BE1003990A5 - Methode pour le dosage d'acides nucleiques, combinaison de reactifs et trousse pour doser ces acides. - Google Patents

Methode pour le dosage d'acides nucleiques, combinaison de reactifs et trousse pour doser ces acides. Download PDF

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Abstract

La méthode de dosage se caractérise en ce que les sondes de capture jouent le rôle d'amorces modifiées, lesdites amorces étant incorporées dans des copies de l'acide nucléique cible dont la présence est ensuite détectée par au moins une sonde de détection sélective.

Description


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  Méthode pour le dosage d'acides nucléiques, combinaison de réactifs et trousse pour doser ces acides - -------La présente invention est relative à une méthode rapide et sensible pour le dosage d'acides nucléiques par des techniques d'hybridation, dans laquelle les sondes de détection sont des amorces modifiées, lesdites ancrées étant incorporées dans des copies de l'acide nucléique cible avant la réaction d'hybridation et à une combinaison de réactifs ainsi qu'à une trousse pour celle-ci. 



  De plus, l'invention est relative à une méthode pour doser des acides nucléiques par des techniques d'hybridation, dans laquelle les sondes de capture sont des amorces modifiées, en étant incorporées dans des copies d'acides nucléiques cibles avant la réaction d'hybridation et à une combinaison de réactifs ainsi qu'à une trousse pour celle-ci. 



  Dans des réactions d'hybridation, on laisse un oligo-ou un polynucléotide marqué, c'est-à-dire la sonde, subir un appariement de basesavec la cible acide nucléique. Diverses méthodes d'hybridation ont été utilisées pour la détection des acides nucléiques. Dans des méthodes d'hybridation directes, le spécimen est soit en solution, soit fixé à un support solide. L'acide nucléique devant être identifié est mis en évidence au moyen d'une sonde marquée. 



  Une méthode d'hybridation de type sandwich a été décrite dans le Brevet US NO 4 486 539. On utilise dans cette méthode deux sondes distinctes, l'une qui est une sonde de détection marquée et utilisée pour la détection et-l'autre étant une'sonde de capture immobilisée sur un support solide pour la séparation de l'acide nucléique cible du mélange réactionnel. 



  La méthode d'hybridation en solution est décrite dans la publication du Brevet britannique NO 2 169 403. On utilise dans cette méthode, deux sondes différentes qui sont toutes deux dans la même phase en solution. La sonde de détection est marquée avec un traceur détectable et une moitié ayant une affinité 

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 pour un autre composant est fixée à la sonde de capture. 



  Après hybridation, l'hybride formé entre la sonde de capture, l'acide nucléique cible et la sonde de détection, peut être séparé de la solution d'hybridation à l'aide de l'autre moitié de la paire d'affinité. 



   La polymérisation d'ADN catalysée par une enzyme, où la séquence de nucléotides d'un brin d'acide nucléique déjà existant, c'est-à-dire la matrice, est copiée avec précision dans son brin complémentaire, est bien connue dans l'Art et elle a été décrite par exemple dans Kornberg, DNA replication, W. H. Freeman & Co, San Francisco, pp. 221-225 et 670-679,1980 et Maniatis et coll. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 122,1982. Cette multiplication biologique est utilisée dans des essais d'hybridation dans lesquels la bactérie à détecter est cultivée et donc son ADN enrichi avant le test et elle est décrite par exemple dans Woo, Methods Enzymol. 68, p. 389, 1979 et dans le Brevet US No 4 358 535.

   Des séquences d'ADN spécifiques peuvent être aussi amplifiées à l'intérieur des cellules vivantes, par exemple au moyen de médicaments convenables tels qu'ils sont décrits par Clewell et Helinski dans J. Bacteriol. 110, p. 1135, 1972 et dans la Demande de Brevet Européen NO 0 055 742. 



  Un enrichissement d'ADN plus spécifique est décrit dans la Demande de Brevet Européen   N"0   175 689 dans laquelle la cible est liée à un replicon plasmidique et introduite dans une cellule convenable. Une autre méthode encore est décrite dans la Demande de Brevet Européen   N"0   201 189, dans laquelle la dépendance de l'amorce de la synthèse d'ADN est utilisée pour créer une réaction in vitro pour l'amplification de   l'ADN   cible. Une méthode pour détecter des gènes amplifiées est suggérée dans la Demande de Brevet Européen NI 0 200 362. 



   Dans la méthode d'hybridation de la présente 

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 invention, soit les sondes de détection, soit les sondes de capture jouent le rôle d'amorces modifiées étant incorporées dans des copies de l'acide nucléique cible dans un procédé de polymérisation dépendant d'une matrice avant la réaction d'hybridation. 



   Dans la méthode de l'invention, une amorce au moins est nécessaire et les amorces sont toujours modifiées. Si les sondes de détection jouent le rôle d'amorces dans la réaction de polymérisation, les amorces sont pourvues d'au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable convenable. 



   Dans une variante, les sondes de capture peuvent être utilisées comme amorces dans la réaction de polymérisation, auquel cas les amorces sont pourvues d'au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité. 



   L'invention décrit aussi une combinaison de réactifs et une trousse comprenant sous une forme conditionnée, une unité à plusieurs récipients comprenant la combinaison de réactifs requis pour la réalisation du test. 



   En utilisant les sondes de détection ou de capture en tant qu'amorces dans une réaction de polymérisation, il est possible d'augmenter de plusieurs ordres de grandeur la sensibilité de la réaction d'hybridation par rapport aux méthodes mesurant directement la cible. 



  De plus, l'invention fournit une méthode commode pour mettre en oeuvre la réaction d'hybridation en solution, si bien que les hybrides sont facilement et rapidement séparés de la solution d'hybridation après la réaction d'hybridation. 



   La méthode de l'invention est commode pour diagnostiquer certaines maladies, qui sont très diffici- 

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 les à diagnostiquer avec des méthodes classiques. La méthode est donc particulièrement utile pour l'identification de cytomégalovirus et de virus de HI ou du SIDA. 



