲル」とは、コロイド粒子が分散媒中で自己組織化し、流動性を失って固化し、固体状となったものをいう。
　本明細書において「ゲル状態」とは、コロイド粒子が分散媒中で自己組織化し、流動性を失って固化した状態をいう。一般的には、ゾルを降温させることによって固化した状態が該当する。「ゲル化」とは、ゾル状態からゲル状態への相転移現象である。
　本明細書において「ゾル」とは、コロイド粒子が分散媒中に分散して、流動性を有する液体状態となったものをいう。例えば、ゲルを昇温することによってゲル化剤からなるコロイドが分散媒中で流動化したものが該当する。
　「ゾル状態」とは、コロイド粒子が分散媒中に分散し、流動性を有した液体状態をいう。例えば、ゲル化剤を水や水溶液等の分散媒中に分散させた状態や、ゲルを昇温させることによって流動化した状態が該当する。「ゾル化」とは、ゲル状態からゾル状態への相転移現象である。
　本明細書において「ゲル化温度」とは、ゲル化剤が、ゾル状態からゲル状態に相転移する温度をいう。「ゾル化温度」とは、ゲル化剤が、ゲル状態からゾル状態に相転移する温度をいう。
　本明細書において「ペプチド」とは、1つ以上のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーをいう。「ペプチド」は、ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。したがって、「ペプチド」には、ジペプチドやトリペプチド等の数個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドから、多数のアミノ酸残基を含むポリペプチドまでが包含される。よって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含される。
　本明細書において「融合ペプチド」とは、自己組織化ペプチドにアドレノメデュリン等の機能性ペプチドを連結したものをいう。自己組織化ペプチドと機能性ペプチドとの間の連結は、共有結合又は超分子相互作用であってもよい。共有結合は限定せず、例えばペプチド結合、ジスルフィド結合等が含まれる。限定はしないが、機能性ペプチドは、自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端に連結することが好ましく、さらに結合は共有結合であることが好ましく、好ましい共有結合はペプチド結合である。
　本明細書において「機能性ペプチド」とは、生体内若しくは生体外、又は細胞内若しくは細胞外において、特定の生物学的機能を有するペプチドをいう。本明細書において「特定の生物学的機能」とは、タンパク質や核酸等の生体分子、細胞、組織又は個体に任意の影響を与え得る機能であれば限定しない。特定の生物学的機能は天然又は非天然を問わず、例えば細胞接着機能、シグナル伝達機能、結合機能、連結機能、標識機能、代謝機能等が例示される。機能性ペプチドの一例として、アドレノメデュリンが挙げられる。
　本明細書において「生体適合性」とは、生体への導入が可能である性質をいう。特に、ある材料が生体に対する毒性や副作用を有しないか、有していても極めて軽微である性質、及び／又は生体内において異物認識されず、排除されることがない性質をいう。本明細書において、「ペプチドが生体適合性を有する」とは、例えば、生物由来のコンタミネーションがないため人体に対してアレルギーや未知の感染症を生じるリスクがないか、非常に少ないペプチドをいう。生体適合性を有するペプチドには、例えば化学的に合成されたペプチド等が挙げられる。
　本明細書において「生体」とは、細胞（培養細胞を含む）、組織、器官、又は個体をいう。限定はしないが、例えばヒト若しくはヒト以外の個体に由来する細胞、組織、若しくは器官、又はヒト若しくはヒト以外の個体に由来する細胞、例えばES細胞やiPS細胞から分化して得られる細胞や組織が挙げられる。好ましくは、ヒト由来の細胞、ヒト由来の細胞からなる組織若しくは器官、又はヒト個体である。
　本明細書において「生理的条件」とは、生体分子の構造や活性、細胞や組織の構造や機能、又は個体の活動や生存が実質的に損なわれない、温度やpH等の条件をいう。より具体的には、生体内若しくは細胞内で存在し得る条件が該当する。本明細書において、生理的条件は、特にタンパク質等の生体分子が変性しない、又は変性しにくい条件を意味する。本明細書において、生理的pHは、タンパク質等の生体分子が変性しない、又は変性しにくいpHであれば限定しない。例えば、pH 4.0～10.0の範囲内、pH 5.0～9.0の範囲内、pH 6.0～8.0の範囲内、又はpH 6.5～7.5の範囲内、例えばpH 7.4である。本明細書において、生理的温度は、タンパク質等の生体分子が変性しない、又は変性しにくい温度であれば限定しない。例えば0～65℃、4～60℃、20～50℃、又は30～40℃の範囲内の温度、例えば37℃である。
　本明細書において「徐放」とは、物質が空間中に徐々に放出されることをいう。本明細書では、特にゲルに含まれる物質が、ゲルから徐々に放散されることをいう。例えば、物質がゲルに内包されていない場合に放散される速度よりも遅い速度で放散されることをいう。生体内に埋め込まれたゲルから機能性分子が徐放される場合、その周囲の空間（例えば、ゲルが埋め込まれた疾患部位、損傷部位、組織、又は器官）では長期間に亘って機能性分子が存在し、その機能が提供される。
　本明細書において「長期」又は「長期間」とは、通常の条件下で物質が放散され続ける期間よりも長い期間を意味する。具体的には、ゲルに内包されていない物質が同一条件下で放散され続ける期間よりも長いことを意味する。具体的な期間は物質の種類によって異なるが、例えば、１時間以上、２時間以上、３時間以上、６時間以上、半日以上、１日以上、２日以上、３日以上、１週間以上、２週間以上、１か月以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、６か月以上、又は１年以上の期間が該当する。
　本明細書において「アミノ酸」は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれも包含する。非天然アミノ酸は、例えば任意の化学修飾基や置換基を有するアミノ酸である。本明細書においてアミノ酸は任意の光学異性体を含み、D体又はL体のいずれであってもよい。
　本明細書において「疎水性アミノ酸」とは、疎水性を有するアミノ酸又は疎水性の高いアミノ酸をいう。例えば、アラニン（Ala/A）、グリシン（Gly/G）、プロリン（Pro/P)、バリン（Val/V）、ロイシン（Leu/L）、イソロイシン（Ile/I）、メチオニン（Met/M）、システイン（Cys/C）、フェニルアラニン（Phe/F）、チロシン（Tyr/Y）、及びトリプトファン（Trp/W）等が含まれる。なお、これらのアミノ酸の中でシステインの疎水性は低いため、親水性アミノ酸として分類される場合もある。
　本明細書において「親水性アミノ酸」とは、親水性を有するアミノ酸又は親水性の高いアミノ酸をいう。例えば、アスパラギン酸（Asp/D）、グルタミン酸（Glu/E）、リジン（Lys/K）、ヒスチジン（His/H）、及びアルギニン（Arg/R）等が含まれる。
　本明細書において「複数個」とは、例えば、2～20個、2～15個、2～10個、2～5個、2～3個、又は2個をいう。また、本明細書において「数個」とは、1～15個、1～10個、1～5個、1～3個、又は1～2個をいう。
