<Desc/Clms Page number 1>
FACTEUR D'ACTIVATION DES NEUTROPHILES
La présente invention concerne une substance immunomodulatrice.
Elle concerne plus particulierement un facteur immunostimulant capable dlactiver les leucocytes neutrophiles humains, désigné dans la suite par facteur d'activation des neutrophiles (NAF).
1. ARRIERE-PLAN
Les leucocytes neutrophiles (neutrophiles) sont les leucocytes les plus courants et représentent environ 2/3 des globules blancs dans le sang humain. Ils ont une fonction principale, qui est de progéger l'organisme hate contre les infeotions microbiennes. Les neutrophiles sont mobiles, sont sensibles aux stimulations chimiotactigues produites par une infection et sont capables d'entrer dans des tissus infectes pour tuer les microorganismes. Cette capacité à tuer depend de l'aptitude des neutrophiles A englober les microorganismes et à libérer des radicaux oxygène et des enzymes microbicides (B. M. Babior, New Engl. J. Med. 298 (1976) 659-
EMI1.1
668, et M. Baggiolini. Experientia 40 [1984j 906-909).
La libération de ces produits déprend de l'activation des nèutrophiles. On pourrait ainsi employer des substances, comme le facteur d'activation des neutrophiles decrit ici, pour améliorer l'activation des neutrophiles et donc le mécanisme de défense anti-microbienne du corps humain.
On a maintenant découvert que les monocytes humains secretent un facteur gui induit l'exocytose et l'eclatement respiratoire (formation de radicaux oxygene et libération d'enzymes) dans les neutrophiles humains et présente ainsi des propriétés d'activation des neutrophiles qui sont importantes dans l'activité anti-microbienne.
Le facteur peut être obtenu A partir du fluide de culture de monocytes humains stimules et a une masse molecu- laire apparente d'environ 6000, plus précisément d'environ 6500 en électrophorèse sur SDS-gel.
<Desc/Clms Page number 2>
On a maintenant découvert que les monocytes humains secrètent un facteur qui induit l'exocytose et l'éclatement respiratoire (formation de radicaux oxygene et libération d'enzymes) dans les neutrophiles humains et présente ainsi des propriétés d'activation des neutrophiles qui sont importantes dans l'activité anti-microbienne.
EMI2.1
Le facteur peut être obtenu à partir du fluide de culture de monocytes humains stimulés et a une masse moléculaire apparente d'environ 6000 ; plus précisément d'environ r 6500 en électrophorèse sur SDS-gel.
Les monocytes sont des cellules phagocytaires analogues aux neutrophiles. Toutefois, contrairement aux neutrophiles, les monocytes ont une duree de vie prolongée. Ils migrent depuis le sang dans tous les sites tissulaires possibles OÙ ils se transforment en macrophages. La transformation des monocytes en macrophages peut également s'observer dans des expériences en culture cellulaire. Les macrophages dans les tissus ont une variété de fonctions, principalement la phagocytose des matières indésirables et la production d'une grande variété de peptides et de protéines qui sont secrétés.
Les macrophages se rassemblent au site de l'infection persistante et c'est en ces lieux que la production de NAF par ces cellules pourrait améliorer les possibilités de défense de l'hole des neutrophiles et avoir ainsi un rôle applicable en pathophysiologie.
Le NAF est caractérisé par ses propriétés d'activation des neutrophiles, c'est-a-dire l'induction de ce que l'on appelle l'éclatement respiratoire avec production de radicaux oxygène et induction de la libération d'enzymes. En termes moléculaires, le NAF est caractérisé par les propriétés suivantes : une masse moléculaire apparente d'environ 6500 en électrophorèse sur SDS-gel, un point isoélectrique d'environ 8, 6, une résistance à la chaleur jusqu'à 80"C et A un nombre d'agents dénaturants mais une sensibilité aux protéases, ce qui suggère que le NAF est un polypeptide. L'ac-
<Desc/Clms Page number 3>
(Cona)etdelaconcentrationdustimuiusetdeladuree d'incubation. Elle est inhibée par la cycloheximide, ce qui indique une fois encore que la synthèse protéinique est mise en jeu.
Comme on l'a deja indique, les monocytes et les macrophages sont des sources abondantes d'une vari6t6 de peptides bioactifs et de proteines (C. F. Nathan, J. Clin. Invest. 79 (1987) 319-326). Ils ont et6 identifiés comme 6tant les producteurs de trois cytocines distinctes : l'interleukine 1 (IL-1), le facteur de necrose tumorale (TNF) et l'interfé-
EMI3.1
ron-alpha (iFN-ol. Un certain nombre de rapports ont été puron-alpha (IFN : : x blies qui montrent que les monocytes et les macrophages produisent aussi des facteurs agissant sur les neutrophiles qui sont différents de ceux mentionnes ci-dessus. comme ils sont actifs sur les neutrophiles, ces facteurs sont présentés dans la suite en detail.
Diverses publications ont rapporte que les macrophages alvéolaires libèrent des facteurs qui sont chimiotactiques pour les neutrophiles (J. A.
Kazm1erowski et coll. J. Clin. Invest. 59 [1977] 273-281 ; W. W. Merrill et coll., J. Clin. Invest. 65 [1980] 268-270 et G. W. Hunninghake et coll., J. Clin. Invest. 66 (1980) 473- 483) et qui peuvent améliorer la defense anti-microbienne dans le poumon. 11 a été ensuite montre que ces facteurs améliorent l'activite microbicide des neutrophiles (J. E.
Pennington et coll., J. Infect. Dis. 148 [1983] 101-109 et J. Clin. Invest. 75 [1985] 1230-1237). Une purification par filtration sur gel et chromatofocalisation a conduit à l'identification d'un facteur sensible aux protéases (nomme NAF) produit par des macrophages alvéolaires, d'une masse moléculaire de 6000 et d'un poids isoélectrique de 7,6. On a rapporte que ce facteur etait faiblement chimiotactique et améliorait l'aptitude des neutrophiles A tuer les bacteries phagocytoses sans toutefois induire en lui-mem la production de radicaux oxygene ni la libération d'enzymes. Un me- canisme similaire d'activité anti-microbinenne améliorée a
<Desc/Clms Page number 4>
été décrit par d'autres chercheurs (A. Ferrante et coll., Clin. Exp.
Immunol. 56 [1984] 559-566), qui ont montre que les neutrophiles humains nécessitent l'addition de milieux de culture provenant de monocytes et de macrophages pour induire l'aptitude & tuer Neigleria fowleri. Les médiateurs de l'activation des granulocytes (GRAM) produits par des monocytes humains stimules par LPS ont été décrits par d'autres laboratoires (A. Kapp et coll., J. Invest. Dermatol. 86
EMI4.1
[1986] 523-528 et F. E. Ma1y et col1., Lymphokine Res. 5 Rhokine Res. 5 [1986] 21-33). Deux espèces de GRAM ont été décrites, une espèce majeure ayant une masse moléculaire apparente de 60 000 et une espèce mineure ayant une masse moléculaire apparente de 10 000 qui induisaient une réponse d'éclatement respiratoire retardé dans les neutrophiles humains, mise en evidence par chimioluminescence.
Ces facteurs sont sensibles A la chaleur et la trypsine et leur production depend de la stimulation des monocytes avec LPS et, apparemment, à nou. veau de la synthese protéinigue.
Plusieurs rapports décrivent des facteurs derives de monocytes et/ou de macrophages ayant une activité chimiotactique vis-à-vis des neutrophiles. Un facteur nomme"chimio- taxine dérivée de cellules mononucléaires" (MOC), qui est apparemment un peptide de masse moleculaire 10 000, qui differe d'un GRAM, a été rapporté (E. Kownatzki et coll., Clin.
Exp. Immunol. 64 [1986] 214-222). Un facteur chimiotactique neutrophile produit par les monocytes de sang humain stimu-
EMI4.2
lés avec LPS, de masse moléculaire environ 10 000 et de point isoélectrique 8-8, 5, a egalement été indique (T.
Yoshimura et co11., J. Immunol. 139 (1987) 788-793). Enfin, on a également rapporte que des macrophages péritonéaux de rats stimules en culture avec LPS libèrent un facteur chimiotactique neutrophile sélectif (F. O. Cunha et coll., J.
EMI4.3
Med. Biol. Res. 19 [1986] 775-777 et Eur. J. Pharmacol. 129 [1986] 65-76).
Du fait de la nature preliminaire de l'information bio-
<Desc/Clms Page number 5>
neutrophile produit par les monocytes de sang humain stimulés avec LPS, de masse moléculaire environ 10 000 et de point isoélectrique 8-8, 5, a également été indique (T.
Yoshimura et coll., J. Immunol. 139 [1987] 788-793). Enfin, on a également rapporté que des macrophages péritonéaux de rats stimulés en culture avec LPS libèrent un facteur chimiotactique neutrophile sélectif (F. Q. Cunha et coll., J.
Med. Biol. Res. 19 [1986] 775-777 et Eur. J. Pharmacol. 129 (1986) 65-76).
Du fait de la nature preliminaire de l'information biochimique contenue dans ces rapports, il est impossible de spéculer sur des similarités et des différences de structure parmi les divers facteurs décrits.
Après la (les) date (s) de priorité qui est (sont) re- vendiquee (s) pour la présente invention, la purification d'un peptide correspondant probablement au NAF a été décrite par van Damme et coll. (J. Van Damme et coll., J. Exp. Med.
167 [1988] 1364-1376) et une séquence identique à celle du NAF a été rapportée par Gregory et coll., (H. Gregory et coll., Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 [1988] 893-890) pour un peptide ayant été purifié à partir de surnageants de lymphocytes humains stimules à la lectine. L'ADNc codant pour MDNCF (T. Yoshimura et coll., Proc. Nat. Acad. Sei. USA JM [1987] 9233-9237) a été récemment clone (K. Matsushima et coll., J. Exp. Med. 167 [1988] 1883-1893) et s'est révélé correspondre à l'ADNc 3-10C (J. Schmid et C. Weissmann, J.
Immunol. 139 [1987] 250-256). Schmid et Weissmann ont montré que le peptide codé par l'ADNc 3-10C a une homologie de structure avec le facteur plaquettaire 4, la ss-thromboglobuline, le peptide III activateur de tissu conjonctif (CTAP- III) et le peptide inductible par l'interferon-gamma (gamma- IP-10. Ces molécules sont également homologues à un peptide à 73 résidus (MGSA) ayant des propriétés de stimulation de la croissance des mélanomes (A. Richmond et coll., EMBO J. 1 [1988] 2025-2033), dont la séquence ressemble étroitement à
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
tides sont largement inconnues. On a rapporté que MGSA et CTAP-III (C. W. Castor et coll., Proc. Nat. Acad. Sei.
