DK164932B - Fremgangsmaade til identificering af nukleinsyrer ved en hybridiseringsmetode, hvor mindst to sonder er i samme oploesningsfase, idet den ene, detektorsonden, er maerket med en egnet detekterbar markoer - Google Patents
Fremgangsmaade til identificering af nukleinsyrer ved en hybridiseringsmetode, hvor mindst to sonder er i samme oploesningsfase, idet den ene, detektorsonden, er maerket med en egnet detekterbar markoer Download PDFInfo
- Publication number
- DK164932B DK164932B DK000386A DK386A DK164932B DK 164932 B DK164932 B DK 164932B DK 000386 A DK000386 A DK 000386A DK 386 A DK386 A DK 386A DK 164932 B DK164932 B DK 164932B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- hybridization
- probe
- poly
- affinity pair
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 61
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BRLRJZRHRJEWJY-VCOUNFBDSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-[3-[3-(4-azido-2-nitroanilino)propyl-methylamino]propyl]pentanamide Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCN(C)CCCNC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1[N+]([O-])=O BRLRJZRHRJEWJY-VCOUNFBDSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- JGQHTPYIIXRFLR-UHFFFAOYSA-N [2-(9h-fluoren-1-yl)-2-oxoethyl] acetate Chemical class C1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C(=O)COC(=O)C)=CC=C2 JGQHTPYIIXRFLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 101150115889 al gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- -1 heme compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
i
DK 164932B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til identificering af nukleinsyrer ved hjælp af hybridisering i opløsning, hvor mindst to sonder (probes) er i samme opløsningsfase ved hybridiseringsreaktionen. Til detektor-5 sonden er der knyttet en markør og til den anden sonde, en såkaldt fangersonde, er der knyttet en komponent med affinitet til en anden komponent ved hjælp af hvilken fangesonden/målnukleinsyren/detektorsonde-hybriden resulterende fra hybridiseringen kan skilles fra de andre 10 komponenter som er til stede i hybridiseringsblandingen.
Der har været anvendt forskellige hybridiseringsmetoder til identificering af nukleinsyrer. Direkte hybridiseringsmetoder og såkaldte sandwich-hybridiseringsmetoder kan nævnes som eksempler. Ved direkte hybridiseringsmetoder er nuklein-15 syreprøven enten i opløsning eller knyttet til en fast bærer. Den nukleinsyre som skal identificeres påvises ved hjælp af én mærket sonde. Ved sandwich-hybridiseringsmetoder (US patentskrift nr. 4.486.539) bruges der to særskilte sonder ved hjælp af hvilke den til identificering værende nukleinsyre påvises 20 i prøveopløsningen. Dektorsonderen er mærket med en mærkningssubstans og den anden sonden er knyttet til en fast bærer.
Der er nu blevet udviklet ny hybridiseringsmetode ved hvilken der bruges to forskellige sonder og hvor begge sonder er i opløsningsfasen. Eftersom både den mål-nukleinsyre som 25 deltager i hybridiseringen og de to sonder er i samme opløsningsfase, er hybridiseringsreaktionen væsentligt hurtigere end ved sandwich-hybridisering ved hvilken den ene sonde er bundet til en fast bærer. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er en inkuberingstid på en time tilstrækkeligt. I et-trins 30 sandwich-hybridiseringen (US patentskrift nr. 4.486.539) kan der ikke opnås tilstrækkelig hybridisering på mindre end 12 timer. Når der udføres to-trins sandwich-hybridisering (Dunn & Hassell, Cell. Vol. 12, side 23-36, 1977), behøves der en hybridiseringstid på mindst 24 timer.
35 WO 84/03520 beskriver en påvisning af en nuklein syre ved hjælp af to nukleinsyresonder, hvoraf den ene er mærket. Imidlertid fastgøres den mærkede nukleinsonde ikke direkte på nukleinsyren som skal påvises, og ved
DK 164932 B
2 en beskrevet praktisk udførelsesform er nukleinsyren som skal påvises,immobiliseret.
