<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung von Tetracyclinen
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Tetracyclinen, u. zw. ein Verfahren zur biologischen Umwandlung von Naphthacenderivaten in antibiotisch wirksame Verbindungen der Tetracyclinreihe mit der Formel
EMI1.1
worin R'5 ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R6 ein WasserstoffatomodereineAlkylgrup- pe mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen und R ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder eine Hydroxylgruppe bedeuten.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Naphthacenderivat der Formel
EMI1.2
worin R ein Wasserstoffatom oder eine Dimethylaminogruppe und Rs ein Wasserstoffatom bedeutet und R ; und R7 wie oben definiert sind, einen üblichen Fermentationsmedium zusetzt, dieses mit einem Stamm einer tetracyclinerzeugenden Art der Gattung Streptomyces wie S. aureofaciens, S. rimosus, S. platensis, S.
hygroscopicus beimpft und die Fermentation solange fortsetzt, bis im wesentlichen in den Stel- lungen 6 und 12a am Ring des eingesetzten Naphthacenderivats eine Hydroxylgruppe und, falls die Stellung 4 nicht substituiert ist, in diese Stellung eine Dimethylaminogruppe sowie gegebenenfalls zusätz- lich, falls die Stellung 7 nicht substituiert ist, in diese Stellung ein Halogenatom und/oder in Stellung 5 eine Hydroxylgruppe eingeführt ist. Halogen kann Chlor, Brom, Jod oder Fluor bedeuten.
Zur Vereinfachung wird das 1, 3, 10, 11, 12-Pentahydroxynaphthacen-2-carboxamidals"Pretetramid" bezeichnet. Die als Ausgangsstoffe für das neue Verfahren der Erfindung verwendeten substituierten
EMI1.3
<Desc/Clms Page number 2>
3, 10, 11, 12-Pentahydroxynaphthacen-2-carboxamidetahydroxynaphthacen-2-carboxamid bequemer als 6-Methylpretetramid, 7 -Clüorpretetramid und 4-Dimethylaminopretetramid bezeichnen.
Die erfindungsgemäss als Ausgangsverbindungen verwendeten"Pretetramide"sind neue Verbindungen, die erhalten werden können, indem man das entsprechende 5, 12- oder 6, 11-Naphthacenchinon, das in Stellung 2 eine Carboxymidogruppe oder eine in diese überführbare Gruppe trägt, reduziert, um die Ketogruppe in Stellung 11 oder 12 in eine Hydroxylgruppe zu überführen und die aus der Ketogruppe in Stellung 5 oder 6 gebildete Hydroxylgruppe zu entfernen, und gegebenenfalls in Stellung 2 die Carboxamidgruppe einführt.
Die Erfindung beruht auf der biologischen Umwandlung von Pretetramiden in Tetracycline. Das Verfahren der Erfindung umfasst, allgemein ausgedrückt, die biologische Hydratisierung an den Stellungen Sa, 6 und 4a, 12a der Pretetramide oder anders ausgedrückt, die Nettoaddition von 2 Molen Wasser, 1 Mol in Stellung 5a, 6 und das andere in Stellung 4a, 12a. Diese Umwandlung wird bewirkt, indem man ein substituiertes Pretetramid oder Pretetramid selbst einem Fermentationsmedium zusetzt, das mit einem Stamm einer Species der Gattung Streptomyces inokuliert wurde, die eines der Tetracycline produzieren kann.
Beispiele solcher geeigneter Stämme sind später genannt. Gleichzeitig mit der Sa, 6-und 4a, 12a-Di- hydratation der Pretetramide können bestimmte andere biologische Umwandlungen erzielt werden. Wenn z. B. R in obiger Formel für die Ausgangsverbindung ein Wasserstoffatom darstellt, so führt jeder Stamm der oben angegebenen Streptomyces-Arten in der Stellung 4 des Pretetramids eine Dimethylaminogruppe ein. Soweit R eine Dimethylaminogruppe darstellt, bleibt dieser Substituent in Stellung 4 erhalten ohne Rücksicht auf die am Rest des Pretetramidmoleküls stattfindenden biologischen Umwandlungen.