   La Fig. 1 représente la séquence de bases des 
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 amorces modifiées, Pa et Pb et également des sondes séa D lectives   S.   et S2 utilisées dans les Exemples 1,2 et 3, ainsi que les sites relatifs des amorces modifiées P a et   Pub'et   des sondes sélectives   S,   et S2 sur l'acide nucléique cible en question. Les longues lignes A et B indiquent les deux brins cibles qui se poursuivent dans les deux directions. Les têtes de flèches sur les amor- 
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 ces Pa et Pub, indiquent la direction dans laquelle a j3 elles sont allongées dans le procédé de polymérisation. 



   La Fig. 2 représente la séquence de bases des 
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 amorces modifiées, Pa a et p b, et de la sonde sélective a D S utilisée dans l'Exemple 4, ainsi que les sites relatifs des amorces modifiées, Pa et Pb et de la sonde séa b lective S sur l'acide nucléique cible en question. La ligne A indique l'ADN et ses copies d'ADN identiques et la ligne B montre les copies d'ADN complémentaires. 



  Les têtes de flèche sur les amorces Pa et Pb indiquent la direction dans laquelle elles sont allongées dans le procédé de polymérisation. 



  Préparation du matériel d'essai. 



   Les sondes utilisées dans la méthode sont des oligo-ou des polynucléotides. Les sondes peuvent être préparées de façon synthétique ou semi-synthétique, qui sont les modes préférés pour préparer des sondes, qui joueront également le rôle   d'amorces.   Il est aussi tout-à-fait possible de préparer les sondes par des techniques recombinantes, ou à partir d'acides nucléiques isolés directement à partir de la nature. Une sonde peut être liée à un vecteur convenable. Elle peut contenir des parties de vecteur ou être complètement dépourvue de parties de vecteur. Actuellement, un grand nombre 

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 d'amorces et de sondes convenables qui peuvent être utilisées, sont disponibles industriellement. 



  Sondes de détection en tant qu'amorces modifiées. 



   Selon l'une des méthodes de la présente invention, les sondes de détection sont des oligonucléotides ou des polynucléotides, qui peuvent être liés à l'acide nucléique cible par un appariement de bases et qui peuvent jouer le rôle d'amorces pour une enzyme synthétisant un acide nucléique dépendant d'une matrice. Il est essentiel que les amorces de   déte   tion soient pourvues d'au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur lequel au moins un marqueur détectable convenable peut être attaché. 



   Divers isotopes radioactifs ou des composés marqués radioactivement peuvent être utilisés en tant que marqueur. La substance de marquage peut aussi être fluorescente, luminescente, émettrice de lumière, mise en évidence de façon enzymatique ou immunologique, etc. 



  Des marqueurs reposant sur l'affinité de la biotine et de l'avidine ou de la streptavidine, des chélates de lanthanides, de la ferritine et des   hèmes,   et des haptènes pouvant être mis en évidence de façon immunologique comme AAF et AIF (dérivés   d'acétoxyacétylfluorène)   peuvent être mentionnés à titre d'exemples. Il est aussi possible d'effectuer l'identification à l'aide de médiateurs par exemple des protéines. 



   La méthode selon l'invention ne dépend pas du marqueur utilisé. Toute les substances de marquage couramment connues convenables pour l'hybridation d'acides nucléiques peuvent être librement appliquées à la méthode. 



  Il est cependant essentiel que dans le cas où les sondes de détection jouent le rôle d'amorces, le marqueur soit choisi dans un groupe de marqueurs qui ne perturbe pas le fonctionnement de l'amorce. Le marqueur doit être attaché à l'amorce de détection de telle sorte que l'enzyme polymérisant l'acide nucléique puisse encore le re- 

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 connaître en tant qu'amorce. 



  Sondes de capture en tant qu'amorces modifiées
Selon l'autre méthode de la présente invention, les sondes de capture sont des oligonucléotides ou des polynucléotides, qui peuvent être liés à l'acide nucléique cible par un appariement de bases et qui peuvent jouer le rôle d'amorces pour une enzyme synthétisant l'acide nucléique dépendant d'une matrice. Il est essentiel que les amorces de capture soient pourvues d'au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ou d'au moins un site sur lequel au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité peut être attachée. 



  Il est aussi possible d'attacher la moitié ou les moitiés de la paire d'affinité par l'intermédiaire d'un médiateur à l'amorce de capture. Il faut seulement qu'il soit possible de séparer l'hybride de la solution d'hybridation à l'aide de la paire d'affinité et que la fonction d'amorce ne soit pas altérée. 



   La moitié de la paire d'affinité est un composant ayant une affinité pour un autre composant. Par exemple, les paires biotine-avidine ou streptavidine, dérivé de métal lourd-groupe thio, divers homopolynucléotides comme poly dG-poly dC, poly dA-poly dT et poly dA-poly U, sont de telles paires d'affinité. 



  Mais on peut aussi utiliser d'autres paires de composants à condition qu'elles aient une affinité assez forte pour permettre la liaison spécifique des amorces de capture modifiées ayant été incorporées dans les copies de l'acide nucléique cible au support solide. On a trouvé des paires d'affinité convenables parmi des ligands et des conjugués utilisés dans des méthodes immunologiques. 



  Sonde de capture sélective
Dans l'une des méthodes de la présente invention, dans laquelle les sondes de détection jouent le 

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 rôle d'amorces, il faut une sonde de capture sélective pour permettre la séparation sélective des copies de l'acide nucléique cible dans lesquelles ont été incorporées les amorces modifiées. Il est essentiel que les sondes de capture soient suffisamment homologues de l'acide nucléique cible pour permettre leur hybridation spécifique avec les copies de l'acide nucléique cible et donc une séparation et une détection sélective des amorces de détection ayant été incorporées dans les copies de l'acide nucléique cible. 



