Yeifahren zur Herstellung eines Provitamin-D enthaltenden Steringemisches. Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Provitamin D enthaltenden Steringe- misches.
Es bestehen bekanntlich zwei in der Natur vorkommende .Sterine, die durch Be strahlung mit Ultraviolettlicht autirachitisch wirksam gemacht wurden, und zwar einer seits Ergosterin pflanzlieh@er Herkunft, das lange als das einzige Provitamin D betrach- tet wurde, und anderseits Cholesterin tieri scher Herkunft.
Trotz .der allgemeinen Er- kenntnss, dass nicht ;das Cholesterin selbst aktiviert wird., sondern eine dasselbe in sehr geringen Spuren begleitende Verunreinigung (Provitamin), sind bisher alle Versuche., die ses Cholesterinprovitamin auszuscheiden oder selbst in erheblichem Masse zu konzentrieren,
gescheitert. Inder diesbezüglichen Literatur werden viele Angaben bezüglich des Prozent- satzes an Provitamin in dem in der Natur vorkommendem Cholesterin erwähnt;
es er gibt sich daraus, .dass. Cholesterin mit einem höheren Provitamingehalt als 0,1% sehr sel ten vorkommt.
Der höchste Gehalt. .der er- wähnt wird, beträgt 0"3,2%; er wurde von Menschick und Page (Hoppe Seyler "Zeit schrift für physiologische Chemie", Band 211, 191321, .Seite .2146) in dem Dotter aus den Eiern einer mit grossen,
Mengen. Er gosterin gefütterten. Heine gefunden. Die Alktivier- barkieit eines Cholesterinmusters wird. nicht durch -die chemischen Eigenschaften bekun det;
sein Schmelzpunkt oder seine optische Rotation, der Schmelzpunkt und die optische Rotation seiner Ester usw.
- gegebenenfalls untersucht nach geeigneter Reinigung zur Entfernung von andern Unremigkeiten als Sterine - entsprechen denjenigen eines durch besondere Behandlung unaktivierbar gemach- ten- CholesteriumuAers. Ein aktivurbares
Cholesterinpräparat ist daher als Cholesterin. im gewöhnlichen. ohemiechen Sinne zu be trachten und vor .der Einführung der jetzt allgemein bekannten spektographischen Prü fung bestanden keine Mittel (ausser der biolö- gischen Prüfung)
zur Unterscheidung eines aktivierbaren Cholesterins von einem unakti- vierbaren Cholesterin. Diese spektographi- sehe Prüfung macht es möglich, einen Unter- schied zu machen zwischen wirklichen Reini gungsverfahren und Verfahren, durch welche die Aktivierbarkeit teilweise verloren geht.
Die Aktivierbankeit von Cholesterin ist in letzter Zeit infolge Waddell's Arbeit ("Journal <B>ei</B> Biol. Chem.", Band 105, Juli 124, Seite 711 bis 7,39) von besonderem In teresse :
geworden. Wadd@ell hat gefunden, dass auf der Vergleichsgrundlage einer gleichen Anzahl von Ratteneinheiten durch Bestrah lung aktiviertes Cholesterin auf Kücken viel wirksamer als bestrahltes Ergosterin ist.
Zur Vorbeugung oder Heilung der Schwäche .der Füsse von Kücken ist die erforderliche An zahl von Ratteneinheiten bestrahltes Ergo- sterin das. 30- bis 50fache desjenigen des durch Bestrahlung aktivierten Cholesterins.
Es wurde gefunden, Jass in dieser Hinsicht durch Bestrahlung aktiviertes Cholesterin Lebertran gleichwertig isst. Infolge des oben erwähnten niedrigen Provitamingehaltes von Cholesterin ist Wad@dell's Entdeckung ,jedoch für praktische Zwecke ohne Bedeutung. Waddell's Präparat von bestrahltem Chole sterin hatte je Milligramm eine Aktivität von nur 5 internationalen Ratteneinheiten Vita:
min D; und sogar das obenerw ähnte beson dere Cholesterin von Menschiek und Page sollte nur in einem Massre von 3-0 internatio nalen Ratteneinheiten je Milligramm akti- vierbar sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von an dern Sterinen tierischer Herkunft als das in der obenerwühnten Literatur beschriebene oder das im Handel vorkommende Chole sterin, die durch Bestrahlung insbesondere für Kücken antirachitisch aktiviert werden können.
Das Verfahren .gemäss der Erfin dung zur Herstellung eines Provitamin D enthaltenden Sterin:gemisches ist dadurch ge kennzeichnet, dass aus wirbellosen Tieren die in Fettlösungsmitteln löslichen, unvers.eif- baren Bestandteile abgeschieden werden, und dassi daraus durch weitere Regung eine Sterinfraktion mit mindestens 0,25 % Pro vitamin erhalten wird.
Nach Verseifung der aus wirbellosen Tieren, insbesondere Pori- fera, Annelida, Ai-hhropoda, Mollusca und Echinodermata. erhaltenen Fettsubstanz, Ex traktion und Rekristallisation des unverseif- ba.ren Stoffes - (wenn dafür Sorge getragen wird, dass,
die angewendeten Reinigungsver fahren das Provitamin D nicht zerstören) wird eine Sterinfraktion erhalten, :die aus einem Gemisch von Sterinen besteht, die Cholesterin enthalten können oder nicht.
Es ist höchst Überraschend, ,dass diese Steringemnsche nicht nur aktivierbar sind. sondern auch Anlass zum Entstehen von ak- tivierten Stoffen geben, die auf Kücken we sentlich wirksamer sind als bestrahltes Ergo sterin. Es ist ausserdem sehr überraschend.
da.ss,diese Aktivierbarkeit zu einem besonders auf Kücken wirksames Vitamin D-nicht auf Cholesterin beschränkt ist, und dass sich die festgestellte hohe Aktivierbarkeit in vielen Fällen nur in Steringemischen vorfand, die eine erhebliche Menge eines andern Sterins als Cholesterin enthalten;
es ist tatsächlich merkwürdig, dass Cholesterin offenbar .durch aus nicht vorhanden zu sein braucht, wenn nur das Steringemisch aus wirbellosen, Tie ren stammt.
Da der gemäss der Erfindung benutzte Grundstoff im Überflut, in der Natur vor- hauden ist und seine Gewinnung verhältnis mässig geringe Kosten mit sich bringt, ist es ,jetzt möglich, auf kommerzieller Grundlage künstliches Vitamin D herzustellen, das sich als Futter für Geflügel eignet.
Es sei bemerkt, dass früher die ungerei- nigten unverseifbaren Teile vom Helig poma- tia. abgeschieden wurden zur Erzielung eines antirachitisch wirksamen Präparates (siehe "Comptes Rendues de la Seance de 1'Acade- mie des Seienees" 1929,
Seite 1701 bis 1702). Dies hat jedoch nicht im geringsten zu der Lösung des Problems beigetragen, mit dem zahlreiche Forscher sich viele Jahre befasst haben und dessen Lösung der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
Die Herstellung des ungereinigten, unverseifbaren Teils von Helix pomaha liegt ausserhalb des durch das vorliegende Patent geschützten Verfahrens.
EMI0003.0001
Zahlreiche <SEP> Forscher <SEP> haben <SEP> sich <SEP> mit <SEP> dem
<tb> Problem <SEP> der <SEP> Beschaffenheit <SEP> :der <SEP> in <SEP> wirbel losen;
<SEP> Tieren <SEP> vorkommenden <SEP> Sterinen <SEP> befasst.
<tb> In <SEP> manchen <SEP> Fä,11en <SEP> wumde <SEP> -das <SEP> Vorhandensein
<tb> von <SEP> Cholesterin <SEP> festgestellt, <SEP> in <SEP> vielen <SEP> andern
<tb> Fällen <SEP> wurden <SEP> andere <SEP> Sterine <SEP> als <SEP> Cholesterin
<tb> gefunden. <SEP> Bergmann <SEP> ("Journal <SEP> o:
f <SEP> Biol.
<tb> Ch,em.", <SEP> Band <SEP> 104, <SEP> 1e34, <SEP> Seite <SEP> 317 <SEP> und <SEP> 553)
<tb> fand <SEP> zwei <SEP> verschiedene.Sterine, <SEP> Ostremtemin <SEP> I
<tb> und <SEP> Ostreasterin <SEP> II, <SEP> in <SEP> Austern <SEP> (Ostrea <SEP> vir ginica) <SEP> und <SEP> legte <SEP> das. <SEP> Vorhandensein <SEP> von
<tb> Ostreasterin <SEP> I <SEP> in <SEP> andern <SEP> zweischaligen <SEP> Schal tieren, <SEP> wie <SEP> Muscheln <SEP> (Modiola) <SEP> and <SEP> Gien muscheln <SEP> (Venus <SEP> mercenamia), <SEP> sowie <SEP> in <SEP> den
<tb> Gastropoda, <SEP> wie <SEP> Fulgur <SEP> carica <SEP> und <SEP> Fulgur
<tb> eanaliculata <SEP> dar.
<SEP> Doree <SEP> ("Biocbemical <SEP> Jour nal", <SEP> Band <SEP> 4, <SEP> 1909, <SEP> Seite <SEP> 72) <SEP> fand <SEP> andere
<tb> Sterine <SEP> als <SEP> Cholesterine <SEP> in <SEP> Seidenwürmern
<tb> (Bombyg <SEP> mori), <SEP> in <SEP> Kakerlaken <SEP> (Blatte
<tb> orientalis), <SEP> in <SEP> Seesternen <SEP> (Asterias <SEP> rubens),
<tb> in <SEP> verschiedenen <SEP> Schwämmen <SEP> (Cliona <SEP> celata,
<tb> Ephydatia, <SEP> fluviatilis) <SEP> und <SEP> vielleicht <SEP> in <SEP> Re genwürmern <SEP> (Lumbricus <SEP> terrestris). <SEP> Henze
<tb> (Hoppe <SEP> 8eyler <SEP> "Zeitschrift <SEP> für <SEP> physiolo gische <SEP> Chemie", <SEP> Band <SEP> 5.5, <SEP> 1908, <SEP> Seite <SEP> 42'7)
<tb> fand <SEP> ein <SEP> neues <SEP> Sterin, <SEP> Spongosterin, <SEP> in <SEP> einer
<tb> andern <SEP> .Schwammart <SEP> (Suberites,domuncula).
<tb>
Ob <SEP> eine <SEP> aus <SEP> wirbellosen <SEP> Tieren <SEP> erhaltene Sterinfraktion ein .Steringemisch enthält und von dem bisher bekannten Cholesterin ver schieden ist, läss,t sich durch allgemein be kannte Verfahren, feststellen, zum Beispiel durch Bestimmung des Schmelzpunktes und des Drehungsvermögens oder des Absorp- tionsspektrums @d:
er wiederholt rekristallis:ier- ten Sterinfraktion oder, nach deren Reini- gung, dumch Niederschlagen mit Digitonin und darauffolgendes Zerlegen.
Da .die erfindungsgemäss verwendeten Grundetoffe lebende Organismen sind, ist dei Provitamingehalt bei verschiedenen Indivi duen :derselben Art selbstverständlich nicht konstant, sondern versohieden je nach der Entwicklungsstufe (Alter), den Lebensver hältnissen, der Jahreszeit, dem Klima, dem Futter usw.
Um einen allgemeinen Eindruck über den Wert von aus wirbellosen Tieren hergestell ten Steringemischen .als Provitaminquelle zu geben, zeigt nachstehende Tabelle, die, auf spektroskopischem Wege ermittelte, in der Sterinfraktion von 29 verschiedenen, aus den Porifera, Echno,dermata, Annelida, Mollusca, und Arthropoda,
beliebig gewählten Tieren enthaltenen Provitaminmenge.
EMI0003.0057
Phylum <SEP> Provitamingehalt
<tb> des <SEP> Sterins <SEP> ,in <SEP> /o
<tb> <I>Pori <SEP> f <SEP> era</I>
<tb> Schwamm, <SEP> Halychondria <SEP> panicea <SEP> 0,6
<tb> <I>Echänodermata</I>
<tb> Seestern, <SEP> Asterias <SEP> rubens <SEP> 0,7
<tb> Seestern, <SEP> Astropecten <SEP> irregularis <SEP> 0,45
<tb> <I>Annelida</I>
<tb> <I>1. <SEP> Chaetopoda</I>
<tb> Seewurm, <SEP> Arenicola <SEP> piscatorum <SEP> . <SEP> 1,2
<tb> Regenwurm, <SEP> Lumbricus <SEP> terrestris <SEP> . <SEP> 11-16
<tb> Regenwurm, <SEP> Tubifeg <SEP> . <SEP> 17-25
<tb> <I>2. <SEP> Hirudinea</I>
<tb> Blutegel, <SEP> Hirudo <SEP> medicinalis <SEP> . <SEP> 4,2
<tb> <I>Dl <SEP> ollusca</I>
<tb> <I>1.
<SEP> Gastropoda</I>
<tb> Erdschnecke, <SEP> Limag <SEP> agrestis <SEP> . <SEP> 3,2
<tb> Wellhornschnecke, <SEP> Buccinum <SEP> undatum <SEP> . <SEP> 10
<tb> Kreiselschnecke. <SEP> Littorina <SEP> littorea <SEP> . <SEP> 5-26
EMI0004.0001
Provitamingehalt
<tb> Phylum <SEP> des <SEP> Sterins <SEP> in <SEP> o%
<tb> <I>2. <SEP> Lamellibranchiata</I>
<tb> ;
Muschel, <SEP> Mytilus <SEP> edulis <SEP> . <SEP> . <SEP> 4-16
<tb> Auster, <SEP> Ostrea <SEP> edulis <SEP> 3
<tb> Schwanmuschel, <SEP> Anodonta <SEP> cygnea, <SEP> g
<tb> <I>3. <SEP> Cephalopoda</I>
<tb> Tintenfisch, <SEP> Loligo <SEP> vulgaris <SEP> . <SEP> 0,7
<tb> <I>.4rthropoda</I>
<tb> <I>1. <SEP> Crustavea</I>
<tb> Krebs, <SEP> Homarus <SEP> vulgaris <SEP> . <SEP> 0,25
<tb> Krabbe, <SEP> Cancer <SEP> pagurus <SEP> . <SEP> 2,7
<tb> chin. <SEP> Wollha.ndkrabbe, <SEP> Eriocheir <SEP> sinensis <SEP> . <SEP> 0,3
<tb> Garnele, <SEP> Crangon <SEP> vulgaris <SEP> 0,3
<tb> <I>2. <SEP> Inseeta</I>
<tb> <I>a) <SEP> Coleoptera</I>
<tb> Mehlwurm, <SEP> Tenebrio <SEP> inolitor <SEP> . <SEP> . <SEP> 10-11
<tb> Wasserkäfer, <SEP> Dytiscus <SEP> ma.rginalis <SEP> 4
<tb> Maikäfer, <SEP> :
VLelolontha <SEP> vulgaris <SEP> 0,5
<tb> Spanische <SEP> Fliege, <SEP> Lytta <SEP> vesicatoria <SEP> 2,2
<tb> <I>h) <SEP> Orthoptera</I>
<tb> Heuschreckeneier, <SEP> Carausius <SEP> morosus <SEP> . <SEP> 2,5
<tb> Heuschrecke <SEP> (fam. <SEP> Acridiidae) <SEP> 2,7
<tb> Kakerlak, <SEP> Blatte <SEP> orientalis <SEP> 2.3
<tb> <I>c) <SEP> Lopidoptera</I>
<tb> Seidenraupeneier, <SEP> Bombyx <SEP> mori <SEP> . <SEP> 1,2
<tb> <I>d) <SEP> Hynaerzoptera</I>
<tb> Honigbiene, <SEP> Apis <SEP> mellifica <SEP> 0,45
<tb> <I>e) <SEP> Dipiera</I>
<tb> Fliegenmaden, <SEP> DIusca <SEP> domestiea <SEP> .
<SEP> 0,7
<tb> Mücke, <SEP> Gyronomus <SEP> 6,1 Bei der Herstellung von Provitamin D enrbhaltenden unverseifbaren Lipoiden bezw. Sterinen aus wirbellosen Tieren werden bei der bekannten Empfindlichkeit des Provit- amins. für verschiedene Einflüsse zweckmässig Vorkehrungen zum Schutz des Provitamins getroffen.
Es sind insbesondere bereits bei der Vorbehandlung der zu extrahierenden Stoffe vor der Fettextraktion zum Beispiel ein lange andauerndes Kochen mit Wasser und Trocknen mit Dampf zu vermeiden.
Weitere Reinigungsverfahren, wie lange an dauerndes Extrahieren mit Äther, lange an- dauerndes Kochen mit Essigsäureanhydrid. Bromierung, Behandlung mit Holzkohle und dergl., welche das Prov itamin leicht zerstö ren könnten, sind zu vermeiden.
Als ein geeignetes präparatives Verfah ren, bei dem die erwähnten schädlichen Handlungen unterlassen werden, sei b@eispiele- weis.e das Folgende geschildert.
Die zu behandelnde gemahlene Masse wird entweder im Vakuum bei nur mässig er höhter Temperatur (z. B. etwa 50 bis 80 C) getrocknet oder nach Zermahlen und Zerrei ben mit Sand, mit NaeSO" mit Alkohol oder mit Aceton getrocknet.
Aus dem auf diese Weise vorbehandelten Grundstoff wird dann das Fett extrahiert, wobei zweckmässig nie- dTig siedende Fettlösungsmittel, wie Äther oder Petrolöther verwendet und zweckmässig halogenhaltige Extraktionsonittel, wie Chloro form oder Tetrachlorkohlenstoff, vermieden werden, da diese zur Bildung von @Sialzsäure Anlass geben können.