　本明細書において「アミノ酸同一性」とは、比較する2つのペプチドのアミノ酸配列において、アミノ酸残基の一致数が最大となるように、必要に応じて一方又は双方に適宜ギャップを挿入して整列化（アラインメント）したときの、全アミノ酸残基数における一致アミノ酸残基数の割合（％）をいう。アミノ酸同一性を算出するための2つのアミノ酸配列の整列化は、Blast、FASTA、ClustalW等の既知プログラムを用いて行うことができる。
　本明細書において「(アミノ酸の）置換」とは、特に断りの無い場合、天然のタンパク質を構成する20種類のアミノ酸間において、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似する保存的アミノ酸群内での置換をいう。例えば、低極性側鎖を有する無電荷極性アミノ酸群（Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr）、分枝鎖アミノ酸群（Leu, Val, Ile）、中性アミノ酸群（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸群（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr，Cys）、酸性アミノ酸群（Asp, Glu）、塩基性アミノ酸群（Arg, Lys, His）、芳香族アミノ酸群（Phe, Tyr, Trp）内での置換が挙げられる。これらの群内でのアミノ酸置換であれば、ペプチドの性質に変化を生じにくいことが知られているため好ましい。
１－３．構成
　本態様の融合ペプチドの構成について、以下で具体的に説明をする。
　本態様の融合ペプチドは、アドレノメデュリン又はその活性断片と自己組織化ペプチドとを連結してなるペプチドである。
　本明細書において「アドレノジュリン（Adrenomedullin；以下、「AM」とも表記する）」とは、強力な血管拡張性の降圧作用を有するペプチドとして見出された生理活性ペプチドである。アドレノメデュリンは、心血管保護作用、抗炎症作用、血管新生作用、及び組織修復促進作用等、多様な薬理作用を有することが知られている。
　アドレノメデュリンの具体例として、配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む、又はからなるヒト由来のアドレノメデュリン(ヒトAM)が挙げられる。さらなる具体例として、配列番号37で示されるアミノ酸配列からなるブタシシ由来のアドレノメデュリン、配列番号38で示されるアミノ酸配列からなるイヌ由来のアドレノメデュリン、配列番号39で示されるアミノ酸配列からなるウシ由来のアドレノメデュリン、配列番号40で示されるアミノ酸配列からなるラット由来のアドレノメデュリン、及び配列番号41で示されるアミノ酸配列からなるマウス由来のアドレノメデュリンも挙げられる。
　また、アドレノメデュリンには、配列番号36～41で示されるアドレノメデュリンと機能的に同等の活性を有する、アドレノメデュリンバリアント、アドレノメデュリン変異体、及び他生物種のアドレノメデュリンオルソログも包含される。具体的には、配列番号36～41で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、或いは配列番号36～41で示されるアミノ酸配列に対して80％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上のアミノ酸同一性を有する、アドレノメデュリンバリアント、アドレノメデュリン変異体、又はアドレノメデュリンオルソログが例示される。
　本明細書においてアドレノメデュリンの「活性断片」とは、上記のいずれかのアドレノメデュリンにおいて、血管新生作用等の生理活性を有する断片、例えば上記のいずれかのアドレノメデュリンの活性の50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、若しくは90％以上の活性、又はそれと同等以上の活性を有する断片をいう。活性断片を構成するペプチドのアミノ酸長は、特に限定しないが、例えば、上記のいずれかのアドレノメデュリンにおいて、20以上、30以上、40以上、又は50以上のアミノ酸が連続する領域であればよい。
　一実施形態において、本態様の融合ペプチドでは、アドレノメデュリンにおいて配列番号36で示すアミノ酸配列の16位及び21位に対応するシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成しているか、又は前記ジスルフィド結合がエチレン基等の連結基によって置換されている。
　また、一実施形態において、アドレノメデュリン又はその活性断片は、そのC末端に付加されたグリシン（Gly）残基を含む。
　本態様の融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドは、水又は水溶液に溶解したゾル状態から、固有の温度及び圧力条件下で固化し、ゲル状態になり得るペプチドであれば、その種類は限定しない。
　一実施形態において、本態様の融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドは、親水性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基が交互に連結された両親媒性ペプチドである。例えば、以下の（ａ）～（ｃ）のアミノ酸配列のいずれかを含むか、又はからなるペプチドが例示される。
　（ａ）以下の式I：
　　Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa　（式I）
　　（式中、Xaaは独立してIle又はMetであり、Yaaは独立してAsp、Glu、Lys、又はArgであり、Zaaは独立してAla又はGlyである）
で示すアミノ酸配列
　（ｂ）以下の式II～式IV：
　　Arg-Gly-Asp-Ala-(Arg-Ala-Asp-Ala)3　（式II）、
　　(Arg-Ala-Asp-Ala)3-Arg-Gly-Asp-Ala　（式III）、又は
　　(Arg-Ala-Asp-Ala)3-Arg-Ala-Asp-Gly　（式IV）
のいずれかで示すアミノ酸配列
　（ｃ）以下の式V：
　　(Arg-Ala-Asp-Ala)p　（式V）
　　（式中、pは1以上の整数）
で示すアミノ酸配列
　上記式Iで示すアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドは、WO2022/025209においてゲル化し得ることが開示されている。上記式Iで示すアミノ酸配列の具体例として、IRARMDADI（配列番号1）、IRADMRADI（配列番号2）、IRADMDARI（配列番号3）、IDARMRADI（配列番号4）、IDARMDARI（配列番号5）、IDADMRARI（配列番号6）、IRGDIRGDI（配列番号7）、IRGDMRGDI（配列番号8）、IRADIRADM（配列番号9）、IDARMRADM（配列番号10）、MDARIDARI（配列番号11）、MDADMRARI（配列番号12）、IRGDMRADI（配列番号13）、IRADMRGDI（配列番号14）、IRGDIRGDI（配列番号15）、IRGDIRADI（配列番号16）、及びIRADIRGDI（配列番号17）が挙げられる。