Wenn eine Streptomyceseart verwendet wird, die in 5-Stellung hydroxyliert, so wird in Stellung 5 eine Hydroxylgruppe eingeführt ; wird eine Art der Gattung Streptomyces verwendet, die die 5-Stellung nicht hydroxyliert, bleibt das Wasserstoffatom R, erhalten. Falls R7 in der Ausgangsverbindung einen andern Substituenten als Wasserstoff darstellt, so bleibt dieser Substituent in Stellung 7 erhalten, unabhängig von den am Rest des Pretetramidmoleküls stattfindenden biologischen Umwandlungen. Ist R7 ein Wasserstoffatom und wird ein Streptomycesstamm verwendet, der nicht halogeniert, so ist 1) auch im Reaktionsprodukt ein Wasserstoffatom.
Ist jedoch R im Pretetramidmolekül ein Wasserstoffatom und wird ein Stamm der Gattung Streptomyces verwendet, der in Stellung 7 halogeniert, so ist R, im Reaktionsprodukt ein Chlor- oder Bromatom in Abhängigkeit von den Fermentationsbedingungen. Zu den Stämmen von S. aureofaciens, die in Stellung 7 des Pretetramidmoleküls ein Chlor- oder Bromatom einführen und die auch die Dihydratisierung in Stellung 5a, 6 und 4a, 12a bewirken und falls R, ein Wasserstoffatom darstellt, die Dimethylaminogruppe einführen, gehören die folgenden :
EMI2.1
<tb>
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 10762a <SEP>
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 10762b
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 10762g
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> A <SEP> TCC <SEP> 10762i <SEP>
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 11989
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> A <SEP> TCC <SEP> 12416b <SEP>
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 12416c
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 12416d
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 12551
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 12552
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 12553
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 12554
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 13189
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 13899
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 13900
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> NRRL <SEP> B-1286
<tb> S.
<SEP> aureofaciens <SEP> NRRL <SEP> B-1287
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> NRRL <SEP> B-1288
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> NRRL <SEP> 2209
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> NRRL <SEP> B-2406
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> NRRL <SEP> B-2407
<tb>
<Desc/Clms Page number 3>
S. aureofaciens NRRL 3013
Ein Beispiel für einen Stamm der Art Streptomyces, der nicht halogeniert, d. h. der in Stellung 7 des Pretetramidmoleküls kein Halogen einführt, jedoch die Dihydratisierung in den Stellungen 5a, 6 und 4a, 12a und die Einführung der Dimethylaminogruppe, falls R ein Wasserstoffatom ist, bewirkt, ist S. aureofaciens NRRL 3014.
Beispiele für Stämme der Gattung Streptomyces, die nicht halogenieren, aber in Stellung 5 des Pretetramids eine Hydroxylgruppe einführen zusätzlich zur Dihydratisierung in den Stellungen 5a, 6 und 4a, 12a und die die Dimethylaminogruppe in Stellung 4 einführen, wenn R ein Wasserstoffatom ist, sind S. rimosus NRRL 2234, S. platensis NRRL 2364 und S. hygroscopicus NRRL 3015.
Im Verfahren der Erfindung sind alle Arten der Gattung Streptomyces, die unter üblichen Fermentationsbedingungen Tetracycline produzieren, verwendbar. Bevorzugt wird jedoch die Verwendung von Stämmen dieser Arten der Gattung Streptomyces, die nur dann Tetracycline produzieren, wenn im Fermentationsmedium Pretetramid-Naphthacenderivat vorliegen, die mindestens in den Stellungen 1, 3,10, 11 und 12 des Ringes Hydroxylgruppen tragen und in Stellung 2 des Ringes eine Carboxamidgruppe aufweisen.
Verwendet man Stämme vonArten der Gattung Streptomyces, die in Abwesenheit vonpretetramiden Tetracycline produzieren, so werden auch aus denFermentationsnährmedien Tetracycline produziert sowie aus den Pretetramiden, woraus sich in manchen Fällen die Notwendigkeit ergibt, die verschiedenen Tetracyclinarten zu trennen. In manchen Fällen ist es aber auch vorteilhaft, den fermentierenden Stämmen von Streptomycesarten, die Tetracycline produzieren, ein spezielles Pretetramid zuzusetzen, um die Bildung eines speziellen Tetracyclins zu verstärken.
Beispiele für Pretetramide, die erfindungsgemäss mit nicht halogenierenden Stämmen der Gattung Streptomyces biologisch umgewandelt werden können, sind 1) Pretetramid, 2) 4-Dimethylaminopretetramid und 3) 6-Methyl-4-dimethylaminopretetramid, wobei man 1) 6-Desmethyltetracyclin bzw.
2) 6-Desmethyltetracyclin und 3) Tetracyclin erhält.