Der bruges med fordel mindst to sonder ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Sonderne er nukleinsyrefragmenter som 5 er tilstrækkeligt homologe med mål-nukleinsyren. Det er fordelagtigt , men ikke nødvendigt at sonderne er homologe med steder der er lokaliseret forholdsvis nær ved hinanden i den til identificering værende nukleinsyre.
Sonderne kan fremstilles syntetisk, semisyntetisk, ved 10 rekombinant-DNA-teknikker eller ud fra nukleinsyre som er isoleret direkte fra naturen. Der er også. sonder kommercielt tilgængelige fra flere forskellige kilder. En sonde kan være bundet til en passende vektor. Den kan indeholde vektordele eller være fuldstændig fri for vektordele.
15 Detéktorsonden er mærket med en passende markør. Som mar kør kan der bruges forskellige radioaktive isotoper eller radioaktivt mærkede forbindelser. Mærkningssubstansen kan fx også være fluorescerende, luminescerende, lysudsendende enzymatisk eller immunologisk påviselig. Markører baseret'.på 20 biotin og avidin eller streptavidin, lantanid-chelater, ferritin og hæm-forbindelser samt immunologisk påviselige haptener såsom acetoxyacetylfluorenderivater (WO '8302286) kan nævnes som eksempler. Identificering under medvirken af proteiner er også mulig. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen afhænger ikke 25 af den anvendte markør. Alle for tiden kendte mærkningssubstanser som egner sig til nukleinsyre-hybridisering eller sådanne som måtte blive udviklet i fremtiden kan frit anvendes i den foreliggende fremgangsmåde.
Til den anden sonde, den såkaldte fangersonde, er der 30 knyttet en komponent med affinitet til en anden komponent. Biotin-, avidin eller streptavidin, forskellige homopolynu-kleotider såscm poly dG - poly dC, poly dA - poly dT, og poly dA -poly U er egnede affinitetspar. Men der kan også bruges andre affinitetspar forudsat at komponenterne har tilstrækkelig stærk affinitet 35 til hinanden. Egnede affinitetspar findes blandt ligander og konjugater der bruges i immunologiske metoder.
DK 164932B
3 Før hybridiseringsreaktionen udføres behandles prøvens gelfrigivelse af mål-nukleinsyrerne i enkeltstrenget form i hybridiseringsopløsningen. Hybridiseringen udføres i en hybri-diseringsblanding hvori mål-nukleinsyrerne, af den mærkede son-5 de og fangersonden, om nødvendigt, er blevet gjort enkelt-stren-get. Der kan bruges forskellige egnede puffere som hybridise-ringsopløsninger. Hybridiseringen finder sted i temperaturområdet 0-80°C, men det er fordelagtigt at bruge en temperatur på 65°C. Hvis hybridiseringsopløsningen indeholder formamid 10 (40-55%) kan der bruges en temperatur på 37°C. En time er tilstrækkelig som hybridiseringstid.
Når hybridiseringen har fundet sted fortyndes opløsningen, om nødvendigt, for at gøre betingelserne fordelagtige for affinitetspar. Derefter bringes blandingen i kontakt med det an-15 det medlem af affinitetsparret. Af finite tskromatografikerlonne ner, filtre, plastoverflader, glasoverflader etc. kan bruges til at fange fangersonden/mål-nukleinsyren/detektorsondehybri-den.
Båir'ématerialet i affinitetskolonnen kan fx være cellu-20 lose, latex, polyacrylamid, dextran eller agarose. Disse materialer kan også bruges som suspensioner i et reagensglas.
Det er også fordelagtigt at bruge reagensglas med den anden komponent af affinitetsparret knyttet til dets indvendige overflade. Det er en forudsætning for det valgte materiale at det 25 er muligt at knytte en komponent til det, som har affinitet til den komponent som er knyttet til fangersonden.