　一実施形態において、上記式Iで示すアミノ酸配列を含む自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端にArgが連結されている。さらなる実施形態では、上記式Iで示すアミノ酸配列を含む自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端の2アミノ酸には、いずれもArgが連結されている。上記式Iで示すアミノ酸配列を含む自己組織化ペプチドのN末端及びC末端がArgである自己組織化ペプチドとして、RIRARMDADIR（配列番号18）、RIRADMRADIR（配列番号19）、RIRADMDARIR（配列番号20）、RIDARMRADIR（配列番号21）、RIDARMDARIR（配列番号22）、RIDADMRARIR（配列番号23）、RIRGDIRGDIR（配列番号24）、RIRGDMRGDIR（配列番号25）、RIRADIRADMR（配列番号26）、RIDARMRADMR（配列番号27）、RMDARIDARIR（配列番号28）、RMDADMRARIR（配列番号29）、RIRGDMRADIR（配列番号30）、RIRADMRGDIR（配列番号31）、RIRGDIRGDIR（配列番号32）、RIRGDIRADIR（配列番号33）、及びRIRADIRGDIR（配列番号34）が挙げられる。
　上記式II～式IVで示すアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドは、WO2020/171161においてゲル化し得ることが開示されている。
　上記式Vで示すアミノ酸配列からなり、p=4の自己組織化ペプチドはRADA16ペプチドとして知られており、ゲル化し得ることが知られている。上記式V中のpは、1以上の整数であり、限定するものではないが、例えば2以上、3以上、又は4以上、及び／又は8以下、7以下、6以下、又は5以下である。
　本態様の融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドは、式I～式Vのいずれかで示すアミノ酸配列を少なくとも１つ含む、又は１以上の式I～式Vのいずれかで示すアミノ酸配列からなる。例えば、本態様の融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドは、式I～式Vのいずれかで示すアミノ酸配列を１つ又は２つ含んでもよい。
　本態様の融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドが、式I～式Vのいずれかで示すアミノ酸配列を２つ含む場合、２つ以上の式I～式Vのいずれかで示すアミノ酸配列は同一のアミノ酸配列からなるものであってもよく、又は異なるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　一実施形態では、本態様の融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドは、式I～式Vのいずれかで示すアミノ酸配列のN末端側及び／又はC末端側にさらなるアミノ酸残基を含むものであっても、或いは含まないものであってもよい。
　本態様の融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドを構成するグリシン以外のアミノ酸は、光学異性体を問わず使用することができる。すなわち、D体又はL体のいずれを使用してもよい。例えば、自己組織化ペプチドを構成するグリシン以外のアミノ酸は、すべてD体であってもよく、又はすべてL体であってもよい。
　本態様の融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸配列の全長は、限定するものではないが、例えば50アミノ酸以下又は25アミノ酸以下である。具体的なアミノ酸長の例として、20アミノ酸以下、15アミノ酸以下、又は10アミノ酸以下、及び／又は4アミノ酸以上、5アミノ酸以上、6アミノ酸以上、7アミノ酸以上、又は8アミノ酸以上、例えば16アミノ酸、15アミノ酸、14アミノ酸、13アミノ酸、12アミノ酸、11アミノ酸、10アミノ酸、又は9アミノ酸が挙げられる。
　一実施形態では、本態様の融合ペプチドは、自己組織化ペプチドのN末端側及び／又はC末端側に、1個のアミノ酸残基、又は複数個のアミノ酸残基からなるペプチドを含んでもよい。自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端のアミノ酸残基は親水性アミノ酸であってもよい。
　本態様の融合ペプチドにおいて、アドレノメデュリン又はその活性断片と自己組織化ペプチドとの連結は、共有結合又は超分子相互作用である。共有結合は限定せず、例えばペプチド結合又はジスルフィド結合である。
　一実施形態では、本態様の融合ペプチドでは、アドレノメデュリン又はその活性断片と前記自己組織化ペプチドとがリンカーを介して連結されている。リンカーの具体的な構造は限定しないが、例えばペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは限定しないが、通常は1～50アミノ酸長、好ましくは5～20アミノ酸長が例示される。側鎖が比較的小さいアミノ酸、例えばセリンやグリシンを多く含むペプチドが用いられる場合が多い。
　本態様の融合ペプチドのN末端アミノ酸残基のアミノ基、及びC末端アミノ酸残基のカルボキシル基には、任意に修飾基が付加されていてもよい。例えば、本態様の融合ペプチドのN末端はアセチル基が付加されていてもよい。また、本態様の改変型ペプチドのC末端はNH2アミドが付加されていてもよい。
　一実施形態において、本態様の融合ペプチドは、アドレノメデュリン又はその活性断片に加えて、それ以外の機能性ペプチドも連結されている。そのような機能性ペプチドの種類は限定せず、例えばアドレノメデュリンの活性を補助するペプチドや、アドレノメデュリンと同様に血管新生促進効果を有するVEGF、標識機能を有するペプチドや精製用のペプチドタグ等のペプチドであってもよい。標識機能を有するペプチドは、限定はしないが、例えば、GFP等の蛍光タンパク質、ルシフェリン、又はイクオリン等の発光タンパク質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、又はアルカリホスファターゼ（AP）等の酵素であり得る。また、ペプチドタグは、人工的に合成された数～十数アミノ酸からなるオリゴペプチドであり、例としてFLAGタグ、ヒスチジンタグ、HAタグ、DAPタグ等のエピトープタグ、及びHisタグやGSTタグ、Haloタグ等が挙げられる。また、本態様の融合ペプチドは、ペプチド結合以外で任意に1以上の化学修飾基を結合していてもよい。化学修飾基の構造は特に限定しないが、それを結合する融合ペプチドに所望の機能を付与する部分である。所望の機能としては、例えば標識機能、リンカー機能、連結機能、及び結合機能等が挙げられる。標識機能を付与する化学修飾基の例としては、発色基や蛍光基（例えばフルオレセイン等）が挙げられる。リンカー機能を付与する化学修飾基の例としては、任意のポリマー（例えば、アルキレン等）が挙げられる。結合機能を付与する化学修飾基の例としては、ビオチン等の化合物が挙げられる。その他、本態様の融合ペプチドに結合することができる化学修飾基としては、脂質、糖、アプタマー、受容体のリガンド等が挙げられる。脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンE、ビタミンA、ビタミンD）、ビタミンK等の脂溶性ビタミン、アシルCoA等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、並びにそれらの誘導体等を例示することができる。糖としては、例えば、グルコース、及びスクロース等が挙げられる。
