AT397514B - Verfahren zur indentifizierung von nukleinsäuren - Google Patents
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Description
AT397 514B
Verfahren zur Identifizierung vnn Nukleinsäuren
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuren mit Hilfe in Lösung erfolgender Hybridisierung. Kennzeichnend für das erfindungsgemäße Verfahren ist, daß bei der Hybridisierungsreaktion mit wenigstens zwei Sonden gearbeitet wird. Die Detektorsonde ist mit einem Indikator markiert, während an die Einfangsonde eine Komponente gebunden ist, die als Partner in einem Affinitätspaar zu fungieren vermag, wobei das bei der Hybridisierung gebildete Einfangsonde:Probe> Detektorsonde-Hybrid von den übrigen in der Hybridisierungsmischung vorliegenden Komponenten mit Hilfe des anderen Partners des Affinitätspaares getrennt werden kann.
Zur Identifizierung von Nukleinsäuren hat man sich verschiedenartiger Hybridisierungsverfahren bedient Als Beispiele seien die direkten Hybridisierungsverfahren und die Sandwich-Hybridisierungsverfahren genannt Bei den direkten Hybridisierungsverfahren liegt die Nukleinsäureprobe entweder in Lösung oder an einen festen Trägerstoff gebunden vor. Die zu identifizierende Nukleinsäure wird unter Verwendung einer einzigen markierten Sonde nachgewiesen. Bei den Sandwich-Hybridisierungsverfahren (US 4 486 539) arbeitet man mit zwei verschiedenen Sonden, mit denen die zu identifizierende Nukleinsäure in der Probelösung nachgewiesen wird. Die Detektorsonde ist dabei mit einem Indikatorstoff markiert, während die Trennsonde an einen festen Träger gebunden ist
Erfindungsgemäß wurde ein neues Hybridisierungsverfahren entwickelt, bei dem man mit zwei verschiedenen Sonden arbeitet wobei beide Sonden in der gleichen Lösungsphase enthalten sind. Da die an der Hybridisierung teilnehmende Probenukleinsäure und beide Sonden sich in der gleichen Lösungsphase befinden, erfolgt die Hybridisierungsreaktion beträchtlich schneller als bei jener Sandwich-Hybridisierung, bei der die Trennsonde an einen festen Träger gebunden ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist eine einstündige Inkubationszeit ausreichend. Bei der einstufigen Sandwich-Hybridisierung (US 4 4S6 539) sind fiir eine ausreichende Hybridisierung 12 Stunden erforderlich. Bei der zweistufigen Sandwich-Hybridisierung (Dun und Hassell, CelL Vol. 12 S. 23 - 36,1977) benötigt man eine Hybridisierungszeit von wenigstens 24 Stunden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren arbeitet man vorzugsweise mit wenigstens zwei Sonden. Diese Sonden sind zur zu identifizierenden Nukleinsäure ausreichend homologe Nukleinsämefragmente. Es ist von Vorteil, wenngleich nicht erforderlich, wenn die Sonden homolog zu relativ nahe beieinander liegenden Stellen in der zu identifizierenden Nukleinsäure sind. Die Sonden dürfen nicht homolog zueinander sein.
Die Sonden können synthetisch, halbsynthetisch, mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechnik oder aus direkt aus der Natur isolierten Nukleinsäuren gewonnen werden. Derartige Sonden sind auch im Handel erhältlich. Die Sonde kann an einen geeigneten Vektor gebunden sein; sie kann Vektorteile »ithalten oder völlig frei von Vektorteilen sein.