Hvis prøven indeholder den til identificering værende nukleinsyre resulterer hybridiseringen i en fangersonde/mål-nukleinsyre/detektorsonde-hybrid. Under fraktioneringen vil 30 denne hybrid hænge ved bæreren. Markøren på den fraktion der hæfter sig til bæreren kan måles ved konventionelle metoder direkte fra bæreren eller efter eluering fra den eluerede opløsning.
Der kan også bruges andre systemer, fx faseekstråktion 35 eller magnetiske felter, i stedet for affinitetskromatografe-ring ved fraktionering.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende beskrives mere udførligt ved nogle eksempler. Fremgangsmåden
DK 164932 B
4 ifølge opfindelsen afhænger ikke af de nukleinsyrefrakmenter som er anvendt i eksemplerne.
Eksempel 1 5
Identificering af DNA fra adenovirus fra et cellelysat ved hjælp af homopolynukleotider_ 125
Den anvendte detektorsonde er I-mærket rekombmant-fag mKTH 1206, der indeholder et Bgl Il-fragment af adenovirus-10 genomet fra position 42-45,3% på genkortet over adenovirus type 2. Rekombinant-fagen er deponeret i. kultursamlingen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under nummeret DSM 2827 den 15. december 1983. Dens specifikke aktivitet af 7 x 10^ cpm/^g DNA. Sonden er beskrevet mere udførligt i Ranki et al Gene 21, si-15 de 77-85, 1983.
Den fangersonde som bruges er rekombinantplasmidet pKTH 1202, der er blevet deponeret i kultursamlingen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under nummeret DSM 2824 den 15. december 1983, og den omfatter et BamHI D fragment af adenoviru-20 set (kortpositionen 29-42%) klonet i plasmidet pBR322. Rekombinantplasmidet pKTH 1202 (DSM 2824) blev fragmenteret under anvendelse af restriktionsenzymet Hae III, og der kobledes en poly A hale til 3'-enderne af fragmenterne ved hjælp af termi-nalt transferase enzym. Længden af halen måltes ved H-A in-25 korporering. Længden var gennemsnitlig ca. 70 A-rester. Før anvendelse blev fangersonden denatureret ved kogning.
Den anvendte prøve bestod af adenovirus-inficerede A-549 celler. Cellerne blev inkuberet i 21 timer efter inficeringen.
Cellerne blev opsamlet og lyseret ved hjælp af en l%s natrium- 6 30 dodecylsulfatopløsning. Opløsningen indeholdt ca. 10 celler/ ml. Dens viskositet blev nedsat ved ultralydbehandling. Identisk behandlede ikke-inficerede A-549 celler brugtes som kontroller. Før hybridiseringen kogtes prøven i 5 minutter i 0,02 M NaOH, afkøledes til 0°C og neutraliseredes med eddikesyre.
35 Til prøven blev 500.000 cpm detektorsonde, 50 ng fanger sonde DNA og 10 μΐ prøve forenet i et reagensglas. Rumfanget reguleredes til 50 μΐ og den anvendte pufferopløsning var 0,6 M natriumklorid, 0,06 M natriumcitrat, 0,02 M natriumfosfat
DK 164932 B
5 (pH 7,6) og 0,5% natriumdodecylsulfat. Blandingen inkuberedes i en time ved 65°C.
Efter hybridiseringen afkøledes opløsningen til +20°C og førtes langsomt gennem en kromatografikolonne med 1 ml oli-5 go dT cellulose. Den opløsning som løb igennem opsamledes og førtes påny gennem kolonnen. Derefter vaskedes kolonnen med 20 ml af en opløsning der indeholdt 0,15 M natriumklorid, 0,015 M natriumfosfat (pH 7,6) og 0,5% natriumdodecylsulfat.
Det tilknyttede DNA blev til slut fraskilt ved anvendelse af 10 1 ml 0,02 M NaOH. Opløsningen opsamledes og dens radioaktivitet bestemtes.