１－４．効果
　本態様の融合ペプチドは、生体内においてアドレノメデュリンに基づく血管形成促進機能を提供することができる。例えば、本態様の融合ペプチドをアドレノメデュリンと融合していない自己組織化ペプチドと組み合わせて脳梗塞部位等の標的部位に投与することにより、融合ペプチドが複合化されたゲルが形成され、ゲルから融合ペプチドが徐放される。この徐放作用に基づいてゲルを移植した標的部位周辺で血管形成が長期に亘って促進され得る。
　本態様の融合ペプチドによれば、上記のいずれかの融合ペプチドをヒト等の被験体に投与することを含む、疾患の治療及び／又は予防方法が提供される。また本態様の融合ペプチドによれば、ヒト等の被験体における疾患の治療及び／又は予防における使用のための、上記のいずれかの本態様の融合ペプチドもまた提供される。さらに本発明によれば、疾患を治療及び／又は予防するための医薬の製造における、上記のいずれかの本態様の融合ペプチドもまた提供される。
２．ゲル化組成物
２－１．概要
　本発明の第2の態様はゲル化組成物である。本態様のゲル化組成物は、第１態様に記載の融合ペプチドを必須の有効成分とし、他にゲル化剤、ゲル化促進成分、及び／又は担体等を包含してなる。本態様のゲル化組成物は、水中又は水溶液中でそのゲル化温度以下の温度で維持することによってゲル化することが可能である。
２－２．構成
２－２－１．構成成分
　本発明のゲル化組成物は、有効成分及びそれ以外の成分によって構成されている。有効成分以外の成分は特に限定はしないが、例えば、ゲル化組成物のゲル化を促進し得る成分や担体等が挙げられる。以下、各構成成分について具体的に説明をする。
（１）有効成分
　本態様のゲル化組成物は、必須の有効成分として第1態様に記載の融合ペプチドを含む。
　ゲル化組成物に配合される融合ペプチドの量（含有量）は、特に限定はされない。本発明のゲル化組成物を生体内に投与する場合には、そのゲル化組成物に包含される融合ペプチド、ゲル化剤の種類及び／又はその有効量、被験体の情報、ゲル化組成物の剤形、並びに後述する担体又は添加物の種類に応じて適宜定めればよい。具体的には、ゲル化組成物中での融合ペプチドの濃度は、限定はしないが、例えば後述するゲル化剤（自己組織化ペプチド）の濃度の100,000分の1以上、10,000分の1以上、1,000分の1以上、100分の1以上、又は10分の1以上、かつ／又は2倍以下、1.5倍以下、1倍以下、0.8倍以下、0.5倍以下、又は0.2倍以下であってもよい。融合ペプチドの具体的な濃度は、以下に限定するものではないが、例えば1×10-6重量％以上、1×10-5重量％以上、1×10-4重量％以上、1×10-3重量％以上、又は1×10-2重量％以上、かつ／又は10重量％以下、5重量％以下、2重量％以下、1重量％以下、0.5重量％以下、0.3重量％以下、0.2重量％以下、0.1重量％以下、0.05重量％以下、又は0.02重量％以下であってもよい。なお、ゲル化組成物中での融合ペプチドの濃度とゲル化剤（自己組織化ペプチド）の濃度との比率は、治療対象や投与部位等によって適宜調節することができる。本明細書において「有効量」とは、ゲル化組成物において融合ペプチドが有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。ここで「被験体」とは、ゲル化組成物や医薬組成物の適用対象となる生体をいう。例えば、ヒト、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ等）、競走馬、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ等）、実験動物（マウス、ラット、モルモット、サル、マーモセット等）等が該当する。好ましくはヒトである。また、「被験体の情報」とは、ゲル化組成物を適用する生体の様々な個体情報であって、例えば、被験者の場合であれば、全身の健康状態、疾患・病害に罹患している場合にはその進行度や重症度、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。ゲル化剤の最終的な有効量、及びそれに基づいて算出される適用量は、個々の被験体の情報等に応じて、最終的には医師、歯科医師、又は獣医師等の判断によって決定される。
　本態様のゲル化組成物は他の有効成分として、薬剤等を包含することもできる。本明細書において「薬剤」とは、低分子化合物、ペプチド（酵素及び抗体を含む）、又は核酸（miRNA、siRNA、shRNA等のRNAi分子、アンチセンス核酸、アプタマー等を含む）を含む概念である。薬剤は、限定はしないが、疾患等の治療や症状軽減を目的とする治療医薬等、様々な種類の薬剤を包含する。本態様のゲル化組成物に包含される薬剤は、1種だけでなく、2種以上であってもよい。
（２）ゲル化剤
　本態様のゲル化組成物は、選択的成分として、ゲル化剤を含む。
　本態様のゲル化組成物に含まれるゲル化剤の種類は限定しないが、有効成分である融合ペプチドをゲル化剤が形成するゲル中に含むことが可能であり、融合ペプチドを徐放可能であるものが好ましい。ゲル化剤は、自己組織化ペプチドであってもよく、或いは自己組織化ペプチド以外のものであってもよい。ゲル化剤の具体的な例としては、アドレノメデュリン又はその活性断片と連結されていない、第1態様に記載の自己組織化ペプチドが挙げられる。アドレノメデュリン又はその活性断片と連結されていない、第1態様に記載の自己組織化ペプチドのアミノ酸配列は、有効成分である融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドのアミノ酸配列と同一であっても異なるものであってもよいが、同一のアミノ酸配列であることが好ましい。なお、ここでのアドレノメデュリン又はその活性断片と連結されていない第1態様に記載の自己組織化ペプチドは、上述の標識機能を有するペプチドや精製用のペプチドタグ等のペプチドが結合していてもよい。
　ゲル化組成物に配合されるゲル化剤の量（含有量）は、特に限定はされない。ゲル化の条件を勘案して適宜定めればよい。また、本発明のゲル化組成物を生体内に投与する場合には、そのゲル化組成物に包含されるゲル化剤の種類及び／又はその有効量、被験体の情報、ゲル化組成物の剤形、並びに後述する担体又は添加物の種類に応じて適宜定めればよい。具体的には、ゲル化組成物中のゲル化剤（自己組織化ペプチド）の濃度は、限定はしないが、例えば1×10-4重量％以上、1×10-3重量％以上、又は1×10-2重量％以上、0.1重量％以上、0.2重量％以上、0.3重量％以上、又は0.4重量％以上、かつ／又は10重量％以下、5重量％以下、2重量％以下、1重量％以下、又は0.5重量％以下であってもよく、例えば0.1重量％以上2.0重量％以下であってもよい。ゲル化剤の最終的な有効量、及びそれに基づいて算出される適用量は、個々の被験体の情報等に応じて、最終的には医師、歯科医師、又は獣医師等の判断によって決定される。
（３）ゲル化促進成分
　本態様のゲル化組成物は、必要に応じてそのゲル化を促進し得る成分を含んでもよい。ゲル化促進成分としては、限定しないが、例えばタンパク質の溶解度を低下させる効果を有する成分が挙げられる。一般的に、タンパク質の溶解度を低下させる効果を有する成分は、ペプチドゲル化剤のゲル化を促進し得るためである。