Beispiele für Pretetramide, die erfindungsgemäss mit einem in Stellung 7 halogenierenden Stamm
EMI3.1
in Stellung 5 hydroxylierenden Stamm der Gattung Streptomyces biologisch umgewandelt werden kann, ist 6-Methylpretetramid, aus dem man 5-Hydroxytetracyclin erhält.
Es war äusserst überraschend, dass die Pretetramide als Substrate für die Mikroorganismen zur Umwandlung in Tetracycline dienen können. Bei der üblichen Fermentierung dienen die Bestandteile des Nährmediums als Substrate, aus denen das Antibiotikum synthetisiert wird. Es war daher nicht zu erwarten, dass chemische Verbindungen, die strukturell so stabil sind wie die Pretetramide, als Substrate für die Herstellung verschiedener Tetracycline dienen können.
Die Fermentationsbedingungen für die biologische Umwandlung der Pretetramide in die Tetracycline sind im allgemeinen die gleichen wie sie in den USA-Patentschriften Nr. 2, 482, 055, Nr. 2, 734, 018 und Nr. 2, 878, 289 beschrieben werden und die wieder im allgemeinen die gleichen sind wie bei den gegenwärtig bekannten Verfahren zur Herstellung verschiedener Tetracycline durch Fermentierung. Das heisst, dass das Fermentationsmedium die üblichen Nährstoffe und Mineralien enthält. Zu den geeigne-
EMI3.2
solubles, Fischmehl u. a. übliche Stoffe verwendet werden.
Die üblichen Anionen und Kationen werden in Form ihrer nicht toxischen Salze verwendet. Spurenelemente wie Mangan, Cobalt, Zink, Kupfer usw. werden entweder als Verunreinigungen der obigen Verbindungen erhalten oder durch Verwendung von Leitungswasser oder indem man Lösungen, die mit diesen Spurenelementen besonders angereichert wurden, extra zugesetzt.
Die andernallgemeinenBedingungen für die Fermentierung, wie die Wasserstoffionenkonzentration, Temperatur, Dauer der Belüftung, Herstellung des Inokulats, Sterilisierung, Inokulierung u. dgl. entsprechen den üblichen und sind denen für die Herstellung anderer Tetracycline, wie sie in den oben angeführten USA-Patentschriften beschrieben werden, ähnlich.
Wird ein Stamm der Gattung Streptomyces verwendet, der in Stellung 7 halogeniert zusammen
<Desc/Clms Page number 4>
mit einem Pretetramid, in dem R7 ein Wasserstoffatom darstellt, so ist es lediglich erforderlich, dass Fermentationsmedium so zu modifizieren, dass es mindestens 10 Teile/Million und vorzugsweise 1000 bis 1500 Teile/Million Chloridionen enthält, falls in Stellung 7 Chlor als Substituent gewünscht wird oder eine gleiche Menge von Bromidionen, falls in Stellung 7 Brom als Substituent gewünscht wird.
Nachdem die Fermentierung ausreichend lange dauerte, d. h. z. B. 12-96 h und die Umwandlung der Pretetramidverbindung in das gewünschte Tetracyclin im wesentlichen vollständig ist, kann das Tetracyclin-Reaktionsprodukt in üblicher Weise aus der Fermentationsmaische isoliert werden. DasVerfahren zur Isolierung kann aus irgendeiner der zahlreichen Isoliertechniken ausgewählt werden, die dem Fachmann schon vertraut sind.
Das alsAusgangsmaterial verwendete Pretetramid kann in jeder gewünschten Konzentra tion zugesetzt werden, obwohl aus praktischen Gründen ein Pretetramid-Substrat mit einer Konzentration bis zu etwa 10 g/l Medium ausreicht, obwohl höhere Konzentrationen bei etwas schlechterer Ausbeute verwendet werden können. Der Zusatz des Pretetramid-Ausgangsmaterials kann auf jede geeignete Weise erfolgen, solange dadurch der Kontakt des Pretetramids mit dem biologischen Medium sichergestellt ist.
Hiezu wird das Pretetramid-Ausgangsmaterial vorzugsweise in einem Lösungsmittel wie Dimethyl-
EMI4.1
oder N-Methylpyrrolidongesetzt. Insbesondere wird jedoch Dimethylsulfoxyd bevorzugt und eine Lösung von Magnesiumacetat in Dimethylsulfoxyd ist das besonders bevorzugte Lösungsmittel für das Pretetramid-Ausgangsma- terial. Lösungen der Pretetramide müssen gegen Luft geschützt werden, da die Verbindungen in Lösung leicht oxydiert werden.