USA 80 [1983] 765-769) sont mitogènes et on a montre que le facteur plaquettaire 4 a des effets immunomodulateurs (A. D. Barone et co11., J. Biol. Chem. 263 [1988] 8710-8715).
Les résultats obtenus suggèrent que le NAF active se- lectivement les neutrophiles par un procédé à médiation par récepteur analogue à celui initie par les agonistes chimio- tactiques .
2. RESUME DE L'INVENTION
On a découvert que le NAF de cette invention induit la formation de radicaux oxygène et la lib6ration d'enzymes dans les neutrophiles humains en agissant par l'intermediai- re d'un récepteur sélectif, different de tous les récepteurs
EMI6.2
décrits jusqu'a present.
La séquence totale d'acides amines du NAF purifie provenant de monocytes humains stimules par LPS a été determi- née et un gene codant pour l'espece de NAF principale a ete synthétisé et exprimé sous forme d'un peptide recombinant ayant les memes propriétés d'activation des neutrophiles que son homologue naturel.
L'invention concerne donc le NAF et son isolement de sources naturelles comme les monocytes humains.
Elle concerne également un NAF synthétique, en particulier recombinant, et sa preparation et son expression.
3. DESCRIPTION DETAILLEE
La sequence complète des acides amines du NAF a été determinee par des méthodes de séquençage connues :
EMI6.3
Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-ProPhe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-ProHis-Cys-Ala-Asn-Thr-Glu-Ile-Ile-Val-Lys-Leu-Ser-Asp-G1y-Arg-GluLeu-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys- Phe-Leu-Lys-Arg-Ala-Glu-Asn-Ser.
La degradation d'Edman de la proteine entière et des
<Desc/Clms Page number 7>
fragments typtiques T 7-26 et T 27-47 obtenus apres élimination de NAF SH-méthylé et amino-succinylé a donné la se- quence jusqu'a la position 47. Par hydrolyse avec de l'acide formique à 75% et degradation d'Edman, on a obtenu deux séquences approximativement équimolaires de 20 acides aminés, suivies d'un simple motif correspondant a la séquence aminoterminale de NAF au-delà de la position 20. La séquence du peptide carboxyterminal A 53-72 a été déterminée par soustraction et confirmée par l'analyse du peptide typtique T 61-72.
Les carboxypeptidases A et B ne donnent pas de produit de segmentation décelable mais, apyres traitement de 1
EMI7.1
nmole de NAF avec la carboxypeptidase Y, on constate la liberation de 120 pmoles de sérine, ce qui indique que la serine est carboxyterminale.
L'analyse de divers lots de NAP a révélé une certaine hétérogénéité aminoterminale. La sequence ci-dessus concerne le constituant majeur (environ 70%) que l'on pense être largement responsable des activités biologiques. On pourrait identifier trois autres variants : Sequence 1 (environ 17%) :
EMI7.2
Ala-Val-Leu-Pro'-Arg-Ser-Ala-Lys-GIu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-LysThr-Tyr-Ser-Lys-pro-Phe-H1s-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-
Ile-Glu-Ser-Gly-Pro- c'est"a-dire la séquence entière ci-dessus prolongée encore, a l'extrémité N, par Ala-Val-Leu-Pro-Arg- (la protéine en-
EMI7.3
tiere a ainsi 77 acides amines).
Sequence 2 (environ 8%) : Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-CyS-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-LyPro-Phe-HisPro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Proc'est. à-dire la sequence entière ci-dessus raccourcie, à l'extrémité N, de Ser-Ala- (la proteine entière a ainsi 70 acides amines).
Sequence 3 (environ 5%)
<Desc/Clms Page number 8>
à l'extrémiste N, par Ala-Val-Leu-Pro-Arg- (la protéine entiere a ainsi 77 acides aminés). Séquence 2 (environ 8%) :
EMI8.1
Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-HisPro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro- c'est-à-dire la séquence entière ci-dessus raccourcie, à l'extrémité N, de Ser-Ala- (la protéine entière a ainsi 70 acides aminés).
EMI8.2
Sequence 3 (environ 5%) : Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-ProLys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-. c'est-à-dire la séquence entière ci-dessus raccourcie, à l'extrémité N, de Ser-Ala-Lys- (la protéine entière a ainsi 69 acides aminés).
Toutes ces séquences peuvent être alignées pour former la sequence prévue à partir de l'ADNc 3-10C, constitué par 99 acides aminés (J. Schmid et C. Weissmann, J. Immunol. 139 [1987] 250-254). Le peptide NAF majeur correspond aux positions 28 à 99 de la séquence d'acides aminés 3-10C, tandis que les trois variants ci-dessus commencent aux positions 23 (séquence 1), 30 (séquence 2) et 31 (séquence 3) de celui-
EMI8.3
ci.
La comparaison de la sequence dérivée d'ADNc 3-10C avec les données de la séquence ci-dessus suggère que les phagocytes mononucléaires synthétisent un précurseur de NAF qui est traité au sein de la cellule. Le peptide à 77 résidus pourrait représenter la forme secrétée la plus grande de NAF car il correspond a la séquence dérivée d'ADNc moins le peptide de signal prévu de 22 acides aminés. L'espèce principale de NAF à 72 residus et les analogues à 70 et 69 résidus peuvent resulter d'autres modifications post-translationnelles.
Toutes les formes de NAF possèdent quatre résidus cys-
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
rieure à la masse moleculaire apparente trouvée par électrophorèse sur SDS-gel.
La production de NAF à partir de sources naturelles, comme les monocytes humains, conduit & de faibles rendements et nécessite des étapes de purification importantes et compliquees
Afin de produire du NAF en grandes quantities et avec des procédés de synthbse a meilleur rendement, on indique par exemple une synthese chimique totale ou des procédés à l'ADN recombinant. La production de NAF de synthèse, par exemple par des méthodes à l'ADN recombinant, comprenant l'expression dans un système d'expression procaryote ou eucaryote, par exemple dans E. coli, font également partie de
EMI9.2
l'invention.
Un NAF de synthdse, c'est-a-dire un NAF produit par des procédés de synthese comme des procédés à l'ADN recombinant, fait egalement partie de l'inventlon. Un NAF de synthèse, par exemple le NAF recombinant isolé, par exemple, AL partir de bactéries, a la ou les mêmes séquences d'acides aminés que le NAF naturel et les mêmes propriétés et activités biologiques. L'expression"NAF recombinant"signifie un NAF obtenu par des procédés à l'ADN recombinant.
La preparation de NAF par des procédées à l'ADN recombinant s'effectue selon des techniques connues, a savoir par synthdse, purification et ligature des oligonucléotides correspondants, clonage du gene de NAF synthétique, expression dans E. coli par exemple et enfin recuperation et purification du NAF recombinant. Par exemple, un gène codant pour le NAF a 72 acides aminés est synthétisé, de preference avec optimisation du codon, puis clone et exprimé dans E. coli.
L'analyse par "western blot" des extraits bactériens bruts, au moyen d'un anti-sérum sensibilise à un NAF naturel, révèle une seule bande qui migre en même temps que le NAF naturel. Le NAF recombinant purifié jusqu'à l'hofnogenei- té possède des séquences aminoterro1nales et carboxyterminales identiques & celles du NAF naturel A 72 acides a-mines.
<Desc/Clms Page number 10>
dans E. coli par exemple et enfin récupération et purification du NAF recombinant. Par exemple, un gène codant pour le NAF a 72 acides aminés est synthétisé, de preference avec optimisation du codon, puis clone et exprimé dans E. coli.
L'analyse par"western blot"des extraits bacteriens bruts, au moyen d'un anti-serum sensibilisé à un NAP naturel, révèle une seule bande qui migre en même temps que le NAF naturel. Le NAF recombinant purifie jusqu'à l'homogeneité possède des séquences aminoterminales et carboxyterminales identiques à celles du NAF naturel à 72 acides aminés.
Si on le teste sur des neutrophiles humains, on constate qu'il a la même activité et la meme efficacité que le NAF naturel pour induire le chimiotactisme, une élévation rapide de Ca2+ libre cytosolique, l'activation de l'éclatement respiratoire et la libération des granulations specifiques et azurophiles.
La figure 13 represente le dessin d'un gène de NAF synthétique. Des changements sont apparents sur la séance codante de l'ADNc 3-10C pour faciliter l'expression dans E. coli. A l'extrémité 3', la sequence de terminaison naturelle TAA est remplacée par une triple séquence de terminaison TAATAATGA et un site BamHI est ajoute immédiatement en aval.
A l'extremite 51, les sites SphI et dal sont ajoutes pour permettre l'insertion dans le clonage et dans le vecteur d'expression, respectivement. A la base 34, est créé un site de restriction TaqI pour des manipulations ulterieures sur l'extrémité 5'par changement du codon Arg de AGA en CGA.
EMI10.1
Le recuit en blocs (oligonucleotides 1-2, 3-4 et 5-6) ne présente aucun avantage par rapport. à la ligature simul- tanée des six oligonucléotides. La 5'-phosphorylation de tous les oligonucléotides donne naissance A des produits de ligature plus grands que la taille attendue mais, lorsque les oligonucleotides terminaux (1 et 6) ne sont pas phosphoryles, le produit ayant la masse moléculaire la plus élevée est le gène complet avec 248/240 bases. Le gène est ligature
<Desc/Clms Page number 11>
dans pBS M13- coupé par SphI/BamHI et transformé dans E. coli.
L'ADN plasmide isolé de 6 des colonies résistantes à l'ampicilline resultantes est découpé avec ClaI/BamHI, donnant dans tous les cas une bande de 237 bp sur un gel d'agarose à 1, 4%. Le séquencage de l'ADN montre les clones contenant la séquence correcte. La bande ClaI/BamHl provenant d'un clone correct est retirée du gène et clone dans le vecteur promoteur de Trp pIL402 (Term). Comme moyen possible d'augmenter l'expression ; on peut incorporer une séquence de terminaison de transcription synthétique (voir exemple 17) dans ce vecteur, fixée à l'extrémiste 3'du gène GM-CSF humain au site BamHI.
Le gène de NAF est donc inséré entre ce site BamHI et le site ClaI en aval du site d'initiation de la transcription dans le promoteur, pour remplacer le gène GM-CSF. Le plasmide d'expression de NAF résultant, p (NAF)-6T3, est représenté sur la figure 14.
L'analyse par coloration à l'argent et"western blot" d'extraits de E. coli contenant p (NAF)-6T3 induit par llaci- de indole-acrylique demontre la chronoproduction d'un peptide qui migre en même temps qu'un NAF naturel et réagit avec un anti-serum contre le NAF naturel.