  Sonde de détection sélective Dans l'autre méthode de la présente invention, dans laquelle les sondes de capture jouent le rôle d'amorces modifiées, il faut une sonde de détection sélective pour permettre la détection des copies des acides nucléiques cibles dans lesquelles ont été incorporées les amorces modifiées. Il est essentiel que la sonde de détection soit suffisamment homologue de l'acide nucléique cible pour s'hybrider spécifiquement et identifier ainsi l'acide nucléique cible sélectivement. Les sondes de détection peuvent être pourvues de quelconques marqueurs détectables convenables, par exemple de ceux qui sont mentionnés ci-dessus. 



  Combinaisons de réactifs Sonde de détection en tant qu'amorce modifiée La présente invention est relative à une combinaison de réactifs comprenant au moins une amorce modifiée pourvue d'au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachés au moins un marqueur détectable convenable et au moins une sonde de capture sélective pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité. 

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  Sonde de capture en tant qu'amorce modifiée
La présente invention est aussi relative à une combinaison de réactifs comprenant au moins une amorce modifiée pourvue d'au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ou d'au moins un site sélectif sur lequel peut être attachée au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ; et au moins une sonde de détection sélective pourvue d'au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable convenable. 



  Trousses
La présente invention décrit aussi une trousse convenable pour doser des acides nucléiques. La trousse comprend sous forme conditionnée, une unité à plusieurs. récipients dans laquelle l'une des combinaisons de réactifs mentionnées plus haut est combinée à au moins l'un des réactifs ou dispositifs suivants requis dans le test,   c'est-à-dire   éventuellement un récipient comprenant au moins un agent de polymérisation dépendant d'une matrice, éventuellement un récipient avec les quatre désoxynucléoside triphosphates, éventuellement un dispositif convenable pour le procédé de polymérisation et d'hybridation, éventuellement un dispositif convenable pour la séparation des copies des acides nucléiques cibles et éventuellement un dispositif convenable pour doser le marqueur.

   Les réactifs et dispositifs préférés sont décrits en détail dans la description ultérieure. 



  Méthode de. l'invention
La méthode préférée de la présente invention commence par l'addition d'au moins deux amorces modifiées, les deux amorces étant soit des amorces de détection, soit de capture, à une solution d'échantillon dénaturé. Les amorces modifiées vont chacune s'enrouler sur le brin complémentaire de l'acide nucléique cible,   c'est-   

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 à-dire la matrice et par addition d'une enzyme synthétisant l'acide nucléique dépendant d'une matrice, les amorces seront allongées.

   Le procédé se déroule efficacement in vitro et crée de nouveaux brins d'acide nucléique qui peuvent avoir plusieurs milliers de bases de long, si les conditions sont convenables
Le procédé peut être répété pour créer des copies complémentaires des brins nouvellement synthétisés, par l'utilisation d'un excès des amorces modifiées, lesquelles sont donc des copies identiques de la première matrice. En répétant ce procédé, on initie une réaction en cascade, si bien que l'acide nucléique cible est multiplié. Le procédé peut être répété autant de fois que l'on veut, pour obtenir la sensibilité de détection désirée. Dans les cas où la concentration de l'acide nucléique cible n'est pas extrêmement faible, une multiplication suffit pour rendre détectable l'acide nucléique cible. 



   Il est aussi possible de n'utiliser qu'une amorce modifiée dans la méthode de l'invention. Dans ce cas, la multiplication n'est cependant pas aussi efficace qu'avec au moins deux amorces, parce que la réaction n'est pas une réaction du type en cascade. 



   A la fois   l'ADN   et   l'ARN   peuvent être déterminés par la méthode de la présente invention. Cependant, si l'acide nucléique cible est un ARN, il est plus commode de copier d'abord l'ARN en l'ADNc correspondant par une enzyme transcriptase inverse, puis de poursuivre ensuite le-procédé comme cela est décrit plus haut. 



   Après incorporation des amorces modifiées dans les copies des acides nucléiques cibles, on ajoute une sonde sélective convenable reconnaissant la séquence cible et ses copies dans le mélange réactionnel et l'on effectue la réaction d'hybridation dans des conditions convenables pour le procédé d'hybridation respectif choisi. 

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   Dans la réaction d'hybridation, en fonction du choix des amorces modifiées, on laisse s'hybrider soit une sonde de capture sélective, soit une sonde de détection sélective, avec les copies de l'acide nucléique cible maintenant présentes en quantité fortement accrue par rapport à la quantité d'acide nucléique cible dans la situation d'origine. 



   Si l'échantillon d'origine contenait la séquence cible, la sonde sélective ajoutée s'hybride aux copies nouvellement synthétisées de l'acide nucléique cible. Il se forme un hybride entre la molécule de copie dans laquelle a été incorporée l'amorce modifiée et la sonde sélective. Les hybrides formés sont, selon la présente invention, commodément séparés de la solution d'hybridation à l'aide de la moitié de la paire d'affinité, qui est attachée soit à l'amorce de capture, soit à la sonde de capture sélective.

   Au cours du fractionnement, ces hybrides contenant la moitié capturante adhèrent à un support solide grâce à l'autre moitié de la paire d'affinité et la quantité de sonde de détection sélective ou d'amorce de détection adhérant au support peut être mesurée par des méthodes classiques, directement à partir du support ou après élution à partir de l'éluant. 



  La quantité de marqueur est une mesure de la quantité d'acide nucléique cible. 



   Avant le fractionnement, la solution est diluée, si cela est nécessaire, pour rendre avantageuses les conditions pour la paire d'affinité. La solution est ensuite mise en contact avec le support solide. Le support en question peut être par exemple une colonne de chromatographie d'affinité, un filtre, une surface plastique ou une surface de verre. Des dispositifs commodes pour effectuer la séparation comprennent différents types de plaques de microtitration, des systèmes à plongeur ou des particules magnétiques, mais il est tout à fait pos- 

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 sible de réaliser la séparation dans des tubes à essais et sur des billes, etc. 