　タンパク質の溶解度を低下させる効果を有する成分は限定せず、例えばタンパク質の溶解度を低下させる効果を有する陽イオン及び陰イオン等が挙げられる。当該効果を有する陽イオン及び陰イオンは、ホフマイスターシリーズとして当業者に周知である。陰イオンであれば、例えば、炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、硫酸イオン等が挙げられる。陽イオンであれば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等が挙げられる。
　タンパク質の溶解度を低下させる効果を有する陽イオン及び陰イオンの濃度は特に限定しない。例えば、1 mM以上、5 mM以上、10 mM以上、20 mM以上、30 mM以上、又は40 mM以上であってもよい。炭酸水素イオン又は炭酸イオンを用いる場合には、水溶液中では炭酸水素イオンと炭酸イオンは通常平衡状態にあることを考慮し、炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計濃度は、1 mM以上、5 mM以上、10 mM以上、20 mM以上、30 mM以上、又は40 mM以上、例えば、44 mMであってもよい。
（４）担体
　本態様のゲル化組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。本明細書において「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、賦形剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。
　溶媒は、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよいが、好ましくは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液である。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、細胞培養や組織培養等に用いられる任意の培地等が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。培地は、市販培地を使用してもよく、一例を挙げればDMEM培地、ハムF12培地、DMEM/F12培地、マッコイ5A培地、イーグルMEM培地、αMEM培地、MEM培地、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、MCDB131培地、ウィリアム培地E、IPL41培地、Fischer's培地等を使用してもよい。
　賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック（登録商標）、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。
　乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
　流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
　上記の他にも、必要であれば医薬において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、無痛化剤、安定剤、pH調節剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、矯味矯臭剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。
　このような担体は、主として剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持する他、有効成分であるゲル化剤が生体内の酵素等によって分解を受け難くするために用いられるものであって、必要に応じて適宜使用すればよい。
２－２－２．ゲル化組成物の性質
　本態様のゲル化組成物のpHは、限定はしない。例えば生理的pHであってもよく、pH 4.0～10.0の範囲内、pH 5.0～9.0の範囲内、pH 6.0～8.0の範囲内、又はpH 6.5～7.5の範囲内、例えばpH 7.4である。
　本態様のゲル化組成物は、水中又は水溶液中でそのゲル化温度以下の温度で維持することによってゲル化し得る。当該ゲル化温度は、原則的には有効成分であるゲル化剤を構成する自己組織化ペプチド又は融合ペプチドのそれに基づく。したがって、本態様のゲル化組成物は、例えば1気圧条件下において、4～80℃の範囲内、10～70℃の範囲内、15～60℃の範囲内、20～50℃の範囲内又は30～40℃の範囲内の温度、例えば37℃でゲル化し得る。
　本態様のゲル化組成物で、融合ペプチドを構成するアドレノメデュリンの活性が実質的に失われることなく、又は少なくともその活性の一部を保持したままで、ゲル化組成物を生理的条件下でゲル化させることができる。それ故、本態様のゲル化組成物がゲル化した後において、当該融合ペプチドを構成するアドレノメデュリンが有する生理活性、例えば血管形成促進機能が発揮され得る。例えば、ゲル化組成物を外科的方法等により生体内に移植することによって、血管形成を誘導することができる。
　被験体に導入された本態様のゲル化組成物は、投与部位において血管形成の促進、及び組織又は器官の形成、再生等が十分に達成された後、例えば対象部位を外科手術等により切開して、ゲル化組成物を移植部位から除去することも可能である。
２－２－３．剤形
　本態様のゲル化組成物の剤形は、特に限定しない。例えば、対象部位への導入が可能な液剤や固形剤であってもよい。固形剤の場合、その形状は問わない。粉剤、散剤、顆粒剤、錠剤等の一般的な固形剤形の他、移植用部材としての形状であってもよい。
２－２－４．適用方法
　本態様のゲル化組成物の適用方法は、特に限定しないが、好ましくは非経口投与であり、さらに好ましくは局所投与である。局所投与には、例えば、筋肉内投与、皮下投与、組織投与、及び器官投与が該当する。本態様のゲル化組成物を局所投与する場合には、本態様のゲル化組成物をゲル状態のまま対象部位に導入してもよい。例えば、対象部位を外科手術により切開して、ゲル状態のまま移植することができる。なお、ゲル状態はゲル形成が完了していない軟らかい段階で行うことが好ましい。投与量は、有効成分が奏効する上で有効な量であればよい。有効量は、被験体情報に応じて適宜選択される。
２－２－５．除去方法
　本態様のゲル化組成物は、必要に応じて、投与部位から除去することができる。例えば、外科手術により投与部位を切開して、ゲル状態のまま外科的に除去することができる。
３．医薬組成物
３－１．構成
　本発明の第3の態様は医薬組成物である。本態様の医薬組成物は、第2態様のゲル化組成物を含む。したがって、本態様の医薬組成物の構成は、下記の構成以外については、第2態様の記載に準じる。
　一実施形態において、本態様の医薬組成物は、血管新生促進及び／又は神経変性抑制のために使用することができる。
　また、一実施形態において、本態様の医薬組成物は移植用である。本発明の医薬組成物は、例えば対象部位を外科手術により切開して、移植することができる。
　本態様の医薬組成物の対象疾患は、以下に限定しないが、神経組織損傷及び／又は虚血が挙げられる。
　本明細書において「神経組織損傷」は、中枢神経組織損傷及び末梢神経組織損傷のいずれも包含する。中枢神経組織損傷には、脳損傷及び脊髄損傷が含まれる。脳損傷は、例えば外傷性脳損傷、脳血管障害等である。脳血管障害は、脳梗塞（虚血性脳血管障害）及び脳出血のいずれも包含する。脊髄損傷は、例えば頚髄損傷、胸髄損傷、腰髄損傷、仙髄損傷等である。末梢神経組織損傷は、任意の末梢神経組織における損傷が包含される。例えば運動神経、感覚神経、及び自律神経の損傷が挙げられる。