Le système d'expression ci-dessus peut également être utilisé pour préparer les variants de NAF mentionnés ci-dessus ou d'autres fragments de NAP biologiquement actifs comme des fragments de NAF ayant perdu le groupe amino.
Les propriétés biologiques du NAF sont spécifiques à une espèce. L'activité chez le lapin reflète tres étroitement l'activité chez l'homme. Des essais préliminaires chez la souris, le rat et le cobaye n'ont pas montré d'activité claire.
L'utilisation du NAF est indiquée dans le traitement des troubles qui sont accompagnés ou provoques, localement ou systemiquement, par une modification du nombre ou de 1'état d'activation des PMN (cellules polymorphonucléairesneutrophiles). Le NAF modifie de manière importante ces pa-
<Desc/Clms Page number 12>
ramètres PMN et son utilisation est donc indiquée dans le traitement des troubles dans lesquels une élévation du nombre ou de l'état d'activation des PMN conduit a une amélioration clinique, par exemple dans les infections bactériennes, mycoplasmiques, par les levures et les champignons et dans les infections virales.
En outre, l'utilisation du NAF est indiquée dans les maladies inflammatoires comme la psoriasis, les affections arthritiques et l'asthme, ou dans les troubles présentant une numération des neutrophiles anormalement faible et/ou un faible taux généralisé des neutrophiles, et dans la préparation d'antagonistes utilisables dans ces indications.
3. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : production de NAF induite par LPS :
Des cellules mononucléaires séparées comme le décrit l'exemple 1 ont été ensemencées dans des plaques de culture à 24 puits (5x106 cellules dans 1 ml) et stimulées avec LPS aux concentrations indiquees. A différents intervalles de temps, les milieux ont été recueillis, éclaircis par centrifugation (20 000 t/min pendant 20 min à 4*C) et on a mesuré l'activité du NAF. Les cellules utilisées provenaient d'un seul donneur ; on a rapporté les moyennes de cultures faites en double exemplaire. Ces résultats sont représentatifs de 4 expériences analogues utilisant des cellules de donneurs différents.
Figure 2 : production de NAF par des phagocytes mononucléaires mais pas par des lymphocytes : a) La fraction totale de cellules mononucléaires (*, , 5xl06 cellules/ml) et les cellules adhérentes en déri- vant (o, ci) sont cultivées en présence (., 0) et en l'absence (IK, M) de 100 ng de LPS pendant 24 heures. b) Des monocytes (o, 106 cellules/ml) et des lymphocytes (IN, 4x106 cellules/ml) purifiés par élutriation sont cultivés en présence de 100 ng de LPS.
Les graphiques représentent les valeurs moyennes rela-
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
Figure 3 : puritication partielle au NAF par cnromacoqrapnle sur phosphocellulose : On y voit la distribution des protéines (absorbance 280 nu, ---), da NAF (o) et de IL-1 (à). Les fractions présentant les activités de NAF les plus élevées sont regroupees comme il est indique.
Figure 4 : purification du NAP par filtration sur vel en CLHP : a) Distribution des protéines (absorbance à 280 nm) et temps d'elution des marqueurs de masse moleculaire (MM)
EMI13.2
(flèches : l MM 66200 ; 2 = MM 42700 ; 3 = MM 21500 ; 4 = MM 6500 et 5 = MM 1255). b) Profil d'activité du NAF.
Fi < xure5 : purificationLde NAPpar Chromatographie sur hy- droxylapatite :
Du NAF partiellement purifie est chargé sur la colonne à une faible concentration saline, puis élué par un tampon contenant NaCl 1M. Les blocs montrent l'activité du NAF.
Figure 6 : purification du NAF par chromatographie sur hépa-
EMI13.3
rince-sepharose :
Du NAF partiellement purifié est chargé sur la colonne à une faible concentration saline, puis élué avec un tampon contenant NaCl I, SM. Les blocs montrent l'activité du NAP. Figure 7 : purification du NAF par CLHP en phase inverse sur colonne de C4 : a) Du NAF purifié est Charge sur une colonne en phase inverse dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%, La colonne est développée avec un gradient linéaire d'acetonitril dans de l'acide trifluoroacétique à 0, 1%. b) Les blocs montrent l'activiste du NAF.
Figure 8 : purification du NAP par CLHP en phase inverse sur colonne de CN-propyle : a) Du NAF purifie est Charge sur une colonne de CN-propyle Bakerbond dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%. La colonne est développée avec un gradient lineaire de n-propa-
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
nol dans de l'acide trifluoroacétique à 0, 1%. b) Les blocs montrent l'activité du NAF.
Figure 9 : purification du NAP par chromatofocalisation :
Du NAF partiellement purifie est chargé sur une colonne de chromatofocalisation. La colonne est développée avec du polytampon 96-HCl, pH 7, 0. On teste les fractions pour dé- terminer l'activit du NAF (-@-) et le pH (--@--).
Figure 10 : réponse de l'éclatement respiratoire au NAF par- tiellement purifi : a) Production de superoxyde : des neutrophiles
EMI14.2
(3xlO6/ml) sont preincubes à 370 avec ou sans 1 zon de PAF, pendant 2 minutes, puis stimules avec des quantities croissantes de NAF. La figure montre les enregistrements de la réduction des cytochromes c apres l'addition de NAF. b) Chimioluminescence dépendant de H2O2 : les courbes d'évolution après stimulation avec un NAF partiellement puriflé et des concentrations quasieguiactives de CSa et fMLP sont indiquées sur la gauche. La phase initiale de la réponse est détaillée sur la droite. Les stimulants sont ajou-
EMI14.3
tes dans 50 lil de PBS-BSA.
Figure 11 : distinction entre NAF et C5a :
CSa et NAF sont incubés pendant 15 minutes avec du serum humain frais ou avec du PBS et l'activité des préparations est déterminée (production de superoxyde). a) C5a dans PBS,
EMI14.4
b) C5a dans sérum, c) serum seul, d) NAF dans PBS, e) NAF dans sérum.
EMI14.5
Figure 12 : formation de superoxyde en réponse A une stimu- lation séquentielle avec un NAF partiellement purifié, C5a et fMLP : a) Des neutrophiles 93x106/ml) sont preincubes à 370c pendant 5 minutes, puis stimulés avec différentes agonistes comme il est indique (flèches).
<Desc/Clms Page number 15>
b) Stimulation séquentielle ou répétée avec NAF et C5a.
Les conditions sont les mêmes qu'en a).
Les flaches representent l'addition des agonistes selon les indications. La concentration de CSa et de 0, 5 nM en a) est de 0, 2 nM en b), oelle de fMLP est de 20 nM dans les deux experiences. Les agonistes sont ajoutés dans 50 p. l de PBS-BSA.
Figure 13 : séquence nucléotidique d'un gene de NAF synthétique :
Les oligonucleotides simples, ON-1 à ON-6, utilisés pour construire le gene, sont indiqués en traits pointillés.
Les numéros (soulignes) des nucléotides apparaissent du côté droit au-dessus du double brin. La séquence peptidique correspondante de la forme majeure est numérotée en partant de l'extremiste aminoterminale (Ser). Les sites de restriction Clal et BamHI sont indiques au-dessus du double brin. Le site TaqI créé en remplagant le A par un C dans le codon d'arginine est également indiqué.
Figure 14 : vecteur d'expression p (NAF)-6T3 :
AR = gène de résistance à l'ampicilline
Trp P/O = promoteur de tryptophane
T = terminaison de transcription synthétique
EMI15.1
Figure 15 : identite du NAF naturel et du NAF recombinant
Graphiques du haut : changements de Ca2+ libre cytosolique induits par un NAF naturel (à gauche) et recombinant (à droite). Les neutrophiles (4x106 cellules/ml) sont charges avec 0, 1 nmole de quin-2/AM, puis stimules avec 3 nM de NAF (marque). Les changements de saturation de quin-2 sont étalonnés comme le décrivent V. Von Tscharner et coll. J.
Biol. Chem. 261 (1986) 10163-10168.
Graphiques du bas : éclatement respiratoire induit par un NAF naturel (gauche) et recombinant (droite). Les neutro-
EMI15.2
phile. s (106 ce. I : Lule philes (106 cellules/ml) sont stimules avec 3, 10 et 30nM de NAF il l'instant 0 et la production de peroxyde d'hydrogène est mesurée par chimioluminescence (M. P. Wymann et coll.,
<Desc/Clms Page number 16>
ges avec 0, 1 nmole de quin-2/AM, puis stimules avec 3 nM de NAF (marque). Les changements de saturation de quin-2 sont étalonnés comme le décrivent V. Von Tscharner et coll., J.
Biol. Chem. 261 (1986) 10163-10168.
Graphiques du bas : éclatement respiratoire induit par un NAF naturel (gauche) et recombinant (droite). Les neutrophiles (106 cellules/ml) sont stimulés avec 3,10 et 30nM de NAF à l'instant 0 et la production de peroxyde d'hydrogène est mesurée par chimioluminescence (M. P. Wymann et coll.,
EMI16.1
Anal. Biochem. 165 [1987) 371-378).
Figure 16 : fuite de plasma dans les sites cutanés :
Après injection intradermique de NAF ou d'endotoxine ; Durée : 4 heures ; Moyenne t erreurs types de la réponse moyenne sur 3 lapins.
Figure 17 ; accumulation des neutrophiles dans les sites cutanés :
Mesures faites simultanément aux réponses tracées sur la figure 16.
Figure 18 : Effet de la polymixine B sur l'accumulation des neutrophiles :
Apres injection intradermique de NAF (10-9 moles/site), de fMLP (10-9 moles/site) ou d'endotoxine (10-13 moles/site) ;
Polymixine B : 40 gg/site ;
Durée : 2 heures ;
Moyenne i erreurs types des réponses moyennes sur 3 lapins.
Figure 19 : effet de l'actinomycine D sur l'accumulation des neutrophiles :
Après stimulation des sites cutanés avec NAF (10-9 moles/site), fMLP (10-9 moles/site) ou de l'endotoxine (10-13 moles/site) ;
Durée : 2 heures ;
Moyenne ! erreurs types des reponses moyennes sur 3 lapins.
<Desc/Clms Page number 17>
PAF : 1-O-hexadécyl-2-O-acétyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (facteur d'activation plaquettaire) MEM ; milieu essential minimal d'Eagle (Seromed GmbH, Munich, RFA), complémenté avec 25 Aglml de néomycine, tamponné A pH 7,4 avec NaHCO3 25nM et HEPES 20nM MEM-PPL : comme ci-dessus, contenant en plus 1% de solution de protéine plasmatique pasteurisée (5% de PPL-SRK, Swiss Red Cross Laboratory, Bern, Suisse) et 100 ui/ml de pénicilline et de streptomycine (Gibco A.G., Bâle, Suisse); PBS : solution saline tamponée au phosphate sans Ca2+ et
EMI17.1
Mg2+ (137mM NaCl, 2, 7mM KC1, 8, lnM NaHPO et l, 5mM KH2P04, ajustée a pH 7, 4) PBS-BSA ; PBS complément par 0, 9mM de caC12, O, 49mM da MgC12 et 2, 5 mg/rnl de BSA.
