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Lipase. microorganisme la produisant. procédé de préparation de cette lipase et utilisations de celle-ci
L'invention concerne une nouvelle lipase. L'invention concerne également une nouvelle souche de microorganisme produisant cette lipase.
L'invention concerne également les procédés de préparation de cette lipase, les utilisations de celle-ci et les compositions comprenant celle-ci.
Il est connu d'inclure des lipases dans les compositions détergentes en vue d'éliminer les dépôts gras des tissus (Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645). Ces dépôts gras contiennent des triglycérides apportés, par exemples, par le sébum, les différents produits alimentaires (huile, sauce, beurre, matières grasses), les produits cosmétiques. Les lipases hydrolysent les triglycérides en formant des produits plus solubles dans l'eau, mono-et di-glycérides, glycérol et acides gras libres.
Des lipases utilisables dans des compositions détergentes sont connues, telles que notamment des lipases provenant de souches de Pseudomonas, par exemples la lipase produite par la souche de Pseudomonas stutzeri (demande de brevet britanique 1372034), la lipase produite par la souche de Pseudomonas mendocina (demande de brevet européen 0 571 982), la lipase produite par la souche de Pseudomonas alcaligenes (brevet US 5,063, 160), et la lipase produite par la souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes (demande de brevet européen 0 218 272). Cependant, malgré les propriétés de ces lipases, les compositions détergentes contenant ces enzymes sembleraient peu efficaces.
En conséquence, il y a actuellement un besoin pour une lipase utilisable dans le domaine de la détergence, très stable et également très active dans une large gamme de pH et de température. De plus, il y a également un besoin pour une lipase particulièrement efficace sur les taches grasses, et cela à faible dose d'enzyme. De plus, il y a également un besoin pour une lipase particulièrement efficace sur les taches grasses dès les premiers cycles de lavage.
La présente invention a pour but de fournir une nouvelle lipase, active dans une large gamme de température, active dans une large gamme de pH
EMI1.1
alcalin, et efficace dès le premier cycle de lavage.
Zn
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La présente invention a également pour but d'identifier, isoler et fournir une souche, en particulier une souche de Pseudomonas, qui produit naturellement ladite lipase.
La présente invention a également pour but de préparer et fournir une composition contenant cette lipase, et en particulier une composition détergente.
A cet effet, la présente invention concerne une lipase, isolée et purifiée, provenant d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. La présente invention concerne également une lipase, isolée et purifiée, provenant d'un dérivé ou d'un mutant d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis capable de produire cette lipase. De préférence la lipase de l'invention provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire cette lipase. La lipase de l'invention est dérivée de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. La lipase est classifiée dans le système international sous le numéro E. C. 3.1. 1.3. ; il s'agit d'une glycérol ester hydrolase.
De préférence, la lipase, isolée et purifiée, a un poids moléculaire d'environ 30 kDa. Elle est essentiellement extracellulaire.
La séquence N-terminale d'acides aminés (SEQ ID NO : 1) de la lipase de l'invention est la suivante : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr Gly 1 5 10 15 Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu
20
L'invention concerne une lipase qui provient d'une bactérie aérobie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose.
La lipase de l'invention est active dans une large gamme de température. La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température supérieure à environ 40 C. La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température inférieure à environ 60 C. Plus particulièrement, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température
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comprise entre environ 40 C et environ 60 C.
De manière particulièrement préférée, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH d'environ 9, 5, à une température d'environ 55 C.
La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique de plus de 50 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de température comprise entre environ 40 C et environ 60 C pour un pH d'environ 9, 5, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 55 C et à un pH de 9, 5.
La lipase de l'invention est active dans une large gamme de pH alcalin.
Habituellement, la lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH supérieur ou égal à environ 8. Habituellement, la lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH inférieur ou égal à environ 10. Plus particulièrement, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10. De manière particulièrement préférée, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 9, 5.
La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique de plus de 85 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10 pour une température d'environ 30 C, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 30 C et à un pH de 9, 5.
La lipase de l'invention est thermostable à un pH alcalin. En effet, la lipase, isolée et purifiée, de l'invention montre une activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 160 minutes à une température de 55 C et à un pH de 10 dans une solution tamponnée de dureté 15. Elle montre une activité enzymatique relative d'au moins 70 % mesurée après une incubation de 80 minutes sous ces mêmes conditions.
Par activité enzymatique relative, on entend le rapport entre l'activité enzymatique, mesurée au cours d'un essai réalisé dans des conditions
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données de pH, température, substrat et durée, et l'activité enzymatique maximale mesurée au cours de ce même essai, l'activité enzymatique étant mesurée à partir de l'hydrolyse de la trioléine et l'activité enzymatique maximale étant fixée arbitrairement à la valeur de 100.
L'invention concerne également une lipase modifiée, c'est-à-dire une enzyme dont la séquence en acides aminés diffère de celle de l'enzyme sauvage par au moins un acide aminé. Ces modifications peuvent être obtenues par des techniques classiques de mutagénèse sur l'ADN, telles que l'exposition à des rayonnements ultra-violets, à des produits chimiques, tels que l'éthyl méthane sulfonate (EMS), le N-méthyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), le nitrite de sodium ou l'O-méthylhydroxylamine ou par des techniques de génie génétique, comme, par exemple, la mutagénèse dirigée ou la mutagénèse aléatoire. Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING-a laboratory manual-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989, chapitre 15.
L'invention concerne également une lipase mutée obtenue par modification de la séquence de nucléotides du gène qui code pour la lipase. Les techniques d'obtention de telles lipases mutées sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING-a laboratory manual-SAMBROOK, FRITSCH, MANIA TIS - second edition,
1989, chapitre 15.
La présente invention concerne également l'isolement, l'identification et la fourniture d'une nouvelle bactérie produisant la lipase. Cette bactérie aérobie a été isolée et purifiée. Généralement elle appartient à la famille des Pseudomonadaceae. De préférence elle appartient au genre Pseudomonas.
De manière particulièrement préférée, il s'agit d'une souche de Pseudo- monas wisconsinensis. De bons résultats ont été obtenus avec la souche de
Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche.
Par dérivé de cette souche, on entend toute bactérie modifiée naturel- lement, c'est-à-dire par sélection naturelle. Par mutant de cette souche, on entend toute bactérie modifiée artificiellement. Les mutants de cette souche peuvent être obtenus par les techniques connues de modification, telles que rayonnement ultra-violet, rayons X, agents mutagènes ou génie génétique.
Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment
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décrites dans SAMBROOK et al., 1989, chapitre 15. Des exemples d'agents mutagènes sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 365-368.
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISM (LMG culture collection, Université de Gand, Laboratoire de Microbiologie-K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gand, Belgique) conformément au Traité de Budapest sous le numéro LMG P-15151 le 12 octobre 1994. L'invention concerne une culture isolée et purifiée de la souche de Pseudomonas wisconsinensis et une culture dérivée ou mutée de celle-ci. Plus particulièrement, l'invention concerne une culture isolée et purifiée de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et une culture dérivée ou mutée de celle-ci.
La souche de la présente invention a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques. Il s'agit d'une bactérie Gram négatif, aérobie. Elle ne se développe pas en anaérobiose. Aucune spore n'est formée. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 % (p/v) de tétraméthyl-l, 4-phénylène-diammoniumdichlorure. Cette bactérie n'est pas thermophile. Elle ne produit pas de gaz à partir de glucose.
La présente invention concerne également un procédé pour la production d'une lipase. Ce procédé comprend la culture d'une bactérie aérobie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose et la récolte de la lipase ainsi obtenue. Ce milieu de culture peut être solide ou liquide. De préférence le milieu de culture est liquide. Habituellement, la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase. Plus particulièrement, la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas wisconsinensis ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase.
De préférence, la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase.
Les conditions de culture de ces bactéries, qui permettent d'obtenir la lipase de l'invention, telles que composants du milieu nutritif, paramètres de culture, température, pH, aération, agitation, sont bien connues de l'homme du métier. Des exemples de conditions de culture sont notamment décrits
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dans la demande de brevet européen 0 571 982.
Les techniques de récolte de la lipase sont bien connues de l'homme du métier et sont choisies selon les utilisations envisagées de la lipase. Habituellement, on emploie la centrifugation, la filtration, l'ultrafiltration, l'évaporation, la microfiltration, la cristallisation ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques telle qu'une centrifugation suivie d'une ultrafiltration. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
La lipase peut ensuite être purifiée, si nécessaire et selon les utilisations envisagées. Les techniques de purification d'enzymes sont bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'un sel, tel que le sulfate d'ammonium, ou de solvant, tel que l'acétone ou un alcool. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
La lipase peut également être séchée par atomisation ou lyophilisation.
Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
La présente invention concerne également des compositions enzymatiques comprenant la lipase selon l'invention et au moins un additif. Selon les utilisations envisagées, les compositions enzymatiques comprenant la lipase de la présente invention peuvent être sous forme solide ou liquide.
Les additifs, compris dans la composition selon l'invention, sont connus de l'homme du métier et sont choisis selon l'utilisation envisagée de la composition. Ils doivent être compatibles avec la lipase et ne pas affecter l'activité enzymatique de la lipase. Habituellement, ces additifs sont des stabilisants de l'enzyme, des agents de conservation et des agents de formulation. Des exemples d'additifs sont notamment décrits dans la demande de brevet européen 0218 272. Comme exemples d'additifs, on peut citer l'éthylène glycol, le glycérol, le 1,2-propanediol, l'amidon, un sucre tel que glucose et sorbitol, un sel tel que chlorure de sodium, chlorure de calcium, sorbate de potassium et benzoate de sodium ou un mélange de deux ou plusieurs de ces produits. De bons résultats ont été obtenus avec le 1, 2-propandiol.
De bons résultats ont également été obtenus avec le sorbitol.
La lipase selon l'invention a des débouchés multiples dans diverses
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industries, telles que, par exemple, les industries alimentaires, les industries pharmaceutiques ou les industries chimiques.
La lipase peut notamment être utilisée en détergence. La présente invention concerne également l'utilisation de la lipase, telle que définie ci-dessus, en détergence. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans la demande de brevet britannique 1372034 et dans la demande de brevet européen 0 218 272. Dans ce cadre, elle fait partie de compositions de détergence. La présente invention concerne donc également les compositions de détergence contenant la lipase. Les composants des compositions de détergence sont connus de l'homme du métier et sont adaptés selon l'utilisation envisagée de la composition.
De tels composants sont notamment des enzymes, telles que par exemple des protéases, amylases et/ou cellulases ; des agents de charge, tels que du tripolyphosphate de sodium ; des agents de blanchiment, tels que du perborate ; des additifs de formulation ; des tensioactifs. Les compositions de détergence de l'invention peuvent être utilisées, selon leur formulation, comme poudre, granule ou liquide lessiviels pour laver le linge ; comme produit détachant pour détacher ou dégraisser des objets ou détacher le linge préalablement au nettoyage ; et comme poudre, granule ou liquide pour laver la vaisselle.
La lipase peut notamment être utilisée lors du traitement de vieux papiers en vue d'enlever les encres à base d'huile. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans le résumé Chemical Abstract
113/154607.
La lipase peut notamment être utilisée lors du traitement de pâte à papier pour éviter les dépôts collants connus sous le nom de"pitch". Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans le document
Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645.
La lipase peut notamment être utilisée en industrie alimentaire pour développer l'arôme de certains produits alimentaires, tels que des fromages ; lors de la fabrication de margarines spéciales. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans le document Enzyme Microb.
Technol., 1993 (3), pages 634-645.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
Exemple 1
Isolement et caractérisation de la souche de Pseudomonas wisconsinensis
T 92.677/1
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La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été isolée d'un échantillon de terre, prélevé aux Etats-Unis dans l'état du Wisconsin.
1 g de terre est mis en suspension dans 10 ml d'eau déminéralisée contenant 9 g/l de NaCl. Cette suspension est diluée 10 fois avec de l'eau déminéralisée contenant 9 g/l de NaCI.
1 ml de la suspension de terre diluée est étalée sur un milieu nutritif gélosé A.
Le milieu A contient 10 g/l de tryptone (Difco), 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCI, 20 g/l d'agar, 2,5 g/l de NaHCOg, 7, 5 g/l de Na2CO3, 10 g/l d'huile d'olive, 1 g/l d'alcool polyvinylique (25/140) et 0,01 g/l de rhodamine B (Sigma 6626).
Le milieu A se prépare comme suit.
Une émulsion d'huile d'olive est d'abord préparée comme suit. 50 ml d'eau distillée est chauffée à 80 C. On ajoute 1 g d'alcool polyvinylique par petites fractions à cette eau chauffée. Puis, on ajoute 10 g d'huile d'olive à la suspension d'alcool polyvinylique. On émulsionne ensuite au moyen d'un mélangeur Ultra-furax à 13500 tours par minute (tige 18 GM).
On stérilise l'émulsion obtenue à 121 C durant 30 minutes.
Une gélose est ensuite préparée comme suit. 10 g de tryptone, 5 g
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d'extrait de levure, 5 g de NaCI, 20 g d'agar sont ajoutés dans 850 ml d'eau distillée. La suspension de gélose obtenue est stérilisée à 121 C durant 30 minutes.
1 1 de tampon carbonate (pH 9,5), contenant 25 g/l de NaHCO3 et 75 g/l de Na2CO3, est préparé, puis stérilisé à 121 C durant 30 minutes.
Puis, on prépare 1 ml d'une solution aqueuse de [0, 01 % (p/v)] rhodamine B (Sigma 6626). Cette solution est stérilisée par filtration sur une membrane de stérilisation (MILLIPORE) de 0,45 it.
L'émulsion d'huile d'olive stérilisée et la gélose stérilisée sont refroidies à 60 C, puis mélangées stérilement. Ensuite, on y ajoute la solution stérilisée de rhodamine. Puis, on ajoute 100 ml de tampon carbonate stérilisé de façon à obtenir un pH de 9,5. On émulsionne, ensuite, la suspension, ainsi obtenue, au moyen d'un mélangeur Ultra-turax à 13500 tours par minute (tige 18 GM).
Le milieu A sur lequel la suspension de terre a été étalée, est incubé 48 heures à 30 C. Les microorganismes produisant une lipase sont détectés à l'aide d'une lumière ultra-violette, ils sont entourés d'un halo fluorescent.
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Les microorganismes détectés comme produisant une lipase, sont mis en culture sur un milieu nutritif gélosé B.
Le milieu B contient 10 g/l de tryptone (Difco), 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCI, 20 g/l d'agar, 2,5 g/l de NaHCO, 7, 5 g/l de NaCO. Tryptone, extrait de levure, NaCI, agar, qui composent le milieu B, sont mélangés avec 900 ml d'eau distillée, ensuite stérilisés à 121 C durant 30 minutes. Le pH est ajusté à 9,5 par l'addition de 100 ml de tampon carbonate prélablement stérilisé (contenant 25 g/l de NaHC03 et 75 g/l de Na2CO3).
Le microorganisme a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques : bactérie Gram négatif, aérobie. Aucune spore n'est formée.
La taille des cellules végétatives est de 0,5-0, 7 cm x 1,5-4, 0 ; nom. La mobilité des cellules végétatives est positive. Le test de la lyse par 3 % (p/v) de KOH est positif. Le test de la catalase est positif en présence de 10 % (v/v) de peroxyde d'hydrogène. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 % (p/v) de tétraméthyl-l, 4-phénylène-diammoniumdichlorure.
Le test de l'uréase est négatif. Le test de la réduction du nitrate est positif.
Des tests comparables ont notamment été décrits dans la demande de brevet européen 0 218 272.
Cette souche est aérobie, c'est-à-dire qu'elle se développe en aérobiose.
Elle ne se développe pas en anaérobiose, c'est-à-dire sous une atmosphère de 84 % (v/v) N2, 8 % (v/v) C02, 8 % (v/v) H2 à 37 C.
L'abréviation % (v/v) représente un pourcentage exprimé en volume par volume. L'abréviation % (v/p) représente un pourcentage exprimé en volume par poids. L'abréviation % (p/v) représente un pourcentage exprimé en poids par volume. L'abréviation % (p/p) représente un pourcentage exprimé en poids par poids.
Cette souche n'est pas thermophile. Elle présente un développement normal après incubation sur le milieu B gélosé à 20 C, 30 C, 37 C et 41 C.
La souche ne produit pas de gaz à partir de glucose.
La souche utilise azelate, caprate, citrate, glucose, gluconate, L-argi- nine, L-histidine, bétaine et geraniol. La souche n'utilise pas adipate, phenylacétate, L-arabinose et maltose. Elle n'hydrolyse pas la gélatine, l'amidon et l'esculine.
La souche appartient au genre Pseudomonas et au groupe RNA-I.
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Les caractéristiques biochimiques différencient nettement la souche de Pseudomonas wisconsinensis, et notamment la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, d'une souche de Pseudomonas mendocina, d'une souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes, d'une souche de Pseudomonas alcaligenes et d'une souche de Pseudomonas stutzeri. Ceci apparait clairement à la lecture du tableau 1 rassemblant les caractéristiques biochimiques principales de ces 5 souches.
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<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 1
<tb> Caractéristiques <SEP> Pseudomonas
<tb> wisconsinensis <SEP> stutzeri <SEP> mendo-alcali-pseudoalcaT <SEP> 92.677/1 <SEP> cina <SEP> genes <SEP> ligenes
<tb> Taille, <SEP> um <SEP> x <SEP> 0,5-0, <SEP> 7 <SEP> 0,7-0, <SEP> 8 <SEP> 0,7-0, <SEP> 8 <SEP> 0,5 <SEP> 0,7-0, <SEP> 8
<tb> #m <SEP> 1,5-4, <SEP> 0 <SEP> 1,4-2, <SEP> 8 <SEP> 1,4-2, <SEP> 8 <SEP> 2,0-3, <SEP> 0 <SEP> 1,2-2,
<SEP> 5
<tb> Pigment <SEP> jaune <SEP> +-+ <SEP> dhydrolyse <SEP> +
<tb> l'amidon
<tb> Arginin <SEP> + <SEP> + <SEP> d
<tb> déhydrolase
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Glucose
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> d <SEP> + <SEP> d
<tb> Gluconate
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> +-+-Géraniol
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> +-+ <SEP> d <SEP> d
<tb> L-histidine
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> +-+ <SEP> + <SEP> +
<tb> L-arginine
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> +-+-+
<tb> Bétaine
<tb>
+ = test positif pour 90% ou plus des souches - = test négatif pour 90% ou plus des souches d = test positif pour plus de 10 %, mais moins de 90 % des souches
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La bactérie isolée appartient donc au genre Pseudomonas, aucune espèce connue n'a pu être déterminée.
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRORGANISMS (LMG culture collection) sous le numéro LMG P-15151 le 12 octobre 1994.
Exemple 2 Production de la lipase par la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu B gélosé à 30 C durant 24 heures.
Puis, à partir de cette culture on réalise une culture dans 25 ml d'un milieu liquide C. Le milieu C contient 10 g/l de tryptone (Difco), 5 g/l d'extrait de levure, 10 g/l de NaCI, le pH du milieu est ajusté à 7,0 avec NaOH 0, IN, le milieu est stérilisé à 121 C durant 30 minutes. La culture est réalisée à 30 C sous agitation orbitale à raison de 200 révolutions par minute avec une amplitude d'environ 2,54 cm.
Après 16 heures d'incubation, on introduit cette culture dans un
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fermenteur de 20 litres contenant 13 litres du milieu liquide D stérilisé.
Le milieu D contient K2HP04 2, 5 g/l, KH2PO4 2, 5 g/l, MgS04. 7H20 1 g/l, (NHSO 2 g/l, (NH2) 2CO 2 g/l, CaCl 1 g/l, farine de soja 20 g/l, extrait de levure 2 g/l, glucose 20 g/l, antimousse Mazuôl (Mazes Chemicals) 5 gll. Le pH est ajusté à 7,4 (par de l'acide phosphorique normal et de la soude caustique normale) avant et après stérilisation dans le fermenteur (30 minutes à 121 C). Le glucose est stérilisé, à part, à pH 4,0 (pH ajusté avec de l'acide phosphorique normal) durant 30 minutes à
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121OC. Le milieu est stérilisé dans le fermenteur 30 minutes à 121OC.
La culture dans le fermenteur est réalisée à une température de 23 C, sous une pression de 0,15. 105 Pa (Pa = Pascal) (0,15 bar), avec une aération de 0,3 VVM (volume d'air par volume de milieu de culture par minute), avec une agitation axiale de 200 tours par minutes, la régulation d'oxygène dissous étant fixée à 10 % (v/v) par régulation de la vitesse
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d'agitation.
ZD
Après 24 heures de fermentation, on mesure l'activité enzymatique de la culture, ainsi obtenue, par la technique suivante.
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L'hydrolyse de la trioléine est quantifiée par la neutralisation des acides gras libérés sous l'action de la lipase. Cette mesure est effectuée à l'aide d'un appareil de titrage automatique, appareil qui maintient le pH constant à une valeur de consigne par l'addition de NaOH 0,01 N.
Une unité lipase (LU) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la libération d'une micromole d'acide gras par minute dans les conditions standards de l'essai décrit ci-après.
On mélange 10 g de Trioléine (Roth 5423.1) et 10 g de gomme arabique (Fluka 51200) dans 100 ml d'eau distillée. On émulsionne ce mélange à l'aide d'un mélangeur Ultra-Turrax à 13500 tours par minutes (agitation axiale) durant 3 fois 5 minutes, en maintenant le mélange sous azote et dans un bain de glace.
On prépare un tampon de dilution contenant 2,34 g/l de NaCl, 2,94 g/l de Cal2. 2H20 et 0,61 g/l de Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-l, 3-propanediol).
On utilise un appareil de titrage automatique, muni d'une burette contenant du NaOH 0, 01N, d'une sonde de température et d'une sonde de
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pH et équipé d'un réacteur thermostatisé.
Dans le réacteur thermostatisé à 30 C, on introduit un barreau magné- tique d'agitation, 10 ml d'émulsion de trioléine et 20 ml de tampon de dilution. Le pH de la solution, ainsi obtenue, est ajusté à 9,5 avec Na OH 0, 1N. Puis, on introduit 0,5 ml de l'échantillon à tester contenant la lipase, l'échantillon est éventuellement dilué de telle sorte qu'il ne contienne qu'un maximum de 5 LU. On contrôle le pH pendant les deux premières minutes avec NaOH 0, 01N. Puis, on enregistre la consommation de soude entre 2 et 4 minutes, tout en maintenant le pH constant (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = VI en nul).
Ensuite, on réalise le même essai en remplacant l'échantillon contenant la lipase par 0,5 ml de tampon de dilution (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = V2 en ul).
On détermine une unité lipase (LU) comme suit :
1 LU/ml = (V1-V2) x dilution éventuelle de l'échantillon x 10
Par cette méthode, une activité lipase est détectée dans la culture.
Exemple 3
Préparation d'une solution concentrée de lipase
On ajuste le pH de là culture, telle qu'obtenue en fin de fennentation à
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l'exemple 2, à un pH de 8 avec de la soude caustique concentrée 10 N.
Puis, on ajoute à cette culture 1 % (v/v) de Triton X-114 (SERVA 37214). Le mélange est agité doucement pendant 2 heures à 15 C.
Ensuite, on ajoute au mélange 1 % (v/v) d'Optifloc FC205 (SOLVAY) sous la forme d'une solution à 10 % (v/v). Le mélange est agité doucement pendant 1 heure à 15 C.
On centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 C. On conserve le surnageant de centrifugation.
On chauffe le surnageant de centrifugation à 40 C pendant 5 minutes.
On observe une séparation de phases. On élimine la phase supérieure. On
EMI14.1
ajoute à la phase inférieure 35 % (v/v) d'acétone à 4 C. On incube la suspension 15 minutes à 4 C sous agitation modérée.
Puis, on centrifuge la suspension 15 minutes à 9000 tours par minutes (BECKMAN J21, rotor JA10) à une température de 4 C. On conserve le surnageant de centrifugation.
On ajoute de l'acétone au surnageant de centrifugation à 4 C jusqu'à l'obtention d'une concentration en acétone de 65 % (v/v). On incube le mélange 16 heures à 4 C.
Ensuite, on centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 C. On conserve le précipité de centrifugation, que l'on met en suspension dans 150 ml d'un tampon (pH 7) contenant 5 mM de Brij 58 (ICI), 25 mM Caca2 et 20 mM Tris.
Puis, on centrifuge la suspension, contenant le précipité, 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 C. On conserve le surnageant de centrifugation, qui forme une solution concentrée de lipase.
Exemple 4 Purification de la lipase
Pour purifier la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3, on utilise la technique de purification mettant en oeuvre une chromatographie d'interaction hydrophobe, suivie de la technique de purification mettant en oeuvre une chromatographie de tamisage moléculaire.
En suivant les indications d'utilisation prescrites par le fournisseur (Phannacia) au sujet de la colonne de chromatographie d'interaction hydro-
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phobe, on charge une colonne Pharmacia Hiload 16/10 Phenyl-Sepharose (réf 17-1085-01) avec 140 ml de la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3.
On utilise, comme tampon d'équilibre, un tampon phosphate 20 mM à pH 7,2 ; comme tampon d'élution, un tampon phosphate 20 mM à pH 7,2 contenant 30 % (v/v) d'isopropanol. Le débit est fixé à 1,5 ml par minute.
On récupère la lipase avec la fraction éluée avec le tampon phosphate contenant l'isopropanol.
On mesure l'activité enzymatique de la fraction selon la méthode décrite à l'exemple 2.
On diafiltre la fraction éluée, contenant la lipase, dans une cellule Amicon, munie d'une membrane YM10, avec 10 volumes d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM CaCI2 et 20 mM Tris.
Puis, on concentre la fraction diafiltrée jusqu'à 0,5 ml par ultrafiltration à l'aide de la même cellule Amicon, munie d'une membrane YM10.
Ensuite, on injecte la fraction concentrée (0,5 ml) sur une colonne de chromatographie de tamisage moléculaire (colonne Superdex 75 HR 10/30 Pharmacia référence 17-1047-01). La séparation est initiée par un débit de 0,5 ml par minute d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM CaCI et 20 mM Tris.
Trois pics d'absorption à 280 nm sont séparés. La lipase correspond au premier pic d'absorption à 280 nm. On conserve la fraction correspondante qui contient la lipase purifiée.
Exemple 5
Détermination de la séquence N-terminale
On utilise la méthode décrite par Vandekerkhove J. et al., Eur. J.
Biochemistry, 152,9 (1985), pour déterminer la séquence N-terminale de la lipase.
On met en oeuvre la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4.
La séquence N-terminale (SEQ ID NO : 1) est la suivante :
Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr Gly
1 5 10 15
Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu
20
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Cette séquence diffère des séquences N-terminales des autres lipases sécrétées par des autres souches de Pseudomonas, séquences notamment publiées dans Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645.
Exemple 6 Détermination du poids moléculaire de la lipase par analyse SDS-PAGE
On effectue sur la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4, une électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Le système de gel utilisé est le système PHASTSYSTEM de PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY (dossier d'utilisation NO 110), avec des gels contenant un gradient de polyacrylamide de 10-15 % (v/v). Les conditions d'électrophorèse sont celles prescrites par le fournisseur. On utilise comme témoin les marqueurs de poids moléculaire PHARMACIA LMW (Low Molecular Weight), référence 17-0446-01. Les marqueurs mis en oeuvre sont la phosphorylase b (94 kD), l'albumine (67 kD), l'ovalbumine (43 kD), la carboanhydrase (30 kD), l'inhibiteur de la trypsine (20,1 kD) et l'alpha-lactalbumine (14,4 kD).
Le gel, ainsi obtenu, montre que la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4, est pure.
Une coloration au bleu de Coomassie (Fast Coomassie staining, Pharmacia, dossier d'utilisation n 200) du gel fait apparaître un polypeptide d'un poids moléculaire d'environ 30 (+/-0, 5) kD.
Exemple 7 Détermination de l'optimum de température de la lipase
On mesure l'activité enzymatique de la lipase à différentes températures selon la méthode décrite à l'exemple 2. On détermine donc l'hydrolyse du substrat (émulsion de trioléine) suite à l'action de la lipase à différentes températures, toutes les autres conditions étant identiques aux conditions standards, telles que décrites à l'exemple 2, c'est-à-dire à un pH de 9,5 et une durée de deux minutes.
On utilise la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 2.
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<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 2
<tb> Température <SEP> Activité <SEP> relative
<tb> oc <SEP> %
<tb> 18 <SEP> 19
<tb> 24 <SEP> 26
<tb> 30 <SEP> 41
<tb> 34 <SEP> 45
<tb> 40 <SEP> 56
<tb> 45 <SEP> 52
<tb> 49 <SEP> 91
<tb> 55 <SEP> 100
<tb> 60 <SEP> 54
<tb> 76 <SEP> 43
<tb>
EMI17.2
A cours de l'essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon placé à un pH d'environ 9, 5 et à une température d'environ 55 C. Par définition, on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 %.
Cet exemple montre que la lipase de l'invention présente une activité enzymatique optimale mesurée à un pH de 9, 5 dans une gamme de température comprise entre environ 40 et environ 60 C.
Cet exemple montre également que la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9, 5, à une température d'environ 55 C.
La lipase de l'invention développe une activité enzymatique de plus de 50 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de température comprise entre environ 40 et 60 C pour un pH d'environ 9, 5.
Exemple 8 Détermination de l'optimum de pH de la lipase On mesure l'activité enzymatique de la lipase à différents pH selon la méthode décrite à l'exemple 2. On détermine donc l'hydrolyse du substrat (émulsion de trioléine) suite à l'action de la lipase à différents pH, toutes les autres conditions étant identiques aux conditions standards, telles que décrites à l'exemple 2, c'est-à-dire à une température de 30 C et une durée de deux minutes.
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On utilise la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 3.
EMI18.1
<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 3
<tb> pH <SEP> Activité <SEP> relative
<tb> %
<tb> 7,0 <SEP> 17
<tb> 8,0 <SEP> 100
<tb> 9,0 <SEP> 100
<tb> 9,5 <SEP> 100
<tb> 10,0 <SEP> 91
<tb> 10,5 <SEP> 71
<tb> 11,0 <SEP> 72
<tb> 12,0 <SEP> 47
<tb>
EMI18.2
Cet exemple montre que la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH compris entre environ 8 et 10.
Au cours de l'essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon placé à un pH d'environ 9, 5 et à une température d'environ 30 C. Par définition, on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 %.
La lipase de l'invention développe une activité enzymatique de plus d'environ 90 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10 pour une température d'environ 30 C.
La lipase de l'invention développe une activité enzymatique de plus d'environ 70 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 11 pour une température d'environ 30 OC.
Exemple 9 Stabilité de la lipase vis-à-vis de la température On incube la partie de la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4, à pH 10 et à 55 C dans un tampon aqueux de dureté 15 (tampon contenant du chlorure de calcium 1. 98 mM, du chlorure
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de magnésium 0,69 mM et du bicarbonate de sodium 2,5 mM).
A intervalles réguliers, tels que précisés dans le tableau 4 (temps d'incubation en minutes), on préleve un échantillon dont on mesure l'activité enzymatique selon la méthode décrite à l'exemple 2.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4.
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<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 4
<tb> Temps <SEP> d'incubation <SEP> Activité <SEP> relative
<tb> minutes <SEP> %
<tb> 0 <SEP> 100
<tb> 10 <SEP> 84
<tb> 20 <SEP> 81
<tb> 30 <SEP> 79
<tb> 40 <SEP> 93
<tb> 50 <SEP> 86
<tb> 60 <SEP> 80
<tb> 80 <SEP> 72
<tb> 100 <SEP> 59
<tb> 120 <SEP> 59
<tb> 130 <SEP> 60
<tb> 140 <SEP> 61
<tb> 160 <SEP> 61
<tb> 260 <SEP> 39
<tb> 1140 <SEP> 25
<tb>
La constante de désactivation (k) sur l'intervalle 0-260 minutes est de 0.000333 min-l. [On obtient la constante de désactivation k selon la définition In (AAo) =-k. t, t étant le temps d'incubation, Ao l'activité relative au temps d'incubation 0 et At l'activité relative au temps d'incubation t.]
Au cours de cet essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon au temps 0.
Par définition on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 %.
De cet exemple on conclut que la lipase de l'invention montre une activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 160 minutes à une température de 55 C et à un pH de 10 dans une solution tamponnée de dureté 15. Elle montre une activité enzymatique
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relative d'au moins 70 % mesurée après une incubation de 80 minutes sous ces mêmes conditions.
Exemple 10 Utilisation d'une composition détergente contenant la lipase
On prépare un morceau de tissu blanc (R. Hoppe Gmbh) à base de coton (65 %) et de polyester (35 %) de 10 cm sur 10 cm, imprégné de graisse de lard et de rouge Soudan. L'imprégnation du tissu est réalisée comme suit.
On prépare une solution homogène de rouge Soudan 7B (SIGMA cat.
N F 1000) et de graisse de lard (Laru Gmbh) en ajoutant 0,1 % (p/p) de rouge Soudan à la graisse de lard. Le mélange est chauffé à 90 C jusqu'à complète dissolution du rouge Soudan. Un rouleau de tissu est plongé dans la solution de rouge Soudan et de graisse de lard maintenue à 90 C et déplacé en continu dans cette solution à la vitesse de 0,5 m/minute. Ensuite, le tissu est essoré sous une pression linéaire constante entre deux rouleaux.
Le tissu ainsi imprégné contient 31,5 % (p/p) de matières grasses. Le tissu imprégné est placé à-18 C durant 22 heures jusqu'à complète cristallisation de la matière grasse. Le tissu est découpé en morceaux de 10 cm sur 10 cm. Ensuite, les morceaux de tissu imprégné sont stockés à-18 C dans le noir.
On prépare une composition détergente liquide contenant 4 g/l d'une poudre compacte lessivielle (poudre Eurocompact d'UNILEVER) et diverses concentrations de lipase équivalentes à 500,1000 et 2000 LU/1, dans une eau de dureté 15 (eau contenant du chlorure de calcium 1,98 mM, du chlorure de magnésium 0,69 mM et du bicarbonate de sodium 2,5 mM). Le pH initial de la composition détergente liquide est d'environ 10. On met en oeuvre la lipase telle qu'obtenue à l'exemple 4, que l'on dilue avec de l'eau de dureté 15 en vue d'obtenir les concentrations souhaitées.
Puis, on lave le tissu imprégné de graisse de lard et de rouge Soudan avec 200 ml de la composition détergente liquide dans un réacteur de 250 ml. Le lavage a lieu à 35 C durant 45 minutes sous une agitation de 40 RPM (agitation va et vient de 20 secondes). Après le lavage, le tissu est rincé trois fois avec 200 ml d'eau distillée, puis séché à 22 C entre deux papiers durant 24 heures.
Ensuite, on détermine la réflectance (RL) à 460 nm du tissu séché à l'aide d'un colorimètre (Tricolor LFM 3).
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On reproduit ce test trois fois, c'est-à-dire on effectue ensuite trois fois le cycle de lavage avec la composition détergente liquide contenant la lipase et le cycle de rinçage sur le même échantillon de tissu sans l'imprégner de rouge Soudan et de graisse de lard entre chaque cycle. A chaque fin de cycle, on détermine la réflectance à 460 nm du tissu séché.
Un essai strictement identique est réalisé avec une composition détergente ne contenant pas de lipase. A chaque fin de cycle, on détermine la réflectance (RO) à 460 nm du tissu séché.
On définit la performance de lavage en % comme la différence entre la réflectance (RL) obtenue avec la lavage en présence de lipase et la réflectance (RO) obtenue avec la lavage en absence de lipase, c'est à dire RLRO exprimé en %.
Les résultats de cet exemple montrent que la lipase de l'invention est efficace à faible dose d'enzyme dans la composition détergente.
Les résultats de cet exemple montrent également que la lipase de l'invention est particulièrement efficace dès le second cycle de lavage et qu'elle conserve une efficacité accrue après trois et quatre cycles de lavage.
Notamment, la lipase est particulièrement efficace à la concentration de 500 LU/1 après trois cycles de lavage.
De plus, la lipase se montre tout particulièrement efficace à la concentration de 1000 LU/1 dès le premier cycle de lavage. La lipase se montre tout particulièrement efficace à la concentration de 1000 LU/1 durant tous les cycles de lavage.
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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES : (i) DEPOSANT : (A) NOM : SOLVAY (Société Anonyme) (B) RUE : rue du Prince Albert, 33 (C) VILLE : Bruxelles (E) PAYS : Belgique (F) CODE POSTAL : 1050 (G) TELEPHONE : (02) 509. 61. 11 (ii) TITRE DE L'INVENTION : Lipase, microorganisme la produisant, procédé de préparation de cette lipase et utilisations de celle-ci (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 1 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR : (A) TYPE DE SUPPORT : Floppy disk (B) ORDINATEUR : IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS : MS-DOS (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 23 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : peptide (v) TYPE DE FRAGMENT :
Fragment N-terlinal
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(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 1 : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr Gly 1 5 10 15 Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu
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