　本明細書において「虚血」は、任意の器官や組織における虚血である。例えば、下肢虚血（例えば、閉塞性動脈硬化症や、その重症型である重症下肢虚血）、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞等）や、上記の脳血管障害等が挙げられる。
　本明細書において、治療は、限定しないが、根治的治療及び予防的治療を含む。また、予防は、発症予防、進行予防、及び再発予防を含む。
３－２．効果
　本発明の医薬組成物を対象者の疾患部位、損傷部位、虚血部位、又はその近傍部位に移植することによって、アドレノメデュリンを含む融合ペプチドを長期間に亘って持続的に放出し続けることが可能となり、血管新生の促進や神経変性の抑制をもたらすことができる。或いは、本発明の医薬組成物を対象者の体内の特定の部位に移植することによって、アドレノメデュリンを含む融合ペプチドを長期間に亘って全身に持続的に放出し続けることもできる。
　脳血管障害はCT検査やMRI検査等の画像検査でリスク発見が可能であり、本発明の医薬組成物によってその発症を予防することができる。また、脳梗塞等の脳血管障害は再発性が高いが、本発明の医薬組成物によってその再発を予防することもできる。
４．ゲル作製方法
４－１．概要
　本発明の第4の態様は、ゲル作製方法である。本態様のゲル作製方法によれば、活性の少なくとも一部を維持するアドレノメデュリン又はその活性断片を含む融合ペプチドを含むゲル（例えば徐放性ゲル）を作製することができる。
４－２．方法
　本発明のゲル作製方法は、混合工程及びゲル化工程を必須の工程として含む。
（混合工程）
　混合工程は、第2態様に記載のゲル化組成物を水又は水溶液と混合する工程である。水又は水溶液は、例えば細胞培養培地等の培地であってもよい。培地は、公知の培地を適宜選択して用いることができる。例えば、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（血清、血清代替試薬、増殖因子等；N2サプリメント、B27(R)サプリメント、インシュリン、bFGF、アクチビンA、ヘパリン、ROCKインヒビター、及び／又はGSK-3インヒビター等）を適宜添加することにより調製することができる。培地の具体例としては、DMEM培地、ハムF12培地、DMEM/F12培地、マッコイ5A培地、イーグルMEM培地、αMEM培地、MEM培地、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、MCDB131培地、ウィリアム培地Ｅ、IPL41培地、Fischer's培地等が挙げられる。本工程における混合方法は特に限定せず、撹拌等によって十分に混合すればよい。
　本工程では、後述のゲル化工程におけるゲル化を促進し得る成分をさらに混合してもよい。ゲル化促進成分としては、限定しないが、例えばタンパク質の溶解度を低下させる効果を有する成分を使用することができる。当該効果を有する陰イオンは第2態様に上述した通りである。
　本工程に供するゲル化組成物に含まれる融合ペプチドの濃度は、限定はしないが、例えばゲル化剤の濃度の100,000分の1以上、10,000分の1以上、1,000分の1以上、100分の1以上、又は10分の1以上、かつ／又は2倍以下、1.5倍以下、1倍以下、0.8倍以下、0.5倍以下、又は0.2倍以下であってもよい。融合ペプチドの具体的な濃度は、以下に限定するものではないが、例えば1×10-6重量％以上、1×10-5重量％以上、1×10-4重量％以上、1×10-3重量％以上、又は1×10-2重量％以上、かつ／又は10重量％以下、5重量％以下、2重量％以下、1重量％以下、0.5重量％以下、0.3重量％以下、0.2重量％以下、0.1重量％以下、0.05重量％以下、又は0.02重量％以下、例えば0.4重量％～10重量％であってもよい。なお、ゲル化組成物中での融合ペプチドの濃度とゲル化剤（自己組織化ペプチド）の濃度との比率は、治療対象や投与部位等によって適宜調節することができる。
（ゲル化工程）
　ゲル化工程は、混合工程後に得られる混合物をゲル化温度以下の温度に維持することによりゲル化させる工程である。
　本工程を行う時間及び本工程において使用する温度は、混合工程で混合するゲル化組成物中の融合ペプチド及び自己組織化ペプチドの種類によって異なるので、その種類に応じて適宜定めればよい。例えば、1分以上、10分以上、又は1時間以上で、4～80℃の範囲内、10～70℃の範囲内、15～60℃の範囲内、20～50℃の範囲内又は30～40℃の範囲内、例えば37℃において混合工程後のゲル化組成物を維持してもよい。特に融合ペプチドを構成するアドレノメデュリン又は活性断片の活性が失われない、又はその活性の少なくとも一部が残存する温度条件が好ましく、例えば、4～80℃の範囲内、10～70℃の範囲内、15～60℃の範囲内、20～50℃の範囲内、又は30～40℃の範囲内、例えば37℃の温度条件を使用することができる。上記いずれかの温度条件（例えば37℃）にて5％CO2条件下でゲル化してもよい。本工程で用いる温度の制御方法は特に限定せず、例えば恒温槽等に配置する方法等が挙げられる。
　本工程のゲル化に用いるpH条件は、限定はしない。例えばpH 4.0～10.0の範囲内、pH 5.0～9.0の範囲内、pH 6.0～8.0の範囲内、又はpH 6.5～7.5の範囲内、例えばpH 7.4である。
４－３．効果
　本発明のゲル作製方法によれば、移植用及び／又は徐放性のゲルを作製することができる。また、本発明のゲル作製方法によれば、融合ペプチドに含まれるアドレノメデュリン又はその活性断片の活性を損なわない生理的条件でゲル化させることができ、さらにアドレノメデュリン又はその活性断片を含む融合ペプチドをゲルから徐放させることができる。本発明のゲル作製方法で作製されるゲルは、アドレノメデュリン又はその活性断片を含む融合ペプチドの取り込み効率が高く、優れた徐放性を有する。
　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、この実施例は単なる一例示に過ぎず、本発明は実施例に記載の範囲に限定されるものではない。
＜実施例１：AM-JigSAP融合ペプチドの作製と活性測定＞
（目的）
　アドレノメデュリン（Adrenomedullin；以下、「AM」と表記する）のN末端側にジグソー型自己組織化ペプチド（jigsaw-shaped self-assembling peptide、JigSAP）を融合したAM-JigSAP融合ペプチドを作製し、その活性を測定する。
（方法と結果）
（１）AM-JigSAP融合ペプチドの作製
　配列番号36で示すアミノ酸配列からなるアドレノメデュリン（AM）を配列番号21で示すアミノ酸配列（RIDARMRADIR）からなるJigSAPのC末端側に融合したアミノ酸配列（配列番号42）からなるAM-JigSAP融合ペプチド（図1A；以下、「融合ペプチド」又は「AM-JigSAP」とも表記する）を株式会社ペプチド研究所に委託して作製した。
（２）AM-JigSAP融合ペプチドの活性測定