HEPES : acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfo- nique PPL-SRK : solution de protéine plasmatique (Swiss Red Cross) NAF : facteur ou protéine d'activation des neutrophiles . CX : cyclohexim1de IL-1 : interleukine-1 SOD : superoxyde C5a : anaphylatoxine CPC : verre poreux contrôlé PAGE : électrophorèse sur gel de polyacrylamide GM-CSF : facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages CB : cytochalasine B (5 #g/ml)
EMI17.2
MES : acide 2- [N-morpholino] ethanesulfonique CLHP :
Chromatographie liquide haute pression SDS : dodecylsulfate de sodium PARTIE I : production de NAF par monocytes humains Exemple l : production de NAF par monocytes humains stimulee avec LPS
Des monocytes humains sont isolés de la couche leucocytaire du sang de donneurs (Swiss Red Cross Laboratory, Bern,
<Desc/Clms Page number 18>
Suisse) par centrifugation à travers un gradient de FicollPaque. Ce procédé sépare les neutrophiles d'avec ce que l'on appelle les cellules mononucléaires, qui sont un melange de monocytes (environ 20%) et de lymphocytes (environ 80%).
On utilise trois préparations de monocytes : (i) la fraction totale des cellules monooluéaires, (ii) des monocytes enrichis à partir de la fraction de cellules mononucléaires par adherence et (iii) des monocytes purs & 90% séparés des lym-
EMI18.1
phocites par centrifugation d'elutriation (G. Garotta et coll., Biochem. B1ophs. Res. Comm. 140 [1986] 948-954 et K. J. Clemetson et coll., J. Exp. Med. 161 [1985] 972-983). Les cellules sont cultivées dans MEM-PPL et stimulées avec des concentrations croissantes (0, 1 ng à 1 9/m1) da LPS. A différents instants, on prélève des parties aliquotes des milieux de culture et on détermine l'activite de NAP en terme de capacité à induire la liberation d'élastase à partir de neutrophiles humains prétraités avec de la cytochala-
EMI18.2
sine B (B. Dewald et coll., Biochem.
Pharmacol. 36 [1987] 2505-2510).
Des cultures de cellules mononucléaires (5x106 cellules/ml) constituées de monocytes et de lymphocytes en un rapport d'environ 1 : 5 produisent du NAP lorsqu'elles sont stimulées avec LPS (10 ng/ml). Le NAF s'accumule dans le milieu en 24 heures et la production se stabilise entre 24 heures et 48 heures. 11 ne se forme pas de NAF en l'absence de stimulus. La figure 1 montre les effets, en fonction du temps et de la concentration, de LPS dejä actif entre 0, 1 ng/ml et 1 ng/ml.
On étudie la source de NAF en utilisant différentes préparations de cellules mononucléaires. La figure 2a montre la production de NAP dépendant de LPS par la fraction totale des cellules mononucléaires et par les monocytes sélectionnés à partir de celle-ci par adhérence. Ces résultats confirment que la production de NAF dépend de LPS et indiquent que le NAF est produit par les monocytes. La présence
<Desc/Clms Page number 19>
de lymphocytes ne semble pas influencer la quantité de production de NAF. On obtient des résultats analogues avec des monocytes et des lymphocytes purifiés par elutriation. Comme l'indigue la figure 2b, le NAF est produit par les monocytes mais pas par les lymphocytes.
Exemple. 2 : production du NAF par des'monocytes humains stimulés par PHA ou ConA
EMI19.1
La fraction da cellules mononucleaires provenant de la couche leucocytaire du sang humain, séparée comme le décrit l'exemple l, est cultivée dans les conditions indiquées dans l'exemple 1 et stimulée avec PHA (5 @g/ml) ou ConA (10 #g/ml). La production de NAF en fonction du temps est analogue à celle observée avec les cellules mononucléaires sti- mulees par 100 ng/ml de LPS. Un maximum est atteint au bout de 24 heures.
Exemple 3 : inhibition de la production de NAF par le cycloheximide
Le fait que le NAF ne soit pas libéré immédiatement par stimulation des monocytes, mais au contraire apres une periode de plusieurs heures, suivant la concentration du stimulus, suggere qu'une fois encore la synthèse protéinique est nécessaire et que la production du NAF est en fait induite par le stimulus. La nécessité d'une synthèse protéinique est démontrée par les expériences dans lesquelles la production de NAF est inhibée par l'addition de cycloheximide.
Les résultats d'une expérience représentative sont in-
EMI19.2
digues sur le tableau 1.
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
Tableau 1
EMI20.2
<tb>
<tb> Innibition <SEP> de <SEP> la <SEP> production <SEP> de <SEP> NAF <SEP> par <SEP> le <SEP> cycloneximide
<tb> Traitement <SEP> Production <SEP> moyenne <SEP> de <SEP> NAF <SEP> après
<tb> 4 <SEP> h <SEP> 8 <SEP> h <SEP> 24 <SEP> h
<tb> Aucun <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> LPS <SEP> 726 <SEP> 2042 <SEP> 2633
<tb> LPS+CX <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> LPS+CX <SEP> A <SEP> 4 <SEP> h <SEP> 774 <SEP> 966 <SEP> 639
<tb> LPS+CX <SEP> 8 <SEP> h <SEP> 752 <SEP> 1884 <SEP> 1854
<tb>
Le cycloheximide (CX, 10 #g/ml) est ajouté 4 ou 8 heures apyres le LPS (100 ng/ml). L'activité est présentée en unités de fluorescence,
exprimant la libération d'elastase.
PARTIE 11 : purification du NAF Exemple 4 : séparation du NAF et de la IL-1 par chromatogra-
EMI20.3
phie sur phosphocellulosse
Des cellules mononucléaires obtenues à partir de la couche leucocytaire du sang d'un donneur, comme le décrit l'exemple 1, sont cultivées dans MEM-PPL pendant 48 heures, en présence de 100 ng/ml de LPS dans des bouteilles de culture agitées (1,5 litres, 5x106 cellules/ml). Les surnageants de culture sont ensuite recueillis, centrifuges à 20 000 t/min pendant 20 minutes a 40 pour éliminer le mat6riau particulaire, et chargés sur une colonne de 10 ml de phosphocellulose (Whatman Pll, 1, 4x6 cm), eguilibrée avec du tampon phosphate de potassium 20mM, pH 7, 2, contenant 20mM de NaCl et 5% de glycerol.
La colonne est lavée avec 30 ml du tampon ci-dessus, puis éluée avec 90 ml d'un gradient lizaire de concentration de NaCl (0,02M à 1,5M) dans le même tampon. Des fractions de 2 ml sont recueillies dans du poly- ethylene-glycol à 0,1% et testées pour déterminer l'activité de NAF et de IL-1. L'absorbance à 280 nm est surveillée en continu et constitue une mesure des protéines.
La figure 3 montre les profils de distribution des pro- tétines (absorbance a 280 nm) et deux activités biologiques, la liberation de l'élastase mesurant 1'activité de NAP et la
<Desc/Clms Page number 21>
proliferation des thymocytes mesurant l'activite de IL-1. La plupart des protéines, ainsi que l'activité de IL-1, se retrouvent dans le volume écoulé total* L'elution avec un gradient linéaire de NaCl donne une certaine activité de IL-1, à une force ionique faible, suivie d'un pie d'act té de
EMI21.1
liberation dlélastase correspondant au NAF, qui commence tu éluer à O, 5M et atteint son maximum à 0,8M de NaCl. Le pie est symétrique et est précédé d'un petit épaulement.
Une certaine matière absorbant les Vest fluée par le gradient salin ; son profil ne coincide toutefois pas avec les activi-
EMI21.2
tés biologiques déterminées. Comme l'indique la figure 3, IL-1 et NAF peuvent être complètement résolues. 11 n'y a pas d'activite de libération de l'élastase associée à Il-1 et pas d'activité produisant la proliferation des tymocytes associée A NAF. La recuperation du NAF par fractionnement est proche de 100%, ce qui snuggere que les milieux ne contiennent pas d'inhibiteurs ni d'activateurs.
Exemple 5 : purification de NAF par filtration sur gel
Un échantillon de 200 cl de NAF partiellement purifié par chromatographie sur phosphocellulose (exemple 4) est appliqué sur une colonne de CLHP TSK- G2000 SW (7,5x600 mm) avec une précolonne de TSK-GSWP (7, 5x75 mm). Dans la colonne, circule NaHP04 100mM, pH 7, 0, contenant lOOmM de NaCl, à un débit de 0, 5 ml/min. On utilise comme standards d'étalonnage de la sérum-albumine bovine (masse moleculaire 66200), de l'ovalbumine (masse moléculaire 42700), un inhibiteur de trypsine de soja (masse moleculaire 21500), de
EMI21.3
l'aprotinine (masse moléculaire 6500) et de l'actinomycin D (masse moleculaire 1255).
Le NAF lue avec un pic légèrement asymétrique juste après l'aprotinine et bien au-dessus de l'actinomycin D. La masse moléculaire apparente du NAF est donc environ de 6500. Aucune activité de NAF n'est éluée
EMI21.4
avant ou après 1e pie décrit (figure 4).
Exemple 6 : purification du NAF par l'hydroxylapatite Un regroupement de fractions obtenues par chromatogra-
<Desc/Clms Page number 22>
phie sur phosphocellulose (exemple 4), d'un volume total de 15 ml (correspondant à environ 800 ml de surnageant de culture non fractionné) est dilué au 1/10 avec du tampon de charge (10mM de phosphate de sodium, pH 6, 9, dans du poly- éthylène-glycol 6000 à 0, 1%) et chargé Bur une colonne de 3 ml d'hydroxylapatite (Biogel HTP) équilibrée dans le tampon de Charge. La colonne est lavée avec trois portions de 3 ml du tampon de charge, puis éluée avec le tampon de charge complémenté par NaCl IM. Par cette opération, on récupère le NAP de la colonne.
Une elution subsequente avec du tampon phosphate de sodium O,SM, pH 6,9, ne donne pas d'activite de NAF supplementaire (figure 5).
EMI22.1
Exemple 7 : purification de NAF par heparine-Sepharose
Un échantillon de 1 ml de NAF partiellement purifié par chromatographie sur phosphocellulose (exemple 4) est Charge sur une colonne de 0, 5 ml d'héparine-Sepharose 4B équilibrée dans du phosphate de sodium lOmM, pH 7, 3, complémenté par du polyéthylène-glycol 6000 a 0, 1% et du NaCl 50 mM. La colonne
EMI22.2
est lavée avec le même tampon, puis eluée avec du phosphate de sodium lOmM, pH 7, 3, complimenté par NaCl 1, 5M. Une quantité mineure de NAF est décelée dans le fluide écoule total, par lavage de la colonne, mais la plupart de l'activité llée à la colonne est 6lute avec le tampon de force ionique soupérieure (figure 6).
Exemple 8 : purification de NAF par chromatographie liquide haute pression en phase inverse sur colonne de C4
Un échantillon de NAF purifie par chromatographie sur phosphocellulose (exemple 4), puls par purification sur hydroxylapatite (exemple 6), est appliqué à une colonne de C4 en phase inverse à large pores (Biorad RP 304). La colonne
EMI22.3
est 6lute avec un gradient de 0 à 80% d'acétonltrile dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%, avec un accroissement de 0, 66%/min. Le debit est de 0, 5 ml/min. Les fractions sont recueillies et séchées sous vide. Los résidus sont remis en suspension dans 100 lil de PBS contenant 0, 1% de polyéthy-
<Desc/Clms Page number 23>
lène-glycol 6000 et testés pour determiner l'activité de NAF.
Le NAF élue avec un temps de rétention d'environ 60 minutes, ce qui correspond a environ 40% d'acétonitrile, sous forme d'un seul pic pointu (figure 7).
EMI23.1
Exemple 9 : purlfication de NAF par chromatographie liquide haute pression en Phase inverse sur colonne de CN-propyle
Un échantillon de NAF purifi6 par chromatographie en phase inverse comme le décrit l'exemple 8, séché sous vide et remis en suspension dans 100 #l de pas contenant 0, 1% de polyethylene-glycol, est dilue avec un volume d'acide trifluoroacétique à 0,1% et applique sur une colonne de cyano (CN)-propyle à large pores Bakerbond (Baker Research Products, Phillipsburg, NJ, USA). La colonne est éluée avec un gradient allant de 0 à 50% de n-propanol dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%, avec un accroissement de 0, 41%/ min. Le debit est de 0,5 ml/min. Les fractions sont recueillies et séchées sous vide.
Les résidus sont remis en suspension dans 100 #l de solution saline tamponnée au phosphate contenant 0, 1% de polyéthylène-glycol 6000 et testés pour determiner l'activité du NAF. Le NAF élue en deux pies pointus, un pic majeur ayant un temps de rétention de 53 min, correspondant à 22% de n-propanol, et un pie mineur représentant moins de 30% de l'activiste totale, avec un temps de retention de 66 min, correspondant à 27, 5% de n-propanol (figure 8).
EMI23.2
Exemple 10 : chromatofocalisation de NAF
Un échantillon de 4 ml de NAF partiellement purifié par chromatographie sur phosphocellulose (exemple 4) est dialyse contre un tampon de départ constitué de chlorhydrate d'étha-
EMI23.3
nolamine 25mM, pH 9, 4, et de 0, 1% de polyethylne-glycol 6000, et Charge sur une colonne de PBE 94 (0, 7x19 cm, Pharmacia) équilibrée aveo le même tampon. La colonne est ensuite eluee avec 200 ml de polytampon 96-HCl (dilue au 1/10 avec de l'eau), pH 7, 0, contenant 0, 1% de polyéthylèneglycol 6000. Des fractions sont recueillies toutes les 10
<Desc/Clms Page number 24>
minutes A un debit de 10-14 ml/h et dosées pour l'activit6 de NAF.
La plupart de l'activité elue dans la région de pH 8, 5 à pH 8, 8 (figure 9).
EMI24.1
PARTIEIII : Caracterjsation physicochnnique et biologique de NAF Exemple 11 : proprietes physicochimi < ? ues de NAF
Du NAP partiellement purifié obtenu par chromatographie sur phosphocellulose (exemple 4) est utilisé dans ces experiences. Apres la chromatographie sur phosphocellulose, les fractions ayant la plus forte activité de NAF sont dialysées pendant une nuit à 40 contre PBS au moyen d'une membrane présentant une coupure de masse moleculaire de 1000 daltons.
La préparation obtenue est ensuite soumise aux traitements suivants : a) incubation à 37 avec et sans trypsine, chymotrypsine ou proteinase K (100 p-g/ml), suivie de l'addition d'un excès de BSA (2 mg/ml) pour stopper la proteolyse de NAF ; b) chauffage à 560, 80 ou 95 (comparé à 22 pour le témoin) ; c) exposition à pH 2 ou 10 (ä 220), suivie d'un
EMI24.2
ajustement du pa & 7, 4 (en comparaison de pH 7, 4 pour le temoin) ; d) exposition au chlorure de lithium 2M, au chlorure de guanidinium GM, au 2-mercaptoéthanol a 1% ou au dodecylsulfate de sodium (SDS) a 0, 5% pendant 3 h A 220, suivie d'une dialyse pendant 24 h à 40 contre PBS.
Lorsqu'on effectue les additions, on manipule les échantillons sans NAF de la meme maière et on les teste pour étudier l'influence possible sur le dosage du NAF.
Comme l'indique le tableau 2, le NAF est remarquablement résistant à l'inactivation. Son activité est detruite
EMI24.3
par incubation avec différentes protéases, ce gui indique que le NAF est un polypeptide. En revanche, le NAF n'est pas facilement inactivé par des conditions de chaleur, de pH acide et alcalin ou par exposition au SDS. Une certaine inactivation est obtenue avec le 2-mercaptoethanol, le chlorure de lithium et le chlorure de guanidinium.
<Desc/Clms Page number 25>
rure de lithium et le chlorure de guanidinium.
Tableau 2
Propriétés physicochimiques de NAF
EMI25.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> Conditions <SEP> Activité
<tb> relative
<tb> Temperature <SEP> 220, <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 100
<tb> 56 , <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 82
<tb> 80 , <SEP> 15 <SEP> min <SEP> 80
<tb> 950, <SEP> 5 <SEP> min <SEP> 66
<tb> pH <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 220, <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 76
<tb> pH <SEP> 0,0 <SEP> 22 , <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 90
<tb> SDS <SEP> 0,5 <SEP> 22 , <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 100
<tb> 2-mercaptoéthanol <SEP> 1,0% <SEP> 22 , <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 30
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> lithium <SEP> 2M <SEP> 220, <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 52
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> guanidinium <SEP> 6M <SEP> 220, <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 68
<tb> trypsine <SEP> 100 <SEP> #g/ml <SEP> 37 , <SEP> 4 <SEP> h <SEP> 100
<tb> 370, <SEP> 12 <SEP> h <SEP> 8
<tb> a-chymotrypsine <SEP> 100 <SEP> #g/ml <SEP> 370,
<SEP> 4 <SEP> h <SEP> 80
<tb> 370, <SEP> 12 <SEP> h <SEP> 1
<tb> protéinase <SEP> K <SEP> 100 <SEP> #g/ml <SEP> 370, <SEP> 12 <SEP> b <SEP> 0
<tb>
Exemple 12 : exocytose induite par le NAF (induction de la libération des granulations par le NAP dans les neutrophiles humains)
Des neutrophiles (Sxl06/ml) en suspension dans PBS/BSA sont préincubés avec ou sans cytochalasine B (5 #g/ml) à 370 pendant 5 min. La libération des granulations est ensuite amorcée par addition du stimulus, par exemple un NAF ou un stimulus étalon. La réaction est stoppée 15 minutes plus tard par refroidissement rapide dans de la glace, suivie d'une centrifugation pour sédimenter les cellules.
Les taux de protéines liées à la vitamine B12, de ss-glucoronidase et de lactate-déshydrogénase sont determines dans les milieux
<Desc/Clms Page number 26>
acellulaires et les culots cellulaires, et la libération de ces constituants est calculée en pourcentage de la teneur cellulaire totale (B. Dewalt et M. Baggiolini, Methods Enzy-
EMI26.1
mol. 132 [1986] 267).
Les effets du NAF sur la libération des protéines liées à la vitamine B12 et de la ss-glucoronidase-qui sont respectivement les constituants des granulations spécifiques et azurophiles - sont résumés sur le tableau 3.
Tableau 3 Exocytose dependant d'un stimulus des granulations des neu- trophiles humains
Pourcent de libération de
EMI26.2
<tb>
<tb> Stimulus <SEP> CB
<tb> Protéines <SEP> lides <SEP> ss-glucu-lactate-
<tb> à <SEP> la <SEP> vitamine <SEP> B12 <SEP> ronidase <SEP> deshydrogenase
<tb> aucun-6. <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 2. <SEP> 1 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 6. <SEP> 2i2.
<SEP> 5
<tb> NAF <SEP> 50 <SEP> #l <SEP> - <SEP> 12.9 <SEP> ¯ <SEP> 1.6 <SEP> 2.7 <SEP> ¯ <SEP> 1.3 <SEP> 5.8 <SEP> ¯ <SEP> 0.7
<tb> NAF <SEP> 100 <SEP> #l <SEP> - <SEP> 13.9 <SEP> ¯ <SEP> 2.1 <SEP> 3.0 <SEP> ¯ <SEP> 1.3 <SEP> 6.8 <SEP> ¯ <SEP> 2.2
<tb> fMLP <SEP> 0,1 <SEP> #M <SEP> - <SEP> 14.0 <SEP> ¯ <SEP> 0.9 <SEP> 2.3 <SEP> ¯ <SEP> 0.8 <SEP> 5.7 <SEP> ¯ <SEP> 1.1
<tb> aucun <SEP> + <SEP> 10.0 <SEP> ¯ <SEP> 1.1 <SEP> 2.4 <SEP> ¯ <SEP> 0.2 <SEP> 7.0 <SEP> ¯ <SEP> 3.2
<tb> NAF <SEP> 50 <SEP> til <SEP> + <SEP> 25.
<SEP> 6 <SEP> ¯ <SEP> 3.4 <SEP> 7.9 <SEP> ¯ <SEP> 2.0 <SEP> 6.7 <SEP> ¯ <SEP> 1.6
<tb> NAF <SEP> 100 <SEP> #l <SEP> + <SEP> 26.8 <SEP> ¯ <SEP> 4.9 <SEP> 8.5 <SEP> ¯ <SEP> 1.7 <SEP> 7.3 <SEP> ¯ <SEP> 2.1
<tb> fMLP <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> uM <SEP> + <SEP> 35.6 <SEP> ¯ <SEP> 5.5 <SEP> 12.1 <SEP> ¯ <SEP> 4.4 <SEP> 5.3 <SEP> ¯ <SEP> 1.6
<tb>
valeurs moyennes ¯ écart type
Dans les neutrophiles normaux, le NAF induit l'exocytose des seules granulations spécifiques. Lorsque les cellules sont prétraitées avec de la cytochalasine B, on obtient toutefois une importante libération des deux types de granulations.
Dans ces dernières conditions, il y a un parallèle entre la libération de la ss-glucoronidase et celle de l'elastase, marqueur utilise pour tester l'activiste du NAF (exemple 1). En termes quantitatifs, les propriétés du NAF induisant l'exocytose sont analogues à celles du peptide chimiotactique fMLP. Aucun des stimuli ne provoque la libé-
<Desc/Clms Page number 27>
qui indique que le dommage cellulaire est négligeable.
Exemple 13 : éclatement respiratoire induit par le NAF (induction de la formation de superoxide par le NAF dans les neutrophiles humains)
La formation de superoxide est mesurée à 370 par la réduction, sensible au SOD, du ferricytochrome c (M. Markert et coll., Methods Enzymol. 132 [1984J 267). Le melange dosé (800 ul) est constitué par 0,75x106 cellules/ml de PBS-BSA contenant 85 #M de cytochrome c. Les changements d'absorbance sont enregistres sur un spectrophotomètre à rangées de diodes Hewlett-Packard 8451A equipe d'un échangeur de cellules thermostaté à sept places. Le tableau 4 illustre la capacité du NAF A provoquer l'éclatement respiratoire dans les neutrophiles humains.
Tableau 4
Production da superoxyde dependant de NAF par les neutrophileshumains
EMI27.1
<tb>
<tb> Réduction <SEP> du <SEP> cytochrome <SEP> a <SEP> <SEP> t
<tb> NAF <SEP> Vitesse <SEP> maximale <SEP> Total <SEP> en <SEP> 3 <SEP> min
<tb> (#l) <SEP> (nmole/min) <SEP> (nmole)
<tb> 5 <SEP> 0.81 <SEP> 0.89
<tb> 10 <SEP> 1. <SEP> 45 <SEP> ¯ <SEP> 0.63 <SEP> 1.45 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 50
<tb> 20 <SEP> 2. <SEP> 32 <SEP> 0. <SEP> 56 <SEP> 2. <SEP> 16 <SEP> 0. <SEP> 39
<tb> 30 <SEP> 2. <SEP> 51 <SEP> 0. <SEP> 50 <SEP> 2. <SEP> 30 <SEP> 0. <SEP> 55
<tb> 50 <SEP> 3. <SEP> 51 <SEP> 0. <SEP> 69 <SEP> 3. <SEP> 10 <SEP> 0. <SEP> 55
<tb> 100 <SEP> 3. <SEP> 69 <SEP> 3.
<SEP> 39
<tb>
EMI27.2
+ toutes les valeurs sont exprimees pour 106 cellules valeurs moyennes i ecart type On obtient une augmentation progressive de la vitesse maximale et de la quantité totale de production de superoxyde lorsque les quantités de NAF augmentent. Comme le mon- trent les expériences comparatives, les quantités de NAF provoquant les taux maximum de production de superoxyde correspondent a celles qui induisent l'exocytose maximale.
<Desc/Clms Page number 28>
respondent à celles qui induisent l'exocytose maximale.
Exemple 14 : formation de H2O2 (comparaison de NAF avec fMLP et C5a comme stimuli de l'éclatement respiratoire dans les neutrophiles humains) 'Les propriétés de NAF, fMLP et C5a comme stimuli de l'éclatement respiratoire sont comparées au moyen de l'évaluation de la production de superoxyde ou de peroxyde d'hydrogene par les cellules stimulées. La formation de superoxyde est déterminée comme le décrit l'exemple 13. La formation de peroxyde d'hydrogène est déterminée par chimioluminescence (M. P. Wymann et coll., Anal. Biochem. 165 [1987) 371-378).
Le melange dosé, constitué de PBS-BSA contenant O,lM d'azoture de sodium, 0, 01mM de luminol, 9 U/ml de peroxidase de raifort et 106 neutrophiles, est préincubé pendant 10 min à 370 et la réaction est démarrée par addition du stimulus à l'aide d'une microseringue.
La figure 10 montre la formation de superoxyde induite par l'elevation des quantités de NAF. Du fait de son démarrage rapide, de sa vitesse élevée et de sa stabilisation précoce, la réponse au NAF ressemble étroitement à celle produite par fMLP ou C5a. La réponse au NAF est remarquablement améliorée par prétraitement des cellules avec un PAF (figure 10), qui améliore egalement la production de superoxyde induite par fMLP ou C5a. Une comparaison directe des réponses à NAF, fMLP et C5a est indiquée sur la figure 9.
Les enregistrements par chimioluminescence de la vitesse de formation de HO en fonction du temps soulignent les similitudes des réponses. Ces mesures, ainsi que d'autres, montrent en outre que le temps entre l'addition du stimulus et le début de la production de H202 induite par NAF, fMLP et C5a a des valeurs identiques et est d'environ 2 s, comme
EMI28.1
il a été rapporté anterieurement pour fMLP, CSa, PAF et le leukotriène B4 (M. P. Wymann et coll., J. Biol. Chem. 262 [1987] 12048). Les analogies qualitatives et quantitatives de la réponse des neutrophiles au NAF, au fMLP et au C5a in-
<Desc/Clms Page number 29>
diquent que le NAF active les neutrophiles en se liant A un récepteur de surface et se comporte ainsi comme un agoniste récepteur.
Exemple 15 : distinction entre NAF et C5a
Comme l'indique l'exemple 14, le profil d'activité du NAF vis-à-vis des neutrophiles humains est analogue à celui de la CSa. Les analogies entre ces deux peptides s'étendent aux propriétés physicochimiques discriminatoires comme la résistance à la chaleur et aux acides. Comme la C5a et le NAF ont des effets analogues sur les neutrophiles, il faut effectuer d'autres experiences pour distinguer entièrement entre les deux. Des échantillons de NAF et de C5a sont exposes a du sérum humain frais. On sait que ce traitement transforme la C5a en son derive désarginylique relativement inactif par clivage à travers une carboxypeptidase.
Comme le montre la figure 11, le traitement au sérum abolit completement l'activité de la C5a mais n'affecte pas celle du NAF.
Cela montre que les deux agents ont des structures différentes.
Exemple 16 : preuve que le NAF possède son propre récepteur spécifique sur les neutrophiles
Lorsqu'on stimule des neutrophiles deux fois avec une meme quantité du tneme agoniste récepteur (par exemple fMLP) et que l'on enregistre la production de superoxyde comme mesure de la réponse des neutrophiles, la seconde stimulation est pratiquement inactive. En revanche, lorsqu'on utilise l'un après l'autre des agonistes agissant sur différents récepteurs (par exemple la fMLP suivi de la C5a) ces stimulations donnent une réponse normale. Des experiences de ce type sont donc utilisées pour déterminer si le NAF agit par son propre récepteur ou par un récepteur également utilise par d'autres agonistes.
La figure 12a montre que les neutrophiles répondent normalement à la fMLP après une première provocation avec le NAF ou la C5a. Sur la figure 12b, sont indiques les résul-
<Desc/Clms Page number 30>
tats d'une stimulation repétée avec le NAF et la CSa. Les cellules sont stimulées d'abord avec le NAF et la C5a à des concentrations qui provoquent environ la même quantité de formation de superoxyde, puis une seconde fois avec le même stimulus ou l'autre stimulus. Lorsqu'on applique deux fois le même agoniste, les cellules ne répondent pas A la seconde stimulation. En revanche, on obtient une réponse normale à la C5a dans les cellules provoquées d'abord avec le NAF et au NAF dans les cellules provoquées d'abord avec la CSa.
Comme les neutrophiles présentent une désensibilisation complète a. l'un ou l'autre Stimulus, mais pas de désensibilisation croisée, le NAF et la C5a semblent exercer leurs effets stimulants via des récepteurs non apparentes, ce qui indique qu'ils sont de structure differente. Des combinaisons du NAF avec le PAF, la fMLP et le leucotriène B4 ne donnent pas non plus de désensibilisation croisée. NAF agit donc par l'in- termédiaire d'un récepteur sélectif, inconnu jusqu'à présent.
Exemple 17 : accumulation des neutrophiles et fuite plasmatique induites par 1e NAF chez le lapin
On examine les reponses inflammatoires dans la peau de lapins albinons néo-zélandais conscients de 2, 0 à 2, 5 kg.
Les érythrocytes dans le sang des lapins donneurs sont sédimentes avec de l'hydroxyethylcellulose (Polysciences, War- rington, Pa. ) et les neutrophiles contenus dans le plasma résultant riche en leucocytes sont purifiés ( > 94% de neutrophiles) par centrifugation à gradient de densité, sur Percoll (Pharmacia, Uppsala, Suède). Les cellules sont remises en suspension dans un solution de Tyrode exempte de Ca2+ et de Mg2+, contenant du plasma pauvre en plaquettes à 10% en concentration de 106 leucocytes/ml et marquée pendant 15 min a la température ambiante avec 40 iCi de lllindium-oxine (Amersham) pour 106 cellules.
Les cellules marquees sont lavees par centrifugation à travers un plasma pauvre en plaquettes à 10% et environ 106 cellules par récipient sont me-
<Desc/Clms Page number 31>
langees avec 10 llci de sérum-albumine humaine marquee à l'iode 125 (Amersham) et injectées par voie intraveineuse dans la veine auriculaire latérale des lapins dont on étudie les lésions inflammatoires. On effectue ensuite des injections intradermiques d'agents inflammatoires et on sacrifie les animaux 2 h plus tard dans les etudes avec l'actinomyci- ne D et la polymyxine B et 4 h plus tard dans les expe- riences de relation dose-effet.
Au milieu de la période pendant laquelle les cellules radiomarqées sont en circulation, on effectue un prélèvement de sang et on determine les activités spécifiques des neutrophiles et du plasma dans le sang. La radioactivité dans les lesions inflammatoires, AL la fin de chaque expérience, est déterminée dans un compteur gamma multicanaux, l'activiste dans les sites cutanés témoins est soustraite et le nombre absolu de neutrophiles et le volume de plasma accumulé dans les lésions inflammatoires sont calculés pour les activités spécifiques. Les nombres de neutrophiles dans les lésions inflammatoires sont normalisés entre les animaux par expression des résultats en nombre de
EMI31.1
cellules par 106 neutrophiles circulant par ml de sang péri- sphérique, selon la methode de Cybulsky et coll., Am.
J.
Pathol. 124 [1986] 367.
Le NAF recombinant obtenu comme le décrit l'exemple 19 est dissous à 400 ug/ml dans un milieu essentiel minimal (50mM) plus 0, 45M de NaCl (pH 6, 5). De l'endotoxine (E. coli sérotype 055 : B5, Sigma, St. Louis, Mo.) est dissous dans du serum physiologique normal apyrogène. De la fMLP est dissoute dans du diméthylsulfoxyde à 10-2M et diluée jusqu'aux concentrations de travail dans PFS. On dissout de la poly-
EMI31.2
myxine B et de l'actinomycine D dans 1 ml d'ethanol et on dilue 20 fois en mélangeant avec le NAF, l'endotoxine ou la fMLP dans PFS. Dans les études sur l'inhibition des réponses inflammatoires, on injecte 40 ug de polymixine B et 10-7 moles d'actionomycine D par site cutané avec 10-6 moles d'endotoxine.
Dans toutes les experiences, on injecte par
<Desc/Clms Page number 32>
voie intradermique 0, 2 ml d'agents inflammatoires par site à travers des aiguilles de diamètre 26, en faisant 5 injections de chaque traitement pour chaque animal.
Le NAF induit une augmentation, dépendante de la dose, de la fuite plasmatique (figure 16) et une accumulation des neutrophiles (figure 17) sur la gamme de doses tes. tees (10-11 à 10-9 moles par site). A titre comparatif, l'endotoxine provoque une fuite plasmatique (figure 16) et une accumulation des neutrophiles (figure 17) d'intensité comparable, à 10-13 moles par site. Chez 5 lapins, le NAF est 3 à 10 fois plus puissant que la fMLP, comme stimulus pour la fuite plasmatique et l'accumulation des neutrophiles. L'ac- cumulation des neutrophiles induite par dilution du tampon utilisé pour dissoudre le NAF jusqu'a la concentration présente dans les solutions fournissant 10-9 moles par site ne diffère pas des réponses données par les sites ne recevant que PSF seul.
La possibilité que l'activité de la préparation du NAF puisse être due A une impureté endotoxine est examinée par injection de polymyxine B (40 ug/site) avec du NAF, de la fMLP ou de l'endotoxine. La polymyxine B provoque une inhibition de 84% de la réponse A l'endotoxine (10-13 moles) mais est sans effet sur l'accumulation des neutrophiles induite par le NAF (10-9 moles) ou la fMLP (10-9 moles) (figure 18).
L'injection d'un inhibiteur non réversible de transcription d'ARN, l'actinomycin D (10-7 moles/site), avec 10-13 moles d'endotoxine, provoque une inhibition de 90% de l'accumulation des neutrophiles (figure 19). En revanche, l'actinomycin D n'a aucun effet sur l'accumulation des neutrophiles induite par le NAF (10-9 moles) ou par la fMLP (10-9 moles) (figure 19).
Les résultats indiquent que le NAF est actif in vivo et induit une accumulation, dependante de la dose, des neutrophiles et une fuite de plasma dans les lésions inflammatoires. L'activité molaire du NAF est comparable à celle
<Desc/Clms Page number 33>
élevée que celle de la fMLP. L'accumulation des neutrophile induite par le NAF n'est pas inhibée par injection intrader mique simultanée d'un inhibiteur de synthèse proteinique (actinomycine D). Le NAP agit ainsi directement, come un agoniste chimiotactique tel que fMLP et contrairement à l'endotoxine.
Exemple 18 : exocytose induite par le NAF (effet sur les neutrophiles du lapin) :
Des neutrophiles de lapin sont isoles du sang périphé-
EMI33.1
rigue (obtenu de la veine auriculaire ou de l'arterie auricu laire) par sédimentation dans du dextran, suivie d'une centrifugation A gradient de densité de Hypaque-Ficoll. On utl lise un NAF naturel purifié.
Conditions d'exocytose : 0, 6 x 105 cellules (dans un volume total de 0, 15 ml) prétraitées avec de la cytochalasine B pendant 5 minutes à 370 sont stimulées avec du NAF 0,1 - 100 nM) ou de la fMLP (100 mM) pendant 15 min. On dose, dans le milieu acellulaire, la N-acetyl-ss-glucosamini dase, qui est un marqueur de granulations azurophiles. Les résultats sont indiqués sur le tableau 5.
Tableau 5
Exocytose induite par NAF
EMI33.2
<tb>
<tb> stimulus <SEP> Concentration <SEP> N-acdtyl-p-glucosaminidase
<tb> (11M) <SEP> (pmole/minJ
<tb> aucun <SEP> 41
<tb> NAF <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 53
<tb> 1. <SEP> 0 <SEP> 99
<tb> 10. <SEP> 0 <SEP> 139
<tb> 100. <SEP> 0 <SEP> 157
<tb> fMLP <SEP> 100. <SEP> 0 <SEP> 181
<tb>
EMI33.3
PARTIE IV :
NAF Recombinant Exemple 19 : synthese et expression de NAF dans E. coli a) Synthèse et purification des oligonucléotides
Les oligonucléotides ON-1 A ON-6 (voir figure 13) sont synthétisés dans un synthétiseur d'ADN automatisé au moyen
<Desc/Clms Page number 34>
EMI34.1
d'une cninn. c scanaara avec, commc monomcres, aes nucj-eosmu ( de 3'-ss-cyanoéthyl-N, N-d1isopropylphosphoamidite, Bur un support solide comme du gel de silice Fractosil ou du verre poreux cdontrôlé (VPC) (S. L. Beaucage et M. H. Caruthers, Tetr. Letters 22 [1981] 1859 ; N. D. sinha et coll., Nucleic Acides Res. 12 [1984] 4539).
Les matieres detritylees sont séparées du support par un traitement de 2 heures avec de l'ammoniaque a 25% à la température ambiante, tous les groupes protecteurs sont élj minés par chauffage de la solution ammoniacale pendant 20 heures à 550 et les produits sont lyophilisés. La séparatic des matieres brutes s'effectue par électrophorèse sur gel d
EMI34.2
polyacrylamide (PAGE) avec 12% d'acrylamide, 0, 3% de bisacrylamide, 7M d'urée, O, 089M de tris-borate, 0,08iM d'acid borique, 0, 002M d'EDTA a 20 V/cm.
Les oligonucleotides entiers sont localises par image UV sur des plaques de gel de silice fluorescent, les parties comportant les gels sont d coupés et electro-fluées dans une chambre d'elution. Les sc lutions concentrées sont dessalées sur une colonne de Bioge P2 (30x0,9 cm), par élution avec de l'éthanol à 10%, et lyc philisées. Les échantillons de ON-1 à ON-6 sont marqués radioactivement avec 32p-γ-ATP et de la polynucleotide-kinase L'analyse par PAGE et l'autoradiographie confirment qu'elle sont homogenes. Les séquences correctes sont confirmées par
EMI34.3
sequenage de Maxam-Gilbert et les oligonucleotides sont in mobilises sur un papier filtre modifié (A.
Rosenthal et coll., Nucleic Acids Res. 13 [1985] 1173-1184). b) Recuit et ligature
Pour le recuit et la ligature, des portions de 250 pmoles des oligonucléot1des sont phosphorylées avec 4 #Ci d 32p-ATP (5000 u-Ci/mmole) et 9 unites de polynucleotide-ki- nase dans 20 #l de tampon kinase (T. Maniatis et coll., Molecular Cloning, A Laboratory Manual [1982], Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.) pendant 40 min ä 37% opération suivie d'une poursuite de 20 min avec 5 mmoles d'ATP non
<Desc/Clms Page number 35>
marque. La reaction est stoppée avec 1 #l d'EDTA 0,5M à 70 .
Les oligonucléotides phosphoryles sont purifies par adsorption sur des cartouches de NENSORB 20 (Du Pont) et elution
EMI35.1
avec de l'Äthanol à 20% et le rendement est d'environ 90%. Le recuit et la ligature simultanés de quantities égales de 30 A 100 pmoles de ON-2 a ON-5 5'-phosphoryles et de ON-1 et ON-6 non phosphoryles s'effectue dans 25 #l de tampon (125 mM Tris-HC1, pB 7, 6) contenant 25nM de MgCl2. Le melange est chauffe à 900 pendant 4 min, refroidit à 14 en 3 h et in-
EMI35.2
cub6 pendant 14 h supplémentaires Ei 140. Le volume est ajusté à 60 lil avec 50nM de Tris-HC1, pH 7, 6, 10mM de MgC12, lOmM de dithiothréitol, lmM d'ATP, 0, 1 mg/ml de serum-albumine bovine contenant 1600 à 2000 unités de T4-ligase.
La ligature est réalisée pendant 14 h à 140 et stoppée par addition de 1 cl d'EDTA O, 5M et chauffage a 700. Apres extrac- tion au phénol, la solution aqueuse est amend à 0,3 d'acétate de sodium, 0,01M d'acétate de magnésium, l'ADN est pre- capité avec de l'ethanol et les produits sont purifiés par PAGE (8% d'acrylamide, urée 7M) avec une charge maximale de 10 pmoles d'ADN par fente de 1, 5 cm d'un gel de 0,5 mm d'épaisseur.
Le produit de longueur correcte est identifie par autoradiographie, le segment de gel est excisé et l'ADN
EMI35.3
est electroelue pendant 6 h à 200 V dans du Biotrap BT100 et précipité dans ltéthanol, pour donner un rendement final de 5 à 8 pmoles d'ADN, double brin purifie par 100 pmoles d'oligonucleotide. c) Clonage du gène synthétique
Un échantillon de 110 ng du gène de NAF synthetique insolé est ligature avec 260 ng d'ADN plasmide pBS M13 decoupé par SpHI/BamHI purifié sur gel d'agarose (Stratagene). Un dixième de ce mélange de ligature est utilisé pour transformer 200 ut de cellules SK de souche E. coli rendues compétentes par la méthode de D. Hanahan, J.
Mol. Bjol. 166 [1983] 557-580 et environ 320 colonies résistantes à l'ampicilline sont produites par ng d'ADN fourni. Six clones
<Desc/Clms Page number 36>
sont choisis et cultives pendant une nuit dans un milieu bouillon L/ampicilline. L'ADN plasmide est préparé (H. c. Birnbolm et J. Doly, Nucleic Acids Res. 1 [1979] 1513-1523)
EMI36.1
et appliqué sur du gel d'agarose à 1%. De l'ADN pur enroulé en super-hélice est isole par électrophorèse des bandes dans du papier 3MM (Whatman) et centrifugation dans des tubes d'Eppendorf. Apr & s extraction au phénol et precipitation dans l'éthanol, l'ADN est séquencé par la methode de termi-
EMI36.2
naison des chaînes plastnidiques dénaturées par une base, au moyen d'amorces T3 et T7 (stratagene) et de l'enyjne sequenase (E. J.
Chen et coll., DNA j4 [1985} 165-170).