Beispiel l : Biologische Umwandlung von Pretetramid (1,3,10,11,12-Pentahydroxynaphthacen- - 2-carboxamid) in 6-Desmethyltetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 3014.
Sporen des nicht chlorierenden S. aureofaciens NRRL 3014 wurden mit sterilem destilliertem Wasser von einem Schrägagar unter Bildung einer Suspension abgespült, die 60 - 80 X 106 Sporen/ml enthielt.
0, 33 ml dieser Suspension wurden zur Inokulierung eines 20, 32 cm-Reagensglases verwendet, das 8 ml eines Mediums enthielt, das folgendermassen zusammengesetzt war :
EMI4.2
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 30 <SEP> g <SEP>
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml. <SEP>
<tb>
Vor der Inokulierung wurde das Medium 20 min in Autoklaven bei 1, 05 kg/cm Druck sterilisiert.
Das inokulierte Rohr wurde dann 24 h bei 28 C auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine, die 116 Schüttelbewegungen/min ausführte, inkubiert, wodurch man ein Inokulum von S. aureofaciens erhielt. Dann wurde ein Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung hergestellt :
EMI4.3
<tb>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 6,7 <SEP> g
<tb> CaCO3 <SEP> 9,0 <SEP> g
<tb> CoCl. <SEP> OHO <SEP> S, <SEP> Omg <SEP>
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP>
<tb> NHC1 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> MnSO <SEP> (70%, <SEP> tech-0, <SEP> 10g <SEP>
<tb> nisch)
<tb> Maisquellwasser <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Stärke <SEP> 52, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Maismehl <SEP> 14, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Nachdem dieses Medium in einem Autoklaven 20 min bei 1, 05 kg/cm2 Druck sterilisiert wurde, wurden je 25 ml davon in 250 ml Erlenmeyerkolben mit je 1, 0 ml des S. aureofaciens-Inokulums inokuliert. Die Fermentierung wurde bei 250C 24 h lang auf einem Rotationsschüttler ausgeführt, der bei
<Desc/Clms Page number 5>
180 Umdr/min arbeitete. Dann wurde jede dieser Maischeportionen in einen besonderen Kolben eingebracht, der eine Lösung von 10 mg Pretetramid in 1 rnl Dimethylsulfoxyd enthielt. Dann wurde die Fermentierung weiters 96h bei 250C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigte dieAna-
EMI5.1
6-Desmthyltetracyclin/ml- 2-carboxamid) in 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 3013.
Es wurde wieder das Verfahren von Beispiel 1 verwendet mit folgenden Ausnahmen : Eine teilweise fermentierte Maische von chlorierendem S. aureofaciens NRRL 3013 wurde in einzelne Flaschen eingebracht, die eine Lösung von 11, 4 mg Pretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielten. Die Fermentation wurde dann weitere 96 h bei 280C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigte die Analyse der Maische das Vorhandensein von 85/lg/ml 7-Chlor-6-desmethyltetracyclinan. Ein Kontrollkolben, der in derselben Weise gefahren worden war, aber kein Pretetramid enthielt, zeigte kein 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin.
EMI5.2
wendung von S. aureofaciens NRRL 3013.
Von einem Schrägagar wurden Sporen von S. aureofaciens NRRL 3013 mit destilliertem Wasser unter Bildung einer Suspension abgespült, die 60 - 80 X 106 Sporen/rnl enthielt. 0, 33 ml dieser Suspension wurden zur Inokulierung eines 20, 32 cm-Reagensglases verwendet, das 8 ml eines genau wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten und inkubieren Inokulationsmediums enthielt, wodurch man ein Inokulum der S. aureofaciens-Kultur erhielt. Dann wurde genau wie in Beispiel 1 beschrieben ein Fermentationsmedium hergestellt.
Nach der Sterilisierung dieses Mediums wurden Portionen von je 25 ml in 250 ml Erlenmeyerkolben mit 1 ml-Portionen des S. aureofaciens-Inokulums inokuliert. Die Fermentation wurde bei 250C 24 h auf einem Rotationsschüttler ausgeführt, der bei 180 Umdr/min arbeitete.
Zu dieser Zeit wurde jede Maischeportion in eine extra Flasche übertragen, die eine Lösung von 10 mg 6-Methylpretetramid in 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielt, die mit Ammoniumhydroxyd alkalisch gemacht worden war. Dann wurde die Fermentierung weitere 96 h bei 250C auf dem Rotations- schüttler fortgesetzt.
