BE1009650A5 - Systeme d'expression, vecteur et cellule transformee par ce vecteur. - Google Patents

Systeme d'expression, vecteur et cellule transformee par ce vecteur. Download PDF

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BE1009650A5 BE9500851A BE9500851A BE1009650A5 BE 1009650 A5 BE1009650 A5 BE 1009650A5 BE 9500851 A BE9500851 A BE 9500851A BE 9500851 A BE9500851 A BE 9500851A BE 1009650 A5 BE1009650 A5 BE 1009650A5
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Christophe Andre
Lucien Charmoille
Manzour Hernando Hazbon
Pierre Cornelis
Patrick Dhaese
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Abstract

L'invention concerne un système d'expression pour la production d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis et une méthode de préparation de celui-ci. Il comprend : la séquence de nucléotides d'un promoteur, la séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion d'une lipase, la séquence de nucléotides qui code pour une lipase mature, et la séquence de nucléotides d'un terminateur. Il peut être introduit sur un vecteur. Une souche de Pseudomonas winsconsienesis, transformée par le vecteur d'expression, est utilisée comme souche hôte. L'invention concerne également le modulateur de la lipase de Pseudomonas winsconsinensis, qui participe à une expression efficace de la lipase et aide à la formation d'une lipase active. L'invention concerne également la protéine GPW qui semble participer également à une expression efficace de la lipase. La lipase produite peut être utilisée dans des compositions détergentes.

Description


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   Système d'expression, vecteur et cellule transformée par ce vecteur 
L'invention concerne un système d'expression utilisable pour la production d'une enzyme et plus particulièrement capable d'effectuer la production extracellulaire d'une lipase. 



   L'invention concerne également un vecteur contenant ce système d'expression et une cellule transformée par ce vecteur, ainsi que des méthodes de préparation du système d'expression, des vecteurs et des cellules transformées, ainsi que l'utilisation de ceux-ci pour préparer l'enzyme. L'invention concerne également un procédé de production de l'enzyme et l'utilisation de cette enzyme, notamment dans des compositions détergentes. 



   Il est connu d'inclure des enzymes, et notamment des hydrolases, telles que protéases, lipases, amylases et/ou cellulases, dans les compositions détergentes en vue d'éliminer les dépôts des tissus tels que les dépôts gras (Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645). Ces dépôts gras contiennent des triglycérides apportés, par exemples, par le sébum, les différents produits alimentaires (huile, sauce, beurre, matières grasses), les produits cosmétiques. 



   Les lipases hydrolysent les triglycérides en formant des produits plus solubles dans l'eau, mono-et di-glycérides, glycérol et acides gras libres. 



   Des lipases utilisables dans des compositions détergentes sont connues, telles que notamment des lipases naturellement produites par des souches de Pseudomonas, par exemples la lipase produite par une souche de Pseudomonas stutzeri (demande de brevet britanique 1372034), la lipase produite par une souche de Pseudomonas mendocina (demande de brevet européen 0 571 982), la lipase produite par une souche de Pseudomonas alcaligenes (brevet US 5,063, 160), et la lipase produite par une souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes (demande de brevet européen   0 218   272). Malheureusement, les lipases produites naturellement par ces souches de Pseudomonas ne sont pas sécrétées de manière efficace et industriellement rentables, leur productivité étant faible. C'est pourquoi, une production efficace a été recherchée. 



   Dans ce contexte, la demande de brevet WO 91/00908 décrit un procédé de production d'une lipase de Pseudomonas cepacia par une souche hôte Cette 

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 souche hôte contient une molécule d'ADN qui comprend la séquence de nucléotides qui code pour un modulateur et la séquence de nucléotides qui code pour la lipase de Pseudomonas cepacia. Ce procédé semble limiter à la lipase de
Pseudomonas cepacia. 



   On a également proposé, dans la demande de brevet WO 94/02617, de transformer une souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes pour produire une lipase. Cette transformation implique le clonage d'une séquence d'ADN qui code pour une lipase de Pseudomonas pseudoalcaligenes et d'une séquence d'ADN qui code pour le modulateur de cette même lipase. Cette transformation est donc limitée à la lipase de Pseudomonas pseudoalcaligenes. 



   A l'heure actuelle, un procédé de préparation de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis permettant d'obtenir un bon rendement n'est pas connu De plus, un système d'expression permettant d'obtenir l'expression et une sécrétion efficace de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis par une souche transformée contenant ce système d'expression n'est pas connu. De plus, la molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis n'a jamais été isolée et identifiée. 



   La présente invention a pour premier but de fournir un système d'expression permettant d'obtenir une enzyme, et notamment une lipase de Pseudomonas, en grande quantité dans le milieu de culture où une souche transformée contenant ce système d'expression est cultivée. 



   La présente invention a également pour but de fournir un vecteur, et notamment un plasmide, permettant d'obtenir une enzyme, et notamment une lipase de Pseudomonas, ayant des caractéristiques et des propriétés aussi proches que possible de celles de l'enzyme native (sauvage). 



   La présente invention a également pour but de fournir une souche transformée de bactérie, et plus particulièrement une souche de Pseudomonas wisconsinensis, souche transformée par le vecteur décrit ci-dessus, qui exprime et sécrète dans son milieu de culture l'enzyme, et notamment une lipase, avec un haut niveau de productivité. Selon l'invention, la sécrétion de l'enzyme est substantiellement extracellulaire. 



   La présente invention a également pour but de fournir un procédé de production d'une enzyme, et notamment d'une lipase, par une souche transformée comprenant le système d'expression décrit ci-dessus, en particulier une souche de bactérie, et notamment de Pseudomonas, qui produit une grande quantité d'enzyme de façon extracellulaire. 

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   La présente invention a également pour but de fournir une enzyme, et notamment une lipase, produite par une souche transformée comprenant le système d'expression décrit ci-dessus. La souche peut être une souche de Pseudomonas et, plus particulièrement, de Pseudomonas wisconsinensis, telle que notamment la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. 



   La présente invention a également pour but de fournir une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides qui code pour un modulateur et notamment pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis. 



   La présente invention a également pour but de fournir une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW. 



  La protéine GPW fait partie de l'opéron de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis. 



   La présente invention a également pour but de fournir un procédé de préparation des systèmes d'expression, des vecteurs, des souches transformées et des molécules d'ADN décrits ci-dessus
A cet effet, l'invention concerne un système d'expression utilisable pour la production d'une enzyme, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : 
 EMI3.1 
 - la séquence de nucléotides d'un promoteur, - la séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion, - la séquence de nucléotides qui code pour une enzyme mature, et   - la   séquence de nucléotides d'un terminateur. 



   Par"système d'expression", on entend une unité moléculaire qui peut être intégrée dans le génome d'un microorganisme ou qui peut être portée par un plasmide introduit dans un microorganisme, et qui est capable de fournir à ce microorganisme l'information génétique nécessaire à la biosynthèse de l'enzyme. 



   Par"promoteur", on entend le ou les promoteur (s) de transcription. Le promoteur qui est constitué d'une séquence d'ADN montrant une forte activité de 
 EMI3.2 
 transcription, telles que des séquences connues sous le nom de"enhancers"ou "upstream activating sequences". Le promoteur contient des séquences de contrôle de transcription qui influent sur l'expression de l'ADN codant. 



   Habituellement, la séquence de nucléotides du promoteur de l'invention provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient 

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 d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T
92.677/1 (LMGP-15151). 



   Habituellement, la séquence de nucléotides du promoteur de l'invention provient d'une protéine, et notamment d'une enzyme. Généralement, elle provient d'une hydrolase. De préférence, elle provient d'une lipase. De manière particulièrement préférée, elle provient d'une lipase de Pseudomonas. De bons résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient d'une lipase d'une souche de
Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient d'une lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1   (LMG P-15151).   



   Par"séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion"d'une protéine, on entend une séquence d'ADN correspondant à une séquence d'acides aminés qui est naturellement liée de façon opérationnelle à la terminaison aminée de la séquence mature de la protéine. La partie du gène de structure qui code pour le peptide signal est nommée séquence de nucléotides qui code pour le signal de sécrétion. 



   La séquence de nucléotides qui code pour le signal de sécrétion peut provenir de n'importe quelle enzyme qui est produite de façon extracellulaire par un microorganisme. N'importe quelle séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion fonctionnelle dans la souche transformée choisie peut convenir. 



   Habituellement, le système d'expression de l'invention comprend une séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion qui provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P- 15151). 



   Habituellement, le système d'expression de l'invention comprend une séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion d'une protéine, et notamment d'une enzyme. Généralement, il comprend une séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion d'une hydrolase, et de préférence d'une 

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 lipase. De manière particulièrement préférée, il comprend une séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion d'une lipase de Pseudomonas. De bons résultats ont été obtenus avec une séquence de signal de sécrétion d'une lipase de Pseudomonas wisconsinensis.

   D'excellents résultats ont été obtenus avec la séquence de nucléotides qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, c'est à dire la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 4) qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. 



   Par"la séquence de nucléotides qui code pour une enzyme mature", on entend la partie de la séquence qui est traduite en enzyme active, c'est à dire la séquence codante de l'enzyme qui correspond au gène de structure de l'enzyme sans la séquence du signal de sécrétion. La partie du gène de structure qui code pour l'enzyme, en tant que telle, est nommée séquence de nucléotides qui code pour l'enzyme mature. 



   Habituellement, le système d'expression de l'invention comprend une séquence de nucléotides qui code pour une enzyme qui provient d'une bactérie. 



  Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P- 15151). 



   Habituellement, l'enzyme est une hydrolase. Généralement, l'enzyme est une lipase, et de préférence une lipase de Pseudomonas. De manière particulièrement préférée, l'enzyme est une lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus avec la séquence de nucléotides qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, c'est à dire la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 7) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. 



   Par"lipase", on entend une enzyme qui catalyse la réaction d'hydrolyse des triglycérides en produits plus solubles dans l'eau, mono-et di-glycérides, glycérol et acides gras libres. Cette enzyme est classifiée dans le système international sous le numéro E. C. 3.1 1.3., une lipase est une glycérol ester 

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 hydrolase. Cette définition inclut les enzymes naturelles et les enzymes modifiées, telles que les enzymes dont la séquence de nucléotides ou d'acides aminés a été modifiée par des techniques de génie génétique ou par des techniques de mutagénèse. 



   Dans une variante préférée de l'invention, la séquence de nucléotides qui code pour le signal de sécrétion provient du même microorganisme que la séquence de nucléotides qui code pour l'enzyme mature. Habituellemnt, elles proviennent d'une bactérie, et généralement d'une souche de Bacillus ou de
Pseudomonas. De préférence, elles proviennent d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elles proviennent d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. 



   Par "terminateur", on entend le ou les terminateur (s) de transcription. La séquence de nucléotides d'un terminateur est une séquence d'ADN qui agit pour terminer la transcription. 



   Habituellement, la séquence de nucléotides du terminateur de l'invention provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY,
1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1   (LMGP-15151).   



   Habituellement, la séquence de nucléotides du terminateur de l'invention provient d'une protéine, et notamment d'une enzyme. Généralement, elle provient d'une hydrolase. De préférence, elle provient d'une lipase. De manière particulièrement préférée, elle provient d'une lipase de Pseudomonas. De bons résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient d'une lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151). 



   Dans une variante de l'invention, le système d'expression comprend une séquence de nucléotides qui code pour un modulateur. 



   Par"modulateur", on entend une protéine qui participe et aide à l'expression d'une enzyme. Dans ce cadre, elle aide à la formation d'une enzyme active 

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Dans cette variante de l'invention, le système d'expression comprend au moins :   - la   séquence de nucléotides d'un promoteur,   - la   séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion,   - la   séquence de nucléotides qui code pour une enzyme mature,   - la   séquence de nucléotides qui code pour un modulateur, et   - la   séquence de nucléotides d'un terminateur. 



   Habituellement, la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur provient d'une bactérie.   Généralement,   elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGES MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY,
1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T   92677/1 (LMG P-15151).   



   Habituellement, la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur provient de l'opéron d'une enzyme. Généralement, elle provient de l'opéron d'une hydrolase. De préférence, elle provient de l'opéron d'une lipase. De manière particulièrement préférée, elle provient de l'opéron d'une lipase de Pseudomonas, et notamment de Pseudomonas wisconsinensis. De bons résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de l'opéron d'une lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1   (LMG P-15151).   D'excellents résultats ont été obtenus avec la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1) qui code pour le modulateur provenant de l'opéron de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. 



   La séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID
NO 1) codant pour le modulateur, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ   ID   NO : 2), est donnée à la figure 1 (figures la et Ib). 



   Par"opéron", on entend une unité fonctionnelle de gènes de structure adjacents sous la dépendance d'un promoteur unique. 



   Dans une variante préférée, l'invention concerne également un système d'expression qui comprend au moins :   - la   séquence de nucléotides d'un promoteur,   - la   séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 4) qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, 

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 - la séquence de nucléotides (SEQ ID   NO 7)   qui code pour la lipase mature de
Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1,   - la   séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, et   - la   séquence de nucléotides d'un terminateur. 



   De préférence, l'invention concerne un système d'expression qui comprend au moins :   - la   séquence de nucléotides d'un promoteur, -la séquence (SEQ ID NO : 10) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci, et   - la   séquence de nucléotides d'un terminateur. 



   La séquence (SEQ ID NO : 10) inclut :   - la   séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 4) qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1,   - la   séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 7) qui code pour la lipase mature de
Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1,   - la   séquence intercistronique (SEQ ID NO : 11) et   - la   séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. 



   La séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 10) est donnée à la figure 2 (figures 2a et 2b). 



   Par"séquence intercistronique", on entend la séquence de nucléotides liant la séquence de nucléotides qui code pour la lipase mature et la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur de la lipase, cette séquence intercistronique est non codante. 



   Dans une autre variante de l'invention, le système d'expression comprend aussi la séquence de nucléotides qui code pour une protéine GPW. La variante de ce système d'expression comprend au moins la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) qui code pour la protéine GPW provenant de l'opéron de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. 



   La protéine GPW semble participer et aider à l'expression d'une enzyme, et, de plus, semble protéger l'enzyme de l'oxygène actif
Dans cette variante de l'invention, le système d'expression comprend au moins :   - la   séquence de nucléotides d'un promoteur,   - la   séquence de nucléotides qui code pour une protéine GPW, 

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 - la séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion,   - la   séquence de nucléotides qui code pour une enzyme mature, et   - la   séquence de nucléotides d'un terminateur. 



   Habituellement, la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGERS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1   (LMGP-15151).   



   Habituellement, la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW provient de l'opéron d'une enzyme. Généralement, elle provient de l'opéron d'une hydrolase. De préférence, elle provient de l'opéron d'une lipase. De manière particulièrement préférée, elle provient de l'opéron d'une lipase de Pseudomonas, et notamment de Pseudomonas wisconsinensis. De bons résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de l'opéron d'une lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151). D'excellents résultats ont été obtenus avec la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) qui code pour la protéine GPW de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. 



   La séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) codant pour la protéine GPW, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 13), est donnée à la figure 3. 



   Dans une autre variante de l'invention, le système d'expression comprend au moins : 
 EMI9.1 
 - la séquence de nucléotides d'un promoteur, - la séquence de nucléotides qui code pour une protéine GPW, - la séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion, - la séquence de nucléotides qui code pour une enzyme mature,   - la   séquence de nucléotides qui code pour un modulateur, et - la séquence de nucléotides d'un terminateur. 



   De préférence, dans le système d'expression selon l'invention, la séquence de nucléotides du promoteur est positionnée en amont de la séquence de nucléotides qui code pour le signal de sécrétion La séquence de nucléotides qui 

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 code pour le signal de sécrétion est positionnée en amont de la séquence de nucléotides qui code pour l'enzyme mature. La séquence de nucléotides qui code pour l'enzyme mature est positionnée en amont de la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur. La séquence de nucléotides qui code pour le modulateur est positionnée en amont de la séquence de nucléotides du terminateur.

   Dans la variante de l'invention qui comprend la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW, la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW est positionnée entre la séquence de nucléotides du promoteur et la séquence de nucléotides qui code pour le signal de sécrétion. Ces positionnements sont choisis de telle sorte que, dans des conditions appropriées, ils permettent l'expression de l'enzyme. 



   De préférence, les séquences comprises dans le système d'expression sont liées de façon opérationnelle. Dans la variante de l'invention qui ne comprend pas la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW, la séquence de nucléotides du promoteur est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucléotides qui code pour le signal de sécrétion, la séquence de nucléotides qui code pour le signal de sécrétion est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucléotides qui code pour l'enzyme mature, la séquence de nucléotides qui code pour l'enzyme mature est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur et la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucléotides du terminateur. 



   Dans la variante de l'invention qui comprend la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW, la séquence de nucléotides du promoteur est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW et la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucléotides qui code pour le signal de sécrétion. 



   La présente invention concerne également un modulateur comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 352 acides aminés (SEQ ID NO : 3) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. La séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1) codant pour le modulateur, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 2), est donnée à la figure 1 (figures la et   lb).   



   Le modulateur de l'invention a un poids moléculaire compris entre environ 39 à 40 kDa. Le modulateur a un point isoélectrique estimé compris entre environ 4,5 et 4,6. 

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   La présente invention concerne également une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-
15151) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. 



   Par"séquence modifiée dérivée d'une molécule d'ADN", on entend toute molécule d'ADN obtenue par modification d'un ou de plusieurs nucléotides du gène sauvage ou initial. Les techniques d'obtention de telles séquences sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR
CLONING-a laboratory   manual-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-   second edition, 1989, chapitre 15. Habituellement, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 70 % d'homologie avec la séquence de nucléotides du gène sauvage ou initial, c'est à dire au moins 70 % de nucléotides identiques et ayant la même position dans la séquence. De préférence, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 80 % d'homologie avec la séquence de nucléotides du gène sauvage ou initial.

   De manière particulièrement préférée, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 90 % d'homologie avec la séquence de nucléotides du gène sauvage ou initial. 



   La présente invention concerne également une protéine GPW comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 199 acides aminés (SEQ ID NO : 14) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. 



   La séquence d'acides aminés (SEQ ID NO : 14) et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) codant pour la protéine GPW, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 13), est donnée à la figure 3. 



   La protéine GPW de l'invention a un poids moléculaire compris entre environ 22 et 23 kDa. Elle a un point isoélectrique estimé compris entre environ 9,7 et 9,8. 



   Il semble que la protéine GPW est capable de protéger les cellules contre l'attaque de l'oxygène actif et de réparer les membranes des cellules endommagées par les radicaux oxygénés. La séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW présente une homologie avec celle qui code pour une glutathione peroxydase. 



   La protéine GPW peut être isolée à partir d'une souche de Pseudomonas Habituellement, la protéine GPW provient d'une souche de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I. De préférence, la protéine GPW provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. De bons résultats ont été obtenus avec la 

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 protéine GPW provenant de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T
92.677/1 et ayant une séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. 



   La présente invention concerne également une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) qui code pour la protéine GPW de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. 



   L'invention concerne également un vecteur contenant le système d'expression, tel que défini ci-dessus, et apte à permettre l'expression de l'enzyme
Habituellement, le vecteur selon l'invention est un plasmide. Généralement, le plasmide selon l'invention est un vecteur d'expression ou un vecteur d'intégration. 



   De préférence, le plasmide selon l'invention est un vecteur d'expression. De bons résultats ont été obtenus avec les vecteurs d'expression pRG930 : : WI12, pRG930 : : WI13, et pRG930 : : WI14. 



   L'invention concerne également une cellule transformée (cellule hôte) contenant le vecteur défini ci-dessus. 



   Dans la variante de l'invention comprenant le modulateur, la cellule transformée est choisie de telle sorte que la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur soit reconnue par cette cellule transformée, c'est à dire qu'elle soit compatible et fonctionnelle pour cette cellule transformée. 



   Généralement, la cellule transformée est une souche de bactérie. 



  Habituellement, la cellule transformée est une bactérie choisie parmi les souches d'Escherichia, de Pseudomonas ou de Bacillus. De préférence, la cellule transformée est une souche de Pseudomonas. De manière particulièrement préférée, la cellule transformée est une souche de Pseudomonas choisies parmi les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I. De bons résultats ont été obtenus avec une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus avec la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1 (LMG P-15151). 



   La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISM (LMG culture collection, Université de Gand, Laboratoire de Microbiologie-K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gand, Belgique) conformément au Traité de Budapest sous le numéro LMG P-15151 le 12 octobre 1994. 



   Dans une variante de l'invention, la souche transformée est une souche 

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 d'Escherichia coli et notamment E. coli HB 101. 



   L'invention concerne également un procédé de préparation du système d'expression. Ce procédé comprend : - l'isolement de la séquence de nucléotides d'un promoteur, de la séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion, de la séquence de nucléotides qui code pour une enzyme mature, et de la séquence de nucléotides d'un terminateur à partir de l'ADN d'un ou de plusieurs microorganismes, et - la liaison de ces séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme. 



   Dans la variante qui comprend la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur, le procédé de préparation du système d'expression comprend également l'isolement de la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur à partir de l'ADN d'un microorganisme et la liaison des séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme sous l'action du modulateur. 



   Dans la variante qui comprend la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW, le procédé de préparation du système d'expression comprend également l'isolement de la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW à partir de l'ADN d'un microorganisme et la liaison des séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme. 



   L'invention concerne également un procédé de préparation d'un vecteur comprenant le système d'expression. Ce procédé comprend l'introduction du système d'expression dans un vecteur, cette introduction étant faite dans un site choisi de telle sorte que le positionnement des séquences comprises dans le système d'expression permettent l'expression de l'enzyme. 



   Dans la variante qui comprend la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur, l'introduction est faite dans un site choisi de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme sous l'action du modulateur. 



   L'invention concerne également un procédé pour la préparation d'une cellule transformée. Ce procédé comprend la transformation d'une cellule par un vecteur contenant un système d'expression dans des conditions permettant l'introduction stable du système d'expression dans la cellule. 



   L'invention concerne également un procédé pour la production d'une enzyme. Ce procédé comprend la culture de la cellule transformée sous des 

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 conditions de culture appropriées et dans un milieu de culture adéquat pour la production de l'enzyme, et la récupération de l'enzyme obtenue. 



   Ce procédé comprend la culture de la cellule transformée capable de produire l'enzyme dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose et la récolte de l'enzyme ainsi obtenue. Ce milieu de culture peut être solide ou liquide. De préférence le milieu de culture est liquide. 



   Les conditions de culture, qui permettent d'obtenir l'enzyme de l'invention, telles que composants du milieu nutritif, paramètres de culture, température,   pH,   aération, agitation, sont bien connues de l'homme du métier. 



   Les techniques de récolte de l'enzyme sont bien connues de l'homme du métier et sont choisies selon les utilisations envisagées de la lipase. 



   Habituellement, on emploie la centrifugation, la filtration, l'ultrafiltration, l'évaporation, la microfiltration, la cristallisation ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques telle qu'une centrifugation suivie d'une ultrafiltration. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276. 



   L'enzyme peut ensuite être purifiée, si nécessaire et selon les utilisations envisagées. Les techniques de purification d'enzymes sont bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'un sel, tel que le sulfate d'ammonium, ou de solvant, tel que l'acétone ou un alcool. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 



  267-276. L'enzyme peut également être séchée par atomisation ou lyophilisation. 



  Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276. 



   L'enzyme selon l'invention a des débouchés multiples dans diverses industries, telles que, par exemple, les industries alimentaires, les industries pharmaceutiques ou les industries chimiques. 



   L'enzyme, telle une hydrolase et en particulier une lipase, peut notamment être utilisée en détergence. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans la demande de brevet britannique 1372034 et dans la demande de brevet européen   0 218   272. Dans ce cadre, elle fait partie de compositions de détergence. 



   La figure 1 (figures la et 1b) représente la séquence d'acides aminés (SEQ ID NO. 3) du modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO. 1) codant pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis, ainsi que sa traduction en acides aminés 
 EMI15.1 
 (SEQ ID NO : 2). 



   La figure 2 (figures 2a et 2b) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 10) incluant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 4) qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 7) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, la séquence intercistronique (SEQ ID NO : 11) et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. 



   La figure 3 représente la séquence d'acides aminés (SEQ ID NO : 14) de la protéine GPW et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) codant pour la protéine GPW, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 13). 



   La présente invention est illustrée par les exemples suivants. 



  Exemple 1 : Isolement et caractérisation de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été isolée d'un 
 EMI15.2 
 échantillon de terre, prélevé aux Etats-Unis dans l'état du Wisconsin. 



  1 g de terre est mis en suspension dans 10 ml d'eau déminéralisée contenant 9 g/l de NaCl. Cette suspension est diluée 10 fois avec de l'eau déminéralisée contenant 9 g/1 de NaCl. 



   1 ml de la suspension de terre diluée est étalée sur un milieu nutritif gélosé A. 



   Le milieu A contient 10 g/1 de tryptone (Difco), 5 g/1 d'extrait de levure, 
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 5 g/1 de NaCI, 20 g/1 d'agar, 2, 5 g/1 de NaHC03, 7, 5 g/1 de Na2C03, 10 g/1 d'huile d'olive, 1 g/1 d'alcool polyvinylique (25/140) et 0,01 g/1 de rhodamine B (Sigma 6626). 



   Le milieu A se prépare comme suit. 



   Une émulsion d'huile d'olive est d'abord préparée comme suit. 50 ml d'eau distillée est chauffée à   80  C.   On ajoute 1 g d'alcool polyvinylique par petites fractions à cette eau chauffée. Puis, on ajoute   10 g   d'huile d'olive à la suspension d'alcool polyvinylique. On émulsionne ensuite au moyen d'un mélangeur Ultraturax à 13500 tours par minute (tige 18 GM). On stérilise l'émulsion obtenue à   121  C   durant 30 minutes. 



   Une gélose est ensuite préparée comme suit. 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de   NaCI,   20 g d'agar sont ajoutés dans 850 ml d'eau 

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 distillée. La suspension de gélose obtenue est stérilisée à   121  C   durant 30 minutes. 



   11 de tampon carbonate (pH 9,5), contenant 25   gI1   de NaHC03 et 75   g/l   de   Na2C03,   est préparé, puis stérilisé à   121  C   durant 30 minutes. 



   Puis, on prépare 1 ml d'une solution aqueuse de (0,01 % (p/v)) rhodamine B (Sigma 6626). Cette solution est stérilisée par filtration sur une membrane de stérilisation (MILLIPORE) de 0,45 5. 



   L'émulsion d'huile d'olive stérilisée et la gélose stérilisée sont refroidies à   60  C,   puis mélangées stérilement. Ensuite, on y ajoute la solution stérilisée de rhodamine. Puis, on ajoute 100 ml de tampon carbonate stérilisé de façon à obtenir un pH de 9,5. On émulsionne, ensuite, la suspension, ainsi obtenue, au moyen d'un mélangeur Ultra-turax à 13500 tours par minute (tige 18 GM). 



   Le milieu A sur lequel la suspension de terre a été étalée, est incubé 48 
 EMI16.1 
 heures à 30  C. Les microorganismes produisant une lipase sont détectés à l'aide d'une lumière ultra-violette, ils sont entourés d'un halo fluorescent. 



   Les microorganismes détectés comme produisant une lipase, sont mis en culture sur un milieu nutritif gélosé B. 



   Le milieu B contient 10 g/1 de tryptone (Difco), 5 g/1 d'extrait de levure, 
 EMI16.2 
 5 gI1 de NaCl, 20 gI1 d'agar, 2, 5 gI1 de NaHC03, 7, 5 g/1 de Na2C03. 



   Tryptone, extrait de levure,   NaCI,   agar, qui composent le milieu B, sont mélangés avec 900 ml d'eau distillée, ensuite stérilisés à   121  C   durant 30 minutes. Le pH est ajusté à 9,5 par l'addition de 100 ml de tampon carbonate prélablement stérilisé (contenant 25 g/1 de NaHC03 et 75   gI1   de   Na2C03).   



   Le microorganisme a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques : bactérie Gram négatif, aérobie. Aucune spore n'est formée. 



   La taille des cellules végétatives est de 0,5-0, 7 um x 1,5-4, 0   um.   La mobilité des cellules végétatives est positive. Le test de la lyse par 3 % (p/v) de KOH est positif Le test de la catalase est positif en présence de 10 % (v/v) de peroxyde d'hydrogène. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 % (p/v) de   tétraméthyl-l,   4-phénylène-diammonium-dichlorure. Le test de l'uréase est négatif Le test de la réduction du nitrate est positif Des tests comparables ont 
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 notamment été décrits dans la demande de brevet européen 0 218272. 



  Cette souche est aérobie, c'est-à-dire qu'elle se développe en aérobiose Elle ne se développe pas enanaérobiose, c'est-à-dire sous une atmosphère de 84 % (v/v) N2,8 % (v/v) C02, 8 % (v/v) H2 à   37  C.   



   L'abréviation % (v/v) représente un pourcentage exprimé en volume par 

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 volume. L'abréviation % (v/p) représente un pourcentage exprimé en volume par poids. L'abréviation %   (p/v)   représente un pourcentage exprimé en poids par volume. 



   L'abréviation % (p/p) représente un pourcentage exprimé en poids par poids. 



   Cette souche n'est pas thermophile. Elle présente un développement normal après incubation sur le milieu B gélosé à 20  C, 30  C, 37  C et   41  C  
La souche ne produit pas de gaz à partir de glucose. 



   La souche utilise azelate, caprate, citrate, glucose, gluconate, L-arginine, L-histidine, bétaine et geraniol. La souche n'utilise pas adipate, phenylacétate, Larabinose et maltose. Elle n'hydrolyse pas la gélatine, l'amidon et l'esculine. 



   La souche appartient au genre Pseudomonas et au groupe RNA-I. 



   Les caractéristiques biochimiques différencient nettement la souche de Pseudomonas wisconsinensis, et notamment la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, d'une souche de Pseudomonas mendocina, d'une souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes, d'une souche de Pseudomonas alcaligenes et d'une souche de Pseudomonas stutzeri. Ceci apparait clairement à la lecture du tableau 1 rassemblant les caractéristiques biochimiques principales de ces 5 souches. 

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 EMI18.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Caractéristiques <SEP> Pseudomonas
<tb> Wisconsinensis <SEP> stutzeri <SEP> mendocina <SEP> alcali-pseudoalcaligenes
<tb> T. <SEP> 92 <SEP> 677/1 <SEP> genes
<tb> Taille <SEP> 0,5-0, <SEP> 7 <SEP> 0,7-0 <SEP> 0,7-0 <SEP> 0,5 <SEP> 0,7-0, <SEP> 8
<tb> umx <SEP> 1,5-4, <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 2,0-3 <SEP> 1,2-2, <SEP> 5
<tb> um <SEP> 1,4-2 <SEP> 1, <SEP> 4-2,, <SEP> 0
<tb> ,

   <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> Pigment <SEP> jaune <SEP> d
<tb> hydrolyse <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> l'amidon
<tb> Arginine <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> d
<tb> déhydrolase
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> Glucose
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> d <SEP> + <SEP> - <SEP> d
<tb> Gluconate
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Géraniol
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> L- <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> d <SEP> d
<tb> histidine
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> L-+ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> arginin
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> +-+ <SEP> +
<tb> Bétaine
<tb> 
 + = test positif pour 90% ou plus des souches - = test négatif pour 90% ou plus des souches d = test positif pour plus de 10 %, mais moins de 90 % des souches
La bactérie isolée appartient donc au genre Pseudomonas,

   aucune espèce connue n'a pu être   déterminée.   



   La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRORGANISMS (LMG culture collection) sous le numéro LMG P-15151 le 12 octobre 1994 

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 Exemple 2 : Production de la lipase par la souche de Pseudomonas wisconsinensis
T 92.677/1
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu B gélosé à   30  C   durant 24 heures. 



   Puis, à partir de cette culture on réalise une culture dans 25 ml d'un milieu liquide C Le milieu C contient 10   g/l   de tryptone   (Difco),   5   g/l   d'extrait de levure, 10   g/l   de   NaCI,   le pH du milieu est ajusté à 7, 0 avec NaOH 0, IN, le milieu est stérilisé à   121  C   durant 30 minutes. La culture est réalisée à   30  C   sous agitation orbitale à raison de 200 révolutions par minute avec une amplitude d'environ 2,54 cm. 



   Après 16 heures d'incubation, on introduit cette culture dans un fermenteur de 20 litres contenant 13 litres du milieu liquide D stérilisé
Le milieu D contient K2HP04 2,5   g/l,   KH2P04 2,5   g/l,   MgS04. 7H20 1 
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 g/1, (NN4) 2S04 2 g/l, (NH2) 2CO 2 g/1, CaCl2 1 g/1, farine de soja 20 g/l, extrait de levure 2   g/1,   glucose 20 g/l, antimousse Mazuöl (Mazes Chemicals) 5   g/l   Le pH est ajusté à 7,4 (par de l'acide phosphorique normal et de la soude caustique normale) avant et après stérilisation dans le fermenteur (30 minutes à   121  C).   Le glucose est stérilisé, à part, à pH 4,0 (pH ajusté avec de l'acide phosphorique normal)

   durant 30 minutes à   121  C.   Le milieu est stérilisé dans le fermenteur 30 minutes à   121 C.   



   La culture dans le fermenteur est réalisée à une température de   23OC,   sous une pression de 0,15. 105 Pa (Pa = Pascal) (0, 15 bar), avec une aération de 0,3   VVM   (volume d'air par volume de milieu de culture par minute), avec une agitation axiale de 200 tours par minutes, la régulation d'oxygène dissous étant fixée à 10 % (v/v) par régulation de la vitesse d'agitation. 



   Après 24 heures de fermentation, on mesure l'activité enzymatique de la culture, ainsi obtenue, par la technique suivante. 



   L'hydrolyse de la trioléine est quantifiée par la neutralisation des acides gras libérés sous l'action de la lipase Cette mesure est effectuée à l'aide d'un appareil de titrage automatique, appareil qui maintient le pH constant à une valeur de consigne par l'addition de NaOH 0,   01 N.   



   Une unité lipase (LU) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la libération d'une micromole d'acide gras par minute dans les conditions standards de l'essai décrit ci-après. 



   On mélange 10 g de Trioléine (Roth 5423.1) et 10 g de gomme arabique (Fluka 51200) dans 100 ml d'eau distillée On émulsionne ce mélange à l'aide d'un 

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 mélangeur   Ultra-Turrax   à 13500 tours par minutes (agitation axiale) durant 3 fois
5 minutes, en maintenant le mélange sous azote et dans un bain de glace
On prépare un tampon de dilution contenant 2,34 g/l de NaCI, 2,94   g/l   de
CaC12. 2H20 et 0,61   g/1   de Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1, 3-propanediol). 



   On utilise un appareil de titrage automatique, muni d'une burette contenant du NaOH 0, 0 IN, d'une sonde de température et d'une sonde de pH et équipé d'un réacteur thermostatisé. 



   Dans le réacteur thermostatisé à   30 C,   on introduit un barreau magnétique d'agitation, 10 ml d'émulsion de trioléine et 20 ml de tampon de dilution. Le pH de la solution, ainsi obtenue, est ajusté à 9,5 avec NaOH 0, 1N. Puis, on introduit 0,5 ml de l'échantillon à tester contenant la lipase, l'échantillon est éventuellement dilué de telle sorte qu'il ne contienne qu'un maximum de 5 LU. On contrôle le pH pendant les deux premières minutes avec NaOH O,   OIN.   Puis, on enregistre la consommation de soude entre 2 et 4 minutes, tout en maintenant le pH constant (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = VI en 51). 



   Ensuite, on réalise le même essai en   remplacant   l'échantillon contenant la lipase par 0,5 ml de tampon de dilution (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = V2 en 51). 



   On détermine une unité lipase (LU) comme suit : 1 LU/ml = (V1-V2) x dilution éventuelle de l'échantillon x 10
Par cette méthode, une activité lipase est détectée dans la culture. 



  Exemple 3 : Préparation d'une solution concentrée de lipase
On ajuste le pH de la culture, telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 2, à un pH de 8 avec de la soude caustique concentrée 10 N. 
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  Puis, on ajoute à cette culture 1 % (v/v) de Triton X-114 (SERVA 37214). Le mélange est agité doucement pendant 2 heures à 15  C. 



   Ensuite, on ajoute au mélange 1 % (v/v) d'Optifloc FC205 (SOLVAY) sous la forme d'une solution à 10 % (v/v). Le mélange est agité doucement pendant 1 heure à   15  C.   



   On centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de   4  C.   On conserve le surnageant de centrifugation. 



   On chauffe le surnageant de centrifugation à   40  C   pendant 5 minutes On observe une séparation de phases. On élimine la phase supérieure. On ajoute à la phase inférieure 35 % (v/v) d'acétone à   4  C.   On incube la suspension 15 minutes à 4    C   sous agitation modérée. 

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   Puis, on centrifuge la suspension 15 minutes à 9000 tours par minutes (BECKMAN J21, rotor JA10) à une température de   4  C.   On conserve le surnageant de centrifugation. 



   On ajoute de l'acétone au surnageant de centrifugation à   4  C   jusqu'à l'obtention d'une concentration en acétone de 65 % (v/v). On incube le mélange
16 heures à   4  C.   



   Ensuite, on centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de   4  C.   On conserve le précipité de centrifugation, que l'on met en suspension dans 150 ml d'un tampon (pH 7) contenant 5 mM de Brij 58 (ICI), 25 mM CaC12 et 20 mM Tris. 



   Puis, on centrifuge la suspension, contenant le précipité, 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de   4  C  
On conserve le surnageant de centrifugation, qui forme une solution concentrée de lipase. 



  Exemple 4 : Purification de la lipase
Pour purifier la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3, on utilise la technique de purification mettant en oeuvre une chromatographie d'interaction hydrophobe, suivie de la technique de purification mettant en oeuvre une chromatographie de tamisage moléculaire. 



   En suivant les indications d'utilisation prescrites par le fournisseur (Pharmacia) au sujet de la colonne de chromatographie d'interaction hydrophobe, on charge une colonne Phannacia Hiload 16/10 Phenyl-Sepharose (réf 17-1085- 01) avec 140 ml de la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3
On utilise, comme tampon d'équilibre, un tampon phosphate 20 mM à pH 7,2 ; comme tampon d'élution, un tampon phosphate 20 mM à pH 7,2 contenant 30 % (v/v) d'isopropanol. Le débit est fixé à 1,5 ml par minute. 



   On récupère la lipase avec la fraction éluée avec le tampon phosphate contenant l'isopropanol
On mesure l'activité enzymatique de la fraction selon la méthode décrite à l'exemple 2. 



   On diafiltre la fraction éluée, contenant la lipase, dans une cellule Amicon, munie d'une membrane YM10, avec 10 volumes d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM CaC12 et 20 mM Tris. 



   Puis, on concentre la fraction diafiltrée jusqu'à 0,5   ml   par ultrafiltration à l'aide de la même cellule   Amicon,   munie d'une membrane YM10 

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Ensuite, on injecte la fraction concentrée (0,5 ml) sur une colonne de chromatographie de tamisage moléculaire (colonne Superdex 75 HR 10/30
Pharmacia référence 17-1047-01). La séparation est initiée par un débit de 0,5 ml par minute d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM   CaC12   et 20 mM Tris. 



   Trois pics d'absorption à 280 nm sont séparés. La lipase correspond au premier pic d'absorption à 280 nm. On conserve la fraction correspondante qui contient la lipase purifiée. 



   Exemple 5 : Détermination de la séquence N-terminale de la lipase
On utilise la méthode décrite par Vandekerkhove J. et al., Eur. J. 



   Biochemistry, 152,9 (1985), pour déterminer la séquence N-terminale de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis. 



   On met en oeuvre la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4. 



   La séquence N-terminale (SEQ ID NO : 15) est la suivante : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr
1 5 10 15 Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu
20 Exemple 6 : Séquence d'acides aminés de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis
La séquence d'acides aminés (SEQ ID NO : 9) de la lipase mature est indirectement déterminée à partir de la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 7) du gène qui code pour cette lipase, dont l'obtention est décrite à l'exemple 15. 



  Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release &num;5. 4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. La lipase mature contient 286 acides aminés (SEQ ID NO : 9). 



   On vérifie que les premiers acides aminés de la séquence de la lipase, ainsi identifiés, correspondent à la séquence N-terminale déterminée à l'exemple 5. 



   On identifie, par la même technique, la séquence d'acides aminés (SEQ ID NO : 6) du signal de sécrétion de la lipase à partir de la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 4) dont l'obtention est décrite à l'exemple 15. Le signal de sécrétion contient 22 acides aminés (SEQ ID NO : 6) qui constitue le peptide signal. 



  Exemple 7 Séquence d'acides aminés du modulateur de la lipase
La séquence d'acides aminés du modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis est indirectement déterminée à partir de la séquence de nucléotides (SEQ ID   NO-1)   du gène qui code pour ce modulateur, dont l'obtention est décrite 

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 à l'exemple 15. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics
Suite Software for Molecular Biology (Release &num;5. 4) d'IntelliGenetics, Inc. USA
La figure 1 (figures la et Ib) représente la séquence d'acides aminés (SEQ
ID NO : 3) du modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1 et la séquence de nucléotides (SEQ ID   NO-1)   codant pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 2). 



   Le modulateur de la lipase contient 352 acides aminés (SEQ ID NO 3). 



  Exemple 8 : Estimation du poids moléculaire du modulateur de la lipase
On estime, par calcul, le poids moléculaire du modulateur de la lipase à partir de la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 3), comme décrit à l'exemple 7
Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release &num;5. 4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. 



   Le poids moléculaire estimé du modulateur est d'environ 39574 Daltons Exemple 9 Estimation du point isoélectrique du modulateur de la lipase
On estime, par calcul, le point isoélectrique du modulateur de la lipase à partir de la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 3), comme décrit à l'exemple 7. 



   Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release &num;5. 4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. 



   Le point isoélectrique estimé du modulateur est d'environ 4,56. 



    Exemple 10 : : Séquence d'acides aminés de la protéine GPW  
La séquence d'acides aminés de la protéine GPW de Pseudomonas wisconsinensis est indirectement déterminée à partir de la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) du gène qui code pour cette protéine, dont l'obtention est décrite à l'exemple 15. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release &num;5. 4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. 



   La figure 3 représente la séquence d'acides aminés (SEQ ID NO : 14) et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO. 12) codant pour la protéine GPW, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 13). 



   La protéine GPW contient 199 acides aminés (SEQ ID NO : 14). 



  Exemple 11 : Estimation du poids moléculaire de la protéine GPW
On estime, par calcul, le poids moléculaire de la protéine GPW à partir de la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 14), comme décrit à l'exemple 10 

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Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite
Software for Molecular Biology (Release &num;5. 4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. 



   Le poids moléculaire estimé de la protéine GPW est d'environ 22230
Daltons. 



   Exemple 12 : Estimation du point isoélectrique de la protéine GPW
On estime, par calcul, le point isoélectrique de la protéine GPW à partir de la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 14), comme décrit à l'exemple 10
Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite
Software for Molecular Biology (Release   &num;5.   4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. 



   Le point isoélectrique estimé est d'environ 9,74. 



   Exemple 13 : Clonage du gène de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T
92.677/1
1. Extraction de l'ADN chromosomique à partir de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
L'ADN génomique est préparé en suivant la technique décrite par WILSON, 1990, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1 (Unit 2.4), avec les modifications décrites ci-après. 



   A partir de la culture, telle qu'obtenue à l'exemple 2, une culture de 200 ml de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est réalisée en milieu LB liquide durant 16 heures à   37  C.   



   La composition du milieu LB liquide est la suivante. TRYPTONE (DIFCO) 10 g/1, extrait de levure 5 g/1,   NaCI 10 g/1.   Le milieu LB gélosé contient, de plus, 20 g/1 d'agar (DIFCO). 



   La culture obtenue est centrifugée (SORVALL RC 5C Plus) à 2000 G pendant 15 minutes. Le culot de centrifugation ainsi obtenu est repris dans une solution contenant 9,5 ml de tampon TE à un pH de 8,0 ; 500 ul d'une solution de SDS (sodium dodécyl sulfate) à 10 %   (p/v)   ; et 50   ul   d'une solution de protéinase K (vendue par BOEHRINGER Mannheim) à 20   mg/ml   (préparée extemporanément). 



   Le tampon TE (pH 8,0) est constitué de 10 mM TRIS-HCI (TRIS-HCI Tris (hydroxyméthyl)   aminométhane)-HCI)   et ImM EDTA (acide   éthylènediaminetétraacétique).   



   La suspension ainsi obtenue, contenant le culot de centrifugation, est incubée 90 minutes à   65  C.   
 EMI24.1 
 



  Puis, on ajoute à cette suspension 1, 8 ml d'une solution de NaCI 5 Met 15 ml d'une solution de CTAB/NaCI à 10 % (p/v) (CTAB = bromure d'ammonium 

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 cetyltriméthyle, NaCI à 0,7 M). La suspension ainsi obtenue est incubée 20 minutes à   65  C.   Un lysat est obtenu. 



   On effectue à partir de ce lysat une extraction avec 15 ml d'un mélange comprenant 24 parts/volume de chloroforme et 1 part/volume d'alcool isoamylique   (3-méthyl-l-butanol)   sous les conditions et en suivant les procédures décrites dans Molecular Cloning-a laboratory manual-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989, à la page E. 3, jusqu'à l'obtention d'une interface propre, comme cela y est décrit. 



   A la phase aqueuse récupérée, on ajoute 0,6 volumes (v/v) d'isopropanol, une suspension visqueuse est obtenue. 



   On précipite l'ADN contenu dans la suspension visqueuse selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, p. 9.18. L'ADN précipité est enroulé autour d'une pipette Pasteur, puis est lavé trois fois avec 70 % (v/v) d'éthanol. L'ADN lavé est séché 5 minutes à l'air à température ambiante. L'ADN séché est mis en suspension dans 2,5 ml de tampon TE à pH 8,0. 



   2. Construction d'une banque génomique de Pseudomonas wisconsinensis T
92677/1
A partir de la suspension obtenue ci-dessus, l'ADN chromosomique (15   ug)   de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est clivé partiellement par l'enzyme de restriction Sau3AI. On met en oeuvre la méthode par dilution successive de l'enzyme de restriction et les conditions de restriction sont celles décrites dans SAMBROOK et al., 1989, pages 5.28-5. 32. 



   Le clivage est partiellement inhibé par l'addition   d'l1 d'EDTA   0,5 M à pH 8,0 en présence de glace. 



   On détermine sur gel d'agarose (0,8 % p/v), comme décrit par SAMBROOK et al., pages 6.01-6. 19, les fractions, obtenues après le clivage, qui contiennent des fragments ayant une taille comprise entre 20 et 40 kpb. 



   L'ensemble des fragments ainsi obtenus est ensuite soumis à une précipitation selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, p.   9. 18  
Les fragments d'ADN sont ensuite ligaturés selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1. 69, avec le plasmide pRG930 (750 ng), préalablement coupé au site   BamFB   comme décrit par SAMBROOK et   al.,   1989, pages 1.60-1.   61.   On obtient une collection de plasmides que l'on dénomme pRG930 : :

   WI
Le procédé d'obtention du plasmide pRG930 est décrit dans Molecular Plant-Microbe Interactions, 1992, vol. 5 (3), pages 228-234 

 <Desc/Clms Page number 26> 

 
La ligation ainsi obtenue est utilisée pour transfecter des cellules de E coli   HB10I (PROMEGA)   en utilisant le kit vendu sous le nom de GIGAPACK II
PACKAGING EXTRACT KIT (STRATAGENE) et en suivant les recommandations d'utilisation du fabricant. 



   Les cellules transfectées d'E. coli   Ho 101   sont mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 25   ug/ml   de streptomycine et 50   ug/ml   de spectinomycine, durant environ 24 heures à   37  C.   On obtient ainsi une collection de souches transfectées que l'on dénomme E. coli   HBlOl (pRG930   : WI). 



   A partir de 12 colonies d'E. coli   HB10I (pRG930   : : WI) choisies au hasard, on isole des fragments d'ADN selon la technique décrite dans SAMBROOK et al.,
1989, page 1.85. 



   On effectue une analyse par restriction de ces fragments d'ADN (SAMBROOK et al., 1989, page 1.85) après un clivage avec les enzymes de restriction EcoRI et PstI. 



   Cette analyse indique que la taille des fragment insérés présents dans les plasmides pRG930 : : WI est comprise entre environ 20 et 30 kpb (kpb =
1000 paires de bases) et que ces fragments sont différents les uns des autres. Ceci indique que la banque génomique qui a été constituée est représentative. 



   Environ 1500 colonies d'E. coli   HB10I   (pRG930 : : WI) sont alors mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 25   ug/ml   de streptomycine et 50   uglml   de spectinomycine, durant environ 24 heures à   37  C   Ces 1500 colonies d'E. coli   HBI0l (pRG930   : : WI) constituent la banque génomique. 



    3.   Obtention d'un fragment chromosomique contenant le gène de la lipase de
Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
Enfin d'établir la séquence nucléotidique d'une sonde apte à cribler la banque génomique, on prend comme base de référence initiale la séquence Nterminale de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, telle qu'obtenue à l'exemple 5. 



   Pour lever le maximum d'ambiguïté dans la traduction des acides aminés vers les nucléotides, on prend en compte d'une part les séquences de nucléotides de plusieurs lipases produites par différentes souches de Pseudomonas et publiées dans Gilbert J. et al., Enzyme Microbiological Technology, 1993,15, p. 634-645, et, d'autre part, la propriété connue sous le nom de"codon usage"de la souche de Pseudomonas aeruginosa et publiée dans West S. et al., Nucleic Acid research, 1988,16, p. 9323-9335. 

 <Desc/Clms Page number 27> 

 



   Sur base de ces éléments on établit la séquence d'un oligonucléotide synthétique de 72 pb (pb = paire de bases). Cet oligonucléotide synthétique est préparé selon la technique décrite dans BEAUCAGE et al. (1981),
Tetrahedron Letters, 22, pages 1859-1882 et en utilisant des   ss-cyanoéthyl   phosphoramidites dans un appareil de BIOSEARCH CYCLONE
SYNTHESIZER. 



   La séquence de cet oligonucléotide synthétique est la suivante
SEQ ID NO : 16 5'-AACTACACCAAGACCAAATACCCCATCGTGCTGGTCCA-   - CGGCGTGACCGGCTTCAACACTATCGGCGGGCTC-3'  
Cet oligonucléotide synthétique est marqué à sa terminaison au moyen de y 32P ATP avec une enzyme T4 polynucléotide kinase en suivant la technique décrite dans le kit SEQUITHERM CYCLE SEQUENCING KIT   (BYOZYME).   



   Un criblage est effectué sur la banque génomique par la technique dite de "colony blot" (AMERSHAM) en utilisant comme sonde l'oligonucléotide synthétique tel que préparé ci-dessus et en suivant la technique indiquée par le fabricant. 



   Les colonies de la banque génomique (E. coli   HB101 (pRG930. WI)) sont   mises en culture durant 18 heures à   37  C   sur des membranes dites"hybond-N+" (AMERSHAM) en suivant la technique indiquée par le fabricant. 



   Les membranes (400 cm2) sont placées dans des sacs plastiques contenant 45 ml de solution de préhybridisation. 



   La solution de préhybridisation contient 15 ml de 20X SSC (3 M NaCl et 0,3 M de citrate de sodium, pH de 7,0), 5 ml de la solution de Denhardt et 500   ig   d'ADN de sperme de saumon dénaturé et fragmenté   (AMERSHAM).   



   100 ml de solution de Denhardt contient 1 g de FICOLL de type 400 (PHARMACIA), 1 g de polyvinylpyrrolidone et 1 g d'albumine de sérum bovin. 



   Les membranes placées dans des sacs plastiques sont incubées à   68  C   dans un bain-marie sous agitation (100 tours par minute, amplitude d'environ 2,54 cm) durant 4 heures. 



   Les membranes sont alors incubées avec une solution d'hybridisation à   68  C   dans un bain-marie sous agitation (100 tours par minute, amplitude d'environ 2,54 cm) durant 18 heures. 



   La solution d'hybridisation est préparée en mélangeant 5 ml de la solution de préhybridisation préchauffée à   68  C   et l'oligonucléotide synthétique marqué, et ayant été incubé au bain-marie durant 5 minutes, la concentration finale de 

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 l'oligonucléotide synthétique est de 0,3 picomoles. 



   Les membranes sont ensuite récupérées. Les membranes sont alors lavées avec une solution contenant 100 ml de 2X SSC (3 M   NaCI   et 0,03 M de citrate de sodium, pH de 7,0) et 0,1 %   (p/v)   de SDS durant 5 minutes à température ambiante. 



   Puis, les membranes lavées sont séchées entre deux papiers absorbants. 



   Les membranes séchées sont couvertes d'une feuille plastique transparente de qualité alimentaire Elles sont alors soumises à une autoradiographie aux rayons X en suivant la technique décrite par le fabricant (AMERSHAM). 



   Le criblage de la banque génomique met en évidence 80 colonies donnant un signal. Ceci montre que ces colonies contiennent un fragment d'ADN portant la séquence de nucléotides qui code pour la lipase de Pseudomonas wisconsinensis. 



   La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est utilisée comme contrôle positif et les souches   d'E.   coli HB101 et   d'E.   coli   HB101 (pRG930)   sont utilisées comme contrôle négatif. On observe un signal clair et fort pour la souche sauvage de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et aucun signal pour les souches d'E. coli HB101 et d'E. coli HB101 (pRG930). 



   La souche   d'E.   coli HB101 (pRG930) a été obtenue par la technique de la transformation décrite dans Molecular Cloning, a laboratory ManualMANIATIS et al., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 150-151, en mettant en oeuvre la souche d'E. coli HB101 et le plasmide pRG930. 



   On réalise un nouvel essai d'hybridisation, selon la technique décrite cidessus. Cet essai confirme les résultats obtenus. 



   Une colonie de la banque génomique présentant un signal fort est isolée et mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 25   ug/ml   de streptomycine et 50   ug/ml   de spectinomycine, durant environ 24 heures à   37  C.   



  Cette colonie est dénommée E. coli   HB101   (pRG930 : : WI12). 



   Un essai d'hybridisation est de nouveau effectué avec la colonie d'E. coli   HB101 (pRG930 : WI12)   en vue de confirmer les résultats obtenus. 



  Exemple 14 : Analyse du plasmide pRG930 : : WI12 présent dans la souche d'E 
 EMI28.1 
 coli HB101 (pRG930 : : WI12) 1. Analyse par la technique dite du Southem Blot
On isole l'ADN à partir de la souche d'E. coli HB101 (pRG930 : : WI12), obtenu à l'exemple 13, selon le technique décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.25-1. 28, et on effectue une analyse par restriction en utilisant l'enzyme de 

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 restriction EcoRI. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 % p/v) selon la technique décrite dans SAMBROOK et al,
1989, pages 6.01-6 19. 



   Cette analyse montre que le fragment d'ADN inséré dans le plasmide pRG930 : : WI12 a une taille d'environ 26-28 kpb (environ 27 kpb)
Puis, l'ADN est transféré sur une membrane dite"hybond-N+" (AMERSHAM) et on effectue une hybridisation en suivant la technique indiquée par le fabricant comme illustrée à l'exemple 13. Comme contrôle négatif, on utilise le plasmide pRG930. 



   On observe une seule bande donnant un signal d'hybridisation avec l'oligonucléotide synthétique (SEQ ID NO : 16) sur le gel d'électrophorèse. Le fragment porté par cette bande a une taille d'environ 24,5 kpb, il est lié au vecteur pRG930. 



    2.   Transformation de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
On effectue une conjugaison dite triparentale selon la technique décrite ciaprès. 



   La souche d'E coli   Hub101   (pRG930 : : WI12) est mise en culture dans un milieu LB liquide contenant, de plus, 25 ug/ml de streptomycine et 50   ug/ml   de spectinomycine, durant environ 18 heures à   37  C.   A partir de la culture, on prépare une nouvelle culture à   30 C   qui est arrêtée à la moitié de la phase 
 EMI29.1 
 exponentielle de croissance. Cette culture est dénommée culture A. 



  La souche d'E. coli DH5a (pRK2013) est mise en culture dans un milieu LB liquide contenant, de plus, 100 ug/ml de kanamycin, durant environ 18 heures à 37  C. A partir de la culture, on prépare une nouvelle culture à 30 C qui est arrêtée à la moitié de la phase exponentielle de croissance. Cette culture est dénommée culture B. 



   La souche d'E. coli   DH5a   (pRK2013) a été obtenue par la technique de la transformation décrite dans SAMBROOK et al., 1989, en mettant en oeuvre la souche dE. coli   DH5a   (GIBCO) et le plasmide pRK2013 (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1979, vol. 76,   N04,   pages 1648-1652). 



   La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est mise en culture dans le milieu LB liquide durant environ 18 heures à 37    C.   A partir de la culture, on prépare une nouvelle culture à   30 C   qui est arrêtée à la moitié de la phase exponentielle de croissance. Cette culture est dénommée culture   C.   



   1 ml des cultures A, B et C est centrifugé avec une centrifugeuse (EPPENDORF 5412) pendant 60 minutes Le culot de centrifugation est récupéré 

 <Desc/Clms Page number 30> 

 et lavé deux fois avec 1 ml de milieu LB liquide. Puis, il est mis en suspension dans 100   gel   de milieu LB liquide. 



   La suspension C contenant la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, obtenue après centrifugation de la culture C, est incubée à   42  C   durant 90 minutes. Les deux autres suspensions, A et B, sont maintenues à température ambiante. 



   50 ai de chaque suspension est alors mélangé. Le mélange est versé dans une boîte de Pétri contenant du milieu LB gélosé, puis est incubé 18 heures à   30  C.   



   Après incubation, le mélange est récupéré en lavant le milieu gélosé contenu dans la boîte de Pétri avec 3 ml de milieu LB liquide. 



   0,3 ml du mélange récupéré est mélangé avec 3 ml de milieu LB liquide. 



  On effectue 3 dilutions sérielles de façon identique. 



   100   ul   de chacune de ces dilutions sont étalées sur la gélose de 6 boîtes de 
 EMI30.1 
 Pétri contenant du milieu LB gélosé, 25 uglml de streptomycine, 50 uglml de spectinomycine et 100 uglml d'ampicilline, en vue d'éliminer les souches dE. coli. 



  Les boîtes de Pétri sont incubées 18 heures à 30  C. 



   A partir des cultures obtenues sur les boîtes de Pétri, on isole une souche transformée de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 qui contient le plasmide pRG930 : : WI12. Cette souche est dénommée Pseudomonas wisconsinensis RC12. 



   La souche de Pseudomonas wisconsinensis RC12 est mise en culture dans du milieu 7A durant 18 heures à   30  C.   
 EMI30.2 
 



  Pour la préparation du milieu 7A, on mélange 2, 5 g de K2HP04, 2, 5 g de KH2P04, 1 g de MgS04. 7H20, 2 g de (NJ4hS04, 2 g de (NH2) 2CO, 1 g de CaC12. 2H20, 20 g d'extrait de levure et 2 g d'antimousse (MAZUÖL) dans 960 ml d'eau distillée. Le pH de ce mélange est d'environ 7. Ce mélange est stérilisé à   121 C   durant 20 minutes. On ajoute à ce mélange stérilisé 40 ml d'une solution contenant 50 % (plv) de glucose qui a été préalablement stérilisé. 



   On mesure l'activité enzymatique (lipase) de la culture en utilisant la technique décrite à l'exemple 2. 



   Cette mesure montre que la souche de Pseudomonas wisconsinensis RC12 produit environ 20 fois plus de lipase que la souche sauvage de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. 



  Exemple 15 : Séquence de nucléotides du gène complet qui code pour la lipase de
Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 

 <Desc/Clms Page number 31> 

 
1. Obtention de la souche de Pseudomonas wisconsinensis RC 13
On effectue une analyse par restriction du plasmide pRG930 : WI12 en utilisant l'enzyme de restriction EcoRI. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 % plv) selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, pages 6.01-6. 19. 



   On effectue une analyse selon la technique du Southem Blot, telle que décrite à l'exemple 14, chapitre 1. 



   Ceci met en évidence que le fragment inséré dans le plasmide pRG930 : WI12 est formé, d'une part, de 4 fragments qui ont ensemble une taille d'environ 18,5 kpb et, d'autre part, d'un fragment attaché au vecteur pRG930 Ce fragment a une taille d'environ 8,5 kpb. 



   Le fragment de 8,5 kpb, attaché au vecteur pRG930, donne un signal d'hybridisation avec l'oligonucléotide synthétique (SEQ ID NO : 16), les 4 autres fragments ne donnent aucun signal. 



   Le fragment de 8,5 kpb attaché au vecteur pRG930 est ensuite ligaturé sur lui-même selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-
1.69. On obtient le plasmide pRG930 : : WI13. 



   La ligation ainsi obtenue est utilisée pour transformer des cellules de   E.   coli   DH5a   (GIBCO) comme décrit dans SAMBROOK et al., 1989, page 1 82- 1.84. 



   On obtient une colonie   d'E.   coli   DH5a   (pRG930 : : WI13) que l'on isole et met en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 25   ug/ml   de streptomycine et 50   ug/ml   de spectinomycine, durant environ 24 heures à   37  C.   



   On effectue une conjugaison triparentale selon la technique décrite à l'exemple 14, en mettant en oeuvre la souche   d'E.   coli   DH5a   (pRG930 : : WI13) en lieu et place de la souche   DH5a   (pRG930 : : WI12). 



   On obtient une souche dénommée Pseudomonas wisconsinensis RC13, que l'on met en culture en utilisant la technique décrite à l'exemple 2. 



   On mesure l'activité enzymatique (lipase) de la culture en utilisant la technique décrite à l'exemple 2. 



   Cette mesure montre que la souche de Pseudomonas wisconsinensis RC 13 produit environ 20 fois plus de lipase que la souche sauvage de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1. 



  2. Identification de la séquence de nucléotides de la lipase
On effectue une analyse par restriction du plasmide pRG930 : : WI13, en utilisant l'enzyme de restriction PstI. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés 

 <Desc/Clms Page number 32> 

 par électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 % plv) selon la technique décrite dans
SAMBROOK et al., 1989, pages 6.01-6. 19. 



   On effectue une analyse selon le technique du Southem Biot, telle que décrite à l'exemple 14, chapitre 1. 



  * Ceci met en évidence que le fragment inséré dans le plasmide pRG930 : WI13 est formé, d'une part, de 5 fragments et, d'autre part, d'un fragment qui a une taille d'environ 2,5 kpb. 



   Le fragment de 2,5 kpb donne un signal d'hybridisation avec l'oligonucléotide synthétique (SEQ ID NO : 16), les 5 autres fragments ne donnent aucun signal. 



   Le fragment de 2,5 kpb est ligaturé avec le vecteur pRG930 selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1. 69. On obtient le plasmide pRG930 : : WI14. 



   A partir du plasmide pRG930 : : WI14, le fragment de 2,5 kpb est inséré dans le plasmide pBLUESCRIPT par la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, page   1.     85.   On obtient le plasmide pBLUESCRIPT : : WI14. 



   Le plasmide pBLUESCRIPT peut être obtenu auprès de la société
STRATAGENE. 



   La séquence de fragment de 2,5 kpb inséré dans le plasmide pBLUESCRIPT : : WI14 est obtenue en mettant en oeuvre le kit SEQUITHERM CYCLE SEQUENCING KIT (BIOZYM) et en suivant la technique préconisée par le fabricant. 



   Pour compléter et vérifier la séquence de nucléotides obtenue, on répète l'exemple ci-dessus avec la modification suivante. On effectue l'analyse par restriction du plasmide pRG930 : : WI14, en mettant en oeuvre successivement les enzymes de restriction SalI, KpnI et SacII en lieu et place de l'enzyme de restriction Pstl. On utilise, comme sonde, la sonde (SEQ ID NO : 16) décrite à l'exemple 13. 



   On identifie, selon la méthode décrite ci-dessus, la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 7) codant pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1. 



   La séquence d'acides aminés (SEQ ID NO : 9) de la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 est obtenue par traduction (SEQ ID NO. 8) de la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 7). Cette traduction est réalisée selon la méthode décrite à l'exemple 6
On identifie, selon la méthode décrite ci-dessus, la séquence de 

 <Desc/Clms Page number 33> 

 nucléotides (SEQ ID NO : 4) du signal de sécrétion la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1. 



   La séquence d'acides aminés (SEQ   ID   NO : 6) du signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 est obtenue par traduction (SEQ ID NO : 5) de la séquence de nucléotides (SEQ ID   NO"4)   La traduction est réalisée selon la technique décrite à l'exemple 6. 



   On identifie, selon la méthode décrite ci-dessus, la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1. Cette séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1) comprend 1056 nucléotides. 



   La séquence d'acides aminés (SEQ ID NO : 3) du modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 est obtenue par traduction (SEQ ID NO : 2) de la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1). La traduction est réalisée selon la technique décrite à l'exemple 7. 



   On identifie, selon la méthode décrite ci-dessus, la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) qui code pour la protéine GPW isolée de l'opéron de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1. 



   La séquence d'acides aminés (SEQ ID NO : 14) de la protéine GPW est obtenue par traduction (SEQ ID NO : 13) de la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) La traduction est réalisée selon la technique décrite à l'exemple 10 

 <Desc/Clms Page number 34> 

 
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES : (i) DEPOSANT : (A) NOM : SOLVAY   (Societe   anonyme) (B) RUE : rue du Prince Albert, 33 (C) VILLE : Bruxelles (E) PAYS : Belgique (F) CODE POSTAL : 1050 (ii) TITRE DE L'INVENTION : Système d'expression, vecteur et cellule transformée par ce vecteur (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 16 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR : (A) TYPE DE SUPPORT : Floppy disk (B) ORDINATEUR : IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION :

   PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL :   Patientin   Release &num;1. 0, Version &num;1. 30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 1059 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 1 :

   ATGTCCAAAT TCTTCAGTCT TTCCCTGGTT GCCGTGGTGG TCGCTGGCGG CCTTACCCTG 60 

 <Desc/Clms Page number 35> 

 
TACTGGCGCT GGCCGGCAGC AGTGCCTGAA GCGCAGCCTG CTACCACTGT CGCCGTGCCG 120
TCACGGCAGT CGTTGATCGA GCAGGCTTCG ACTTCCCCCG CCAAGGCGCC CGCCGAGGCG 180
CAACCGTCAA TAGCCGTGAC CTTGCCCAGC CTGGCCGGTA CCGAGGTGGA TGGCCAGCTG 240
CGTACCGACG CGGCCGGCAA TCTGCTGCTG GATCTGGCGG TTCGCGATTA CTTCGATTAC 300 TTCCTGAGCG CGGTCGATCA TTCCGGGCTC GATGCGGTGA TCGAGGCCCT GCTGGCCGAT 360 GCCGGCCGGC GCCTGCCGGA GCCCGCACTC GGGCAGATGA TCAGCCTGCT CGGTGATTAC 420 CTTGACTACA AGCGCGCCAG CATGGCGCTG ATGCAGCAAC CACTGGATGC AAGGCAGCAG 480 GTCGAGCCGC AGGCGCAGCT ACAGGCTCTG CAGTCGGCTT TCGCGCGCCT GGACGAGCTG 540 CGCCGCGCAC ATTTCTCTGC AACTGCGCAG GAAGCGCTGT TCGGCGCCGA ACAGGCCTAT 600 GCCCGTTACA CCCTCGATAG CCTGGCAGTG CAGCAGCGTG ATGACCTCGG CGAGGCGCAG 660 CGCACGCAAC TGCTCGAACA GTTGCGTGAG CGTCTGCCCG ATGCGCTGCG CGAAAGTGAG 720 CAGCGCCAGC 

  AACTGGCCCA GGAGCAACTG CAGCGCAGCG AGCAACTCTG GCGTGATGGT 780 GCGGACGAGC AACAGGTGCG CGAGTTCCTG GCGATGACCT ATGATCCGGA CACCGTGCAG 840 CGTCTGCTTG ATGAGCAGCG TCGCGAGCGC GACTGGCAGC AGCACTACCA GGCCTATCGC 900 AATGAGTTGG CCAGCCTGCA AGGTCGGGGG CTGAGCGAGG CAGATGGCGA GCAACTGCAG 960 CGCCAGCTGC GCGAGCGGCT GTTCAGCAGT GAAGACCGAC ACCGTGTGGA AACCTATGAC 1020 GCCATTGCCG CGAAGCAGCC GGAGCCGCTC GACCCCTGA 1059 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2 : 

 <Desc/Clms Page number 36> 

 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 1059 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT : 1.. 1056 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 2 :

   ATG TCC AAA TTC TTC AGT CTT TCC CTG GTT GCC GTG GTG GTC GCT GGC 48 Met Ser Lys Phe Phe Ser Leu Ser Leu Val Ala Val Val Val Ala Gly
1 5 10 15 GGC CTT ACC CTG TAC TGG CGC TGG CCG GCA GCA GTG CCT GAA GCG CAG 96 Gly Leu Thr Leu Tyr Trp Arg Trp Pro Ala Ala Val Pro Glu Ala Gln
20 25 30 CCT GCT ACC ACT GTC GCC GTG CCG TCA CGG CAG TCG TTG ATC GAG CAG 144 Pro Ala Thr Thr Val Ala Val Pro Ser Arg Gln Ser Leu Ile Glu Gln
35 40 45 GCT TCG ACT TCC CCC GCC AAG GCG CCC GCC GAG GCG CAA CCG TCA ATA 192 Ala Ser Thr Ser Pro Ala Lys Ala Pro Ala Glu Ala Gln Pro Ser Ile
50 55 60 GCC GTG ACC TTG CCC AGC CTG GCC GGT ACC GAG GTG GAT GGC CAG CTG 240 Ala Val Thr Leu Pro Ser Leu Ala Gly Thr Glu Val Asp Gly Gln Leu
65 70 75 80 

 <Desc/Clms Page number 37> 

 
CGT ACC GAC GCG GCC GGC AAT CTG CTG CTG GAT CTG GCG GTT CGC GAT 288
Arg Thr Asp Ala Ala Gly Asn Leu Leu Leu Asp Leu Ala Val Arg Asp
85 90 95 
TAC TTC 

  GAT TAC TTC CTG AGC GCG GTC GAT CAT TCC GGG CTC GAT GCG 336
Tyr Phe Asp Tyr Phe Leu Ser Ala Val Asp His Ser Gly Leu Asp Ala
100 105 110 
GTG ATC GAG GCC CTG CTG GCC GAT GCC GGC CGG CGC CTG CCG GAG CCC 384 Val Ile Glu Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Arg Arg Leu Pro Glu Pro
115 120 125 GCA CTC GGG CAG ATG ATC AGC CTG CTC GGT GAT TAC CTT GAC TAC AAG 432 Ala Leu Gly Gln Met Ile Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Lys
130 135 140 CGC GCC AGC ATG GCG CTG ATG CAG CAA CCA CTG GAT GCA AGG CAG CAG 480 Arg Ala Ser Met Ala Leu Met Gin Gln Pro Leu Asp Ala Arg Gln Gln 145 150 155 160 GTC GAG CCG CAG GCG CAG CTA CAG GCT CTG CAG TCG GCT TTC GCG CGC 528 Val Glu Pro   Gln   Ala Gin Leu Gin Ala Leu Gin Ser Ala Phe Ala Arg
165 170 175 CTG GAC GAG CTG CGC CGC GCA CAT TTC TCT GCA ACT GCG CAG GAA GCG 576 Leu Asp Glu Leu Arg Arg Ala His Phe Ser Ala Thr Ala Gin Glu Ala
180 185 190 CTG TTC GGC 

  GCC GAA CAG GCC TAT GCC CGT TAC ACC CTC GAT AGC CTG 624 Leu Phe Gly Ala Glu Gln Ala Tyr Ala Arg Tyr Thr Leu Asp Ser Leu
195 200 205 GCA GTG CAG CAG CGT GAT GAC CTC GGC GAG GCG CAG CGC ACG CAA CTG 672 Ala Val Gin Gln Arg Asp Asp Leu Gly Glu Ala Gln Arg Thr Gln Leu
210 215 220 

 <Desc/Clms Page number 38> 

 CTC GAA CAG TTG CGT GAG CGT CTG CCC GAT GCG CTG CGC GAA AGT GAG 720 Leu Glu Gln Leu Arg Glu Arg Leu Pro Asp Ala Leu Arg Glu Ser Glu 225 230 235 240 CAG CGC CAG CAA CTG GCC CAG GAG CAA CTG CAG CGC AGC GAG CAA CTC 768 
 EMI38.1 
 Gln Arg Gln Gln Leu Ala Gln Glu Gln Leu Gln Arg Ser Glu Gln Leu 245 250 255 
TGG CGT GAT GGT GCG GAC GAG CAA CAG GTG CGC GAG TTC CTG GCG ATG 816
Trp Arg Asp Gly Ala Asp Glu   Gln     Gln   Val Arg Glu Phe Leu Ala Met
260 265 270 ACC TAT GAT CCG GAC ACC GTG CAG CGT CTG CTT GAT GAG CAG CGT CGC 864 Thr Tyr Asp Pro Asp Thr 

  Val Gln Arg Leu Leu Asp Glu Gln Arg Arg
275 280 285 GAG CGC GAC TGG CAG CAG CAC TAC CAG GCC TAT CGC AAT GAG TTG GCC 912 Glu Arg Asp Trp   Gln   Gln His Tyr Gln Ala Tyr Arg Asn Glu Leu Ala
290 295 300 AGC CTG CAA GGT CGG GGG CTG AGC GAG GCA GAT GGC GAG CAA CTG CAG 960 Ser Leu Gln Gly Arg Gly Leu Ser Glu Ala Asp Gly Glu Gln Leu Gln 305 310 315 320 CGC CAG CTG CGC GAG CGG CTG TTC AGC AGT GAA GAC CGA CAC CGT GTG 1008 Arg Gln Leu Arg Glu Arg Leu Phe Ser Ser Glu Asp Arg His Arg Val
325 330 335 GAA ACC TAT GAC GCC ATT GCC GCG AAG CAG CCG GAG CCG CTC GAC CCC 1056 Glu Thr Tyr Asp Ala Ile Ala Ala Lys Gln Pro Glu Pro Leu Asp Pro
340 345 350 TGA 1059 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 3 : 

 <Desc/Clms Page number 39> 

 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

   (A) LONGUEUR : 352 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 3 : Met Ser Lys Phe Phe Ser Leu Ser Leu Val Ala Val Val Val Ala Gly
1 5 10 15 Gly Leu Thr Leu Tyr Trp Arg Trp Pro Ala Ala Val Pro Glu Ala Gln
20 25 30 Pro Ala Thr Thr Val Ala Val Pro Ser Arg Gln Ser Leu Ile Glu Gln
35 40 45 Ala Ser Thr Ser Pro Ala Lys Ala Pro Ala Glu Ala Gln Pro Ser Ile
50 55 60 Ala Val Thr Leu Pro Ser Leu Ala Gly Thr Glu Val Asp Gly Gln Leu
65 70 75 80 Arg Thr Asp Ala Ala Gly Asn Leu Leu Leu Asp Leu Ala Val Arg Asp
85 90 95 Tyr Phe Asp Tyr Phe Leu Ser Ala Val Asp His Ser Gly Leu Asp Ala
100 105 110 Val Ile Glu Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Arg Arg Leu Pro Glu Pro
115 120 125 Ala Leu Gly Gln Met Ile Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Lys
130 135 140 

 <Desc/Clms Page number 40> 

 Arg Ala Ser Met 

  Ala Leu Met Gln Gln Pro Leu Asp Ala Arg Gln Gln 145 150 155 160 Val Glu Pro   Gln   Ala Gln Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ala Phe Ala Arg
165 170 175 Leu Asp Glu Leu Arg Arg Ala His Phe Ser Ala Thr Ala Gln Glu Ala
180 185 190 Leu Phe Gly Ala Glu Gln Ala Tyr Ala Arg Tyr Thr Leu Asp Ser Leu
195 200 205 Ala Val   Gln     Gln   Arg Asp Asp Leu Gly Glu Ala   Gln   Arg Thr Gln Leu
210 215 220 Leu Glu Gln Leu Arg Glu Arg Leu Pro Asp Ala Leu Arg Glu Ser Glu 225 230 235 240 
 EMI40.1 
 Gln Arg Gln Gln Leu Ala Gln Glu Gln Leu Gln Arg Ser Glu Gln Leu 245 250 255 Trp Arg Asp Gly Ala Asp Glu Gln Gln Val Arg Glu Phe Leu Ala Met 
260 265 270 Thr Tyr Asp Pro Asp Thr Val Gln Arg Leu Leu Asp Glu Gln Arg Arg
275 280 285 Glu Arg Asp Trp Gln Gln His Tyr Gln Ala Tyr Arg Asn Glu Leu Ala
290 295 300 Ser Leu Gln Gly Arg Gly Leu Ser Glu Ala 

  Asp Gly Glu Gln Leu Gln 305 310 315 320 Arg Gln Leu Arg Glu Arg Leu Phe Ser Ser Glu Asp Arg His Arg Val
325 330 335 

 <Desc/Clms Page number 41> 

 Glu Thr Tyr Asp Ala Ile Ala Ala Lys Gln Pro Glu Pro Leu Asp Pro
340 345 350 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 66 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 4 : ATGCGTCGCG TCTATACCGC TGCCCTGGCA ACACTCGCTC TGCTTGGCGC CGTCGAGGCC 60 CAGGCC 66 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 66 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE :

   CDS (B) EMPLACEMENT : 1.. 66 

 <Desc/Clms Page number 42> 

 (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE :    sig-peptide   (B) EMPLACEMENT : 1.. 66 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 5 : ATG CGT CGC GTC TAT ACC GCT GCC CTG GCA ACA CTC GCT CTG CTT GGC 48
Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15 GCC GTC GAG GCC CAG GCC 66 Ala Val Glu Ala   Gln   Ala
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 22 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 6 : Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15 Ala Val Glu Ala   Gln   Ala
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID   NO : 7   :

   (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : 

 <Desc/Clms Page number 43> 

 (A) LONGUEUR : 861 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (v) TYPE DE FRAGMENT : interne (vi) ORIGINE : (A) ORGANISME : Pseudomonas (B) SOUCHE : Pseudomonas wisconsinensis (C) INDIVIDU/ISOLE : T 92.677/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 7 :

   AACTACACCA AGACCAAGTA TCCGATCGTG CTGGTACACG GCGTGACCGG GTTCAATACC 60 ATCGGCGGGC TGGTCAATTA CTTCCATACC ATTCCCTGGA ACCTAGAGCG CGATGGCGCC 120 CGGGTGCACG TCGCCAGTGT CGCTGCCTTC AATGACAGCG AGCAGCGCGG CGCCGAGCTG 180 GCCCGGCAGA TCGTGCCCTG GGCCGCAGGC GGAGGCGGCA AGGTCAACCT GATCGGCCAC 240 AGTCAGGGCT CGCCGACCTC GCGCGTGGCG GCTTCGTTGC GGCCGGATCT GGTGGCATCG 300 GTGACCTCGA TCAACGGCGT CAACAAGGGC TCCAAGGTCG CCGATGTGGT GCGCGGCGTG 360 CTGCCACCGG GTAGCGGTAT CGAAGGCGGC GCCAATGCCA TCGCCAACGC CCTCGGTGCG 420 GTGATCAATC TGCTGTCTGG CTCAAGCAAC CCGCAAAACG GTATCAACGC GCTAGGCACC 480 CTGACCACCG CGGGCACCAG TGCGCTGAAC AGTCGCCACC CGTGGGGCGT CAACACCAGC 540 AGCTACTGCG CCAAGTCCAC CGAAGTGCAC AATGTGCGCG GTCACAGCAT CCGCTACTAC 600 

 <Desc/Clms Page number 44> 

 
TCCTGGACCG GTAATGCCGC CTATACCAAC GTGCTCGATG CGGCCGATCC CTTCCTGGCC 660 
TTCACCGGCC TGGTGTTCGG CAGCGAGAAG AACGACGGTC TGGTGGGCGT ATGTTCCACC 720 
TATCTGGGGC 

  AGGTGATCGA CGACAGCTAC AACATGAACC ACGTCGATGC GATCAACCAC 780 
CTGTTCGGCA TTCGTGGCTG GACCGAACCG GTGTCGCTGT ATCGCCAGCA CGCCAACCGC 840 
CTGAAGAACA AGGGCGTCTG A 861 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 8 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 861 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT :   !..   858 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 8 :

   AAC TAC ACC AAG ACC AAG TAT CCG ATC GTG CTG GTA CAC GGC GTG ACC 48 Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr
1 5 10 15 GGG TTC AAT ACC ATC GGC GGG CTG GTC AAT TAC TTC CAT ACC ATT CCC 96 Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn Tyr Phe His Thr Ile Pro
20 25 30 

 <Desc/Clms Page number 45> 

 
TGG AAC CTA GAG CGC GAT GGC GCC CGG GTG CAC GTC GCC AGT GTC GCT 144
Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val His Val Ala Ser Val Ala
35 40 45 GCC TTC AAT GAC AGC GAG CAG CGC GGC GCC GAG CTG GCC CGG CAG ATC 192 Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gln Arg Gly Ala Glu Leu Ala Arg Gln Ile
50 55 60 GTG CCC TGG GCC GCA GGC GGA GGC GGC AAG GTC AAC CTG ATC GGC CAC 240 Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Val Asn Leu Ile Gly His
65 70 75 80 AGT CAG GGC TCG CCG ACC TCG CGC GTG GCG GCT TCG TTG CGG CCG GAT 288 Ser Gln Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala Ala Ser Leu Arg Pro Asp
85 90 95 CTG GTG GCA 

  TCG GTG ACC TCG ATC AAC GGC GTC AAC AAG GGC TCC AAG 336 Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly Val Asn Lys Gly Ser Lys
100 105 110 GTC GCC GAT GTG GTG CGC GGC GTG CTG CCA CCG GGT AGC GGT ATC GAA 384 Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro Pro Gly Ser Gly Ile Glu
115 120 125 GGC GGC GCC AAT GCC ATC GCC AAC GCC CTC GGT GCG GTG ATC AAT CTG 432 Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu Gly Ala Val Ile Asn Leu
130 135 140 CTG TCT GGC TCA AGC AAC CCG CAA AAC GGT ATC AAC GCG CTA GGC ACC 480 Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gln Asn Gly Ile Asn Ala Leu Gly Thr 145 150 155 160 CTG ACC ACC GCG GGC ACC AGT GCG CTG AAC AGT CGC CAC CCG TGG GGC 528 Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn Ser Arg His Pro Trp Gly
165 170 175 

 <Desc/Clms Page number 46> 

 
GTC AAC ACC AGC AGC TAC TGC GCC AAG TCC ACC GAA GTG CAC AAT GTG 576
Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser Thr Glu Val His Asn Val
180 185 190 
CGC 

  GGT CAC AGC ATC CGC TAC TAC TCC TGG ACC GGT AAT GCC GCC TAT 624 Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp Thr Gly Asn Ala Ala Tyr
195 200 205 ACC AAC GTG CTC GAT GCG GCC GAT CCC TTC CTG GCC TTC ACC GGC CTG 672 Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe Leu Ala Phe Thr Gly Leu
210 215 220 GTG TTC GGC AGC GAG AAG AAC GAC GGT CTG GTG GGC GTA TGT TCC ACC 720 Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu Val Gly Val Cys Ser Thr 225 230 235 240 TAT CTG GGG CAG GTG ATC GAC GAC AGC TAC AAC ATG AAC CAC GTC GAT 768 Tyr Leu Gly Gln Val Ile Asp Asp Ser Tyr Asn Met Asn His Val Asp
245 250 255 GCG ATC AAC CAC CTG TTC GGC ATT CGT GGC TGG ACC GAA CCG GTG TCG 816 Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly Trp Thr Glu Pro Val Ser
260 265 270 CTG TAT CGC CAG CAC GCC AAC CGC CTG AAG AAC AAG GGC GTC TGA 861 Leu Tyr Arg Gln His Ala Asn Arg Leu Lys Asn Lys Gly Val
275 280 285 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 9 :

   (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 286 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire 

 <Desc/Clms Page number 47> 

 (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 9 : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr
1 5 10 15 Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn Tyr Phe His Thr Ile Pro
20 25 30 Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val His Val Ala Ser Val Ala
35 40 45 Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gln Arg Gly Ala Glu Leu Ala Arg Gln Ile
50 55 60 Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Val Asn Leu Ile Gly His
65 70 75 80 Ser Gln Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala Ala Ser Leu Arg Pro Asp
85 90 95 Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly Val Asn Lys Gly Ser Lys
100 105 110 Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro Pro Gly Ser Gly Ile Glu
115 120 125 Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu Gly Ala Val Ile 

  Asn Leu
130 135 140 Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gln Asn Gly Ile Asn Ala Leu Gly Thr 145 150 155 160 Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn Ser Arg His Pro Trp Gly
165 170 175 

 <Desc/Clms Page number 48> 

 
Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser Thr Glu Val His Asn Val
180 185 190 
Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp Thr Gly Asn Ala Ala Tyr
195 200 205 
Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe Leu Ala Phe Thr Gly Leu
210 215 220 
Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu Val Gly Val Cys Ser Thr
225 230 235 240 
Tyr Leu Gly Gln Val Ile Asp Asp Ser Tyr Asn Met Asn His Val Asp
245 250 255 Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly Trp Thr Glu Pro Val Ser
260 265 270 
Leu Tyr Arg Gln His Ala Asn Arg Leu Lys Asn Lys Gly Val
275 280 285 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 10 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

   (A) LONGUEUR : 2028 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 10 : ATGCGTCGCG TCTATACCGC TGCCCTGGCA ACACTCGCTC TGCTTGGCGC CGTCGAGGCC 60 

 <Desc/Clms Page number 49> 

 
CAGGCCAACT ACACCAAGAC CAAGTATCCG ATCGTGCTGG TACACGGCGT GACCGGGTTC 120
AATACCATCG GCGGGCTGGT CAATTACTTC CATACCATTC CCTGGAACCT AGAGCGCGAT 180
GGCGCCCGGG   TGCACGTCGC   CAGTGTCGCT GCCTTCAATG ACAGCGAGCA GCGCGGCGCC 240
GAGCTGGCCC GGCAGATCGT GCCCTGGGCC GCAGGCGGAG GCGGCAAGGT CAACCTGATC 300
GGCCACAGTC AGGGCTCGCC GACCTCGCGC GTGGCGGCTT CGTTGCGGCC GGATCTGGTG 360 GCATCGGTGA CCTCGATCAA CGGCGTCAAC AAGGGCTCCA AGGTCGCCGA   TGTGGTGCGC   420 GGCGTGCTGC CACCGGGTAG CGGTATCGAA GGCGGCGCCA ATGCCATCGC CAACGCCCTC 480 GGTGCGGTGA TCAATCTGCT GTCTGGCTCA AGCAACCCGC 

  AAAACGGTAT CAACGCGCTA 540 GGCACCCTGA CCACCGCGGG CACCAGTGCG CTGAACAGTC GCCACCCGTG GGGCGTCAAC 600 ACCAGCAGCT ACTGCGCCAA GTCCACCGAA GTGCACAATG TGCGCGGTCA CAGCATCCGC 660 TACTACTCCT GGACCGGTAA TGCCGCCTAT ACCAACGTGC TCGATGCGGC CGATCCCTTC 720 CTGGCCTTCA CCGGCCTGGT GTTCGGCAGC GAGAAGAACG ACGGTCTGGT GGGCGTATGT 780 TCCACCTATC TGGGGCAGGT GATCGACGAC AGCTACAACA TGAACCACGT CGATGCGATC 840 AACCACCTGT TCGGCATTCG TGGCTGGACC GAACCGGTGT CGCTGTATCG CCAGCACGCC 900 AACCGCCTGA AGAACAAGGG CGTCTGATCC CGGTGAACGC GGCGGGGCAA CTCGCCGCAG 960 TGAGGTCGCA TGTCCAAATT CTTCAGTCTT TCCCTGGTTG CCGTGGTGGT CGCTGGCGGC 1020   CTTACCCTGT   ACTGGCGCTG GCCGGCAGCA GTGCCTGAAG CGCAGCCTGC TACCACTGTC 1080 GCCGTGCCGT CACGGCAGTC GTTGATCGAG CAGGCTTCGA CTTCCCCCGC CAAGGCGCCC 1140 

 <Desc/Clms Page number 50> 

 
GCCGAGGCGC AACCGTCAAT AGCCGTGACC TTGCCCAGCC TGGCCGGTAC CGAGGTGGAT 1200 
GGCCAGCTGC GTACCGACGC GGCCGGCAAT 

  CTGCTGCTGG ATCTGGCGGT TCGCGATTAC 1260 
TTCGATTACT TCCTGAGCGC GGTCGATCAT TCCGGGCTCG ATGCGGTGAT CGAGGCCCTG 1320 
CTGGCCGATG CCGGCCGGCG CCTGCCGGAG CCCGCACTCG GGCAGATGAT CAGCCTGCTC 1380 
GGTGATTACC TTGACTACAA GCGCGCCAGC ATGGCGCTGA TGCAGCAACC ACTGGATGCA 1440 AGGCAGCAGG TCGAGCCGCA GGCGCAGCTA CAGGCTCTGC AGTCGGCTTT CGCGCGCCTG 1500 
GACGAGCTGC GCCGCGCACA TTTCTCTGCA ACTGCGCAGG AAGCGCTGTT CGGCGCCGAA 1560 
CAGGCCTATG CCCGTTACAC CCTCGATAGC CTGGCAGTGC AGCAGCGTGA TGACCTCGGC 1620 GAGGCGCAGC GCACGCAACT GCTCGAACAG TTGCGTGAGC GTCTGCCCGA TGCGCTGCGC 1680 GAAAGTGAGC AGCGCCAGCA ACTGGCCCAG GAGCAACTGC AGCGCAGCGA GCAACTCTGG 1740 CGTGATGGTG CGGACGAGCA ACAGGTGCGC GAGTTCCTGG CGATGACCTA TGATCCGGAC 1800 ACCGTGCAGC GTCTGCTTGA TGAGCAGCGT CGCGAGCGCG ACTGGCAGCA GCACTACCAG 1860 GCCTATCGCA ATGAGTTGGC CAGCCTGCAA GGTCGGGGGC TGAGCGAGGC AGATGGCGAG 1920 CAACTGCAGC GCCAGCTCGG CGAGCGGCTG TTCAGCAGTG AAGACCGACA CCGTGTGGAA 1980 

  ACCTATGACG CCATTGCCGC GAAGCAGCCG GAGCCGCTCG ACCCCTGA 2028 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 11 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 42 paires de bases 

 <Desc/Clms Page number 51> 

 (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 11 : 
TCCCGGTGAA CGCGGCGGGG CAACTCGCCG CAGTGAGGTC GC 42 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 12 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 600 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 12 :

   GTGTCCGGCC ATGCTCCAGG CGAACTGCCC AAGCTGCGCG CCAAAGGTGA AAACATCGAG 60 CTCTGTCAGT ACGCGGGCAA GCCGCTGGTG GTGGTCAATA CCGCCAGCTT TTGCGGCTTC 120 ACCCCGCAAT TCAAAGGGCT TGAAGCGCTT TACCAGCGGT ACAAGGATCA GGAACTGGAG 180 GTATTGGGCG TGCCGTCCGA CGACTTCCGC CAGGAATCCG CCGATAGCAA GGAAACGGCC 240 ACCGTCTGCT ACGTCAACTA CGGCGTGACC TTCGCCATGA CCGAACCGCA GCCGGTTTCC 300 GGTGCCAATG CCATCCCGTT GTTCAAGGGC CTGGCCGAGC AGAGCCGGCA GCCGCGCTGG 360 AACTTCTTCA AGTACGTGGT CGACCGTCAG GGCAAGGTGG TGGCGAGTTT CTCCAGCCTG 420 

 <Desc/Clms Page number 52> 

 
ACCAAGCCTG ACGATCCCGA GCTGATTGCC GCCCGTAGAG AAGGCGATCG CCTCGCAACC 480 
CTGATTCCGT CCCGCTTCAC GGCCCTTCAC CCATCTGGGC GATGGGCCTT GTCCGTCTGC 540 
CTGCCTAGAC TGGCCAGGCG CCGGACGCAG TTCACCCGGC GTGCCCTACA AGAACAATGA 600 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 13 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

   (A) LONGUEUR : 600 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT : 1.. 597 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 13 : GTG TCC GGC CAT GCT CCA GGC GAA CTG CCC AAG CTG CGC GCC AAA GGT 48 Val Ser Gly His Ala Pro Gly Glu Leu Pro Lys Leu Arg Ala Lys Gly
1 5 10 15 GAA AAC ATC GAG CTC TGT CAG TAC GCG GGC AAG CCG CTG GTG GTG GTC 96 Glu Asn Ile Glu Leu Cys Gln Tyr Ala Gly Lys Pro Leu Val Val Val
20 25 30 AAT ACC GCC AGC TTT TGC GGC TTC ACC CCG CAA TTC AAA GGG CTT GAA 144 Asn Thr Ala Ser Phe Cys Gly Phe Thr Pro Gln Phe Lys Gly Leu Glu
35 40 45 

 <Desc/Clms Page number 53> 

 
GCG CTT TAC CAG CGG TAC AAG GAT CAG GAA CTG GAG GTA TTG GGC GTG 192
Ala Leu Tyr Gln Arg Tyr Lys Asp   Gln   Glu Leu Glu Val Leu Gly Val
50 55 

  60 
CCG TCC GAC GAC TTC CGC CAG GAA TCC GCC GAT AGC AAG GAA ACG GCC 240
Pro Ser Asp Asp Phe Arg Gln Glu Ser Ala Asp Ser Lys Glu Thr Ala
65 70 75 80 ACC GTC TGC TAC GTC AAC TAC GGC GTG ACC TTC GCC ATG ACC GAA CCG 288 Thr Val Cys Tyr Val Asn Tyr Gly Val Thr Phe Ala Met Thr Glu Pro
85 90 95 CAG CCG GTT TCC GGT GCC AAT GCC ATC CCG TTG TTC AAG GGC CTG GCC 336 Gln Pro Val Ser Gly Ala Asn Ala Ile Pro Leu Phe Lys Gly Leu Ala
100 105 110 GAG CAG AGC CGG CAG CCG CGC TGG AAC TTC TTC AAG TAC GTG GTC GAC 384 Glu   Gln   Ser Arg   Gln   Pro Arg Trp Asn Phe Phe Lys Tyr Val Val Asp
115 120 125 CGT CAG GGC AAG GTG GTG GCG AGT TTC TCC AGC CTG ACC AAG CCT GAC 432 Arg Gln Gly Lys Val Val Ala Ser Phe Ser Ser Leu Thr Lys Pro Asp
130 135 140 GAT CCC GAG CTG ATT GCC GCC CGT AGA GAA GGC GAT CGC CTC GCA ACC 480 Asp Pro Glu Leu Ile Ala Ala Arg Arg Glu Gly Asp Arg Leu Ala 

  Thr 145 150 155 160 CTG ATT CCG TCC CGC TTC ACG GCC CTT CAC CCA TCT GGG CGA TGG GCC 528 Leu Ile Pro Ser Arg Phe Thr Ala Leu His Pro Ser Gly Arg Trp Ala
165 170 175 TTG TCC GTC TGC CTG CCT AGA CTG GCC AGG CGC CGG ACG CAG TTC ACC 576 Leu Ser Val Cys Leu Pro Arg Leu Ala Arg Arg Arg Thr Gln Phe Thr
180 185 190 

 <Desc/Clms Page number 54> 

 
CGG CGT GCC CTA CAA GAA CAA TGA 600
Arg Arg Ala Leu Gln Glu Gln
195 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 14 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 199 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 14 :

   Val Ser Gly His Ala Pro Gly Glu Leu Pro Lys Leu Arg Ala Lys Gly
1 5 10 15 Glu Asn Ile Glu Leu Cys Gln Tyr Ala Gly Lys Pro Leu Val Val Val
20 25 30 Asn Thr Ala Ser Phe Cys Gly Phe Thr Pro Gln Phe Lys Gly Leu Glu
35 40 45 Ala Leu Tyr Gln Arg Tyr Lys Asp Gln Glu Leu Glu Val Leu Gly Val
50 55 60 Pro Ser Asp Asp Phe Arg Gln Glu Ser Ala Asp Ser Lys Glu Thr Ala
65 70 75 80 Thr Val Cys Tyr Val Asn Tyr Gly Val Thr Phe Ala Met Thr Glu Pro
85 90 95 Gln Pro Val Ser Gly Ala Asn Ala Ile Pro Leu Phe Lys Gly Leu Ala
100 105 110 

 <Desc/Clms Page number 55> 

 Glu Gln Ser Arg Gln Pro Arg Trp Asn Phe Phe Lys Tyr Val Val Asp
115 120 125 Arg Gln Gly Lys Val Val Ala Ser Phe Ser Ser Leu Thr Lys Pro Asp
130 135 140 Asp Pro Glu Leu Ile Ala Ala Arg Arg Glu Gly Asp Arg Leu Ala Thr 145 150 155 160 Leu Ile Pro Ser Arg Phe Thr Ala Leu His Pro Ser Gly Arg Trp Ala
165 170 175 Leu Ser Val Cys Leu Pro Arg Leu 

  Ala Arg Arg Arg Thr Gln Phe Thr
180 185 190 Arg Arg Ala Leu Gln Glu Gln
195 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 15 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 24 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : peptide (v) TYPE DE FRAGMENT : N-terminal (vi) ORIGINE : (A) ORGANISME : Pseudomonas (B) SOUCHE : Pseudomonas wisconsinensis (C) INDIVIDU/ISOLE : T 92.677/1 

 <Desc/Clms Page number 56> 

 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 15 : 
Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr
1 5 10 15 
Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 16 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 72 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE :

   Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION :/desc   ="oligonucleotide   synthétique" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 16 : AACTACACCA AGACCAAATA CCCCATCGTG CTGGTCCACG GCGTGACCGG CTTCAACACT 60 ATCGGCGGGC TC 72

Claims (33)

  1. EMI57.1
    R E V E N D I C A T I O N S REVENDICATIONS 1. - Système d'expression utilisable pour la production de lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis, qui comprend au moins : - la séquence de nucléotides d'un promoteur, - la séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion d'une lipase, - la séquence de nucléotides qui code pour une lipase mature, et - la séquence de nucléotides d'un terminateur.
  2. 2.-Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides du promoteur provient d'une souche de Pseudomonas.
  3. 3.-Système d'expression selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides du promoteur provient d'une lipase.
  4. 4.-Système d'expression selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides du promoteur provient d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
  5. 5.-Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion provient d'une souche de Pseudomonas.
  6. 6.-Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides qui code pour la lipase mature provient d'une souche de Pseudomonas.
  7. 7.-Système d'expression selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de nucléotides qui code pour une lipase mature d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. <Desc/Clms Page number 58>
  8. 8.-Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides du terminateur provient d'une souche de Pseudomonas.
  9. 9. - Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides du terminateur provient d'une lipase.
  10. 10.-Système d'expression selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides du terminateur provient d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
  11. 11. - Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence de nucléotides qui code pour un modulateur et qui provient de l'opéron d'une lipase.
  12. 12.-Système d'expression selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur provient d'une souche de Pseudomonas.
  13. 13.-Système d'expression selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur est une séquence de nucléotides qui code pour un modulateur provenant de l'opéron d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
  14. 14.-Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la séquence de nucléotides qui code pour une protéine GPW.
  15. 15.-Système d'expression selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW provient d'une souche de Pseudomonas.
  16. 16.-Système d'expression selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW provient de l'opéron d'une lipase. <Desc/Clms Page number 59>
  17. 17.-Système d'expression selon la revendication 14,15 ou 16, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW est une séquence de nucléotides qui code pour une protéine GPW d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
  18. 18.-Modulateur comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 352 acides aminés (SEQ ID NO : 3) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
  19. 19.-Molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 1) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
  20. 20.-Protéine GPW comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 199 acides aminés (SEQ ID NO : 14) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
  21. 21.-Molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
  22. 22.-Vecteur comprenant le système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 21.
  23. 23.-Vecteur selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pRG930 : : WI12 ou pRG930 : : WI13 ou pRG930 : : WI14.
  24. 24.-Cellule transformée contenant le vecteur selon la revendication 22 ou 23.
  25. 25.-Cellule transformée selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Pseudomonas ou d'Escherichia.
  26. 26.-Cellule transformée selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche de Pseudomonas wisconsinensis ou d'Escherichia coli.
  27. 27.-Procédé de préparation du système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le procédé comprend : <Desc/Clms Page number 60> - l'isolement de la séquence de nucléotides d'un promoteur, de la séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion d'une lipase, de la séquence de nucléotides qui code pour une lipase mature, et de la séquence de nucléotides d'un terminateur à partir de l'ADN d'un ou de plusieurs microorganismes, et - la liaison de ces séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permet l'expression de la lipase.
  28. 28.-Procédé de préparation du système d'expression selon la revendication 27, caractérisé en ce que le procédé comprend également l'isolement de la séquence de nucléotides qui code pour le modulateur d'une lipase à partir de l'ADN d'un microorganisme et la liaison des séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permet l'expression de la lipase sous l'action du modulateur.
  29. 29.-Procédé de préparation du système d'expression selon la revendication 27, caractérisé en ce que le procédé comprend également l'isolement de la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW à partir de l'ADN d'un microorganisme et la liaison des séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permet l'expression de la lipase.
  30. 30.-Procédé de préparation d'un vecteur selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que le procédé comprend l'introduction du système d'expression dans un vecteur, cette introduction étant faite dans un site choisi de telle sorte que le positionnement des séquences comprises dans le système d'expression permet l'expression de la lipase.
  31. 31.-Procédé pour la préparation d'un cellule transformée selon la revendication 24,25 ou 26, caractérisé en ce que le procédé comprend la transformation d'une cellule <Desc/Clms Page number 61> par un vecteur contenant un système d'expression dans des conditions permettant l'introduction stable du système d'expression dans la cellule.
  32. 32.-Procédé pour la production d'une lipase, caractérisé en ce que le procédé comprend la culture de la cellule transformée selon la revendication 24,25 ou 26 sous des conditions de culture appropriées et dans un milieu de culture adéquat pour la production de la lipase, et la récupération de la lipase obtenue.
  33. 33.-Lipase produite par la cellule transformée selon la revendication 24,25 ou 26.
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