Resultater:
12S
I-aktivitet (cpm) 15- Mål-nukleinsyre: inficerede celler Kontrol celler 5230 325
Eksempel 2 20
Identificering af DNA fra Chlamydia trachomatis ved hjælp af biotin-streptavidin_ 125
Den anvendte detektorsonde var cI-mærket rekombinant-fag mKTH 1245 som indeholder to BamHI-Sall DNA-fragmenter fra 25 klonen pKTH 1220, som sammen er koblet til Ml3np8 vektoren. Klonen pKTH 1220 er deponeret i kultursamlingen Deutsche Samm-lung von Mikroorganismen under nummeret DSM 2825 den 15. december 1983 og er beskrevet i Palva et al. FEMS Microbiology Letters ,23, side 83-89, 1984.
30 Den anvendte fangersonde var rekombinantplasmidet pKTH 1250.
Dette plasmid består af 2,9 kb Sall-Clal fragment fra plasmidet pKTH 1220 (DSM 2825) og af vektoren pAT 153. Der kobledes biotin molekyler kovalent til pKTH 1250 DNA ved anvendelse af den kendte indsnits-translateringsmetode (nick-translation method; 35 Rigby et al. J. Mol. Biol. 113, side 237-251, 1977), og med biotin-ll-UTP som substrat (Bethesda Research Laboratoris). Fangersonden DNA kobles i en puffer indeholdende 10 mM Tris-Cl pH 7,6, 1 mM EDTA i 5 minutter før brug.
DK 164932 B
6 Mål-nukleinsyren var rekombinant plasmid pKTH 1220 (DSM 2825). Dette plasmid indeholder ca. 10 kb af det DNA som er karakteristisk for Chlamydia trachomatis, bundet til vektoren pBR322. Plasmidet tjener som model-DNA og repræsenterer bak-5 teriens genom DNA. Før brugen kogtes plasmidet i 5 minutter i 0,02 M NaOH hvorefter opløsningen neutraliseredes med eddikesyre.
Streptavidin, der brugtes som affinitetsmateriale, fik-seredes til CNBr-aktiveret "Sepharose'^ (Pharmacia) i henhold 10 til Axen et al. Nature 214, side 1302-1304, 1967.
Til testen kombineredes 500.000 cmp.sonde, 50 ng fangersonde DNA og 10 ng mål-DNA i reagensglas. Rumfanget reguleredes til 20 μΐ og pufferopløsningen var den samme som i eksempel 1. Kontrol-DNA var kalvetymus-DNA.
15 Blandingen inkuberedes i 60 minutter ved 65°C. Derefter tilsattes der 500 μΐ af en pufferopløsning med sammensætning 0,1 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2, 0,05% "Triton'® x-100. Tilslut fraktioneredes opløsningen i en 0,2 ml strep-tavidin-"Sepharose'*" kolonne. Kolonnen vaskedes med 10 ml af 20 ovennævnte puffer og 10 ml 0,015 M natriumklorid, 0,015 M natriumfosfat (pH 7,6), 0,5% natriumdodecylsulfat (50°C). Herved hæftede det biotinylerede DNA sig til streptavidinet mens det andet DNA passerede gennem kolonnen. Den radioaktive sonde hæftede sig kun som resultat af hybriddannelsen. Den fangede ra-25 dioaktivitet bestemtes ved overførsel af hele kolonnen til tællerrøret i en gammatæller.
Resultater: 125 I-aktivitet (cpm) 30 - Mål-nukleinsyre:
10 ng pKTH 1220 10 ng kontrol DNA
1350 115
DK 164932 B
7
Eksempel 3
Identificering af plasmidet pBR322 DNA ved hjælp af et antigen-antistofpar_
Den anvendte detektorsonde er et derivat af plasmidet pBR 5 322 (kommercielt tilgængeligt for flere kilder) hvorfra fragmentet Pstl-Sall (3613-651) er blevet fjernet. Plasmidet mærkedes med fotobiotin ved hjælp af en kendt metode (Forster et al. Nucleic Acids Res. 13, side 745-761, 1985) og kommercielle reagenser (Bresa, Adelaide, Australien).