   Le matériau support de la colonne d'affinité peut être un polymère naturel ou synthétique, par exemple une cellulose, un polyacrylamide, un polystyrène, du dextrane ou de l'agarose. Ces matières peuvent être aussi utilisées en tant que suspensions dans un tube à essais. Il est aussi avantageux d'utiliser des tubes à essais ayant l'autre moitié d'une paire d'affinité fixéesur sa surface intérieure. Il est indispensable qu'on puisse fixer sur la matière choisie un composant ayant une affinité pour la moitié de la paire d'affinité qui est attachée à l'amorce de capture ou à la sonde de capture sélective. 



   Il n'est pas nécessaire d'attacher la ou les moitiés de la paire d'affinité à l'amorce de capture au commencement de la polymérisation. Il n'est pas non plus nécessaire d'attacher le marqueur détectable à l'amorce de détection avant la polymérisation. Ils peuvent être aussi ajoutés après le procédé de polymérisation à l'amorce modifiée ayant été incorporée dans les copies de l'acide nucléique cible. Par exemple, lorsque le marqueur détectable est sensible aux conditions d'hybridation, il peut être d'abord ajouté après l'hybridation de la sonde de capture sélective avec les copies de l'acide nucléique cible. 



   Si les sondes de détection jouent le rôle d'amorces modifiées ayant été incorporées dans les copies de l'acide nucléique cible, l'hybride peut être séparé du mélange réactionnel au moyen des sondes de capture sélectives immobilisées sur des supports solides. Dans cette méthode, qui a été aussi décrite dans la Demande de Brevet Européen NO 0 237 362, l'étape limitant la vitesse est créée lorsque l'acide nucléique cible et ses copies, dans lesquelles ont été incorporées des amorces de détection, doivent s'hybrider avec la sonde 

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 de capture sélective qui est immobilisée sur un support solide. L'hybridation en solution est donc une méthode plus avantageuse de l'invention que celle-là.

   Cependant, si la méthode est réalisée avec une sonde de capture immobilisée, l'hybride formé sur le support solide est lavé et la quantité du marqueur sur le support est mesurée par des méthodes classiques. 



   - Le principe du test est mis en évidence dans les Exemples suivants. 



  EXEMPLE 1 Détection d'ADN de cytomégalovirus avec des sondes de détection en tant qu'amorces modifiées
Dans cette expérience modèle, la cible était un plasmide recombinant (pBR322/CMV HindIII L) qui incluait un fragment de 12,3 kb du génome du cytomégalovirus (CMV, AD 169, ATCC VR-538). Les deux amorces de 
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 détection (Pa'Pb'Fig. 1) utilisées avaient une lona D gueur de 20 nucléotides et étaient synthétisées par des méthodes standards sur un synthétiseur automatisé. Ils correspondaient à deux régions sur l'insert spécifique du CMV qui étaient distantes de 111 nucléotides. Deux sondes de capture sélectives   (SI'S2'Fig. 1)   reconnaissaient des régions sur chacun des deux brins entre les deux amorces de détection.

   Les amorces de   détec-   
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 32 tion Pa et Pb ont été marquées avec du 32p à leurs exa b-'g trémités 5', à une activité spécifique de 4. 109 CPM/g grâce à la réaction bien connue avec la polynucléotide kinase et le   gamma-P-ATP   (Maniatis et coll., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). 



   Des nucléotides biotinylés ont été ajoutés aux extrémités 3'des sondes de capture avec du bio 11-dUTP (BRL) et de la transférase terminale (Promega   Biotech. ) comme cela est décrit par Riley et coll.,   DNA, 5 (4), pp. 333-337,1986. Le plasmide cible a été 

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   1inéarisé   par coupure avec l'enzyme de restriction EcoRI. 



  L'ADN   polymérase,   le fragment de Klenow, a été achetée chez Boehringer-Mannheim et la streptavidine agarose chez BRL. 



   L'expérience suivante a été réalisée avec ces réactifs. 



   Quatre réactions différentes ont été assemblées contenant 0, 104, 106 et    108   molécules (correspondant à 0,2 x 10, 2 x   10   et 2 x   10   moles) respectivement cible. De plus, toutes les quatre réactions contenaient en un volume total de 50   ul   : 2 pmoles de chacune des deux amorces, 0,5 mM de chacun des quatre désoxynucléoside triphosphates (c'est-à-dire dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5), 10 mM de MgC12'50 mM de NaCl et 10 mM de dithiothréitol. Le mélange a été chauffé à   100 C   pendant 2 minutes, puis incubé pendant 5 minutes à   370C   et ensuite additionné de 1   pl   (équivalent à une unité) d'ADN polymérase.

   Ensuite, le mélange a été encore incubé pendant 10 minutes à   37 C.   L'ébullition suivie d'un enroulement des amorces de détection et d'une incubation avec de l'ADN polymérase ajoutée à   37 C,   constituent un cycle de synthèse d'ADN. 



   Dans cette expérience, le cycle a été réalisé soit une seule fois, soit répété 5 ou 15 fois. Après le dernier cycle, l'échantillon a été encore lavé à   100 C,   puis 10 pmoles de la sonde de capture sélective ont été ajoutées avec du NaCl (0,9 M), de l'EDTA (20 mM), du phosphate de sodium (pH 7,   5 ;   20   mM)   et du dodécylsulfate de sodium (0,1 %). Le volume atteignait'100 pl et les concentrations données sont des concentrations finales. Le mélange a été ensuite incubé à   500C   pendant une heure. Après cette réaction d'hybridation, on a ajouté 200 pl d'une suspension à 25 % de streptavidine dans du NaCl l M, du phosphate de sodium 20 mM (pH 7,5) 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 et de   l'EDTA   1 mM.

   Les molécules biotinylées ont été laissées se fixer au streptavidine-agarose pendant 15 minutes à   370C   dans un mélangeur   tournant. L'agarose   a été collecté par une brève centrifugation-et le surnageant enlevé par aspiration. L'agarose a été ensuite lavé une fois dans du NaCl 1 M tamponné et deux fois dans une solution contenant 150 mM de NaCl, 15 mM de citrate de sodium et 0,2 % de dodécylsulfate de sodium (pH 8) à   37 C.   La radioactivité de l'agarose auquel étaient liés les hybrides formés, a été ensuite déterminée dans un compteur de radioactivité. La procédure de récolte et de lavage pour des hybrides d'ADN contenant un marqueur biotinylé sont des procédures déjà connues décrites par exemple dans la Publication de Brevet britannique NO 2 169 403. 