Zu dieser Zeit zeigten biologische Versuche mit der Maische das Vorhandensein einer antibakteriellen Aktivität an, die 180 l. g/ml 7 -Chlortetracyclin entsprach. Die Identität des Produktes als 7-Chlortetracyclin wurde papierchromatographisch in Butanol-Phosphatpuffer PH 3 sichergestellt. Ein in gleicher Weise gefahrener Kontrollansatz, dem jedoch nur Dimethylsulfoxyd und kein 6-Methylpretetramid zugegeben worden war, zeigte kein 7-Chlortetracyclin.
Beispiel 4 : Biologische Umwandlung von 6-Methylpretetramid in 7-Chlortetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens ATCC 10762a.
Es wurde dem Verfahren von Beispiel 3 gefolgt mit folgenden Ausnahmen : An Stelle von NRRL 3013 wurden Sporen von S. aureofaciens ATCC 107 62a verwendet. Die teilweise fermentierte Maische wurde in einzelne Flaschen überführt, die eine Lösung von 11 mg 6-Methylpretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielten. Die Fermentierung wurde dann weitere 96 h bei 280C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigte die Analyse der Maische das Vorhandensein von 265/lg 7-Chlortetracyclin/rnl an. Ein Kontrollansatz, der in genau derselben Weise, aber ohne 6-Methylpretetramid ausgeführt worden war, zeigte kein 7 - Chlortetra - cyclin.
Beispiel 5 : Biologische Umwandlung von 6-Methylpretetramid inTetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 3014.
Es wurde dem Verfahren von Beispiel 4 gefolgt mit folgenden Ausnahmen : An Stelle von A TCC 10762a wurden Sporen des nicht chlorierenden S. aureofaciens NRRL 3014 verwendet. Die teilweise fermentierte Maische wurde in Flaschen überführt, die eine Lösung von 11 mg 6-Methylpretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielten. Dann wurde die Fermentierung weiters 96 h bei 280C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigte die Analyse der Maische das Vorhandensein von 108/lg Tetracyclin/ml an. Eine in gleicher Weise gefahrene Kontrollprobe, die kein 6-Methylpretetramid enthielt, zeigte kein Tetracyclin.
Beispiel 6 : Biologische Umwandlung von 6-Methylpretetramid in Oxytetracyclin unter Verwendung von S. hygroscopicus NRRL 3015.
Es wurde das Verfahren von Beispiel 3 mit folgendenAusnahmenverwendeten Stelle von NRRL 3013
<Desc/Clms Page number 6>
wurden Sporen einer Kultur verwendet, die aus Erde isoliert worden war und als S. hygroscopicus NRRL 3015 identifiziert worden war. Die teilweise fermentierte Maische (fermentiert bei 280C) wurde in Kolben überführt, die eine Lösung von 10 mg 6-Methylpretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielten. Die Fermentierung wurde dann weitere 96 h bei 340C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigte die Analyse der Maische eine Erhöhung der Oxytetracyclinmenge gegenüber einer Kontrollprobe, die in der gleichen Weise, aber unter Ausschluss von 6-Methylpretetramid, behandelt worden war.
Beispiel 7 : Biologische Umwandlung von 6-Methylpretetramid in Oxytetracyclin unter Ver- wendung von S. rimosus NRRL 2234.
Es wurde das Verfahren von Beispiel 6 verwendet mit der einzigen Ausnahme, dass an Stelle von S. hygroscopicus NRRL 3015 Sporen von S. rimosus NRRL 2234 verwendet wurden. Eine zuletzt ander Maische durchgeführte Analyse zeigte eine Erhöhung der Oxytetracyclinmenge gegenüber einer Kontrollprobe an, die in gleicher Weise, aber unter Ausschluss von 6-Methylpretetramid, behandelt worden war.
Beispiel 8 : Biologische Umwandlung von 4-Dimethylamino-6-methylpretetramid in Tetra- cyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 3014.