　文献（Kuwasako K, et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (2000), Vol. 275, No. 38, pp. 29602-29609）に記載の方法に従って、AM-JigSAP融合ペプチドの活性を測定するために、1型アドレノメデュリン受容体（AM1）を安定的に発現するHEK-293細胞を10％FCS含有DMEM培地に懸濁し、ヒトファイブロネクチン（Thermo Fisher Scientific社製）をコートした24ウエルプレートに播種し、5％CO2、37℃で培養した。0.035％NaHCO3、0.2％BSAを含むハンクスバランスド塩溶液に培地を交換して、上記（１）で作製したAM-JigSAP融合ペプチドを0.5 mMイソブチルメチルキサンチン存在下で添加し37℃で15分間インキュベートした。細胞溶解液を添加し、上清中のcAMP濃度をエンザイムイムノアッセイ（Cayman Chemical Company）で測定した。また、JigSAPと融合していないアドレノメデュリン（配列番号36；以下、「非融合型AM」又は単に「AM」とも表記する）を上記（１）と同様に株式会社ペプチド研究所に委託して作製し、非融合型AMに対するcAMP産生能を測定した。
　結果を図1Bに示す。AM-JigSAP融合ペプチドは、非融合型AMと同程度のcAMP産生を誘導し、ほぼ同等の活性を有することが明らかになった。
＜実施例２：AM-JigSAPに基づく脳梗塞治療効果の検証＞
（目的）
　AM-JigSAP融合ペプチドをマウス脳梗塞モデルの脳内に投与し、歩行障害に対する治療効果を検証する。
（方法）
（１）非融合型JigSAPの作製
　アドレノメデュリンと融合していないJigSAP（アミノ酸配列RIDARMRADIR、配列番号21；以下、「非融合型JigSAP」又は単に「JigSAP」とも表記する）をWO2022/025209に記載のFmocペプチド固相合成法によって0.10 mmolスケールで合成した。合成されたペプチドのN末端にはアセチル基が結合しており、C末端はNH2アミドである。合成後のJigSAPは、乾燥後にイオン交換水に分散させ、凍結乾燥した。
　1.5 mLのミクロチューブ管に凍結乾燥後のペプチド粉末1 mgとD-MEM（4.0 mM HEPES、44 mM NaHCO3含有；pH 7.4）90 μLを加え、水浴型超音波装置（AS12GTU、35 kHz、60 W）中で超音波を照射することによってJigSAPを1.0重量％濃度で分散させた。
（２）AM-JigSAP/JigSAP組成物の調製
　上記（１）で調製した1.0重量％のJigSAPを含む溶液10 μLに対して、実施例１で作製した6 μg/μLのAM-JigSAP融合ペプチドを含む水溶液10 μLを加えて、AM-JigSAP融合ペプチド及びJigSAPを含む組成物（以下、「AM-JigSAP/JigSAP組成物」と呼ぶ）を調製した。AM-JigSAP/JigSAP組成物は、JigSAPに対してモル比が2分の1のAM-JigSAP融合ペプチドを含む。
　なお、以下の実験では、AM-JigSAP融合ペプチドを含まず、上記（１）で調整した1.0重量％のJigSAPを含む溶液10 μLに対して、リン酸緩衝液10 μLを加えた組成物（以下、「JigSAP組成物」と呼ぶ）を調製し、AM-JigSAP/JigSAP組成物の比較対照とした。
（３）脳梗塞治療効果の評価
　マウス脳梗塞モデルは、本発明者らが過去に報告した中大脳動脈遠位部梗塞（dMCAO）モデルを用いた（Oshikawa, M. et al., Adv Healthc Mater. 2017;6(11):10.1002/adhm.201700183, PMID: 28488337）。dMCAOモデルでは、中大脳動脈からの血液供給が途絶えた脳領域に梗塞巣が形成される。
　脳梗塞モデル作製後7日目の亜急性期に、投与前の歩行機能解析（1回目の歩行機能解析；図3A、「歩行機能解析1」）としてfoot-fault testを行った。foot-fault testは、本発明者らによる過去の文献（Jinnou, H., et al., Cell Stem Cell., 2018, 22(1), 128-137.e9., PMID: 29276142）に記載の方法に準じて実施した。具体的には、脳梗塞発症後6日目に金網の上を歩く訓練を10分間行ったマウスに対して、金網の上を10分間歩く歩行試験を実施し、試験の間に下方向からマウス足をビデオ撮影した。撮影後、動画を解析して足を滑らせた歩数（図2A）及び正常な歩数（図2B）をカウントした。総歩数のうち足を滑らせた歩数の割合（踏み外し回数／総歩数（％））を算出した。
　1回目の歩行機能解析の後、dMCAOモデル作製時に頭蓋骨に貫通させた直径2 mmの穴に上記（２）で調整したAM-JigSAP/JigSAP組成物又はJigSAP組成物を充填させたガラス針(Drummond社製、WiretrolII)を差し込み、マイクロマニュピレーター(ナリシゲ社製)によりガラス針差し込み量の調整を行い、中大脳動脈付近の損傷領域に上記（２）で調製したAM-JigSAP/JigSAP組成物2μLを5分間かけて少量ずつ投与した（図3A、「注入」）。投与前のゲルの状態は氷上0℃付近で、投与直前は針中で室温25℃、投与中はマウス体内温度37℃付近で温度維持した。投与量は1個体あたり2 μLとした。投与後7日目（脳梗塞モデル作製後14日目）に2回目の歩行機能解析を行った（図3A、「歩行機能解析2」）。歩行機能解析2において総歩数のうち足を滑らせた歩数の割合に対する、歩行機能解析1において総歩数のうち足を滑らせた歩数の割合を「回復率」として算出した。
（結果）
　マウス脳梗塞モデルにAM-JigSAP/JigSAP組成物又はJigSAP組成物を投与した場合の回復率を図3Bに示す。AM-JigSAP/JigSAP組成物を投与した脳梗塞モデル（n=7；図3B、「AM-JigSAP」）では、JigSAP組成物を投与した脳梗塞モデル（n=7；図3B、「JigSAP」）と比較して、投与から1週間後に総歩数のうち足を滑らせた歩数の割合がより顕著に低下し、歩行機能の著しい改善が認められた（P=0.041、スチューデントt検定）。なお、JigSAPと融合していないAMを投与した脳梗塞モデル（n=8;図3B、「AM」）では、JigSAP組成物を投与した脳梗塞モデル（n=7；図3B、「JigSAP」）と比較して、歩行機能完全に関して有意差は認められなかった（P=0.395）。
　したがって、AM-JigSAP融合ペプチドをJigSAPと共に投与することによって、脳梗塞で生じる歩行機能障害の回復を顕著に促進する効果が得られることが示された。この結果は、JigSAPが形成するゲルからAM-JigSAP融合ペプチドが周囲の脳組織に徐放され、AM-JigSAP融合ペプチドに含まれるアドレノメデュリンに基づく血管形成促進機能が長期間に亘って脳梗塞部位やその周囲の脳組織に供給される結果として、脳機能の回復が顕著に促進されることを示している。
＜実施例３：AM-JigSAPに基づく遺伝子発現変化の解析＞
（目的）
　AM-JigSAP融合ペプチドを投与したマウス脳梗塞モデルにおける遺伝子発現変化を解析する。血管内皮細胞増殖因子（VEGF）をJigSAPのC末端側に融合したVEGF-JigSAP融合ペプチドを投与したマウス脳梗塞モデルにおける遺伝子発現変化と比較する。
（方法）
（１）VEGF-JigSAP融合ポリペプチド及びVEGF-JigSAP/JigSAP組成物の作製