Die Detektorsonde ist durch passende Indikatoren markiert. Als Indikatoren eignen sich verschiedenartige radioaktive Isotope oder radioaktiv markierte Verbindungen. Der Indikator kann auch fluoreszierend, lumineszierend, lichtemittierend oder enzymatisch bzw. immunologisch nachweisbar sein usw. Als Beispiele seien die auf der Affinität von Biotin und Avidin oder Streptavidin basierenden Indikatorstoffe, die Lanthanidchelate, die Ferritin· und Hämverbindungen und die immunologisch nachweisbaren Haptene, wie die Acetoxyacetylfluorenderivate (WO 8 302 286), genannt. Auch eine Identifizierung über Proteine ist möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren ist unabhängig vom verwendeten Indikator. Im Zusammenhang mit dem Verfahren können alle bekannten und zukünftig zu entwickelnden, für die Nukleinsäurehybridisierung geeigneten Indikatorstoffe frei eingesetzt werden.
An die als Einfangsonde dienende Sonde ist eine Komponente gebunden, die als Partner in einem Affinitätspaar zu fungieren vermag. Derartige Affinitätspaare sind beispielsweise Biotin - Avidin, Biotin -Streptavidin, Schwermetallderivat - Thiogruppe und die verschiedenen Homopolynukleotide, wie Poly dG -Poly dC, Poly dA - Poly dT oder Poly dA - Poly U. Es können jedoch auch andere Affinitätspaare eingesetzt werden, sofem ihre Komponenten nur eine genügend starke Affinität zueinander haben. Unter den bei immunologischen Verfahren eingesetzten Liganden und Konjugaten finden sich geeignete Affinitätspaare.
Vor der Hybridisierungsreaktion wird die Probe so behandelt, daß die Nukleinsäuren in einsträngiger Form in die Hybridisierungslösung freigesetzt werden. Die Hybridisierung erfolgt in einer Hybridisierungs-mischung, in der die Nukleinsäuren, die markierte Detektorsonde und die Einfangsonde nötigenfalls in einsträngige Form überführt sind. Als Hybridisierungslösung können verschiedenartige für diesen Zweck geeignete Puffer verwendet werden. Die Hybridisierung erfolgt im Temperaturbereich 0-80 °C, jedoch wird vorzugsweise mit einer Temperatur von 65 °C gearbeitet. Enthält die Hybridisierungslösung Formamid (40 - 55 %), so kann eine Temperatur von 37 °C angewendet werden. Als Hybridisierungszeit genügt eine Stunde.
Nach erfolgter Hybridisierung wird die Lösung nötigenfalls so verdünnt, daß sich für das Affinitätspaar günstige Verhältnisse ergeben. Danach bringt man das Gemisch mit dem anderen Partner des Affinitätspaares in Kontakt, der an einen festen Träg» gebunden ist, z. B. an eine Affinitätschromatographie-Säule, ein Filter oder eine Plastik- bzw. Glasfläche, und isoliert das Einfangsonde:Probe:Detektorsonde-Hybrid.
Als Affinitätssäulen-Trägermaterial kann zum Beispiel Zellulose, Latex, Polyacrylamid, Dextran oder Agarose dienen. Diese Materialien können auch als Suspensionen im Reagenzglas eingesetzt werden. Vorteilhaft gestaltet es sich auch, mit Reagenzgläsern zu arbeiten, an deren Innenfläche die eine Komponente des -2-
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Affinitätspaares angelagert ist. Voraussetzung bei der Wahl des Materials ist, daß daran eine Komponente gebunden werden kann, welche Affinität zu der an die Einfangsonde gebundenen Komponenten hat.
Falls die Probe zu identifizierende Nukleinsäure enthält, entsteht bei der Hybridisierung ein Einfang-sonde:Probe:Detektorsonde-Hybrid. Dieses Hybrid haftet sich bei der Fraktionierung an den Träger. Die Markierung der sich an den Träger gehafteten Fraktion kann nach herkömmlichen Verfahren direkt am Träger oder nach vorheriger Elution am Eluat gemessen werden.
Bei der Fraktionierung können anstelle von Affinitätschromatographie auch andere Systeme, beispielsweise Phasenextraktion oder Magnetfeld, zur Anwendung gebracht werden.
