DD272664A5

DD272664A5 - Verfahren zum nachweis von nucleinsaeuren durch hybridisierung

Info

Publication number: DD272664A5
Application number: DD88313526A
Authority: DD
Inventors: Hans-Erik Soederlund; Arja M Weckman
Original assignee: ��`��@��k��
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-03-09
Publication date: 1989-10-18
Also published as: SE500262C2; NL194922C; GB2202328A; PT86937A; LU87153A1; IT8819722A0; HUT50868A; SE8800864D0; FI94429B; BE1003990A5; GB2202328B; NL194922B; US5476769A; NL8800594A; DE3807994C2; CH677285A5; DE3807994A1; DK175384B1; DK129588A; AT395434B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsaeuren durch Hybridisierung. Ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsaeuren durch Hybridisierung wird offenbart, bei dem man als Detektor- und Einfangsonden modifizierte Primer verwendet, die in Kopien der nachzuweisenden Nucleinsaeure vor der Hybridisierungsreaktion eingebaut werden. Abhaengig von der Auswahl der modifizierten Primer wird eine selektive Einfang- oder Detektorsonde in der folgenden Hybridisierungsreaktion benutzt, um die selektive Abtrennung oder den Nachweis der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsaeure, in welche die modifizierten Primer eingebaut worden sind, zu ermoeglichen.

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnungen

Anwendungsgebiet dar Erfindung

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird als Nachweisverfahren für Nucleinsäuren mit Hilfe von Hybridisierungstechniken angewendet. Es ist besonders zur Diagnose bestimmter Krankheiten geeignet, wie die Identifizierung von Cytomegalie-Viren und HIV- bzw. AIDS-Viren.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Boi Hybridisierungsreaktionen wird ein markiertos Oligo- oder Polynucleotid, d.h. das Sondenmolekül, über Basenpaarungen an eine nachzuweisende Nucleinsäure angelagert. Verschiedene Hybridisierungsverfahren wurden zum Nachweis von Nucleinsäuren verwendet. Bei direkten Hybridisierungsverfahren befindet sich die Probe entweder in Lösung oder sie ist an einen festen Träger gebunden. Die nachzuweisende Nucleinsäure wird mit einem markierten Sondenmolekül nachgewiesen. Die US-PS 4486539 beschreibt ein Sandwich-Hybridisierungs-Verfahren. Bei diesem Verfahren werden zwei getrennte Sondenmoleküle verwendet. Eines davon ist eine Detektorsonde. Sie ist markiert und wird nach Nachweis verwendet. Die andere ist eine Einfangsonde. Sie ist an einem festen Träger immobilisiert und dient der Abtrennung der nachzuweisenden Nucleinsäure vom Reaktionsgemisch.

Das Hybridisierungsverfahren in Lösung wird in der GB-OS 2169403 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden zwei verschiedene Sondenmoleküle verwendet, die sich in derselben Lösung befinden. Die Detektorsonde wird mit einer nachweisbaren Markierung markiert. Die Einfangsonde wird mit einer Gruppe versehen, die eine Affinität für einen anderen Bestandteil aufweist. Nach der Hybridisierung wird das zwischen der Einfangsonde, der nachzuweisenden Nucleinsäure und der Detektorsondc gebildete Hybrid aus der Hybridisierungslösung mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares abgetrennt. Die enzymatisch katalysierte DNA-Polymerisatio, >, bei der die Nuclootidsequenz eines vorgegebeneil Nucleinsöurestranges, d. h. einer Matrize, exakt kopiert wird und dabei der komplementäre Strang synthetisiert wird, ist aus dem Stand der Technik gut bekannt; vgl. z.B. Kornberg, „DNAreplication", W.H.Freeman & Co., San Francisco, S.221-225 und 670-679,1980, und * Maniaties et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, S. 122,1982. Diese biologische Vermehrung wird bei Hybridisierungs-Nachweisverfahren verwendet, also in Nachweisverfahren, bei denen der

nachzuweisende Mikroorganismus gezüchtet und dadurch snine DNA vor der Durchführung der Tests angereichert wird; vgl. z.B. Woo, Methods Enzymol. 68 [1979], S.389, und US-PS 4358535. Spezifische DNA-Sequenzen lassen sich aurh in lebenden Zellen amplifizieren, z. B. durch Verwendung geeigneter Arzneistoffe; vgl. z. B. Clewell und Helinski, J. Bacteriol. 110 (1972), S. 1135, und EP-A 55742. Eine noch spezifischere DNA-Anreicherung wird in der EP-A175689 beschrieben. D?.bei wird die nachzuweisende Nucleinsäure mit einem Plasmid-Replikon verbunden und in eine geeignete Zelle eingefüh¹1. Eine weitere Methode wird in der EP-A 201184 beschrieben. Dabei wird die Primer-abhängige DNA-Synthese In einer in v.tro-Reaktion zur Amplifikation der nachzuweisenden DNA benützt. In der EP-A 200362 wird ein Verfahren zum Nachweis amplifizierter Nucleinsäure-Sequenzen vorgeschlagen, das jedoch insbesondere zur Durchführung von Reihenuntersuchungen nicht schnell, empfindlich und einfach genug ist.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein schnell und einfach durchführbares Verfahren zum Nachweis von geringen Nucleinsäure-Konzentrationen bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren mit Hilfe von Hybridisierungstechniken bereitzustellen das im Vergleich mit den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren einerseits schnell und einfach durchzuführen ist und bei dem andererseits die Empfindlichkeit der Hybridisierungsreaktion um mehrere Größenordnungen gegenüber Nachweisverfahren gesteigert ist, bei denen die nachzuweisende Nucleinsäure direkt gemessen wird.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Durchführung der Hybridisierungsreaktion in Lösung bereitgestellt, bei dem die Hybridmoleküle einfach und schnell aus der Hybridisierungslösung nach der Hybridisierungsreaktion abgetrennt werden können. Bei dem erfindungsgemäßen Hybridisierungsverfahren wirken entweder die Detektorsonden oder die Einfangson len als modifizierte Frimer, die in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure während einer matrizenabhängigen Polymerisationsreaktion vor der Durchführung der Hybridisierung eingebaut werden. Es wird also die nachzuweisende Nucleinsäure amplifiziert.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird mindestens ein Primer benötigt, der immer modifiziert ist. Wenn die Detektorsonden als Primer bei der Polymerisationsreaktion dienen, weisen die Primer mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle auf, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.