10 Den anvendte fangersonde var DNA. fra en rekombinant-fag M13mpll hvori fragmentet pBR322 Pstl-Sall var blevet indført. DNA var blevet sulfoneret ved en hjælp af en kendt metode (Orgenics Ltd. Yavne, Israel).
Prøven var Escherichia coli HB101 med plasmidet pBR322, 15 hvis mængde var blevet forøget ved hjælp af kloramfenicol-for-stærkning (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982). Bakteriecellerne 'blev lyseret med lysozyme efterfulgt af kogning i NaOH som beskrevet i publikationen Palva, J. Clin. Microbiol. 18, side 92-20 100, 1983).
Antisulfon monoclone antistoffer anvendtes til overtrækning af polystyren-mikrotiter kamre ved standardmetode (McKaern i Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, red. Ken-nett et al., Plenum Press 1980).
g 25 Til prøven kombineredes 5 x 10 lyserede Escherichia coli celler (både med og uden pBR322) med hver 100 ng fanger-DNA og ctetektorsonde i en 50 μΐ stor hybridiseringsblanding. Betingelserne var som i eksempel 1 bortset fra at der sattes 5% po-lyætylenglykol (PEG 6000) til blandingen og natriumdodecyl-30 sulfatkoncentrationen var 0,1%. Efter hybridiseringen fortyndedes opløsningen til 250 μΐ med tilsætning af 0,02 M natriumfosfat (pH 7,6) hvorpå opløsningen overførtes til det med antistof overtrukne mikrotiterkamre (microtiter well). Dette fulgtes ved inkubering i 2 timer ved 37°C. Kammeret blev der-35 efter vasket med en opløsning indeholdende 0,15 M natriumklorid, 0,02 M natriumfosfat pH 7,6 og 0,05% "Triton”® X-100. Nærværelse
DK 164932 B
8 af detektorsonden synliggjordes ved tilsætning af streptavidin (Bethesda Research Laboratories BRL), vask, tilsætning af bio-tinyleret alkalinfosfatase (BRL) og vask som beskrevet af Leary et al. i Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, side 4045-4049, 1983.
5 Til slut tilsattes 250 μΐ af en 35 mg/ml opløsning af parani-trofenylfosfat (Sigma) i diætanolaminpuffer (pH 10). Efter 60 minutter standsedes reaktionen og absorptionen måltes ved 410 nm.
10 Resultat: A410 nm Mål-nukleinsyre:
Celler med pBR 322 Celler uden pBR 322 15 >2 0,15
Claims (7)
1. Fremgangsmåde til identificering af nukleinsyrer ved en hybridiseringsmetode hvor mindst to sonder er i samme opløsningsfase, idet den ene, detektorsonden, er mærket med en egnet detekterbar markør, kendeteg- 5. e t ved at der til den anden, fangersonden, er knyttet det ene medlem af et affinitetspar, hvorpå den ved hybridiseringsreaktionen dannede fangersonde/ målnukleinsyre/detektorsonde-hybrid isoleres fra de andre komponenter som foreligger i hybridiseringsopløs-10 ningen ved hjælp af det andet medlem af affinitetsparret som er knyttet til en fast bærer. ·
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at affinitetsparret er biotin-streptavidin eller biotin-avidin.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved at affinitetsparret er et homopolynukleotid-par.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 3, kendetegnet ved at affinitetsparret er poly cD-dG.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 3, kende tegnet ved at affinitetsparret er poly dA-poly dT.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 3, kendetegnet ved at affinitetsparret er poly dA-poly U.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-25 n e t ved at affinitetsparret er et antigen-antistof.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI850004 | 1985-01-02 | ||
| FI850004A FI72146C (fi) | 1985-01-02 | 1985-01-02 | Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror. |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK386D0 DK386D0 (da) | 1986-01-02 |
| DK386A DK386A (da) | 1986-07-03 |
| DK164932B true DK164932B (da) | 1992-09-07 |