In den folgenden Anwendungsbeispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht an die in den Beispielen verwendeten Nukleinsäurefragmente gebunden. Für den Fachmann ist es eine Selbstverständlichkeit, wie sich entsprechende Nukleinsäurefragmente gewinnen lassen.
Beispiel 1
Identifizierung von Adenovirus-DNA aus Zellenlvsat unter Verwendung von Homopolvnukleotid
Als Detektorsonde dient der mit ^1 markierte rekombinante Phage mKTH 1206, ein Bgl II-Fragment des Adenovirus (Typ 2) aus der Adenovirus-Genkarten-Position 42 - 453 %· Der besagte rekombinante Phage ist in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter Nr. 2827 deponiert Seine spezifische Aktivität beträgt 7 x 107 cpm/jig DNA. Eine nähere Beschreibung dieser Sonde findet sich in der Schrift Ranki et al. 1983, Gene 21,77 - 85.
Als Einfangsonde dient das rekombinante Plasmid pKTH 1202, das in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 2824 deponiert ist und aus einem BamHI D-Fragment des Adenovirus (Kartenposition 29 - 42 %), kloniert auf das Plasmid pBR322, besteht Das rekombinante Plasmid pkTH 1202 (DSM 2824) wurde mit Restriktionsenzym Hae III gespaltet und an die 3' Enden der Fragmente wurde mit Hilfe von Terminaltransferase ein Poly-A-Schwanz gefügt Die Schwanzlänge wurde durch 3H-A-Inkoiporation gemessen. Die Länge betrug im Durchschnitt etwa 70 A-Reste. Vor Gebrauch wurde die Einfangsonde durch Kochen denaturiert. Als Probe dienten Adenovirus-infizierte A-549-Zellen. Die infizierten Zellen wurden 21 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und mit einprozentig» Natriumdodecyl- sulfatlösung aufgebrochen. Die Lösung enthielt ca. 106 Zellen/ml. Die Viskosität wurde durch Ultraschallbehandlung gesenkt. Als Kontrolle dienten nichtinfizierte A-549-Zellen, die identisch behandelt wurden. Vor der Hybridisierung wurde die Probe 5 min in 0,02 M NaOH gekocht auf 0 °C abgekühlt und mit Essigsäure neutralisiert. Für den Test wurden im Reagenzglas 500.000 cpm Detektorsonde, 50 ng Einfangsonden-DNA und 10 μΐ Probe zusammengebracht. Das Volumen wurde auf 50 μΐ eingestellt, und als Pufferlösung dienten 0,6 M Natriumchlorid, 0,06 M Natriumzitrat, 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,6) und 0,5 % Natriumdodecylsulfat. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 65 °C inkubiert.
Nach erfolgter Hybridisierung wurde die Lösung auf +20 °C abgekühlt und langsam durch eine Chromatographiesäule geschleust, die 1 ml Oligo-dT-Zellulose enthielt. Der Durchlauf wurde aufgefangen und erneut durch die Säule geschickt Danach wurde die Säule mit 20 ml Lösung gewaschen, welche 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumphosphat (pH 7,6) und 0,5 % Natriumdodecylsulfat enthielt. Die angelagerte DNA wurde zum Schluß mit 1 ml 0,02 M NaOH äbgelöst. Diese Lösung wurde aufgefangen, und ihre Radioaktivität wurde bestimmt
Ergebnis: ^I-Aktivität (cpm)
Probe: infizierte Zellen Kontrollzellen 5230 325
Beispiel 2
Identifizierung der DNA von Chlamydia trachomatis unter Verwendung von Biotin - Strentavidin
IOC
Als Detektorsonde diente der mit I markierte rekombinante Phage mKTH 1245, welcher zwei BamHI -Sali DNA-Fragmente des Klons pKTH 1220 enthält, die zusammen an den Vektor M13mp8 gebunden sind. Der Klon pKTH 1220 ist in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 2825 deponiert und in der Publikation Palva et al., FEMS Microbiology Leiters 23 S. 83 - 89 (1984) beschrieben.