Von einem Schrägagar wurden mit sterilem destilliertem Wasser Sporen des nicht chlorierenden S. aureofaciens NRRL 3014 abgespült unter Bildung einer Suspension, die 60 - 80 X 106 Sporen/ml enthielt. 0, 33 ml dieser Suspension wurden zur Inokulierung eines 20, 32 cm-Reagensglases verwendet, das 8 m1 eines Inokulationsmediums enthielt, das genau wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und inkubiert worden war, wobei man ein Inokulum von S. aureofaciens Kultur erhielt. Ein Fermentationsmedium wurde genau wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Nach der Sterilisierung dieses Mediums wurden 25 ml-Portionen in 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit 1 ml-Portionen des S. aureofaciens Inokulums inokuliert. Die Fermentierung wurde 24 h bei 250C auf einem Rotationsschüttler, der mit 180 Umdr/min arbeitete, ausgeführt. Zu dieser Zeit wurde jede Maischeportion in eine extra Flasche überführt, die eine Lösung von 10 mg 4-Dimethylamino-6-me- thylpretetramid in 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielt. Die Fermentierung wurde weitere 96 h bei 250C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigten biologische Versuche mit der Maische das Vorhandensein von 25 li g Tetracyclin/ml an.
Ein in genau der gleichen Weise behandelter Kontrollansatz, der jedoch kein 4-Dimethylamino-6-methylpretetramid enthielt, zeigte kein Tetracyclin.
Beispiel 9 : Biologische Umwandlung von 4-Dimethylamino-6-methylpretetramid in 7-Chlor- tetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 3013.
Es wurde das Verfahren von Beispiel 3 verwendet mit folgenden Ausnahmen : Die teilweise fermentierte Maische wurde in einzelne Flaschen überführt, die eine Lösung von 10,6 mg 4-Dimethylamino- - 6-methylpretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und lml Dimethylsulfoxyd enthielten. Die Fermentierung wurde dann weitere 96 h bei 280C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt.
Zu dieser Zeit zeigte die Analyse der Maische das Vorhandensein von 58 p. g 7 -Clüortetracyclin/ml an. Ein in genau derselben Weise unter Ausschluss von 4-Dimethylamino-6-methylpretetramid ausgeführter Kontrollansatz zeigte kein 7-Chlortetracyclin.
Beispiel 10 : Biologische Umwandlung von 7-Chlor-4-dimethylaminopretetramid in7-Chlor- - 6-desmethyltetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 3013.
Von einem Schrägagar wurden mit sterilem destilliertem Wasser Sporen von S. aureofaciens NRRL3013 abgespült unter Bildung einer Suspension, die 60-80 x 106 Sporen/ml enthielt. 0, 33 ml dieser Suspension wurden zur Inokulierung eines 20, 32 cm-Reagensglases verwendet, das 8 ml eines Inokulums enthielt, das genau wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und inkubiert worden war, wobei man ein Inokulum von S. aureofaciens Kultur erhielt. Ein Fermentationsmedium wurde genau wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Nach der Sterilisierung dieses Mediums wurden 25 ml-Portionen davon in 250 ml Erlenmeyerkolben mit 1 ml-Portionen des S. aureofaciens Inokulums inokuliert.
Die Fermentierung wurde 24 h bei 250C auf einem Rotationsschüttler, der mit 180 Umdr/min arbeitete, ausgeführt. Zu dieser Zeit wurde jede Maischeportion in einen Extrakolben überführt, der eine Lösung von 10 mg 7-Chlor-4-dimethylaminopretetramid in 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielt. Dann wurde die Fermentierung weitere 96 h bei 250C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigten biologische Versuche mit der Maische das Vorhandensein von 28 p. g 7 -Chlor -6- desmethylte- tracyclin/ml an. Ein in genau derselben Weise unter Ausschluss von 7-Chlor-4-dimethylaminoprete- tramid behandelter Kontrollansatz zeigte kein 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin.
<Desc/Clms Page number 7>
Beispiel 11 : Biologische Umwandlung von 7-Chlor-4-dimethylaminopretetramidin7-Chlor- - 6-desmethyltetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 3014.
Es wurde wieder dem Verfahren von Beispiel 10 gefolgt mit folgenden Ausnahme : An Stelle von NRRL 3013 wurden Sporen des nicht chlorierenden S. aureofaciens NRRL 3014 verwendet. Die teilweise fermentierte Maische wurde in Kolben überführt, die eine Lösung von 10 mg 7-Chlor-4-dimethylamino- pretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielten.
Dann wurde die Fermentierung weitere 96 h bei 280C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigte die Analyse der Maische das Vorhandensein von 31 jag 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin pro ml an. Ein in genau derselben Weise und unter Ausschluss von 7-Chlor-4-dimethylamiriopretetramid ausgeführter Kontrollansatz zeigte kein 7 -Chlor- 6-desmethyltetracycliD.
Beispiel 12 : Biologische Umwandlung von 7-Chlor-4-dimethylaminopretetramid in7-Chlor- - 6-desmethyltetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL B-2407.
Es wurde wieder dem Verfahren von Beispiel 10 gefolgt mit folgenden Ausnahme : An Stelle von NRRL 3013 wurden Sporen von S. aureofaciens NRRL B-2407 verwendet Die teilweise fermentierte Maische wurde in einzelne Kolben überführt, die eine Lösung von 10, 1 mg 7-Chlor-4-dimethylami- nopretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielten.
Die Fermentierung wurde dann weitere 96 h bei 2SoC auf einem Rotationsschütler fortgesetzt.
Zu dieser Zeit zeigte die Analyse der Maische der Vorhandensein einer antibiotischen Aktivität. die auf 7-Chlortetracyclin berechnet, 99 u g/ml entsprach. Ein Papierstreifenchromatogramm zeigte das Vorhandensein von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin. Ein in genau derselben Weise ausgeführter Kontrollansatz unter Ausschluss von 7-Chlor-4-dimethylaminopretetramid zeigte kein 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin.
Beispiel 13 : Biologische Umwandlung von 7-Chlor-4-dimethylamino-6-methylprete tramid in 7-Chlortetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 3013.
Von einem Schrägagar wurden mit sterilem destilliertem Wasser Sporen von S. aureofaciens NRRL 3013 abgespült unter Bildung einer Suspension, die 60 - 80 X 106 Sporen/ml enthielt. 0,33 ml dieser Suspension wurden zum Inokulieren eines 20,32 cm-Reagensglases verwendet, das 8 ml eines Mediums enthielt, das folgendermassen zusammengesetzt war :
EMI7.1
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 30 <SEP> g <SEP>
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
EMI7.2
der Inokulierung wurde das Medium in einem Autoklaven 20 min bei einem Drucksterilisiert. Das inokulierte Reagensglas wurde dann 24 h bei 280C auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine, die mit 116 Schüttelbewegungen/min arbeitete, inkubiert, wobei man ein Inokulum von S. aureofaciens erhielt.
Dann wurde ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt :
EMI7.3
<tb>
<tb> (NHSO4 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> g
<tb> CaCO <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Cocu. <SEP> 6 <SEP> H <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> mg
<tb> NHCl <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> MnSO <SEP> (70%, <SEP> technisch) <SEP> 0, <SEP> 10g <SEP>
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Stärke <SEP> 52, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Maismehl <SEP> 14, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Nachdem dieses Medium in einem Autoklaven 20 min bei einem Druck von 1, 05 kg/cm2 sterili -
<Desc/Clms Page number 8>
siert worden war, wurden 25 ml-Portionen in 250 ml Erlenmeyerkolben mit je 1, 0 ml des S. aureofaciens Inokulums inokuliert.
Die Fermentierung wurde bei 280C 24h lang auf einem RDtationsschüttler, der mit 180 Umdr/min arbeitete, ausgeführt.
Zu dieser Zeit wurde jede Maischeportion in eine besondere Flasche überführt, die eine Lösung von 9, 5 mg 7-Chlor-4-dimethylamino-6-methylpretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielt. Dann wurde die Fermentierung weitere 96h bei 280C auf dem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigte die Analyse der Maische das Vorhandensein von
EMI8.1
Beispiel 14 : Biologische Umwandlung von 7-Hydroxypretetramid in 7-Hydroxy-6-desmethyltetracyclin unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 3013.
Es wurde dem Verfahren von Beispiel 13 gefolgt mit folgenden Ausnahmen : Die teilweise fermen- tierte Maische wurde in einzelne Kolben überführt, die eine Lösung von 3, 95 mg 7-Hydroxypretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielt. Dann wurde die Fermentierung weitere 96h bei 280C auf einem Rotationsschüttler fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigte die
EMI8.2
von 2,8 f. lg/ml entsprach. Ein in gleicher Weise ausgeführter Kontrollansatz unter Ausschluss von 7-Hydroxypretetramid zeigte keine antibiotische Aktivität.
Beispiel15 :Umwandlungvon4-Dimethylaminopretetramidin6-Desmethyltetracyclin.