   Les résultats de l'expérience sont montrés dans le Tableau I. On constate qu'un cycle de synthèse d'ADN incorpore assez de radioactivité pour la détection seulement s'il y a de fortes concentrations de cible, mais que, même la très faible quantité de cible est détectable après 15 cycles. La quantité d'amorce de détection devient limitante avec une forte quantité de cible et 15 cycles. 



   TABLEAU 1 
 EMI14.1 
 
<tb> 
<tb> 32
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> Activité <SEP> de <SEP> 32p <SEP> dans <SEP> des <SEP> hybrides
<tb> cible <SEP> (moles) <SEP> collectés <SEP> a) <SEP> (CPM <SEP> au-dessus <SEP> du <SEP> fondb)
<tb> 1 <SEP> 5 <SEP> 15 <SEP> N  <SEP> de <SEP> cycles
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 10-20 <SEP> ND <SEP> ND <SEP> 650
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 10-18 <SEP> ND <SEP> 300 <SEP> 11000
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 10-16 <SEP> 700 <SEP> 13000 <SEP> 36000
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 a) Moyenne de deux déterminations b) ND-non détectable (moins de radioactivité que 2 fois l'activité moyenne du fond) EXEMPLE 2 Détermination de   l'ADN   de cytomégalovirus avec des sondes de capture en tant qu'amorces modifiées
Dans cet Exemple, les sondes de capture jouent le rôle d'amorces.

   Les réactifs utilisés étaient les mêmes que dans l'Exemple 1 avec les exceptions suivantes. 
 EMI15.1 
 Les amorces de capture (Pa, Pb, Fig. 1) n'étaient pas 32 marquées avec du P, mais leur extrémité 5'était plutôt modifiée de façon à contenir un résidu biotine. 



  Cette modification chimique a été faite selon des méthodes connues, décrites par Chollet et Kawashima, Nucleic Acids Research, 13, pp. 1529-1541,1985. Les deux sondes sélectives   (S, et S, Fig.   1) étaient dans ce cas marquées à leur extrémité   5'de   façon à jouer le rôle 
 EMI15.2 
 de sondes de détection. Leur activité spécifique était Q Q d'environ 2 x 109 et 2, 5 x 109 cpm/pg respectivement. 



   Les mélanges de réaction ont été assemblés selon la procédure de l'Exemple 1. Les amorces de capture biotinylées ont été cependant ajoutées en des quantités décuples, c'est-à-dire à raison de 20 pmoles de chacune par réaction. On a effectué   l,   5 ou 15 cycles comme cela est décrit plus haut, puis on a chauffé les échantillons 
 EMI15.3 
 à 1000C et ajouté 0, 5 pmole de chacune des sondes S, et 32 52 marquées par du P. L'hybridation a été effectuée dans les mêmes conditions que dans l'Exemple 1. 



   Les hybrides ont été ensuite collectés sur 
 EMI15.4 
 32 streptavidine-agarose, lavés et leur activité de 32p comptée, comme dans l'Exemple 1. Le résultat est fourni dans le Tableau 2. 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 
 EMI16.1 
 
<tb> 
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> Activité <SEP> de <SEP> 32P <SEP> dans <SEP> les <SEP> hybrides <SEP> colcible <SEP> (moles) <SEP> lectés <SEP> a) <SEP> (CPM <SEP> au-dessus <SEP> du <SEP> fond) <SEP> b)
<tb> 1 <SEP> 5 <SEP> 15 <SEP> N  <SEP> de <SEP> cycles
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 10-20 <SEP> ND <SEP> ND <SEP> 800
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 10-18 <SEP> ND <SEP> 400 <SEP> 13000
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 10-16 <SEP> 300 <SEP> 11000 <SEP> 54000
<tb> 
 a) Moyenne de deux déterminations b) ND-non détectable (cf. ex.

   1) EXEMPLE 3 Détection d'ADN de cytomégalovirus à partir d'échantillons cliniques avec des sondes de capture en tant qu'amorces modifiées
On a démontré dans cet Exemple, l'applicabilité de la méthode à l'étude d'échantillons cliniques par la détection de CMV à partir de l'urine d'un jeune enfant souffrant d'une infection par un cytomégalovirus. 



  L'urine provenant d'un enfant en bonne santé a été incluse comme témoin. Les deux échantillons étaient 10 ml d'urine dont   l'ADN   total avait été isolé de la façon décrite dans Virtanen et coll., J. Clin. Microbiol., 20 (6), pp. 1083-1088,1984. Les ADN dissous dans 20   ul   de H20 ont été utilisés comme cible dans des réactions qui ont été par ailleurs effectuées selon la procédure de l'Exemple 2. Après 10 cycles de synthèse d'ADN, la sonde sélective marquée a été ajoutée à l'échantillon laissée s'hybrider et les hybrides collectés. L'ADN provenant de l'urine du malade a présenté une radioactivité nettement élevée dans des hybrides tandis que celui de la personne en bonne santé ne présentait que la radioactivité de fond.

   Les valeurs de cpm réelles étaient de 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 2300 et 240 respectivement. 



  EXEMPLE 4 Détection de l'ARN du virus Semiliki Forest avec des sondes de capture en tant qu'amorces modifiées
L'Exemple 4 montre que la méthode décrite peut aussi être utilisée pour la détection d'ARN. Le modèle utilisé était   l'ARN   du virus Semiliki Forest (SFV). 



   Les réactifs utilisés étaient deux amorces de capture biotinylées en 5' (Fig. 2) (préparés selon la procédure de l'Exemple 2), une seule sonde de détection 
 EMI17.1 
 32 sélective marquée par du 32p en 5' (préparée selon la procédure de l'Exemple 1), une transcriptase inverse (Promega Biotech) et une ADN   polymérase,   fragment de Klenow (Boehringer Mannheim). 