| DK164932C DK164932C (da) | 1993-01-25 |
Family
ID=8520136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK000386A DK164932C (da) | 1985-01-02 | 1986-01-02 | Fremgangsmaade til identificering af nukleinsyrer ved en hybridiseringsmetode, hvor mindst to sonder er i samme oploesningsfase, idet den ene, detektorsonden, er maerket med en egnet detekterbar markoer |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0669400B2 (da) |
| AT (1) | AT397514B (da) |
| AU (1) | AU561382B2 (da) |
| BE (1) | BE903937A (da) |
| CA (1) | CA1271705A (da) |
| CH (1) | CH666696A5 (da) |
| DE (1) | DE3546312A1 (da) |
| DK (1) | DK164932C (da) |
| FI (1) | FI72146C (da) |
| FR (1) | FR2575493B1 (da) |
| GB (1) | GB2169403B (da) |
| HU (1) | HU196453B (da) |
| IE (1) | IE58290B1 (da) |
| IL (1) | IL77489A (da) |
| IT (1) | IT1201514B (da) |
| LU (1) | LU86238A1 (da) |
| NL (1) | NL189427C (da) |
| NO (1) | NO166743C (da) |
| RO (1) | RO94651B (da) |
| SE (1) | SE463212B (da) |
| ZA (1) | ZA859895B (da) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5288609A (en) * | 1984-04-27 | 1994-02-22 | Enzo Diagnostics, Inc. | Capture sandwich hybridization method and composition |
| US6060237A (en) | 1985-02-26 | 2000-05-09 | Biostar, Inc. | Devices and methods for optical detection of nucleic acid hybridization |
| IL79112A (en) * | 1985-06-13 | 1992-01-15 | Abbott Lab | Method for the isolation of a nucleic acid sequence and kit for performing a hybridization assay |
| US4910300A (en) * | 1985-12-11 | 1990-03-20 | Chiron Corporation | Method for making nucleic acid probes |
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| FI76119C (fi) * | 1986-02-27 | 1988-09-09 | Orion Yhtymae Oy | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
| AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
| FI894132A7 (fi) * | 1987-06-26 | 1989-09-01 | Du Pont | Kontaminoivien sekvenssien affiniteettipoisto kloonatusta yhdistelmänu kleiinihaposta kaappaushelmiä käyttämällä |
| KR960002234B1 (ko) * | 1987-07-31 | 1996-02-13 | 젠-프로우브 인코오퍼레이티드 | 바람직하지 못한 교차반응을 제거하기 위한 올리고뉴클레오티드를 사용하는 폴리뉴클레오티드에 대한 측정방법 |
| EP0305145A3 (en) * | 1987-08-24 | 1990-05-02 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Methods and probes for detecting nucleic acids |
| EP0304845A3 (en) * | 1987-08-28 | 1991-03-06 | Profile Diagnostic Sciences Inc. | Method and kit for assaying gene expressions |
| CA1325761C (en) * | 1987-12-25 | 1994-01-04 | Takanori Oka | Method of detecting an intended nucleic acid in a sample |
| DE3800644A1 (de) * | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum hochspezifischen nachweis von nukleinsaeuren in loesung |
| US5104791A (en) * | 1988-02-09 | 1992-04-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Particle counting nucleic acid hybridization assays |
| EP0436547B1 (en) * | 1988-05-10 | 1994-11-30 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for rapid nucleic acid detection |
| US5185243A (en) * | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
| AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| US5858652A (en) * | 1988-08-30 | 1999-01-12 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| GB2225112A (en) * | 1988-11-22 | 1990-05-23 | Ici Plc | Hybridisation probes |
| US5082935A (en) * | 1988-12-15 | 1992-01-21 | Amoco Corporation | Diagnostic reagents made by attaching cytidine containing nucleic acid probes to amino functionalized solid supports by bisulfite mediated transamination |
| JP3015462B2 (ja) * | 1989-02-06 | 2000-03-06 | ジーン‐トラック・システムス | リステリア検出のためのプローブ類及び方法 |
| AU5269590A (en) | 1989-03-10 | 1990-10-09 | Gene-Trak Systems | Immobilized oligonucleotide probes and uses therefor |