Parmi les 6 clones, trois, à savoir les clones 1, 2 et 6, contiennent la sequence de NAF correcte. Les trois autres clones comportent des erreurs : le clone 3 contient un résidu G supplémentaire inséré après le codon d'initiation ATG, ce gui fait que la totalité de la séquence de codage est déphasée. Dans le clone 5, Cast remplacé par T en position 34, ce qui fait qu'un codon d'arret se forme après l'acide aminé nO 6. Enfin, le clone 4 n'a pas de G en position 13. Cette position ne figure pas dans la sequence codante mais dans la région entre le codon d'initiation et le site de liaison au ribosome.
Le plasmide contenant la séquence correcte (clone 6) est découpé avec les enzymes de restriction Clal et BamHI et le fragment à 237 bp est isolé du gel d'agarose par elution dans. du papier 3 MM comme ci-dessus. Ce fragment est ensuite ligature à un fragment dtADN linéaire contenant, de gauche à droite : - un site d'endonucléase de restriction BamHI ; - une séquence de terminaison de transcription synthétique (CCCGGGCGATGAATCGCCCGGGouCCCGGGCGATTCATCGCCCGGG); - une section de plasmide pAT153, depuis le site SalI au nu- cleotide nO 651, en passant par l'origine de replication et le gène de résistance à l'ampicilline, jusqu'au site EcoRI au nucléotide nO 0 ;
<Desc/Clms Page number 37>
- le promoteur E. coli tryptophane ;
- un site ClaI situé approximativement à 5 paires de bases en aval du site de liaison au ribosome dans le promoteur.
Leplasmided'expressionrésistantàl'ampicillinerésultant, désigné par p (NAF). 6T3 (figure 14) est transform6 en cellules E. coli de souche HB101.
- La sequence do terminaison do la transcription n'est pas essentielle pour l'expression de NAF dans E. coli. Elle permet une interruption efficace de l'ARNm-NAF produit par la E. coli-polym6rase et acoroît ainsi le rendement de l'expression. Le NAF peut cependant aussi être exprimé dans le même vecteur sans la séquence de terminaison de la transcription, mais le rendement est alors, cependant, 30 A 50% plus faible.
Ce gène synthétique codant pour le NAF, ainsi que d'autres gènes codant pour la même séquence peptidique de base, mais ayant une séquence nucldotidigue différente ou codant pour des peptides de longueurs variables, peut également etre exprimé dans E. coli à l'aide d'autres promoteurs, par exemple les promoteurs lambda PL ou les promoteurs E. coli Lac OU Tao. Les gènes peuvent également être introduits à l'aide d'autres vecteurs et exprimes dans d'autres organismes, par exemple dans des levures, des champignons, des cellules animales, des lignées cellulaires bactériennes, des végétaux et dans des organismes transgenigues supérieurs.
EMI37.1
c) Expression
L'expression de p (NAF)-6T3 dans E. coli HB 101 est ef- fectuee de la manière suivante.
Preculture 1 : on ajoute 50 #l d'une culture dans le glyce-
EMI37.2
rol de la lignée cellulaire maintenue au 10 ml de milieu LB sterile (10 g/l de tryptone, 5 g/l d'extrait de levure, 10 g/l de NaCl) contenant 10 9/ml d'ampicilline. La culture est agitée dans un incubateur pendant 8 h à 370 et à 200 t/min.
Preculture 2 : 8 ml du milieu de préculture 1 sont inoculés
<Desc/Clms Page number 38>
Préculture 2 : 8 ml du milieu de précu1ture 1 sont inoculés dans 1 1 de milieu M9 (J. H. Miller Experiments in Molecular Genetics [1972), Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., p.
431-433) contenant 0, 2% de glucose, 0, 5% de casaminoacides (Difco), 25 mg/l de tryptophane et 100 mg/ml d'ampicilline. Cette culture est agitée dans un incubateur pendant 15-16 h
EMI38.1
a 370 et à 200 t/min. Fermentation : la fermentation principale est effectuée dans un fermenteur de 70 l, à un volume de travail de 35 1. On
EMI38.2
utilise le même milieu que pour la préèu1ture 2, sauf que l'on n'ajoute que 5 mgll de triptophane. On inocule la préculture 2 dans ce milieu et on poursuit la fermentation a 37"jusqu'à ce que l'on obtienne une densité optique de 2, 8 à 600 nm (DO600). Lorsque la DOgoo atteint 2, 8, on ajoute de l'acide indole-acrylique dans de l'ethanol jusqu'à une concentration finale de 20 mg/l.
Au bout de 4 h, la D0600 est passee à 13, 5 ; la centrifugation donne un culot de 516 g. d) Purification du NAF recombinant
Des cellules de E. coli contenant du NAP recombinant sont stockées à -200. Des lots de 100 g sont lavés avec 100 ml de Tris-HCl 20mM, pH 8, 0, contenant 50mM de NaCl, remis en suspension dans 250 ml du même tampon et rompus sous 2500 psi dans une presse française (Aminco). Après centrifugation à 47 OOOxg pendant 40 min, le culot est remis en suspension dans le meme tampon, recentrifugé et stocké à -200. Des portions de 10 g sont mises en suspension dans 100 ml de MESNaOH 50rum, pH 6, 5, 6M de chlorhydrate de guanidine, agitées pendant 1 h et dialysées contre de l'acide acétique a 0, 5%.
Le dialysat est clarifié par centrifigation et chargé. en parties aliquotes sur une colonne de Mono-S (HR 5/5, Pharmaeia). La colonne est lavée avec MES-NaOH 50mM, pH 6, 5,
EMI38.3
contenant 0, 2M de NaCl, et éluee à une vitesse de 0, 5 ml/min avec un gradient linéaire dans le même tampon (0, 2 à O, 5M de NaCl). Les fractions ayant la teneur en NAF la plus levee
<Desc/Clms Page number 39>
EMI39.1
en phase inverse à larges pores (Vydac C4TP 0, 46x125 mm) dans de l'acide trifluoroacetique A 0, 1% et avec un gradient de 20 at 60% d'ac6tonitrile, à un débit de 1 ml/min.
PARTIE V : Identite du NAF naturel et du NAF recombinant Exemple 20 : identité physicochimigue
Le NAF récupéré par CLHP (voir exemple 19) est considéré comme étant pur sur la base de deux critères : des gels de SDS-polyacrylamide colorés à l'argent présentent une seule bande coïncidant avec le NAF naturel (1 #g de NAF recombinant provenant de la fraction du pic CLHP dans la bande 2 contre 1 #g de NAF naturel dans la bande 3, avec les étalons de masse moléculaire cytochrome c [12,5 kd] et aprotinine [6, 5 kd] dans la bande 1), et la degradation d'Edman du peptide segmenté à l'acide formique donne des seguences aminoterminales et carboxyterminales correspondant à celles du NAF naturel a 72 acides amines.
L'analyse des acides amines est en accord avec la composition attendue de la séquence.
EMI39.2
On ne trouve pas de méthionine, ce qui indique que ce residu est probablement éliminé par les bactériens.
Exemple 21 : identl. te biochintigue
Du NAF naturel et du NAF recombinant sont testés en parallèle sur des neutrophiles humains. Ils provoquent des changements pratiquement identiques de Ca2+ libre cytosolique, donnant une élévation maximale A une concentration aussi faible que 3nM (figure 15). On obtient avec les deux préparations une réponse à l'éclatement respiratoire dépendant de la concentration presque identique dans l'intervalle de 1 à 30nM évaluée par chimioluminescence. L'eguiva- lence entre le NAF naturel et le NAF recombinant est egalement reflétée par des mesures de chimiotaxie et d'exocytose.
La migration chimiotactique s'observe entre 0, 1 et 10nM, avec un effet maximal à InM (tableau 6). Avec l'un ou l'autre peptide, on observe une liberation significative de proteine lide A la vitamine B12 a partir des granulations spécifiques à 0,3nM et de la ss-glucuronidase A partir des
<Desc/Clms Page number 40>
EMI40.1
specifiques à 0, 3nM et de la ss-glucuronidase à partir des granules azurophiles à lnM. Cet effet augmente avec la concentration du stimulus, comme l'indique le tableau 7.
Tableau 6 Chimiotaxie des neutrophiles induite par le NAF
EMI40.2
<tb>
<tb> NAF <SEP> (nM) <SEP> nat <SEP> rec
<tb> 0. <SEP> 1 <SEP> 98 <SEP> ¯ <SEP> 6 <SEP> 88 <SEP> ¯ <SEP> 6
<tb> 1. <SEP> 0 <SEP> 123 <SEP> 6 <SEP> 124 <SEP> t <SEP> 3
<tb> 10.0 <SEP> 127 <SEP> ¯ <SEP> 3 <SEP> 126 <SEP> 4
<tb>
EMI40.3
Les valeurs représentent les moyennes i écart type de migra- tion du front d'attaque, en #m (n=3). La migration aléatoire en l'absence d'un stimulus chimiotactique est de 61 ¯ 5 ze nat = NAF naturel rec = NAF recombinant
Tableau 7 Exocytose induite par le NAF
EMI40.4
<tb>
<tb> Proteine <SEP> liée <SEP> ä <SEP> la <SEP> vitamine <SEP> B12 <SEP> ss-glucuronidase
<tb> NAF <SEP> (nM)
<SEP> nat <SEP> rec <SEP> nat <SEP> rec
<tb> 0.3 <SEP> 7.8 <SEP> ¯ <SEP> 3.6 <SEP> 5.4 <SEP> ¯ <SEP> 2.0 <SEP> 1.1 <SEP> ¯ <SEP> 0.8 <SEP> 0.8 <SEP> ¯ <SEP> 0.6
<tb> 3. <SEP> 0 <SEP> 21. <SEP> 9 <SEP> i <SEP> 4. <SEP> 2 <SEP> 20. <SEP> 2 <SEP> i <SEP> 3. <SEP> 7 <SEP> 8. <SEP> 2 <SEP> j <SEP> : <SEP> 1. <SEP> 9 <SEP> 7. <SEP> 1 <SEP> 1. <SEP> 7
<tb> 30.0 <SEP> 28.4 <SEP> ¯ <SEP> 3.7 <SEP> 28.1 <SEP> ¯ <SEP> 3.8 <SEP> 14.2 <SEP> ¯ <SEP> 2.1 <SEP> 12.9 <SEP> ¯ <SEP> 2.9
<tb>
EMI40.5
Le pourcentage de libération à partir de neutrophiles prétraités à la cytochalasine B (4x106 cellules/ml) est stimule pendant 10 min avec du NAF naturel (nat) oudu NAF reccm- binant (rec). La libération provenant des témoins non stimules correspondants est déduite. Moyennes ¯ écart type (n=3).