   'La première étape de la détection de   l'ARN   de SFV consistait à synthétiser une copie d'ADNc. Les 20 pl de mélange réactionnel contenaient 10 mM de tris- Cl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 10 mM de MgC12'10 mM de dithiothréitol, 0,5 mM de chacun des quatre désoxynu- cléoside triphosphates, 0, 5 ug de l'ARNc, 10 pg   d'ARN      de SFV, 10 pmoles d'amorce de capture P et 100 U de a   transcriptase inverse. Ce mélange a été incubé à   37 C   pendant 15 minutes. Puis le mélange a été chauffé à 1000C pendant 5 minutes et refroidi à la température ambiante. On a ensuite ajouté 50 pl d'une solution con- tenant 10 mM de tris-Cl (pH 7,4), 50 mM de NaCl, 10 mM de MgC12'10 mM de dithiothréitol, 10 pmoles de l'amorce de capture Pb et 0,5 mM de chacun des 4 désoxynucléoside- triphosphates.

   La température-a été élevée à   37 C   et après une période de 5 minutes, 1U   d'ADN-polymérase   a été ajoutée. Après 10 minutes d'incubation supplémentaires le mélange réactionnel a été incubé à   100 C   pendant 5 minutes, refroidi à   37 C   et 5 cycles de synthèse d'ADN    ont été effectués. Après une étape de dénaturation finale, on aajouté 0,1 pmole (1,2. 106 cpm) de la sonde détectrice   

 <Desc/Clms Page number 18> 

 sélective dans   80   pl de NaCl 1 M, 50 mM d'EDTA, 50 mM de phosphate de sodium (pH 7,5) et 0,1 % de   dodécy1sul-   fate de sodium.

   La solution a été ensuite incubée pendant 2 heures à   55 C,   puis les hybrides ont été collectés et lavés selon la procédure de l'Exemple 1. 



   Un témoin négatif pour les réactions était fourni par un échantillon identique qui a été soumis au même traitement, sauf que la transcriptase inverse n'a pas été ajoutée. L'échantillon dans lequel l'ARN était converti en ADNc avec la transcriptase inverse a donné 
 EMI18.1 
 32 une activité de 32p de 420 cpm dans des hybrides cap- turés, tandis que le témoin donnait une activité   de 5U cpm.   



  EXEMPLE 5 Comparaison de différents modes de détection d'ADN multiplié
On a comparé dans cet Exemple trois différents modes de détection d'ADN multiplié. Les réactifs et le procédé de multiplication étaient tels que décrits dans les Exemples 1 et 2, sauf que les sondes de détection ou de capture sélectives étaient des clones M13 reconnaissant environ 100 nucléotides entre les amorces. 



   On a obtenu les clones M13 en sous-clonant un fragment de restriction HaeIII de plasmide recombinant pBR322/CMV HindIII L dans le vecteur phage   M13mplO   avec des techniques. standards. Les clones M13 à ajouter en tant que sondes sélectives de capture étaient modifiés 
 EMI18.2 
 TM avec de la biotine au moyen de la photoprobeTM (marque déposée) biotine (Vector Laboratories). Les clones M13 devant servir de sondes sélectives de détection étaient   32 marqués avec du 32p-dCTP au moyen d'ADN-polymérase I   (le fragment de Klenow) et d'un allongement d'amorce (Hu et Messing, Gene 17, pp. 271-277,1982)) une acti- 
 EMI18.3 
 0 vite spécifique de 2 x 108 cpm/pg. 



   La multiplication de 3 x 10 molécules (0,5 x 10-18 moles) du plasmide linéarisé pBR322/CMV HindIII L 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 
 EMI19.1 
 a été effectuée avec 10 cycles. Pour effectuer la détection selon les modes l et 2, on a employé 2 pmoles de chacune des amorces de détection Pa et Pb marquées par du P et effectué le procédé de multiplication selon la procédure de l'Exemple 1. Dans le cas de la détection selon le Mode 3, on a utilisé 25 pmoles des amorces de capture biotinylées dans la procédure de multiplication et réalisé la réaction selon la procédure qui est décrite dans l'Exemple 2. 



  Mode 1 de détection-sonde sélective de capture utilisée pour collecter des hybrides formés en solution avec les copies de l'acide nucléique cible. 



  Dans ce mode de détection, on a utilisé des sondes sélectives de capture Ml3 biotinylées pour collecter les fragments d'ADN multipliés. Après le dernier cycle de multiplication, le mélange d'échantillon a été Q chauffé à 1000C et additionné de 2 x 109 molécules de chacune des sondes sélectrices de capture biotinylées, avec du NaCl (0, 6 M), de l'EDTA (5 mM), du phosphate de sodium (20 mM) et du SDS (0, 1 %). Le volume a été porté à 100 pl et les concentrations finales sont données. 



  Le mélange a été incubé à 65 C pendant 2 heures. Les hybrides formés ont été collectés sur streptavidineagarose selon la procédure de l'Exemple l, sauf que deux lavages supplémentaires d'une minute ont été effectués à 500C avec du NaCl 15 mM, du citrate de sodium 1, 5 mM, 0, 2 % de SDS. La radioactivité des hybrides collectés a été mesurée. 



  Mode 2 de détection-Sonde sélective de capture immobilisée avant son hybridation avec les copies de l'acide nucléique cible. 



  On a utilisé dans ce cas, des sondes M13 sélectives immobilisées pour capturer l'ADN multiplié. 



  Après le dernier cycle de multiplication, les échantillons ont été chauffés à 100 C. On a ajouté du NaCl TM (0, 6 M), du citrate de sodium (60 mM), du Ficoll 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 (marque déposée) (0,02 %), de la polyvinylpyrrolidone (0,02 %), de l'albumine de sérum bovin (0,02 %) et de l'ADN de sperme de hareng dénaturé (0,2 mg/ml) pour donner les concentrations indiquées dans un volume final de 100   pl.   On a ajouté à chaque échantillon, un disque de filtre de nitrocellulose sur lequel ont été immobilisées 5 x   1010   molécules de chacune des sondes sélectives selon une procédure décrite préalablement (US 4 486 539). Le mélange a été incubé avec les filtres à   65 C   pendant 2 heures ou 18 heures.