Als Einfangsonde diente das rekombinante Plasmid pKTH 1250. Dieses Plasmid besteht aus einem 2,9 kb Sali - Clal Fragment des Plasmids pKTH 1220 (DSM 2825) und dem Vector pAT 153. An die DNA des pKTH 1250 wurden unter Anwendung des bekannten Nick-Translationsverfahrens (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, S. 237 - 251,1977) und mit Biotin-ll-UTP als Substrat (Bethesda Research Laboratories) Biotinmoleküle kovalent gebunden. Die Einfangsonden-DNA wurde vor Gebrauch 5 min in dem Puffer 10 mM Tris-Cl pH 7,6,1 -3-
AT 397 514 B mM EDTA gekocht.
Als Probe diente das rekombinante Plasmid pKTH 1220 (DSM 2825). Dieses Plasmid enthält etwa 10 kb für Chlamydia trachomatis typische DNA, gebunden an den Vector pBR322. Das Plasmid fungiert als ModellDNA und repräsentiert Genom-DNA des Bakteriums. Vor Gebrauch wurde das Plasmid 5 min in 0,02 M NaOH gekocht und sodann die Lösung mit Essigsäure neutralisiert.
Das als Affinitätsmaterial verwendete Streptavidin wurde an CNBr-aktivierte Sepharose gebunden (Axen et al., Nature 214, S. 1302 -1304,1967). Für den Test wurden im Reagenzglas 500.000 cpm Detektorsonde, 50 ng Einfangsonden-DNA und 10 ng Proben-DNA zusammengebracht Das Volumen wurde auf 20 μΐ eingestellt, und die Pufferlösung war die gleiche wie im Beispiel 1. Als Kontroll-DNA diente Kalbsthymus-DNA.
Das Gemisch wurde bei 65 °C 60 min inkubiert Danach wurden 500 μΐ Pufferlösung folgender Zusammensetzung zugesetzt: 0,1 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgC^, 0,05 % Triton X-100. Die Lösung wurde zum Schluß in einer 0,2 ml Streptavidin-Sepharose-Säule fraktioniert. Die Säule wurde mit 10 ml der o. g. Pufferlösung und mit 0,015 M Natriumchlorid-, 0,015 M-Natriumphosphat- (pH 7,6), 0,5 % Natriumdodecylsulfatlösung (50 °C), Volumen 10 ml, gewaschen. Dabei haftete sich die biotinylierte DNA ans Streptavidin, während die übrige DNA die Säule passierte. Die radioaktive Sonde haftete sich nur als Folge der Hybridbildung an. Die angehaftete Radioaktivität wurde durch Einbringen der gesamten Säule in das Zählrohr eines Gammazählers bestimmt
Ergebnis: ^1-Aktivität (cpm)
Probe: 10 ng pKTH 1220 10 ng Kontroll-DNA 1350 115
Beispiel 3
Identifizierung von Plasmid-pBR322-DNA unter Verwendung eines Antigen-Antikörper-Paares
Als Detektorsonde diente ein Plasmid-pBR322-Derivat (kommerziell aus verschiedenen Quellen erhältlich), aus dem das Fragment Pstl-Sall (3613 - 651) entfernt worden war. Das Plasmid war nach einem bekannten Verfahren (Förster et al., Nucleic Acids Res. 13, S. 745 - 761,1985) und unter Verwendung im Handel erhältlicher Reagenzien (Bresa, Adelaide, Australien) mit Photobiotin markiert worden.
Als Einfangsonde diente DNA des rekombinanten Phagen M13mpll, an welche das Plasmidfragment Pstl-Sall gefügt worden war. Die DNA war nach einem bekannten Verfahren (Orgenics Ltd. Yavne, Israel) sulfoniert worden.
Als Probe diente E. Coli HB101, an welches das Plasmid pBR322 gefügt war. Die Plasmid-pBR322-Menge wurde durch Chloramphenikol-Amplifikation erhöht (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die Bakterienzellen wurden mit Lysozym aufgebrochen und in NaOH gekocht wie in der Publikation Palva, J. Clin. MicrobioL 18, S. 92 -100,1983, beschrieben ist.
Die Antisulfon-monoklonalen Antikörper wurden nach Standardverfahren (McKeam, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennett et al., Plenum Press 1980) in den Vertiefungen der aus Polystyrol hergestellten Mikrotiter befestigt. Für den Test wurden 5 x 10^ aufgebrochene E, coli-Zellen (sowohl ans Plasmid pBR322 gefügt als auch ohne dieses), 100 ng Einfangsonden-DNA und 100 ng Detektorsonden-DNA zu einer Hybridiesierungslösung vereint, deren Volumen man auf 50 μΐ einstellte. Die Hybridisierungsverhältnisse waren die gleichen wie im Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß 5 % Polyethylenglykol (PEG 6000) zugesetzt wurden und der Natriumdodecylsulfatgehalt 0,1 % betrug.
Nach erfolgter Hybridisierung wurde die Lösung mit 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,6) auf 250 μΐ verdünnt; danach wurde die Lösung in die Mikrotiter-Vertiefungen gebracht, in denen die Antikörper befestigt waren. Es folgte eine zweistündige Inkubation bei 37 °C. Danach wurden die Mikrotiter mit einer aus 0,15 M Natriumchlorid, 0,02 M Natriumphosphat und 0,05 % Triton-X-100 bestehenden Lösung gewaschen.
Die Beobachtung der Detektorsonde erfolgte durch Zugabe von Streptavidin (Bethesda Research Laboraties, BRL), Waschen, Zugäbe von biotinylierter alkalischer Phosphatase (BRL) und Waschen wie in der Publikation Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, S. 4045 - 4049,1983, beschrieben ist. Zum Schluß wurden 250 μΐ Paranitrophenylphosphatlösung (35 mg/ml, Sigma) im Diethanolaminpuffer (pH 10) zugesetzt. Nach 60 Minuten wurde die Reaktion gestoppt und die Absorption bei 410 nm gemessen.
Ergebnis: A 410 nm
Probe: Zellen, an die Kontrollzellen pBR322 gefügt war (ohne pBR322) >2 0,15 -4-
Claims (8)
- 5 AT397 514B PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man beim Hybridisie-10 rungsverfahren mit wenigstens zwei in der gleichen Lösungsphase vorliegenden Sonden arbeitet, von denen die Detektorsonde mit einem passenden meßbaren Indikatorstoff markiert ist, während an die andere, als Einfangsonde fungierende Sonde eine Komponente gebunden ist, welche als Partner in einem Affinitätspaar zu fungieren vermag, so daß das bei der Hybridisierungsreaktion entstandene Einfangsonde:Probe:Detektorsonde-Hybrid mit Hilfe der anderen Komponenten des Affinitätspaares von den übrigen im Hybridisierungsgemisch 15 befindlichen Komponenten getrennt werden kann.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Komponentenpaar, das Affinität zueinander hat, Biotin - Streptavidin oder Biotin - Avidin ist.
- 3. Verfahren nach Anbruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Komponentenpaar, das Affinität zueinander hat, ein Homopolynukleotid-Paar ist
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Komponentenpaar, das Affinität zueinander hat, Foly dC - Poly dG ist 25
- 5. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Komponentenpaar, das Affinität zueinander hat, Poly dA - Poly dT ist
- 6. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Komponentenpaar, das Affinität 30 zueinander hat Poly dA - Poly U ist
- 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Komponentenpaar, das Affinität zueinander hat aus Schwermetallderivat - Thiogruppe besteht
- 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Komponentenpaar, das Affinität zueinander hat, aus Antigen - Antikörper besteht. -5-
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