| EP0481999B1 (en) * | 1989-03-10 | 1997-07-23 | VYSIS, Inc. | Preventing interference with affinity capture schemes |
| WO1991000926A1 (en) * | 1989-07-11 | 1991-01-24 | Microprobe Corporation | Quantification of bacteria using a nucleic acid hybridization assay |
| US5334501A (en) * | 1989-07-11 | 1994-08-02 | Microprobe Corporation | Quantification of bacteria using a nucleic acid hybridization assay |
| GB8924989D0 (en) * | 1989-11-06 | 1989-12-28 | Scotgen Ltd | Method and device for the detection of antibiotic resistance |
| US5580970A (en) * | 1989-12-01 | 1996-12-03 | Amoco Corporation | Detection of HPV transcripts |
| AU7429591A (en) * | 1990-04-18 | 1991-10-24 | Gene-Trak Systems | Nucleic acid probes for the detection of giardia lamblia |
| EP0529070A1 (en) * | 1991-02-27 | 1993-03-03 | Amoco Corporation | Methods for improving the sensitivity of hybridization assays |
| WO1993020234A1 (en) * | 1992-03-31 | 1993-10-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | A rapid, high capacity nucleic acid based assay |
| US7713528B1 (en) | 1993-02-18 | 2010-05-11 | Enzo Therapeutics, Inc. | Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate |
| WO1997038131A1 (en) * | 1996-04-11 | 1997-10-16 | Valentina Filippovna Kulikova | Method for detecting a nucleic acid chain to be analysed |
| US5853993A (en) * | 1996-10-21 | 1998-12-29 | Hewlett-Packard Company | Signal enhancement method and kit |
| GB0016833D0 (en) | 2000-07-07 | 2000-08-30 | Lee Helen | Improved dipstick assays (2) |
| US7465540B2 (en) | 2000-09-21 | 2008-12-16 | Luminex Corporation | Multiple reporter read-out for bioassays |
| CN1303221C (zh) * | 2003-01-27 | 2007-03-07 | 英科新创(厦门)科技有限公司 | 使用亲和放大的集成信号基团的靶核酸检测法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| FR2518755B1 (fr) * | 1981-12-23 | 1986-04-11 | Pasteur Institut | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissable par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
| GB8306426D0 (en) * | 1983-03-09 | 1983-04-13 | Malcolm A D B | Detecting polynucleotide sequence |
| CA1228811A (en) * | 1983-05-05 | 1987-11-03 | Robert G. Pergolizzi | Assay method utilizing polynucleotide sequences |
| NO843838L (no) * | 1983-09-26 | 1985-03-27 | Ortho Diagnostic Systems Inc | Fremgangsmaate for detektering av nukleinsyre |
| ZA849593B (en) * | 1983-12-12 | 1985-07-31 | Miles Lab | Hybridization assay employing labeled pairs of hybrid binding reagents |
| FR2558172B1 (fr) * | 1984-01-16 | 1986-06-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissance par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps specifiques pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
| CA1223222A (en) * | 1984-02-22 | 1987-06-23 | Nanibhushan Dattagupta | Immobilized nucleic acid-containing probes |
| FR2560298B1 (fr) * | 1984-02-28 | 1988-07-15 | Mors | Procede et dispositif de reglage avec precision de la chute de pression d'un fluide initialement sous pression elevee, tel qu'un fluide hydraulique par exemple alimentant un groupe hydraulique, et application du procede au dispositif dans un groupe ou une centrale hydraulique, en etant integre ou non, notamment a une table de machine ou a tout dispositif de support d'outillage |
| NZ211453A (en) * | 1984-03-22 | 1989-01-06 | Biotechnology Research Enterpr | Aryl azides, their preparation and use in the detection, localisation and isolation of polynucleotides |
| US4766062A (en) * | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor |
-
1985
- 1985-01-02 FI FI850004A patent/FI72146C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-12-17 CH CH5378/85A patent/CH666696A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-20 GB GB08531414A patent/GB2169403B/en not_active Expired