   Après la réaction d'hybridation, les filtres ont été lavés deux fois pendant 20 minutes à   500C   avec du NaCl 15 mM, du citrate de sodium 1,5 mM et 0,2 % de SDS et la radioactivité liée aux filtres a été mesurée. 



   Mode 3 de détection-Sonde sélective de détection utilisée pour la détection. 



   On a utilisé des sondes de détection Ml3 sé- 
 EMI20.1 
 32 lectives marquées par du 32p pour la détection de l'ADN multiplié et collecté les hybrides à l'aide des amorces de capture   biotinylées   aux extrémités 5', comme cela est décrit dans l'Exemple 2. Les échantillons multipliés ont été chauffés à   1000C   et additionnés de 
 EMI20.2 
 O r 2 x 10 molécules (2 x 10 cpm) de chacune des sondes 32 sélectives marquées par du P, avec les sels indiqués à propos du Mode 1. L'hybridation et la collection des hybrides formés ont été effectuées de la façon qui est décrite dans le Mode 1. 



   Le Tableau 3 montre une comparaison des résultats obtenus par les trois modes de détection. 



   Les Modes 1 et 3 ont l'avantage de la plus grande vitesse d'hybridation en solution par rapport à l'hybridation sur filtre dans le mode 2. On obtient la plus forte 
 EMI20.3 
 32 activité de 32p par le mode 3 parce que la sonde de dé- tection sélective contient plusieurs atomes de 32p par molécule.

   

 <Desc/Clms Page number 21> 

 TABLEAU 3 
 EMI21.1 
 
<tb> 
<tb> Mode <SEP> Amorces <SEP> Sonde <SEP> M13 <SEP> Durée <SEP> Activité <SEP> de
<tb> sélective <SEP> d'hybridation <SEP> 32p <SEP> dans <SEP> les
<tb> (Heures) <SEP> hybrides
<tb> (cpm) <SEP> a)
<tb> 1 <SEP> Détection <SEP> mar- <SEP> Biotinylée
<tb> quée <SEP> par <SEP> du <SEP> 32P <SEP> de <SEP> capture <SEP> 2 <SEP> 870
<tb> 2 <SEP> Détection <SEP> mar- <SEP> Immobilisée <SEP> 2 <SEP> 43
<tb> quée <SEP> par <SEP> du <SEP> 32P <SEP> de <SEP> capture <SEP> 18 <SEP> 920
<tb> 3 <SEP> Biotinylée <SEP> Détection <SEP> marde <SEP> capture <SEP> quéepar <SEP> du <SEP> P <SEP> 2 <SEP> 7800
<tb> 
 a) Moyenne de trois déterminations (cpm au-dessus du fond)

   EXEMPLE 6 Multiplication d'ADN de cytomégalovirus avec des amorces de détection biotinylées en une détection indirecte avec un conjugué peroxydase streptavidin-raifort
Dans cet Exemple, on a effectué la multiplication du plasmide spécifique du CMV (pBR322/CMV   HindIIIL)   
 EMI21.2 
 en utilisant les amorces biotinylées Pa et Pb décrites a D dans l'Exemple 2 en tant qu'amorces de détection. Les clones M13 décrits dans l'Exemple 5 modifiés avec des groupes sulfone, ont été utilisés comme sondes sélectives de capture. Les hybrides formés ont été collectés dans des puits de microtitration enduits d'anticorps reconnaissant   l'ADN   modifié par le groupe sulfone. La détection finale des hybrides formés a été faite avec un conjugué de peroxydase de streptavidin-raifort, qui détecte les parties biotine des amorces. 



   Les clones M13 ont été modifiés par une réaction de sulfonation avec les réactifs et selon la procédure recommandés par Orgenics Ltd (Yavne, Israel). 



  Les puits de microtitration en polystyrène (Nunc,   Danemark)   ont été enduits de 10 pg/ml d'IgG purifiée 

 <Desc/Clms Page number 22> 

 provenant d'un anticorps monoclonal dirigé contre   l'ADN   modifié par le groupe sulfone (Orgenics Ltd) dans un tampon au carbonate de sodium 10 mM (pH 9,6) pendant 
 EMI22.1 
 une nuit à 4 C. 



   On a soumis un mélange réactionnel contenant 3 x 105 molécules des plasmides pBR322/CMV HindIII L linéarisés ou des témoins sans plasmide et 25 pmoles de chacune des amorces Pa   et Pb biotinylées   à 10 cycles de multiplication dans les conditions décrites dans l'Exemple 1. Les échantillons ont été chauffés à 100 C, 
 EMI22.2 
 g puis additionnés de 2 x 109 molécules de chacune des sondes sélectives sulfonées de capture avec les réactifs spécifiés à propos du Mode 1 de détection de l'Exemple 5. 



   Le mélange a été incubé à   65 C   pendant 2 heures, dilué avec 100   p. l   de Tween 20 à 0,2 %, puis transféré dans des puits de microtitration enduits. On a laissé les hybrides se fixer aux puits pendant 2 heures à   37 C.   Le mélange réactionnel a été rejeté et les puits lavés à trois reprises avec 0, 1 % de Tween 20 dans du chlorure de sodium 0,15 M, du phosphate de sodium 20 mM (pH 7,5) (PBS). 200   pl   d'un composé streptavidine-raifort peroxydase (Amersham, UK) dilué à 1 :

   2000 dans une solution de 1 % d'albumine de sérum bovin, 0,1 % de Tween 20 dans du PBS ont été ajoutés et les puits ont été incubés pendant 45 minutes à   37 C.   Après quatre lavages comme ci-dessus, on a ajouté 200 ul d'une solution de substrat consistant en 0,46 mg/ml   d'O-phénylène-diamine   0,01 % de   H ; 02 dans   un tampon d'acétate de sodium 0,1 M (pH 5,0). Après 15 minutes à   22 C,   on a arrêté la réac- 
 EMI22.3 
 tion en ajoutant 50 pl de H2S04 2N et mesuré le taux d'ab- 2 4 sorption du produit coloré avec un spectrophotomètre à 492 nm. Les procédures de collection et de détection ont été déjà décrits par Syvânen et coll. (Nucleic Acids Res, 14, pp. 5037-5048,1986). 



    Les résultats de l'expérience sont montrés dans le Tableau 4. On a nettement détecté 3 x 105 molé-   

 <Desc/Clms Page number 23> 

 
 EMI23.1 
 TO cules (0, 5 x 10 mole) du plasmide cible après 10 cy- cles de multiplication.
TABLEAU   4   
 EMI23.2 
 
<tb> 
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> cible <SEP> (moles) <SEP> Taux <SEP> d'absorption <SEP> à <SEP> 492 <SEP> nm <SEP> a)
<tb> zip
<tb> 0,5 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 348
<tb> 0 <SEP> 0,120
<tb> 
 a) Moyenne de trois essais.

Claims (9)

  1. Revendications 1. Méthode pour doser des acides nucléiques par hybridation, caractérisée en ce que les sondes de capture jouent le rôle d'amorces dont au moins une est modifiée par l'introduction d'au moins une moitié ou composant d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique auquel au moins une moitié d'une paire d'affinité est attachée ; lesdites amorces modifiées étant incorporées dans des copies de l'acide nucléique cible dont la présence est ensuite détectée par au moins une sonde de détection sélective.
  2. 2. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que : a) on pourvoit au moins une amorce de l'acide nucléi- que cible d'au moins une moitié d'une paire d'affi- nité ou d'au moins un site spécifique sur lequel au moins une moitié d'une paire d'affinité peut être attachée, b) on laisse cette ou ces amorces de capture réagir avec l'acide nucélique cible à brin unique dans des conditions convenables pour une réaction de polymé- risation dépendant d'une matrice, c) on laisse les copies à brin unique de l'acide nucléique cible dans lesquelles les amorces de capture ont été incorporées, s'hybrider avec une sonde de détection capable de s'hybrider sélective- ment avec l'acide nucléique dans des conditions convenables pour une réaction d'hybridation, d)
    on sépare les copies de l'acide nucléique cible dans lesquelles ont été incorporées les amorces de capture, à l'aide de l'autre moitié de la paire d'affinité, e) on détecte la présence des sondes de détection sélectives s'étant hybridées avec es copies de <Desc/Clms Page number 25> l'acide nucléique cible.
  3. 3. Méthode pour doser des acides nucléiques par hybridation, dans laquelle les sondes de détection jouent le rôle d'amorces modifiées étant incorporées dans les copies des acides nucléiques cibles, caractérisée en ce que les copies d'acides nucléiques cibles comprenant les amorces dont au moins une est modifiée par l'introduction d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site auquel au moins un marqueur détectable est attaché sont d'abord hybridées en solution avec au moins une sonde de capture sélective et l'hybride résultant est alors séparé à l'aide de cette sonde capturante, puis la présence de l'hybride est détectée.
  4. 4. Méthode suivant la revendication 3, caractérisée en ce que : a) on pourvoit au moins une amorce de l'acide nucléi- que cible d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être atta- ché au moins un marqueur détectable, b) on laisse cette ou ces amorces de détection réagir avec l'acide nucléique cible à brin unique dans des conditions convenables pour une réaction de polymé- risation dépendant d'une matrice, c) on laisse les copies à brin unique de l'acide nucléique cible dans lesquelles ont été incorporées les amorces de détection s'hybrider avec une sonde de capture capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible dans des conditions conve- nables pour une réaction d'hybridation, d)
    on sépare les copies de l'acide nucléique cible dans lesquelles ont été incorporées les amorces de détection à l'aide de la sonde de capture sélec- tive, e) on détecte la présence des copies des acides nu- cléiques cibles. <Desc/Clms Page number 26>
  5. 5. Méthode suivant les revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la sonde de capture sélective est pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité.
  6. 6. Combinaison de réactifs pour doser des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique cible, pourvue d'au moins une marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins un marqueur détectable, et b) au moins une sonde de capture capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible, pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être atta- chée au moins une moitié d'une paire d'affinité.
  7. 7.-Combinaison de réactifs pour doser des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique cible, pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité, et b) au moins une sonde de détection capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible pourvue d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable.
  8. 8.-Trousse pour doser des acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle comprend sous une forme conditionnée, une unité à plusieurs récipients ayant : a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique ci- ble pourvue d'au moins un marqueur détectable ou d'ce moins un site spécifique sur lequel pue être attaché au moins un marqueur détectable, <Desc/Clms Page number 27> b) au moins une sonde de capture capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être atta- chée au moins une moitié d'une paire d'affinité, c) éventuellement un récipient comprenant au moins un agent de polymérisation dépendant d'une matrice, d)
    éventuellement un récipient avec les quatre désoxy- nucléosidetriphosphates, e) éventuellement un dispositif pour la polymérisation et le procédé d'hybridation, f) éventuellement un dispositif pour la séparation des copies de l'acide nucléique cible, g) éventuellement un dispositif pour doser le marqueur.
  9. 9.-Trousse pour doser des acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle comprend sous une forme condi- tionnée, une unité à plusieurs récipients ayant : a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique cible, pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'af- finité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité, b) au moins une sonde de détection capable de s'hybrider sélectivement avec un acide nucléique cible, pourvue d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable, c) éventuellement un récipient comprenant au moins un agent de polymérisation dépendant d'une matrice, d) éventuellement un récipient avec quatre nucléoside- triphosphates, e)
    éventuellement un dispositif pour la polymérisation et le procédé d'hybridation, f) éventuellement un dispositif pour la séparation des copies se l'acide nucléique cible, g) éventuellement un dispositif pour doser le marqueur.
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