Von einem Schrägagar wurden mit sterilem destilliertem Wasser Sporen des nicht chlorierenden S. aureofaciens A TCC F-198-1 unter Bildung einer Suspension, die 60 - 80 X 106 Sporen/ml enthielt, abgespült. 0, 33 ml dieser Suspension wurden zur Inokulierung eines 20, 32 cm-Reagensglases verwendet, welches 8 ml eines Mediums enthielt, welches folgendermassen zusammengesetzt war :
EMI8.3
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 30 <SEP> g <SEP>
<tb> Ammonsulfat <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
Vor der Inokulierung wurde das Medium im Autoklaven 20 min bei einem Druck von 1, 05 kg/cm2 sterilisiert.
Das inokulierte Reagensglas wurde dann 24 h bei 280C inkubiert, wodurch man ein Inokulum von S. aureofaciens erhielt.
Nun wurde ein Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung hergestellt :
EMI8.4
<tb>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 6,7 <SEP> g
<tb> CaCO3 <SEP> 9,0 <SEP> g
<tb> CoCl'6HO <SEP> 5, <SEP> 0mg <SEP>
<tb> 2 <SEP> 2
<tb> NHCl <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> MnSO <SEP> (70cl, <SEP> technisch) <SEP> 0, <SEP> 10g <SEP>
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Stärke <SEP> 52, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Maismehl <SEP> 14, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Nachdem dieses Medium in einem Autoklaven 20 min bei einem Druck von 1, 05 kg/cm2 sterilisiert worden war, wurden Portionen von 25 ml in 250 ml Erlenmeyerkolben mit je 1 ml des S. aureofaciens Inokulums inokuliert. Die Fermentierung wurde 24 h bei 280C auf einem Rotationsschüttler ausgeführt.
Zu dieser Zeit wurde jede Maischeportion in einen einzelnen Kolben überführt, der eine Lösung von 10 mg 4-Dimethylaminopretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumaeeiatund l ml Di- methylsulfoxyd enthielt. Dann wurde die Fermentierung weitere 96 h bei 280C auf dem Rotations -
<Desc/Clms Page number 9>
schütt1. er fortgesetzt. Zu dieser Zeit zeigte die Analyse der Maische das Vorhandensein von 6-Desmethyltetracyclin. Ein in gleicher Weise ausgeführter Kontrollansatz unter Ausschluss von 4-Dimethylaminopretetramid zeigte kein 6-Desmethyltetracyclin.
Beispiel 16 : Umwandlung von 6-Methyl-4-dimethylaminopretetramid zu Tetracy clin.
Es wurde wie in Beispiel 15 fermentiert mit folgender Ausnahme : die teilweise fermentierte Maische wurde in Kolben gebracht, die eine Lösung von 10 mg 6-Methyl-4-dimethylaminopretetramid in einer Mischung von 10 mg Magnesiumacetat und 1 ml Dimethylsulfoxyd enthielten. Dann wurde die Fermentierung wie in Beispiel 15 fortgesetzt. Die Analyse der Maische zeigte das Vorhandensein von Tetracyclin. Ein in gleicher Weise ausgeführter Kontrollansatz unter Ausschluss von 6-Methyl-4- dimethyl- aminopretetramid zeigte kein Tetracyclin.
PATENT ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur biologischen Umwandlung von Naphthacenderivaten in antibiotisch aktive Verbindungen der Tetracyclinreihe mit der Formel
EMI9.1
worin R'g ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, Ra ein Wasserstoffatom oder eineAlkylgruppe mit 1- 6 Kohlenstoffatomen und R ein Wasserstoff-oder Halogenatom oder eine Hydroxylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Naphthacenderivat der Formel
EMI9.2
worin R ein Wasserstoffatom oder eine Dimethylaminogruppe und R ein Wasserstoffatom bedeutet und 1\ und R wie oben definiert sind, einem üblichen Fermentationsmedium zusetzt, dieses mit einem Stamm einer tetracyclinerzeugenden Art der Gattung Streptomyces wie S. aureofaciens, S. rimosus, S.
platensis, S. hygroscopicus beimpft und die Fermentation so lange fortsetzt, bis im wesentlichen in den Stellungen 6 und 12a am Ring des eingesetzten Naphthacenderivats eine Hydroxylgruppe und, falls die Stellung 4 nicht substituiert ist, in diese Stellung eine Dimethylaminogruppe sowie gegebenenfalls zusätzlich, falls die Stellung 7 nicht substituiert ist, in diese Stellung ein Halogenatom und/oder in Stellung 5 eine Hydroxylgruppe eingeführt ist.