- 1985-12-24 BE BE0/216059A patent/BE903937A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-12-27 JP JP60299797A patent/JPH0669400B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-27 NO NO855308A patent/NO166743C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-12-29 HU HU855030A patent/HU196453B/hu unknown
- 1985-12-30 ZA ZA859895A patent/ZA859895B/xx unknown
- 1985-12-30 DE DE19853546312 patent/DE3546312A1/de active Granted
- 1985-12-30 IT IT23408/85A patent/IT1201514B/it active
- 1985-12-30 LU LU86238A patent/LU86238A1/fr unknown
- 1985-12-30 RO RO121637A patent/RO94651B/ro unknown
- 1985-12-30 FR FR858519394A patent/FR2575493B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-30 AT AT0376785A patent/AT397514B/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-31 NL NLAANVRAGE8503597,A patent/NL189427C/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-12-31 IL IL77489A patent/IL77489A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-12-31 CA CA000498834A patent/CA1271705A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-31 AU AU51748/85A patent/AU561382B2/en not_active Expired
- 1985-12-31 IE IE333385A patent/IE58290B1/en not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-01-02 SE SE8600011A patent/SE463212B/sv not_active IP Right Cessation
- 1986-01-02 DK DK000386A patent/DK164932C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK164932B (da) | Fremgangsmaade til identificering af nukleinsyrer ved en hybridiseringsmetode, hvor mindst to sonder er i samme oploesningsfase, idet den ene, detektorsonden, er maerket med en egnet detekterbar markoer | |
| US5098825A (en) | Probe containing a modified nucleic acid recognizable by specific antibodies and use of this probe to detect and characterize a homologous dna sequence | |
| DK175384B1 (da) | Forbedret fremgangsmåde til bestemmelse af nukleinsyrer samt reagenskombination og reagenssæt dertil | |
| US4556643A (en) | Assay method and probe for polynucleotide sequences | |
| EP0188450B1 (en) | Methods for the in vitro detection and identification of unknown pathogens or genetic entities | |
| US4731325A (en) | Arrays of alternating nucleic acid fragments for hybridization arrays | |
| US4562159A (en) | Diagnostic test for hepatitis B virus | |
| US4994373A (en) | Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes | |
| EP0336454B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay | |
| AU630836B2 (en) | Diagnostic assays using nucleic acid probes | |
| US7270982B2 (en) | Helicobacter pylori antigens in blood | |
| JPH0740960B2 (ja) | 核酸検出用キット | |
| Dahlén et al. | Sensitive detection of genes by sandwich hybridization and time-resolved fluorometry | |
| EP0146815B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes | |
| US6248513B1 (en) | Anticytomegalovirus monoclonal antibodies and processes for the in vitro diagnosis of infections by human cytomegaloviruses and a protein-kinase inducible by cytomegaloviruses and recognizable by aforesaid monoclonal antibodies | |
| JPS611388A (ja) | ヌクレオチド雑種形成プローブ | |
| WO1987004165A1 (en) | Dna probe and method of preparing the same | |
| WO1990001560A1 (en) | Bacterial dna probe | |
| Sakamoto et al. | Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with dot hybridization using 32P-or 2-acetylaminofluorene (AAF)-labelled cDNA probes for the detection and characterization of beet necrotic yellow vein virus | |
| EP0401313B1 (en) | Macromolecular conjugate | |
| EP0543222A1 (en) | Method for detecting nucleic acids and relative diagnostic kit | |
| Feary | The study of a Pseudomonas aeruginosa bacteriophage system | |
| JPH0657160B2 (ja) | ハイブリダイゼーション検定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |