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Procédé de préparation de produits à activité antirachitique.
EMI1.1
L-9invention est roative à la préparation de pro- duits possédant une activité antirachitique vis à vis des poussins.
Il existe, comme on le sait, deux stérines naturel- les qui, après exposition à la lumière ultra-violette, sont douées d'une activité antirachitique. D'une part, c'estl'er- gostérine d'origine végétale, qui fut considérée longtemps comme la seule provitamine D, et de l'autre part, c'est la cholestérine d'origine animale. Bien qu'il soit du domaine public que ce n'est pas la cholestérine elle-même qui est ac- tivée, mais une impureté (provitamine) qui l'accompagne en fai- bles traces, on n'a pas réussi jusqu'ici à séparer ou même à
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concentrer sensiblement cette provitamine renfermée dans la cholestérine.
La littérature sur ce sujet fait mention de plusieurs pourcentages de provitamine présente dans la choles- térine naturelle, démontrant ainsi qu'un pourcentage de plus de 0,1 % de provitamine est très rare. Le pourcentage le plus élevé dont on fait mention est de 0,32 %, ce pourcentage étant constaté par Menschick et Page (Hoppe Seyler "Zeitschrift für physiologische Chemie", Tome 211, 1932, page 246) dans la cholestérine provenant des oeufs d'une poule nourrie avec de grandes quantités d'ergostérine. La susceptibilité d'un étalon de cholestérine d'être activé ne se traduit pas par ses pro- priétés chimiques;
son point de fusion ou sa rotation optique, le point de fusion et la rotation optique de ses éthers, etc.- examinés, si nécessaire, après une.purification convenable réalisée pour enlever les impuretés autres que les stérines - étant égaux à ceux d'un étalon de cholestérine rendue inactiva- ble par un traitement spécial. Un produit activable à base de cholestérine doit être considéré, par conséquent, comme de la cholestérine dans le sens chimique ordinaire et avant l'intro- duction de l'examen spectographique bien connu à l'heure actuel- le, il n'existait pas de moyens (outre l'examen biologique) de distinguer une cholestérine activable d'une cholestérine inactivable.
Cet examen spectrographique nous permet de dis- tinguer entre des méthodes de purification convenables et des méthodes dans lesquelles une partie de la susceptibilité d'être activée est perdue.
Ces derniers temps la susceptibilité de la cholesté- rine d'être activée est devenue d'un intérêt particulier par suite de l'ouvrage de Waddell (Journal of Biol.Chem.,tome 105, juillet 1934, pages 711-739). Waddell a trouvé que la cholesté- rine activée par irradiation est beaucoup plus active vis à vis- des poussins que l'ergostérine irradiée, la comparaison étant
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basée sur le même nombre d'unités d'activité vis à vis des rats. Pour prévenir ou guérir la faiblesse des pattes des poussins, le nombre requis d'unités d'activité vis à vis des rats d'ergostérine irradiée est 30 à 50 fois plus grand que celui de cholestérine activée par irradiation.
On a trouvé qu'à ce point de vue la cholestérine activée par irradiation était équivalente à l'huile de foie de morue. Toutefois, la découverte de Waddell n'a aucun intérêt pratique à cause de la dite faible teneur en provitamine de la cholestérine. Les produits de Waddell de cholestérine irradiée ne possédaient par milligramme que 5 unités internationales d'activité an- tirachitique vis à vis de rats; même la cholestérine spéciale de Menschick et Page mentionnée ci-dessus ne serait activable qu'à un degré d'environ 30 unités internationales d'activité vis à vis des rats, par milligramme.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de produits ayant un effet antirachitique sur les poussins, par irradiation de stérines d'origine animale autres que la cholestérine décrite dans la littérature précitée ou que la cholestérine du commerce. Les stérines utilisées con- formément à l'invention, sont les stérines présentes dans les invertébrés et plus particulièrement, dans les porifera, anne- lida,arthropoda, mollusca et echinodermata. Après saponifica- tion de la graisse d'invertébrés, après extraction et recris- tallisation de la matière insaponifiable (tout en prenant soin que les procédés de purification réalisés ne détruisent pas la provitamine D) - on obtient une fraction de stérines cons- tituée par un mélange de stérines qui peut contenir de la cholestérine ou non.
Il est extrêmement surprenant que ces mélanges de stérines non seulement soient activablés mais aussi donnent @
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lieu à la production de substances activées qui sont sensi- blement plus actives vis à vis de poussins que l'ergostérine irradiée. De plus, il est fort surprenant que cette suscepti- bilité d'être activée de manière à former une vitamine D ac- tive notamment vis à vis de poussins, ne soit pas limitée à la cholestérine et que la grande susceptibilité que nous avons constatée dans beaucoup de cas ne fût présente que dans des mélanges de stérines contenant une quantité appréciable de stérine différente de la cholestérine.
Il est remarquable, en effet,qu'apparemment la présence de cholestérine n'est pas essentielle pourvu que le mélange de stérines provienne des invertébrés.
Puisque la matière première utilisée conformément à l'invention existe en abondance dans la nature et peut être obtenue de façon relativement peu coûteuse, il est possible de produire de façon commerciale de la vitamine D artificiel- le convenant pour la nourriture de la volaille.
Il y a lieu d'observer qu'autrefois on a décrit l'irradiation de la partie insaponifiable d'hélix pomatia, réalisée pour obtenir un produit à activité antirachitique.
Ceci n'a en rien contribué, toutefois, à la solution du pro- blème dont de nombreux chercheurs se sont occupés durant de longues années, cette solution étant l'objet de la présente invention. Cette irradiation de la partie insaponifiable d'helix pomatia est, par conséquent, exclue de ce brevet.
De nombreux chercheurs ont traité le problème de la nature des stérines présentes dans les invertébrés. Dans beaucoup de cas on a constaté la présence de cholestérine, dans beaucoup d'autres cas celle de stérines différentes de la cholestérine. Bergmann ("Journal of Biol.Chem", tome 104, 1934, pages 317 et 553) trouva deux stérines différentes (ostreasté-
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rine I et ostreastérine II) dans les huitres (ostrea viginica) et démontra la présence d'ostreastérine I dans d'autres bival- ves tels que les moules (modiola) et les venus mercenaria, et dans les gastropoda tels que les fulgur carica et les fulgur canaliculata.
Dorée ("Biochemical Journal", tome 4,1909, page 72) trouva des stérines différentes de la cholestérine dans les vers à soie (bombyx mori), les blattes (blatta orientalis), les astéries (asterias rubens), différentes éponges (cliona, cela- ta, ephydatia fluviatalis) et peut-être dans les vers de terre (lumbricus terrestris). Henze (Hoppe Seyler "Zeitschrift fur Pbysiologische Chemie", tome 55, 1908 .page 427) trouva une nouvelle stérine,la spongostérine., dans un autre genre d'é- ponges (suberites domuncula).
La question de savoir si une fraction de stérines produite d'invertébrés comprend un mélange de stérines et dif- fère de la cholestérine connue jusqu'ici, peut être résolue par des méthodes connues, par exemple, par détermination du point de fusion et du pouvoir rotatoire ou du spectre d'absorp- tion de la fraction de stérines recristallisée à plusieurs re- prises ou, après purification, par précipitation avec de la digitonine suivie d'une décomposition.
Pour réaliser la présente invention il n'est pas né- cessaire d'enlever la fraction de stérines de la partie insapo- nifiable, cette partie pouvant être irradiée en son entier.
Puisque les matières premières utilisées conformément à la présente invention, sont des organismes vivants, la propor- tion de provitamine présente dans différents individus du même genre n'est naturellement pas constante mais varie suivant le degré de développement (âge), les conditions d'existence, la saison, le climat, la nourriture, etc.
Pour donner une impression générale de la valeur de mélanges de stérines produits d'invertébrés comme sources de
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provitamine., le tableau ci-après montre la quantité de provita- mine., déterminée par spectroscopie, présente dans la fraction de stérines de 29 animaux différents choisis arbitrairement parmi les poriféra, echinodermata, annelida., mollusca et ar- thropoda.
Phylum Teneur en provitamine de la stérine en %.
PORIFERA
EMI6.1
Eponge Halychondria panicea 0,6 ECHINODEEMATA
EMI6.2
<tb> Astérie, <SEP> Asterias <SEP> rubens <SEP> 0,7
<tb>
<tb> Astropecten <SEP> irregularis <SEP> 0,45
<tb>
ANNELIDA
EMI6.3
<tb> 1) <SEP> Chaetopoda
<tb>
<tb> Arénicole, <SEP> Arenicola <SEP> piscatorum <SEP> 1.2
<tb>
<tb> Ver <SEP> de <SEP> terre, <SEP> Lumbricus <SEP> terrestris <SEP> 11 <SEP> - <SEP> 16
<tb> - <SEP> Tubifex <SEP> 17 <SEP> - <SEP> 25
<tb>
<tb> 2) <SEP> Hirudinea
<tb>
<tb> Sangsue, <SEP> Hirudo <SEP> medicinalis <SEP> 4.2
<tb>
MOLLUSCA
EMI6.4
<tb> 1) <SEP> Gastropoda
<tb> Limace <SEP> Lima <SEP> agrestis <SEP> 3.2
<tb> Buccin, <SEP> Buccinum <SEP> undatum <SEP> 10
<tb> Littorine, <SEP> Littorina <SEP> littorea <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 26 <SEP>
<tb>
<tb> 2) <SEP> Lamellibranchiata
<tb> Koala,
<SEP> Mytilus <SEP> edulis <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 16 <SEP>
<tb> Battre, <SEP> Ostrea <SEP> edulis <SEP> 3
<tb> Anodonte, <SEP> Anodonta <SEP> cygnea <SEP> 8
<tb>
<tb> 3) <SEP> Cephalopoda
<tb> Seiche, <SEP> Loligo <SEP> vulgaris <SEP> 0.7
<tb>
ARTHROPODA
EMI6.5
<tb> 1) <SEP> Crustacea
<tb> Homard, <SEP> Homarus <SEP> vulgaris <SEP> 0.25
<tb> Crabe, <SEP> Cancer <SEP> pagurus <SEP> 2.7
<tb> ? <SEP> , <SEP> Eriocheir <SEP> sinensis <SEP> 0.3
<tb> Crevette, <SEP> Crangon <SEP> vulgaris <SEP> 0.3
<tb>
<tb> 2) <SEP> Insecta
<tb> a) <SEP> Coleoptera,
<tb> er <SEP> de <SEP> farine, <SEP> Tenebrio <SEP> molitor <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 11
<tb> hydrophile, <SEP> Dytiscus <SEP> marginalis <SEP> 4
<tb> Hanneton, <SEP> Melolontha <SEP> vulgaris <SEP> 0.5
<tb> Cantharide, <SEP> Lytta <SEP> vesicatoria <SEP> 2.
<SEP> 2 <SEP> -
<tb>
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EMI7.1
<tb> b) <SEP> Orthoptera
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Oeufs <SEP> de <SEP> sauterelles, <SEP> Carausius
<tb>
<tb>
<tb> morosus <SEP> 2.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sauterelles, <SEP> (fam. <SEP> Acridiidae) <SEP> 2.7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Blatte, <SEP> Blatta <SEP> orientalis <SEP> 2.3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> c) <SEP> Lepidoptera <SEP> soie
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Oeufs <SEP> de <SEP> vers <SEP> à <SEP> soie, <SEP> Bombyx <SEP> mori <SEP> 1.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d) <SEP> Hymenoptera
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Abeille <SEP> domestique, <SEP> Apis <SEP> mellifica <SEP> 0.45
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> e) <SEP> D <SEP> t <SEP> a <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Larves <SEP> de <SEP> mouches, <SEP> Musca <SEP> domestica <SEP> 0.
<SEP> 7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Moustique, <SEP> Gyronomus <SEP> 6.1
<tb>
Dans la préparation de lipoides insaponifiables ou de stérines contenant de la provitamine D, à partir d'inver- tébrés, il est recommandée eu égard à la sensibilité connue de la provitamine à toutes sortes d'influences, de prendre des précautions pour protéger la provitamine. Plus particulière- ment, on doit éviter dans le traitement préalable des substan- ces à extraire, avant l'extraction de la graisse, par exemple, une ébullition de relativement longue durée avec de l'eau et le séchage avec de la vapeur.
D'autres méthodes de purification comme une extrac- tion d'assez longue durée à l'aide d'éther, une ébullition de longue durée avec de l'anhydride acétique, bromination., un traitement par du charbon, etc. qui peuvent aisément détruire la provitamine, doivent 'être évitées.
Comme méthode préparatoire convenable dans laquelle certaines actions nuisibles sont supprimées, on peut citer la méthode suivante :
On sèche la masse moulue à traiter dans le vide à une température modérée (par exemple, de 50 à 80 c environ) ou bien l'avoir moulue et triturée (à l'aide de sable) à l'aida de Na2So4, d'alcool ou d'acétone. De la matière première ainsi préparée, on extrait ensuite la graisse; dans cette extraction on utilise, de préférence, des dissolvants de graisse à bas
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point d'ébullition tels que l'éther ou l'éther de pétrole, et on évite, de préférence, l'emploi de substances extracti- ves contenant de l'halogène telles que le chloroforme ou le tétrachlorure de carbone car ces substances peuvent donner lieu à la production diacide chlorhydrique.
Il est avantageux d'éviter un contact prolongé avec de l'éther car l'éther con- tient souvent des peroxydes ou tout au moins la production de peroxydes est difficile à éviter avec l'emploi d'éther. Si la matière première a été séchée à l'aide d'alcool ou d'acétone, une partie de la graisse peut y être contenue à l'état dissous, cette graisse pouvant être obtenue par vaporisation à siccité du solvant dans le vide. La solution de graisse est débarrassée par filtration d'albumines éventuellement suspendues, le sol- vant étant enlevé par distillation. Ensuite, on saponifie la graisse de la manière usuelle tout en évitant, de préférence, les températures très élevées et en utilisant, par exemple, une solution de NaOH ou de KOH dans de l'alcool à 80 au moins.
Eventuellement, on peut débarrasser la solution de savon par distillation d'une partie de l'alcool, après quoi on peut obtenir la partie insaponifiable soit en étendant la solution de savon d'eau et en extrayant ensuite la partie insaponifiable à l'aide d'éther ou d'éther de pétrole, soit en précipitant les savons de chaux dans la solution aqueuse de savon en traitant par un sel calcaire et en y extrayant, par exemple à l'aide d'acétone, les constituants insaponifiables précipités simul- tanément avec les savons de chaux.
La fraction de stérinespeut fréquemment être séparée de la partie insaponifiable ainsi obtenue, par exemple, par recristallisation dans l'alcool} pour la purification ultérieure on peut utiliser avec beaucoup de succès une recristallisation dans l'alcool méthylique dans lequel certaines substances contaminantes, par exemple hui-
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leuses, ou certains constituants de lipoïdes colorés ne sont que peu solubles et peuvent être éliminés de cette façon.
Plus particulièrement dans les cas où les constituants insaponifia- bles contiennent des quantités appréciables de substances colorantes telles que les carotinoldes., une partie de la pro- vitamine peut être perdue sous Inaction de la lumière et de l'air; il est, par conséquent, désirable de tenir compte aussi de cette circonstance.
Pour déterminer la teneur en provitamine on peut utiliser avec avantage la méthode connue du spectre d'absorp- tion. Cette méthode permet de déterminer par voie optique la quantité de provitamine-poussins dans une préparation suffi- samment pure, en accord satisfaisant avec le contrôle biolo- gique, par comparaison avec la quantité d'ergostérine végétale qui provoque la même absorption. Comme, exposées à la lumière ultra-violette dans des conditions semblables, ces quantités de provitamine - poussins et d'ergostérine qui absorbent dans la même mesure, acquièrent sensiblement la même activité an- tirachitique pour les rats et, par conséquent des nombres égaux d'unités internationales, la quantité de provitamine- poussins se trouve déterminée dans une mesure suffisante en pratique.
Pour obtenir une préparation contenant un nombre maxi- mum d'unités par mg. de provitamine transformée, il est recom- mandé de limiter l'irradiation activante à la gamme de lon- gueurs d'onde comprise entre 270 muet 300 muet de trans- former au maximum 60 % de la provitamine.
EXEMPLE 1.
On moulut 4,1 kg. de moules d'eau salée (mytilus edulis) débarrassées des écailles, à l'aide d'un hache-viande
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et on les sécha dans le vide à 50 C environ. On soumit la masse séchée trois fois à une extraction avec au total 3,5 litres d'éther de pétrole (point d'ébullition 40 - 60 C), on lava l'extrait d'éther de pétrole avec de l'eau, on le sécha à l'aide de Na2 SO4 et on le filtra, l'éther de pétrole étant ensuite éliminé par distillation. On obtint ainsi 45 g. de graisse. On saponifia la substance grasse en la faisant bouillir pendant 2 heures avec 200 centimètres cubes d'al- cool à 96 et 20 g. de KOH dans 20 centimètres cubes d'eau à l'aide d'un réfrigérant à reflux.
Après refroidissement on versa la solution savonneuse dans 1 litre d'eau distillée et on épuisa la solution aqueuse de savon à cinq reprises par au total 1,1 litre d'éther. La. solution éthérique fut épui- sée à cinq reprises chaque fois par 100 centimètres cubes d'eau distillée, séchée à l'aide de Na2So4et filtrée. Après élimination de l'éther par distillation il resta en arrière une masse solide de couleur fauve ayant un poids de 7,5 g. Cet- te fraction brute insaponifiable de la graisse de moules fut dissoute d'abord dans 50 centimètres cubes d'alcool à 96 , ensuite dans 25 centimètres cubes d'alcool à 96 et finale- ment dans 110 centimètres cubes d'alcool méthylique et re- cristallisée chaque fois. La fraction de stérines ainsi pré- parée avait un poids de 2,5 g. et était une masse cristalline jaune clair.
En mesurant le spectre d'absorption de ces cristaux on trouva que les bandes d'absorption caractéristi- ques de la provitamine avaient une intensité correspondant à une teneur en ergostérine de la substance de 16 %. Comme il a été dit, il est désirable que la durée des traitements par l'éther soit aussi courte que possible.
On mit 150 milligrammes des cristaux obtenus en dissolution dans de l'éther exempt de peroxyde et en remuant
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constamment on exposa cette solution dans le vide à la lu- mière d'une lampe au mercure en quartz filtrée par une so- lution de xylène, jusque ce que 40 à 50 % de la provitamine présente fussent transformes. On introduisit la solution irradiée, toujours dans le vide, dans 200 centimètres cubes d'huile d'arachides et on élimina l'éther par évaporation* dans le vide.
On examina ensuite l'activité antirachitique de la solution d'huile sur des rats, comparativement à la solution internationale normalisée de vitamine D, et sur des poussins, en comparaison avec une huile de foie de morue con- tenant 100 unités internationales d'activité vis à vis des rats, de vitamine D. L'essai réalisé sur des rats, démontra que la solution d'huile contenait 1000 unités internationales de vitamine D par centimètre cube. L'essai sur des poussins démontra que l'activité de la solution d'huile était dix fois plus forte que ,celle de l'huile de foie de morue utilisée.
150 milligrammes de stérines de moules fournissaient, par conséquent, au total environ 200.000 unités internationales de vitamine D, c'est à dire environ 1330 unités internationa- les par milligramme.
Dans un autre exemple le procédé fut légèrement modifié. Pendant 5 minutes on immergea les moules dans une grande quantité d'eau bouillante, après quoi on les débarras- sa des écailles; on sécha la chair pendant 10 heures dans un extracteur à vide tournant, la température ayant atteint à la fin de cette période une valeur de 80 C environ. Ensui- te, on soumit la chair séchée à une extraction complète avec de l'éther de pétrole (point d'ébullition 40 - 60 C); on recueillit les extraits ainsi obtenus et on chassa l'éther de pétrole par distillation. On saponifia la graisse ainsi obtenue à l'aide d'une solution alcoolique de KOH (5 parties
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de KOH, 10 parties de graisse, 90 parties d'alcool à 80 ) et la partie insaponifiable fut extraite de cette solution de savon au moyen d'éther de pétrole.
On recristallisa la fraction insaponifiable, après l'évaporation du solvant, d'abord de 3 parties d'alcool à 96 , ensuite d'environ 4 parties d'éther de pétrole (point d'ébullition 40 - 60 C) et finalement de 5 parties d'alcool à 96 ; le résultat fut un mélange de stérines de couleur à peu près blanche conte- nant 11% de provitamine, la quantité étant de 1,4 g. (0,15 g. de pro vitamine) par kilogramme de chair de moules.
EXEMPLE 2.
On moulut 28 kg. de littorines (littorina littorea)- à l'aide d'un moulin à marteau, on remua la masse obtenue ainsi deux fois avec de l'alcool à 96 (40 litres au total).
La masse ainsi débarrassée d'eau fut extraite à quelques re- prises à l'aide d'éther de pétrole et après avoir être étendu jusqu'à 50 , l'alcool fut épuisé à l'aide d'éther de pétrole.
Après lavage, séchage et distillation on obtint 100 grammes de graisse.
On saponifia cette graisse à chaud pendant deux heures à l'aide d'un réfrigérant à reflux dans une solution de 50 grammes de KOH dans 50 grammes d'eau et 400 centimètres cubes d'alcool à 96 . On dilua la solution de savon avec 2 litres d'eau, la partie insaponifiable étant ensuite extrai- te à l'aide d'éther. Résultat: 17 grammes. En recristallisant cette partie insaponifiable à l'aide d'alcool et deux fois à l'aide d'alcool méthylique, on obtint la fraction de stérines dont le poids était de 3,85 g. Le spectre d'absorption montra que cette préparation contenait environ 5 % de provitamine.
@
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On exposa 590 mg de cette préparation à la lumière ultra-violette jusqu'à la transformation de 30% de la pro- vitamine; on introduisît ensuite la substance irradiée dans
250 centimètres cubes d'huile d'arachide de la manière décrite dans l'exemple 1. On trouva que l'activité antirachi- tique sur des rats était de 815 unités internationales par centimètre cube. Pour examiner l'activité antirachitique sur des poussins, on mélangea cette solution avec les ingrédients de nourriture dans une quantité correspondant à 75 unités internationales de vitamine D par 100 g. de nourriture. On trouva que, vis-à-vis d'une quantité égale de vitamine D sous la forme d'huile de foie de morue, la préparation obtenue de littorines était complètement activé.
Pour le degré de transformation réalisé dans cette expérience, 590 mg. de cette préparation avaient fourni, par conséquent, 204.000 unités internationales de vitamine D ou environ 350 unités internationales par milligramme.
EXEMPLE 3.
On moulut 524 g. de vers dé farine (tenebrio molitor) à l'aide d'un hache-viande et on traita la masse obtenue par de l'alcool et de l'éther de pétrole (point d'ébullition 40 -
60 C) de la manière décrite dans l'exemple 2. On saponifia la graisse, 44,5 grammes, avec une solution de 22g. de KOH dans
22 centimètres cubes d'eau et 150 centimètres cubes d'alcool à 96 , la partie insaponifiable étant ensuite extraite à l'ai- de d'éther. Résultat : 1,08 g. Après recristallisation à l'aide d'alcool et (à quatre reprises) d'alcool méthylique, il resta en arrière une substance butyreuse difficilement soluble. La fraction de stérine obtenue (0.14g) présentait la forme d'une poudre cristalline à peu près blanche.
Le spectre d'absorption démontra que la teneur en provitamine de cette stérine était @
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de 10% environ. On exposa 62,7 mg. de cette préparation à la lumière ultraviolette jusqu'à la transformation de 30% de la provitamine et ensuite on introduisit la substance irradiée dans 250 centimètres cubes d'huile d'arachides de la manière décrite dans l'exemple 1. On trouva par une expé- rience réalisée sur des rats, que l'activité antirachitique était de 180 unités internationales par centimètres cubes.
Pour une expérience sur des poussins on mélangea cette solu- tion avec la nourriture dans une proportion correspondant à 90 unités internationales de vitamine D par 100 grammes de nourriture; on trouva que cette quantité était complètement active comparativement à de l'huile de foie de morue. Pour le degré de-transformation atteint dans cette expérience, 62,7 mg de cette préparation obtenue de vers de farine avaient fourni, par conséquent, 45. 000 unités internationales de vitamine D ou 720 unités internationales par milligramme.
EXEMPLE 4
On moulut 404 grammes de vers de terre (lumbricus) à l'aide d'un hache-viande et on traita la masse ainsi ob- tenue par de l'alcool et de l'éther de pétrole (point d'ébul- lition 40 - 60 C) de la manière décrite dans l'exemple 2.
On saponifia l'extrait (4.3 gr. ) avec une solution de 2.2 g. de KOH dans 2.2 centimètres cubes d'eau et 16 centimètres cubes d'alcool. Par extraction avec de l'éther on obtint 0,9 g. qui donna après recristallisation à l'aide d'alcool et de l'alcool méthylique une fraction de stérine (0.3 g) sous la forme de cristaux blancs. On trouva par voie spectrogra- phique que la teneur en provitamine était de 11%. Dans un autre cas on obtint à partir de 9,7 kilogrammes de vers de terre une fraction de stérinesde 12.5 g. contenant environ 16% de provitamine.
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On exposa 62.4 mg. de la préparation précitée à la lumière ultra-violette jusque la transformation de 30 % de la provitamine. Ensuite, on introduisit la substance irra- diée dans 250 centimètres cubes d'huile d'arachides de la manière décrite dans l'exemple 1. Par une expérience réalisée sur des rats, on trouva que l'activité antirachitique était de 200 unités internationales par centimètre cube. Pour une expérience faite avec des poussins, on mélangea cette solution avec les ingrédients de nourriture dans une proportion corres- pondant à 100 unités internationales de vitamine D par 100 g.
,de nourriture. On trouva que, vis-à-vis d'huile de foie de morue,cette quantité était complètement active. Pour le degré de transformation réalisé dans cette expérience, 62,4mg. de cette préparation obtenue de vers de terre, avaient fourni, par conséquent, 50. 000 unités internationales de vitamine D ou 800 unités internationales par milligramme.
EXEMPLE 5.
On moulut 500 g. de sangsues (hirudinea) à l'aide d'un hache-viande et on traita la substance moulue par de l'alcool et de l'éther de pétrole.(point d'ébullition 40 - 60 C) de la manière décrite dans l'exemple 2. On saponifia l'extrait, 7.4 grammes, avec une solution de 3.7 g. de KOH dans 3.7 centimètres cubes d'eau et 25 centimètres cubes d'alcool, obtenant ainsi une partie insaponifiable en poids de 1. 5 g. Après recristallisation à l'aide d'alcool et d'al- cool méthylique on obtint une fraction de stérines (0,68 g. ) sous la forme de cristaux blancs dont la teneur en provita- mine, déterminée spectrographiquement, était de 4.2 %.
On exposa 179 mg de cette préparation à la lumière ultra-violette jusqu'à ce que 40% de la provitamine fussent
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transformés. On introduisit la substance irradiée dans 250 centimètres cubes d'huile d'arachides de la manière décrite dans l'exemple 1. Par une expérience réalisée sur des rats, on trouva que l'activité antirachitique était de 300 unités internationales par centimètre cube. Pour l'ex- périence sur des poussins on mélangea cette solution avec les ingrédients de nourriture dans une proportion corres- pondant à 150 unités internationales par 100 grammes de nourriture; il se révéla que, vis-à-vis d'huile de foie de morue, cette quantité était complètement active.
Pour le degré de transformation réalisé dans cette expérience, 179 mg. de cette préparation provenant de sangsues, avaient donné, par conséquent, 75.000 unités internationales de vitamine D, c'est-à-dire 420 unités internationales par milligramme.
EXEMPLE 6.
On moulut 5 kg. d'éponges de la mer du Nord (halichondria panicea) à l'aide d'un hache-viande et on traita la masse ainsi obtenue par de l'alcool et de l'éther de pétrole (point d'ébullition 40 -60 C) de la manière décrite dans l'exemple 2. On saponifia l'extrait, 26.7 grammes, avec une solution de 14 g. de KOH dans 14 centimètres cubes d'eau et 100 centimètres cubes d'alcool et après extraction à l'aide d'éther on obtint un résidu insaponifiable de 7.7 grammes donnant après recristallisation à l'aide d'alcool et d'alcool méthylique 3,85 grammes de stérinessous la forme de cristaux jaune clair. Le spectre d'absorption révé- la une teneur en provitamine de 0,6%.
On exposa 1245 mg. de cette préparation à la lumière ultra-violette jusqu'à ce que 15% de la provitamine fussent transformés. On introduisit la substance irradiée
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dans 250 centimètres cubes d'huile d'arachides de la manière décrite dans l'exemple 1. On trouva que l'activité antira- chitique sur des rats était de 100 unités internationales par centimètre cube. Pour faire l'expérience sur des pous- sins on mélangea la solution avec les ingrédients de nourri- ture dans une proportion correspondant à 100 unités inter- nationales de vitamine D par 100 grammes de nourriture; on trouva que cette quantité était complètement active vis-à-vis d'huile de foie de morue.
Pour le degré de transformation atteint dans cette expérience, 1245 mg. de cette préparation obtenue d'éponges avaient donné, par conséquent, 25.000 unités internationales de vitamine D; c'est-à-dire 20 unités internationales par milligramme.
EXEMPLE 7
On moulut 6. 8 kg d'astéries (asterias rubens) à l'aide d'un hache-viande et on traita la masse ainsi obtenue par de l'alcool et de l'éther de pétrole de la manière décrite dans l'exemple 2. On saponifia l'extrait, 115 grammes, avec une solution de 60 g. de KOH dans 60 centimètres cubes d'eau et 400 centimètres cubes d'alcool. Par extraction à l'aide d'éther on obtint un résidu insaponifiable de 18 grammes. En recristallisant ce résidu deux fois dans l'alcool on obtint 5.5 g. de cristaux rose clair. Le spectre d'absorp- tion démontra une teneur en provitamine de 0.7%.
On exposa 1015 mg. de cette préparation à la lumière ultra-violette jusqu'à la transformation de 15% de la pro- vitamine. On introduisit la substance irradiée dans 250 centimètres cubes d'huile d'arachides de la manière décrite dans l'exemple 1. Examinée sur des rats, l'activité anti- rachitique était de 100 unités internationales par centimètre cube. Pour faire l'expérience sur des poussins, on mélangea
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la solution avec les ingrédients de nourriture dans une proportion correspondant à 100 unités internationales de vitamine D par 100 g. de nourriture; on trouva que cette quantité était complètement active comparativement à l'huile de foie de morue.
Pour le degré de transformation atteint dans cette expérience 1015 mg. de cette préparation obtenue d'asté- ries, fournissaient, par conséquent, 25.000 unités inter- nationales de vitamine D,c'est-à-dire 25 unités internationa- les par milligramme.