In einer anderen Ausführungsform worden die Einfangsonden als Primer bei der Polymerisationsreaktion verwendet. Dabei weisen die Primer mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine geeignete Stelle auf, an die mindestens ein geeignetes Teil eines /⁵Zfinitätspaares gebunden werden kann.

Die Erfindung betrifft auch eine Reagenzienkombination und ein Besteck zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die Reagenzienkombination in einem unterteilten Behälter.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz der modifizierten Primer P₁ und P_b und der selektiven Sondenmoleküle Si und S₂, die in den Beispielen 1 bis 3 verwendet werden. Ferner zeigt sie die relativen Stellen der modifizierten Primer P, und P„ und der selektiven Sondenmoleküle S, und S₂ in der in diesem Fall nachzuweisenden Nucleinsäure. Die durchgehenden Linien A und B bezeichnen die beiden nachzuweisenden Stränge, die in beiden Richtungen weitergehen. Die Pfeilspitzen an den Primern P₁ und P₆ bezeichnen die Richtung, in der sie während der Polymerisation verlängert werden.

Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz der modifizierten Primer P, und P_b und des selektiven Sondenmoleküls S, die in Beispiel 4 verwendet werden. Ferner zeigt sie die relativen Stellen der modifizierten Primer P, und P_b und des selektiven Sondenmoleküls S in der in diesem Falle nachzuweisenden Nucleinsäure.

Die Linie A bezeichnet die RNA und ihre identischen DNA-Kopien und die Linie B zeigt die komplementären DNA-Kopien. Die Pfeilspitzen an den Primern P, und P_b bezeichnen die Richtung, in der sie bei der Polymerisation verlängert werden.

Präparation von Sondenrr.olekulen

Die erfindungsgemäß verwendeten Sondenmoleküle sind Oligo- oder Polynucleotide. Sie können synthetisch oder halbsynthetisch hergestellt werden, je nach dem, welche Herstellungsweise für die als Primer zu verwendenden Sondenmoleküle bevorzugt wird. Außerdem lassen sich die Sondenmoleküle durch DNA-Rekombinationsverfahren oder aus unmittelbar aus der Natur isolierten Nucleinsäuren herstellen. Ein Sondenmolekül kann an einen geeigneten Vektor gebundon werden. Es kann gegebenenfalls Vektorteile enthalten. Eine Reihe erfindungsgemäß verwendbarer Primer und Sondenmoleküle

ist im Handel erhältlich.

Die Detektorsonden als modifizierte Primer

Ir einem der erfindungsgemäßen Verfahren sind die Detektorsonden Oligo- oder Polynucleotide, die an die nachzuweisende Nucleinsäure über Basenpaarungen gebunden werden und als Primer für eine matrizenabhängige, enzymatische NuoleinsäuresynU se dienen. Wesentlich ist, daß die als Detektorsonde wirkenden Primer mindestens eine geeignete, nachweisbar Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweisen, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.

[ * Als Markierung lassen sich verschiedene radioaktive Isotope oder radioaktiv markierte Verbindungen verwenden. Die

, Markierungssubstanz kann auch fluoreszieren, lumineszieren, lichtemittieren oder enzymatisch oder immunologisch

» nachweisbar sein. Es lassen sich auch Markierungen verwenden, die auf der Affinität von Biotin zu Avidin oder Streptavidin ) beruhen, Lanthanid-Chelate, Ferritin- und Häm-Verbindungen. Weitere Beispiele sind immunologisch nachweisbare Haptene,

wie AAF und AIF (Acotoxyacetylfluorenderivate). Die Identifizierung kann auch mit Hilfe von vermittelnden Molekülen, z. B. Proteinen, durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäßen Verfahren hängt nicht von der verwendeten Markierung ab. Alle gegenwärtig bekannten Markierungssubstanzen, die für die Hybridisierung von Nucleinsäuren geeignet sind, lassen sich verwenden. Es ist jedoch wesentlich, daß die Markierung aus einer Gruppe von Marl.icrungen ausgewählt wird, die nicht die Funktion des Primers stören, sofern die Detektorsonden als Primer verwendet werden. Der als Detektorsonde verwendete Primer muß so mit der Markierung versehen werden, daß die Nucleinsflure-Poylmerase den Primer immer noch als solchen erkennt.

Die Einfangsonden als modifizierte Primer

In einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren sind die Einfangsonden Oligo- oder Polynucleotide, die an die nachzuweisende Nucleinsäureüber Basenpaarungen gebunden werden und als Primer bei einer matrizenabhängigen, enzymatischen Nucleinsäuresynthese wirken. Wesentlich ist, daß die als Einfangsonden wirkende Primer mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweisen, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann. Das Teil oder die Teile des Affinitätspaares lassen sich auch über ein vermittelndes Molekül an den als Einfangsonde wirkenden Primer binden. Die einzigen Bedingungen sind, daß sich das Hybrid aus der Hybridisierungslösung mit Hilfe des Affinitäispaares abtrennen läßt und daß die Funktion des Primers nicht beeinträchtigt wird.

Das Teil des Affinitätspaares ist ein Bestandteil mit einer Affinität für einen anderen Bestandteil. Beispiele solcher Affinitätspaare sind Biotin — Avidin oder Streptavidin, ein Schwermetallderivat — eine Thiogruppe, verschiedene Homopolynucleotide, wie Poly dG — Poly dC, Poly dA — Poly dT und Poly dA— Poly U. Es lassen sich aber auch andere Paare von Verbindungen verwenden, vorausgesetzt, daß sie eine ausreichende Affinität für die spezifisch) Bindung des modifizierten, als Einfangsonde wirkenden Primers, der in dia Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut ist, an den festen Träger aufweisen. Geeignete Affinitätspaare sind auch in immunologischen Verfahren verwendete Liganden und Konjugate.

Die selektive Einfangsonde

In einem der erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Detektorsonde als Primer verwendet wird, wird eine selektive Einfangsonde benötigt, um die selektive Abtrennung der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure zu ermöglichen, in die die modifizierten Primer eingebaut sind. Wesentlich ist, daß die Einfangsonden ausreichend homolog zur nachzuweisenden Nucleinsäure sind, um ihre spezifische Hybridisierung mit den Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure zu gestatten und dadurch die selektive Abtrennung und den Nachweis der als Detektorsonde wirkenden Primer zu ermöglichen, die in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut sind.

Die selektive Detoktorsonde

In einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Einfangsonden als modifizierte Primer verwendet werden, wird eine selektive Detektorsonde benötigt, um den Nachweis der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäuren zu ermöglichen, in die die modifizierten Primer eingebaut sind. Wesentlich ist, daß die Detektorsonde ausreichend homolog zur nachzuweisenden Nucleinsäure ist, um spezifisch mit dieser zu hybridisieren und dadurch die nachzuweisende Nucleinsäure selektiv zu identifizieren. Die Detektorsonden können geeignete, nachweisbare Markierungen aufweisen, beispielsweise die vorstehend genannten.

Reagenzienkombinationan

Die Detektorsonde als modifizierter Primer

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reagenzienkombination, enthaltend mindestens einen modifizierten Primer, der mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann, und mindestens eine selektive Einfangsonde, die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.

Die Einfangsonde als modifizierter Primär

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Reagenzienkombination enthaltend mindestens einen modifizierten Primer, der mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann, und mindestens eine selektive Detektorsonde, die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.

Die Erfindung beschreibt auch ein für den Nachweis von Nucleinsäure geeignetes Besteck. Das Besteck enthalt, gegebenenfalls verpackt in einen unterteilten Behälter, eine der vorstehend genannten Reagenzienkombinationen in Verbind«, ig mit mindestens einem der folgenden Reaktanten oder der folgenden Einrichtungen, die beim Testverfahren benötigt werden, d. h.

gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend mindestens Reagens zur matrizenabhängien Polymerisation, gegebenenfalls ein Gefäß mit den vier Desoxynudeosidtriphosphaten, gegebenenfalls eine für die Durchführung der Polymerisation und der Hybridisierung geeignete Einrichtung, gegebenenfalls eine zum Abtrennen der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure geeignete Einrichtung, und gegebenenfalls ein» zum Nachweis der Markierung geeignete Einrichtung. Cie bevorzugten Einrichtungen und Reaktanten werden nachstehend näher erläutert.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden zunächst mindestens zwei modifizierte Primer zu einer denaturierten Probenlösung zugegeben. Beide Primer sind entweder als Detektorsonde oder als Einfangsonde wirkende Primer. Dabei lagern sich die modifizierten Primer jeweils an den komplementären Strang der nachzuweisanden Nucleinsäure, d. h. die Matrize, an. Nach der Zugabe eines Enzyms, das matrizenabhängig Nucleinsäure synthetisiert, werden die Primer verlängert. Dieses Verfahren schreitet in vitro mit hoher Ausbeute fort. Dabei werden neue Nucleinsäurestränge geschaffen, die mehrere tausend Nucleotide

'lang sein können, sofern die gewählten Bedingungen dafür geeignet sind.

Durch Verwendung eines Überschusses der modifizierten Primer kann der Vorgang wiederholt werden, um komplementäre Kopien der r?u synthetisierten Stränge herzustellen, die somit identische Kopien der zunächst verwendeten Matrizen darstellen.

Durch Wiederholung dieses Vorgangs wird eine Rea'rtionskaskade eingeleitet, durch di6 die nachzuweisende Nucleinsäure vervielfältigt wird. Dieser Vorgang läßt sich sooft wie gewünscht wiederholen, um die gewünschte Nachweisempfindlichkeit zu erhalten. In Fällen, in denen die Konzentration der nachzuweisenden Necleinsäure nicht extrem niedrig i st, reicht eine Vervielfältigung aus, um die Nucleinsäure nachweisbar zu machen.

Es ist auch möglich, lediglich einen ir:odifizierten Primer beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden. In diesem Fall wird die Vervielfältigung jedoch nicht so wirksam sein, wie bei der Verwendung von mindestens zwei Primern, da keine Reaktionskaskade eingeleitet wird.

Mit dem erfindungsgemäßen Ve; Tahren kann sowohl DNA als auch RNA bestimmt werden. Falls jedoch die zu bestimmende Nucleinsäure eine RNA ist, ist es bequemer, zunächst eine entsprechende cDNA-Kopie der RNA mit einer reverser! Transkriptase anzufertigen und sodann das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen.

Nachdem die modifizierten Primer in die Kopien der ju bestimmenden Nucleinsäuren eingebaut sind, wird das Reaktionsgemisch mit einem geeigneten selektiven Sondenmolekül versetzt, das die zu bestimmende Sequenz und ihre Kopien erkennt, und die Hybridisierung wird unter Bedingungen durchgeführt, die für den gewünschten Hybridh;ierungsvorgang geeignet sind.

Bei der Hybridisierungsreaktion wird je nach Wahl der modifizierten Primer entweder eine selektive Einfangsonde oder eine selektive Detektorsonde mit den Kopien der zu bestimmenden Nucleinsäure hybridisiert, die nunnruthr in vielfachen Mengen gegenüber dor Ausgangssituation vorliegt.

Falls die ursprüngliche Probe die nachzuweisende Sequenz enthält, hybridisiert das selektive Sondenmolekül mit den neu synthetisierten Kopien der zu bestimmenden Nucleinüäure. Es wird ein Hybrid zwischen dem kopierten Molekül, in das der modifizierte Primer eingebaut ist, und dem selektiven Sondenmolekül gebildet. Die gebildeten Hybrid j lassen sich erfindungsgemäß aus der Hybridisierungslösung in einfacher Weise mit Hilfe des Teils des Affinitätspaares abtrennen, die entweder an dem als Einfangsonde wirkenden Primer oder an der selektiven Einfangsonde befestigt ist. Während der Fraktionierung bleiben die Hybride, die einen solchen Einfangteil aufweisen, an einem festen Träger mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares haften. Die Menge der selektiven Detektorsonde oder des als Detektorsonde wirkenden Primers, die am Träger haften bleibt, kann in an sich bekannter Weise direkt am Trägermaterial oder nach der Elution im Eluat bestimmt werden. Die ermittelte Menge der Markierung ist ein Maß für die Menge der zu bestimmenden Nucleinsäure. Vor der Fraktionierung wird die Lösung gegebenenfalls verdünnt, um die Bedingungen vorteilhaft für das Affinitätspaar zu beeinflussen. Sodann wird die Lösung mit dem festen Träger in Berührung gebracht. Der zu verwendende Träger kann beispielsweise eine Affinitätschromatographiesäule, ein Filter, eine Plastikoberfläche oder eine Glasoberfläche sein. Günstige Einrichtungen zur Durchführung der Abtrennung sind unterschiedliche Typen von Mikrotiterplatten, Eintauchsystemen oder magnetischen Teilchen. Es ist aber auch möglich, die Abtrennung in Teströhrchen oder mit Körnchen durchzuführen. Als Trägermaterial kann für die Affimtätschromatographiesäule beispielsweise ein natürliches oder synthetisches Polymer, wie die Cellulose, Polyacrylamid, Polystyrol, Dextran oder Agarose, verwendet werden. Diese Materialien können auch als Suspensionen in einem Teströhrchen eingesetzt werde n. In einer bevorzugten Ausführungsform v/erden Teströhrchen verwendet, an deren innerer Oberfläche das andere Te.I des Affinitätspaares gebunden ist. Eine Voraussetzung für das ausgewählte Material ist, daß es die Bindung eines Bestandteils mit Affinität zu dem Teil des Affinitätspaares gestattet, an den als Einfangsonde wirkenden Primer oder die selektive Einfangsonde gebunden ist.

Es ist nicht erforderlich, das Teil oder die Teile? des Affinitätspaares an den als Einfangsonde wirkenden Primer zu Beginn der Polymerisation zu binden. Auch i^ct es nicht notwendig, die nachweisbare Markierung an den als Einfangsonde wirkenden Primer vor der Polymerisation zu binden. Sie können auch nach der Polymerisation an den modifizierten Primer angelagert oder gebunden werden, der in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut ist. Wenn beispielsweise die nachweisbare Markierung bei den Hybridisierungsbedirgungen nicht beständig ist, kann sie auch nach der Hybridisierung der selektiven Einfangsonde mit den Kopien der nachzuweisenden Ntcleinsäure zugegeben werden.

Wen die Detektorsonden als modifizierte Primer wirken, die in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut sind, läßt sich das Hybrid aus dem Reaktionsgemisch mit Hilfe selektiver Einfangsonden abtrennen, die an festen Trägern immobilisiert sind. Bei einem derartigen Verfahren wird die Reaktionsgeschwindigkeit dadurch begrenzt, daß die nachzuweisende Nucleinsäure und i<i' Kopien, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit der selektiven Einfangsonde hybridisieren müssen, die an einem festen Träger immobilisiert ist. Deshalb wird bei der vorliegenden Erfindung die Hybridisierung in Lösung bevorzugt. Faüs das Verfahren jedoch mit einer immobilisierten Einfangsonde durchgeführt wird, wird das am festen Träger gebildete Hybrid gewaschen, und die Menge der Markierung am Trägermaterial wird in an sich bekannter Weise gemessen.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Nachweis von Cytomegalievirus-DNA mit als modifizierte Primer wirkenden Detektorsonden In diesem erfindungsgemäßen Beispiel wird als nachzuweisende Nucleinsäure das rekombinante Plasmid pBR322/CMV Hindill L verwendet. Dieses enthält t'n 12,3kb Fragment des Cytomegalievirus-Genoms (DMV, AD 169, ATCC VR-536). Die beiden als Detektorsonde verwendeten Primer P, und P₀ (vgl.Fig. 1) haben eine Länge von 20 Nucleotiden und wurden in an sich bekannter Weise mit einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert. Sie entsprechen zwei Regionen der CMV-spezifischen Insertion, die 111 Nucleotide voneinander entfernt sind. Die beiden selektiven Eingangsonden S₁ und S₂ (vgl. Fig. 1) erkennen Bereiche in jedem der beiden DNA-Stränge, die zwischen den beiden als Detektorsonde wirkenden Primern liegen. Die als Detektorsonde wirkenden Primer P, und P_b werden mit ³²P an ihren 5'-Enden so markiert, daß ihre spezifische Aktivität 4 χ 10⁹CPMz^g beträgt. Die Markierung wird in an sich bekannter Weise mit Polynucleotidkinase und Gamma-³²P-ATP durchgeführt; vgl. Maniatis et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. *Die 3'-Enden der Einfangsonden werden mit biotinylierten Nucleotiden versehen. Dabei wird Bio 11-dUTP (BRL) und eine terminale Transferase (Promega Biotech.) verwendet; vgl. Riley et al., DNA 5 (4) (1986), S 333-337. Das nachzuweisende Plasmid wird durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, wurde bei Boehringer-Mannheim und Streptavidin-Agarose bei BRL gekauft.

Mit diesen Reagenzien wird das folgende Experiment durchgeführt:

Es werden vier unterschiedliche Reaktionen durchgeführt, die 0,10\ 10⁶ und Ί0⁸ Moleküle des nachzuweisenden Plasmids enthalten. Dies entspricht 0,2 χ 10~^M, 2 x 10~¹⁸ bzw. 2 χ 10"'⁶MoI. Weitere Bestandteile des Gesamtreaktionsvolumens von 50μΙ sind 1 pMol der beiden Primer, 0,5 mM von jedem der vier Desoxynucleosidtriphosphate (d. h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 1OmM MgCI₂,5OmM NaCI und 1OmM Dithiothreitol. Das Reaktionsgemisch wird 2 Minuten auf 100⁰C erhitzt und dann 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird 1 μΙ (1 Einheit) DNA-Polymerase zugegeben. Das Gemisch wird nochmals 10 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Das Aufkochen und das anschließendo Anlagern der als Detektorsonde wirkenden Primer sowie die Inkubation mit der DNA-Polymerase bei 37°C ist ein DNA-Synthesezyklus. Bei diesem Experiment wird der Reaktionszyklus entweder nur einmal durchgeführt oder 5 oder 15mal wiederholt. Nach dem letzten Reaktionszyklus wird die Probe nochmals auf 100⁰C erhitzt. Sodannwerden 10OpMoI der selektiven Einfangsonde und 0,9 M NaCI, 2OmM EDTA, 2OmM Natriumphosphat (pH 7,5) und 0,1 % Natriumdodecylsulfat zugegeben. Das Gesamtvolumen beträgt 100μΙ. Die angegebenen Konzentrationen sind die Endkonzentrationen. Das Gemisch wird sodann 1 Stunde bei 5O⁰C inkubiert. Nach dieser Hybridisierungsreaktion werden 200μΙ einer 25%igen Suspension von Streptavidin-Agarose in 1M NaCI, 2OmM Natriumphosphat (pH 7,5) und 1 mM EDTA zugegeben. Es wird 15 Minuten bei 37⁰C in einem Rotationsmischer inkubiert, damit die biotinylierten Moleküle an die Streptavidin-Agarose binden können. Die Agarose wird kurz abzentrifugiert und der Überstand wird abgebaut. Sodann wird die Agarose einmal mit gepufferter 1M NaCI-Lösung und zweimal mit einer Lösung enthaltend 15OmM NaCI, 15mM Natriumeitrat und 0,2% Natriumdodecylsulphat (pH 8) bei 37⁰C gewaschen. Sodann wird die durch die gebildeten Hybride an die Agarose gebundene Radioaktivität mit einem Zählgerät bestimmt. Die Isolierungs- und Waschverfahren der die biotinylierten Markierungen enthaltenden DNA-Hybride erfolgt wie in der GB-A 2169403. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle I zusammengefaßt. Aus Tabelle I ergibt sich, daß bei einem einzigen DNA-Synthesezyklus nur dann genügend Radioaktivität für den Nachweis eingebaut wird, wenn hohe Ausgangskonzentrationen der nachzu' '/eisenden Nucleinsäure vorliegen. Werden jedoch 15L JA-Synthesezyklen durchgeführt, lassen sich selbst sehr geringe Mengen dieser nachzuweisenden Nucleinsäure nachweisen. Bei einer großen Menge der nachzuweisenden Nucleinsäure und 15DNA-Synthesezyklen wird die Reaktion durch die Menge des als Detektorsonde wirkenden Primers begrenzt.

Tabelle I

Menge der nachzuweisenden ³²P-Aktivität in den gesan ..nelten Nucleinsäure (Mol) Hybriden'¹

(CPM über Hintergrund)¹¹¹

1 5 15 Anzahl der

DNA-Synthesezyklen

0 0 0 0

2 x 10"^M ND ND 650

2x10"¹⁸ ND 300 11000

2 x 10"^le 700 13000 36000

a) Mittelwert aus zwei Messungen

b) ND: nicht nachweisbar (weniger als zweimal soviel Radioaktivität wie die mittlere Hintergrundaktivität)

Beispiel 2

Bestimmung von Cytomegalievirus-DNA mit Einfangsonden als modifizierte Primer Bei diesem erfindungsgemäßen Beispiel werden die Einfangsonden als Primer verwendet. Bis auf die nachfolgend genannten Abweichungen werden die gleichen Reagenzien wie in Beispiel 1 verwendet. Die als Einfangsonde wirkendon Primer P, und P_b (vgl. Fig. 1) werden nicht mit ³²P markiert. Statt dessen werden ihre 5'-Enden mit einem Biotinrest versehen. Diese chemische Modifizierung wird in an sich bekannter Weise durchgeführt; vgl. Chollet und Kawashima, Nucleic Acids Research, 13 (1985),

S. 1529-1541. Die beiden selektiven Sondenmoleküle S₁ und S₂ (vgl. Fig. 1) werden in diesem Experiment an ihren 5'-Enden mark'ort. Sie werden als Detektorsonden verwendet. Ihre spezifischen Aktivitäten sind 2 x 10⁹ bzw. 2,5 χ 10⁹CpTi^g.

Die Rt 'ktionsgemische haben die in Beispiel 1 beschriebene Zusammensetzung. Die biotinylierten, als Einfangsonde wirkenden Primei, werden jedoch in 10facher Menge zugefügt, d. h. 2OpM pro Reaktion. Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden 1; 5 oder 15DNA-Synthesezyklen durchgeführt. Sodann werden die Proben auf 100^cC erhitzt und 0,5pM von jedem der ³²P-markierten Sondenmoleküle Si und S₂ werden zugegeben. Die Hybridisierung wird unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt.

Die Hybride werden sodann an Streptavidin-Agarose gesammelt, gewaschen und die "P-Aktivität wird wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle Il zusammengefaßt.

Tabelle Il

Menge der nachzuweisenden ³²-P-Aktivita! in den gesammelten Nucleinsäure (Mol) Hybriden*¹

(CPM über Hintergrund)¹"¹

♦ 2 χ 10"²⁰ 2 χ 10'¹⁸ 2 x 10"¹⁶

1	5	15	Anzahl der
			DNA-Syn
			thesezyklen
0	0	0
ND	ND	800
ND	400	13000
300	11000	54000

a) Mittelwort aus zwei Messungen

b) ND: nicht nachweisbar (vgl. SJeisfjte! 1)

Beispiel 3

Nachwels von Cytomegalievlrus-DNA aus klinischen Proben mit Einfangsonden als modifizierte Primer In diesem Beispiel wird gezeigt, daß das erfindung^gemäße Verfahren zur Untersuchung klinischer Proben geeignet ist. Dies erfolgt durch den Nachweis von CMV aus dem Urin eines Kindes, das bekanntermaßen an einor Cytomegalievirus-Infektion leidet. Der Urin eines gesunden Kindes wird dabei als Kontrolle verwendet. Aus zwei Proben mit jeweils 10 ml Urin wird die Gesamt-DNA isoliert nach der Vorschrift von Virtanen et al., J. Clin. Microbiol. 20 (6) (1984), S. 1083-1088. Die in 20μΙ H₂O gelösten DNA's werden als nachzuweisende Nucleinsäure in gemäß Beispiel 2 ausgeführten Reaktionen verwendet. Nach 10 DNA-Synthesezyk!en wird die Probe mit dem markierten, selektiven Sondenmolekül versetzt. Sodann wird die Hybridisierung durchgeführt und die Hybride werden gesammelt. Die DNA aus dem Urin des Patienten zeigt in den Hybriden eine deutlich erhöhte Radioaktivität, während des gesunden Kindes lediglich Hintergrund-Radioaktivität zeigt. Die tatsächlichen cpm-Werte sind 2300 bzw. 240.

Beispiel 4

Nachweis von SFV (Semliki Forest-Virus)-RNA mit Einfangsonden als modifizierte Primer Beispiel 4zeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren avieh für den Nachweis von RNA geeignet ist. Als Modellsystem wird SFV (Semliki Forest-Virus)-RNA verwendet.

Die verwendeten Reagenzien sind zwei 5'-biotinylierte, ata Einfangsonde wirkende Primer (vgl. Fig. 2), die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurden, eine einzige 5'-³²P-markierte, selektive Detektorsonde, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, reverse Transkriptase (Promega Biotech) und DNA-Polymerase, Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim).

Der erste Schritt beim Nachweis der SFV-RNA ist die Synthese einer cDNA-Kopie. In 20 μ! Roaktionsgemisch sind 10 mM Tris-HCL (pH 8,3), 5OmM KCI, 1OmMMgCI₂,1OmM Dithiothreitol,0,5mM von jedem der vier Desoxynucleosidtriphosphate.O^gt-RNA, 10pg SFV-RNA, 10μΜ als Einfangsonde wirkender Primer P, und 100 Einheiten reverse Transkriptase enthalten. Dieses Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Sodann wird das Gemisch 5 Minuten auf 100⁰C erhitzt und bei Umgebungstemperatur abgekühlt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit 50 μΙ einer Lösung, enthaltend 1OmM Tris-HCI (pH 7,4), 5OmMNaCI, 1OmMMgCI₂,1OmM Dithiothreitol, 1OpM des als Einfangsonde wirkenden Primers P_b und miiO,5mM von jedem der vier Desoxynucleotidtriphosphato versetzt. Die Temperatur wird auf 37°C erhöht. Nach 5 Minuten wird 1 Einheit DNA-Polymerase zugegeben, es wird 10 Minuten inkubiert und das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten auf 10O⁰C erhitzt. Sodann wird das Reaktionsgemisch auf 37⁰C abgekühlt. Insgesamt werden 5DNA-Synthesezyklen durchgeführt. Nach einem letzten Denaturierungsschritt werden 0,1 pMol (1,2 χ 1ü⁶cpm) der selektiven Detektorsonde in 80μ! 1 M NaCI, 5OmM EDTA, 5OmM Natriumphosphat (pH 7,5) und 0,1 % Natriumdodecylsulfat zugegeben. Die Lösung wird 2 Stunden bei 55°C inkubiert.

Anschließend werden die Hybride gesammelt und wie in Beispiel 1 beschrieben gewaschen.

Als negative Kontrolle für die Reaktionen wird eine identische Probe in gleicher Weise behandelt, jedoch ohne Zugabe der reversen Transkriptase. Die Probe, in der ausgehend von der RNA mit reverser Transkriptase eine cDNA-Kopie hergestellt wurde, ergibt eine ³²P-aktivität von 420cpm in den eingefangenen Hybriden, während die negative Kontrolle lediglich 50cpm ergibt.

Beispiels

Vergleich verschiedener Methoden zum Nachweis von vervielfältigter DNA

In diesem Beispiel werden drei Methoden zum Nachweis von vervielfältigter DNA verglichen. Es werden die Reagenzien und das Vervielfältigungsverfahren von Beispiel 1 und 2 verwendet. Jedoch werden als selektive Einfang- oder Detektorsonden M 13-Clone verwendet, die etwa 100 Nucleotide zwischen den Primern erkennen.

Die M 13-Clone werden durch Subclonierung eines Haelü-Restnktionsfragmentes des rekombinanten Plasrnids pBR322/CMV Hindill L in den Phagen Vektor M13mp10 in üblicher Weise erhalten. Die als selektive Einfangsonden zu verwendenden M 13-Clone worden unter Verwendung von Photoprobe®-Biotin (Vector Laboratories) mit Biotin modifiziert. Die als selektive Detektorsonden zu verwendenden M 13-Clone werden mit ³²P-dCTP unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Primer-Verlängerung markiert, so daß die spezifische Aktivität 2 x 10⁸cpm^g beträgt; vgl. Hu und Messing, Gene 17 (1982), S.271-277.

Jstzt werden 10 Vervielfältigungscyclen von 3 x 10⁵ Molekülen (0,S χ 10"'⁸MoI) des linearisierten Plasmids pBR322/CMV Hindlll L durchgeführt. Zum Nachweis nach der Methode 1 und 2 werden jeweils 2 pMol der³²P-markierten, als Detektorsonde wirkenden Primer P, und P_b verwendet. Das Vervielfältigungsverfahren wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Zum Nachweis nach der Methode 3 werden 25pMol der biotinylierten als Einfangsonde wirkenden Primer im Vervielfältigungsverfahren verwendet. Dabei wird die Reaktion wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.

ι Ergebnisse der Nachweismethode 1: Verwendung einer selektiven Einfangsonde zum Einsammeln der in Lösung mit den

\ \ Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure gebildeten Hybride.

Bei dieser Nachweismethode werden biotinylierte selektive M13 Einfangsonden zum Einsammeln der vervielfältigten DNA-Fragmente veavendet. Nach dem letzten Vervielfältigungscyclus wird das Probengemisch auf 100⁰C erhitzt und mit jeweils 2 x 10⁹ Molekülen de: biotinylierten, selektiven Anfangssonden sowie mit NaCI iO,6M), EDTA (5mMol) Natriumphosphat (2OmMoI) und SDS (0,1 %) versetzt. Angegeben sind die Endkon? jntrationen in einem Endvolumen von 100μΙ. Oas Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 65⁰C inkubiert. Die gebildeten Hybride werden an Streptavidin-Agarose wie in Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt, jedoch wird zusätzlich zweima! jeweils 1 Minute bei 50⁰C mit 15mM NaCI, 1,5mM Natriumeitrat und 0,2% SDS gewaschen. Die Radioaktivität der abgetrennten Hybride wird gemessen.

Nachweismethode 2: Verwendung von vor der Hybridisierung mit den Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäureimmobilisierten, selektiven Einfangsonden

Bei dieser Methode werden immobilisierte, selektive M 13-Sondenmolekülezum Einfangen der vervielfältigten DNA verwendet. Nach dem letzten Vervielfältigungscyclus werden die Proben auf 100⁰C erhitzt. Sodann werden sie mit NaCI (0,6Ml, Natnumcitrat (6OmM), Ficoll⁸ (0,02%), Polyvinylpyrrolidon (0,02%), Rinderserumalbumin (0,02% und denaturierter Heringspermien-DNA (0,2 mg/ml) versetzt. Wie angegeben, sind die Endkonzent'ationen in einem Endvolumen von 100μΙ. Sodann wird jede Probe mit

einer Nitrocellulosefilterscheihe versetzt, an der Bx 10¹⁰ Moleküle von jedem der selektiven Sondenmoleküle nach dem in der US-PS 4486539 beschriebenen Verfahren immobilisiert sind. Das Gemisch wird 2 oder 18 Stunden bei 65°C mit Filtern inkubiert.

Nach der Hybridisierung werden die Filter zweimal jeweils 20 Minuten bei 50°C mi: 15 mM NaCI, 1,5 i«M Natriumeitrat und 0,2% SDS gewaschen und die an die Filter gebundei e Radioaktivität wird gemessen.

Nachweismethode 3: Verwendung einer selektiven Detektorsonde zum Nachweis Bei dieser Methode werden ³²P-markierte, selektive M13-Detektorsonden zum Nachweis der vervielfältigten DNA verwendet. Die Hybride werden mit Hilfe der als Anfangsonde wirkenden Primer abgetrennt, die an ihren S'-Enden gemäß Beispiel 2 biotinyliert sind. Die vervielfältigten Proben werden auf 100°0 erhitzt und mit 2 x 10⁸ Molekülen (2 x 10⁵cpm) von jedem der ³²P-rm-rkierten, selektiven Sondenmoleküle wie bei Nachweismethode 1 mit Salzen versetzt. Die Hybridisierung und die Abtrennung der gebildeten Hybride wird gemäß Nachweisme'Jiode 1 durchgeführt.

Die bei den drei Nachweismethoden erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle IiI zusammengefaßt und verglichen.

Die Methoden 1 und 3 haben den Vorteil einer höheren Hybridisierungsgeschwindigkeit in Lösung, verglichen zur Filterhybridisierung bei der Methode 2. Die höchste ³²P-Aktivität wird bei der Method» 3 erhalten, da die selektive Detoktorsonde viele ³²P-Atome pro Molekül enthält.

Tabeile III

Methode	Primer	Selektives	Hybridisie-	³²P-Aktivi-
		M13-Sonden-	rungszeit,	töt in den
		molekül	Std.	Hybridmolekülen
				(cpm)"
1	³²P-markierter Primer	biotinyüerte	2	870
	als Detektorsonde	Einfangsonde
2	dto.	immobilisierte	CSl	43
		Einfangsonde	18	920
3	biotinylierter	³²P-markierte	2	7800
	Primer als	Detektorsonde
	Einfangsonde

A) Mittel aus drei Messungen (cpm über Hintergrund)

Beispiel 6

Vervielfältigung von Cytomegaüevlrus-DNA mit blotinyllerien als Detektdrsonde wirkenden Printern und Indirekte Bestimmung mit Streptavidin-Meerrettlch-Peroxldase

Bei diesem Beispiel wird die Vervielfältigung des CMV-Plasmids (pBR322/CMV Hindill L) mit den als Detektorsonde wirkenden, biotinylierten Primern P, und P_b gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Die in Beispiel 5 beschriebenen M 13-Clone werden mit Sulfongruppen modifiziert und als selektive Einfangsonden verwendet. Die gebildeten Hybride werden in den Bohrungen von Mikrotiterplatten abgetrennt, die mit Disulfon-modifizierte DNA erkennenden Antikörpern beschämet sind. Der Nachweis der gebildeten Hybride wird schließlich mit einem Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat durchgeführt, das die Biotinreste der Primerrnoleküle nachweist.

Die M 13-Clone werden durch eine Sulfonieiungsreaktion modifiziert. Dabei werden die von der Firma Orgenics Ltd (Yavrte, Israel! empfohlenen Reagenzien und Verfahren verwendet.

Polystyrol-Mikrotiterplatten (Nunc, Dänemark) werden mit 10pg/mI IgG in 1OmM Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,6) über Nacht bei 4°C beschichtet. Das IgG wurde durch Reinigung eines monoclonalen Antikörpers gegen mit Sulfongruppen modifizierte DNA erhalten (Orgenics Ltd.).

Reaktionsgemische enthalten 3 x 10⁵ Moleküle des linearisierten Plasmids pBR322/CMV Hindill L oder Kontrollen ohne Plasmid und 25pMo! von jedem der biotinylierten Primer P₁ und P_b werden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen 10 Vervielfältigungscyclen untarworfon. Die Proben werden auf 100°C erhitzt und dann mit jeweils 2 χ 10⁹ Molekülen von jeder der sulfonierten, selektiven Einfangsonden zusammen mit den in Beispiel 5 für die Methode 1 angegebenen Reagenzien versetzt.

Das Gemisch wird 2 Stunden bei 65⁰C inkubiert, mit 100μΙ 0,2%Tween 20 .'erdünnt und in die beschichteten MikrotiterpSatten überführt. Die Hybride werden 2 Stunden bei 37°C an die Bohrungen der Mikrotiterplatte gebunden. Das Reaktionsgemisch wird verworfen und die Bohrungen werden Jeweils 3mai mit 0,1 % Tween 20 in 0,1 Bmolar Natriumchlorid, 2OmM Natriumphosphat (pH 7,5) (PBS) gewaschen. Es worden 200 μΙ eines Streptavidin-Meerrettichperoxidasäe-Konjugais (Amersham, UK) zugesetzt, das 1:2000 in einer 1%igen Rinderserumalbumin-Lösung mit 0,1% Tween 20 in PBS verdünnt ist. Die Bohrungen der (vükrotiterplatte warden 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Auf diese Weise wird viermal gewaschen. Sodann werden 200 μΙ einer Substratlösung, bestehend aus 0,46mg/ml o-Phenylendiamin, 0,01 % H₂O₂ in 0,1 M Natriumscetatpuffer (pH 5,0) zugegeben.

Nach 15 Minuten bei 22⁰C wird die Umsetzung durch Zugabe von 50 μΙ 2N H₂SO« gestoppt und die Absorption des farbigen Reak;ionsprodukts bei 492 nm wird mit einem Photospektrometer gemessen. Diese Abtrsnnungs- und Nachweisverfahren wurde?: bereits von Syvänen et al in Nucleic Acids Res. 14 (19Ρ"5ί, S.5037-5Q48 beschrieben.

Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle IV zusammengefaßt. 3 χ 10⁵ Moleküle (0,5 χ 10~¹⁸ Mol) des nachzuweisenden Pissmäds siad nach 10 Vervielfältigungscyclen deutlich nachweisbar.

Tabelle IV	Absorption bei 492 nrn¹'
Menge der nachzuweisenden 'NucleinsäurefMol)	0,348 0,120
0,5 x 1Q""¹⁸ 0

a) Mittelwert aus drei Messungen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren durch Hybridisierung, gekennzeichnet dadurch, daß

a) als Einfangsonden modifizierte Primer verwendet werden die in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut sind, deren Vorhandensein dann durch mindestens eine selektive Detektorsonde nachgewiesen wird

b) die Detektorsonden als modifizierte Primer verwendet werden, die in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäuren eingebaut sind, die mit Hilfe mindestens einer selektiven Einfangsonde getrennt werden und deren Vorhandensein dann nachgewiesen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) minHestens einen Primer der nachzuweisenden Nucleinsäure mit mindestens einem Teil eines Affinitätspaares oder mit mindestens einer spezifischen Stelle bereitstellt, an der mindestens ein Teil des Affinitätspaares gebunden werden kann;

b) den oder die als Einfangsonde wirkenden Primer mit der einzelsträngigen, nachzuweisenden Nucleinsäure unter Bedingungen reagieren läßt, die eine matrizenabhängige Polymerisationsreaktion gestatten;

c) die einzelsträngigen Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure, in die die als Einfangsonde wirkenden Primer eingebaut sind mit einer Detektorsonde hybridisiert, die selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure hybridisiert;

d) die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure, in die die als Einfangsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares abtrennt; und

e) vorliegende selektive Detektorsonden nachweist, die mit den Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure hybridisiert haben.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) mindestens einen Primer der nachzuweisenden Nucleinsäure mit mindestens einer nachweisbaren Markierung oder mindestens einer spezifischen Stelle bereitstellt, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann;

b) den oder die als Detektorsonde wirkenden Primer mit der einzelsträngigen, nachzuweisenden Nucleinsäure unter Bedingungen reagieren läßt, die eine matrizenabhängige Polymerisationsreaktion gestatten;

c) die einzelsträngigen Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit einer Einfangsonde hybridisiert, die selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure hybridisiert;

d) die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure, in die die als Detektorsonde wirkenden Printer eingebaut sind, mit Hilfe der selektiven Einfangsonde abtrennt; und

e) vorliegende Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäuren nachweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die selektive Einfangsonde mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.

5. Reagenzienkombination zur Durchführung des Verfahrens zum Nachweis von Nucleinsäuren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Bestandteile enthält:

a) mindestens einen modifizierten Primer einer nachweisenden Nucleinsäure, der mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann; und

b) mindestens eine Einfangsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren, und mindestens einen Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann, oder

a) mindestens einen modifizierten Primer einer nachzuweisenden Nucleinsäure, der mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann; und

b) mindestens eine Detektorsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren, und mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann.

6. Reagenzienkombination nach Anspruch 3, in Form eines Bestecks zur Durchführung des Verfahrens zum Nachweis von Nucleinsäuren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Bestandteile enthält:

a) mindestens einen modifizierten Primer einer nachzuweisenden Nucleinsäure, eier mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann;

b) mindestens eine Einfangsonde, die in der Lage ist, selektiv mit dec nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren, und mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann;

c) gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend mindestens ein Reagenz zur matrizenabhängigen Polymerisation;

d) gegebenenfalls ein Gefäß mit den vier Desoxynucleosidtriphosphaten;

e) gegebenenfalls eine Einrichtung zur Durchführung der Polymerisation und der Hybridisierung;

f) gegebenenfalls eine Einrichtung zum Abtrennen der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure; und

g) gegebenenfalls eine Einrichtung zum Nachweis der Markierung oder

a) mindestens einen modifizierten Primer der nachzuweisenden Nucleinsäure, der mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle a jfweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann;

b) mindestens eine Detektorsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren, und die mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann;

d) gegebenenfalls ein Gefäß mit den vier Nucleosidtriphoshaten;

f) gegebenenfalls eine Einrichtung zur Abtrennung der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure; und

g) gegebenenfalls eine Einrichtung zum Nachweis der Markierung.