　マウスVEGFを配列番号21で示すアミノ酸配列（RIDARMRADIR）からなるJigSAPのN末端側に融合したアミノ酸配列からなるVEGF-JigSAP融合ペプチド（配列番号43）を実施例1の（１）と同様の方法により作製した。さらに実施例2の（２）と同様の方法により、VEGF-JigSAP融合ペプチド及びJigSAPを含む組成物（以下、「VEGF-JigSAP/JigSAP組成物」と呼ぶ）を調製した。VEGF-JigSAP/JigSAP組成物は、JigSAPに対してモル比が105分の1のVEGF-JigSAP融合ペプチドを含む。
（２）遺伝子発現変化の解析
　実施例2の（２）と同様に調製したAM-JigSAP/JigSAP組成物若しくはJigSAP組成物、又は上記（１）で作製したVEGF-JigSAP/JigSAP組成物若しくはPBSを脳皮質内投与によりマウス脳梗塞モデルに投与した。投与から14日後のマウス脳から損傷周辺部を含む損傷領域を摘出し、遺伝子発現アレイにより発現解析を行った。
（結果）
　遺伝子発現解析の結果を図4に示す。図4は、VEGF-JigSAP/JigSAP組成物を投与したマウス脳における遺伝子発現を、PBSを投与したマウス脳における遺伝子発現と比較した結果（図4A、「VEGF-JigSAP VS PBS」）、及びAM-JigSAP/JigSAP組成物を投与したマウス脳における遺伝子発現を、JigSAP組成物を投与したマウス脳における遺伝子発現と比較した結果（図4B、「AM-JigSAP VS JigSAP」）を示す。AM-JigSAP/JigSAP組成物を投与した脳における発現上昇遺伝子群は、VEGF-JigSAP/JigSAP組成物を投与した脳における発現上昇遺伝子群と高い類似性を示した。この結果は、AM-JigSAP/JigSAP組成物は、VEGF-JigSAP/JigSAP組成物の投与に基づく脳機能回復機構と類似した機構によって脳機能回復を達成していることを示唆している。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (21)

  1. 　アドレノメデュリン又はその活性断片と自己組織化ペプチドとを連結してなる融合ペプチド。
  2. 　前記アドレノメデュリンが、
    　（ｉ）配列番号36～41のいずれかで示すアミノ酸配列、
    　（ｉｉ）配列番号36～41のいずれかで示すアミノ酸配列において1～15個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、又は
    　（ｉｉｉ）配列番号36～41のいずれかで示すアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列
    からなる、請求項１に記載の融合ペプチド。
  3. 　前記アドレノメデュリンにおいて、配列番号36で示すアミノ酸配列の16位及び21位に対応するシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成しているか、又は前記ジスルフィド結合がエチレン基によって置換されている、請求項１に記載の融合ペプチド。
  4. 　前記アドレノメデュリン又はその活性断片が、そのC末端に付加されたグリシン残基を含む、請求項１に記載の融合ペプチド。
  5. 　前記自己組織化ペプチドが、
    　（ａ）以下の式I：
    　　Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa　（式I）
    　　（式中、Xaaは独立してIle又はMetであり、Yaaは独立してAsp、Glu、Lys、又はArgであり、Zaaは独立してAla又はGlyである）
    で示すアミノ酸配列、
    　（ｂ）以下の式II～式IV：
    　　Arg-Gly-Asp-Ala-(Arg-Ala-Asp-Ala)3　（式II）、
    　　(Arg-Ala-Asp-Ala)3-Arg-Gly-Asp-Ala　（式III）、又は
    　　(Arg-Ala-Asp-Ala)3-Arg-Ala-Asp-Gly　（式IV）
    のいずれかで示すアミノ酸配列、又は
    　（ｃ）以下の式V：
    　　(Arg-Ala-Asp-Ala)p　（式V）
    　　（式中、pは1以上の整数である）
    で示すアミノ酸配列
    を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合ペプチド。
  6. 　前記式I、前記式II～式IV、又は前記式Vで示すアミノ酸配列のN末端側及び／又はC末端側にArgが付加されている、又は前記式I、前記式II～式IV、又は前記式Vで示すアミノ酸配列のN末端側及び／又はC末端側に2アミノ酸のArgが付加されている、請求項５に記載の融合ペプチド。
  7. 　前記アドレノメデュリン又はその活性断片が、前記自己組織化ペプチドのC末端側及び／又はN末端側に連結されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合ペプチド。
  8. 　前記アドレノメデュリン又はその活性断片と前記自己組織化ペプチドとがリンカーを介して連結されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合ペプチド。
  9. 　C末端がアミド化されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合ペプチド。
  10. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の融合ペプチドを有効成分として含む、ゲル化組成物。
  11. 　請求項１０に記載のゲル化組成物を含む、徐放性ゲル。
  12. 　前記アドレノメデュリン又はその活性断片と連結されていない前記自己組織化ペプチドをさらに含む、請求項１０に記載のゲル化組成物。
  13. 　炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択されるいずれか１種以上の陰イオンをさらに含む、請求項１０に記載のゲル化組成物。
  14. 　請求項１０に記載のゲル化組成物を含む、医薬組成物。
  15. 　血管新生促進及び／又は神経変性抑制のための、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　神経組織損傷及び／又は虚血の治療及び／又は予防に用いるための、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 　前記神経組織損傷が脳梗塞、脳卒中、又は外傷性脳損傷である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 　ゲル作製方法であって、
    　請求項１０に記載のゲル化組成物を水又は水溶液と混合する、混合工程、及び
    　前記混合工程後に得られる混合物をゲル化温度以下の温度に維持することによりゲル化させる、ゲル化工程
    を含むゲル作製方法。
  19. 　前記混合工程で、炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択されるいずれか１種以上の陰イオンをさらに混合する、請求項１８に記載の方法。
  20. 　前記ゲル中の前記融合ペプチドの濃度が0.4重量％～10重量％である、請求項１８に記載の方法。
  21. 　前記ゲルが移植用及び／又は徐放性である、請求項１８に記載の方法。
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