Eine einigermassen lange andauernde Berührung mit Äther ist zweckmässig zu vermeiden, da er häufig Peroxyde enthält oder wenigstens bei dessen Verwendung :
die Bildung von Peroxyden schwer zu verhindern .ist. Ist der Grundstoff mit Hilfe von Alkohol oder Aceton getrock net worden, so kann @darin ein Teil des Fet tes gelöst sein, das. :durch Eindampfung des Lösungsmittels im Vakuum gewonnen wer den kann.
Die Fettlösung wird -durch Fil- trierung von gegebenenfalls suspendierten Eiweissbestandteilen befreit und das Lösungs- mitteldurch Destillation entfernt.
Das Fett wird,dann :auf übliche Weise verseift, wobei zweckmässig wieder sehr hohe Temperaturen vermieden werden, und zum Beispiel eine Lösung von NaOH oder KOH in wenigstens 80 % igem Alkohol verwendet wird.
Die Sei fenlösung kann .gewünsthtenfaIls durch. De stillation, von :einem Teil des Alkohols befreit werden, worauf -der unverseifbare Teil ent weder dadurch erhalten werden kann, dass die Seifenlösung mit Wasser verdünnt und dann :der unverseifbaxe Teil mit Hilfe von Äther oder Petroläther extrahiert wird, oder dass ,in der wässerigen :
Seifenlösung durch Behandlung mit einem Kalksalz die Kalk seifen niedergeschlagen und die zusammen mit :den Kalkseifen niedergeschlagenen un- verseifbaren Bestandteile, z. B. mit Aceton, aus ihnen. extrahiert werden.
Aus dem auf diese Weise erhaltenen unverseifbaren Teil kann oft die .Sterinfraktion durch Umkristal- lis:ierung zum Beispiel aus Alkohol abge schieden werden.
Zur weiteren Reinigung kann mit Erfolg :eine Umkristallisierung mit Methylalkohol angewendet werden. in d. ein bestimmte verunreinigende, zum Beispiel öl artige Stoffe oder farbige Lipoidbestandteile,
sehr wenig löslich sind und auf diese Weise entfernt werden können. Insbesondere in denjenigen Fällen, in denen die unverseif- baren Bestandteile erhebliche Mengen von Farbstoffen. wie Carotinoide enthalten, kann unter :
dem Einfluss von Licht und Luft ein Teil @d@es Provitamins verloren gehen; :es ist also gewünscht, auch diesem Umstand Rech nung zu tragen.
Es ist vorteilhaft, bei der Bestimmung des Provitamingehaltesdas bekannte Abs orp- tionsspetktrumverfahren anzuwenden. Es: ist auf diese Weise möglich, auf optischem Wege in einem ;
genügend reinen Präparat,die Menge des. Kürokenprovitamins in befriedi gender Übereinstimmung mit der biologischen Kontrolle zu bestimmen, und zwar durch Vergleichung mit der Menge von pflanz- liehem Ergostenn, welche die gleiche Ab sorption herbeiführt. Da nun in ,
gleichem Masse - absorbierenid@e Mengen des Kücken- provitamin,s und,des E,rgostelins bei Bestrah lung mit Ultraviolettlicht. unter gleichen Verhältnissen eine nahezu gleiche äntirachi- tische Aktivität für Ratten, d. h. eine nahezu gleiche Anzahl von internationalen Einheiten erhalten, ist :
die Menge des Kückenpro- vitamins dadurch für die Praxis in befrie digendem Masse bestimmt.
Es wenden nachstehend einige Ausfüh- rungsbeispiele des Verfahrens nach der vor liegenden Erfindung gegeben mit dem Be merken, dass die Bestrahlung des nach diesen Verfahrenbeispielen erhaltenen Provitamin D enthaltenden Steringemisches und die mit ihr zusammenhängenden Massnahmen nicht mehr zum beanspruchten Verfahren. gehören.
<I>Beispiel 1:</I> 4,1 ;kg :Salzwassermuscheln (Mytilus edu- lis) wurden nach Entfernung der ,Schalen in einer ]Elarkfleischmühle zermahlen und im Vakuum bei etwa<B>50'</B> C getrocknet.
Die ge trocknete Masse wurde dreimal mit insge- samt 3:,5 Liter 1'etroläther (Siedepunkt 40 bis<B>60'</B> C) extrahiert, der Petrolätherauszug wurde mit Wasser gewaschen., mit I\TaZS04 getrocknet,
filtriert und der Petroläther durch Destillation entfernt. Es wurden auf diese Weise 45 g Fett erhalten. Die Fett- masse wunde dadurch verseift, .dass sie wäh- rend zwei :
Stunden mit 2,00 cm' <B>96</B> % Alkohol und 20 g KOH in .20 cm' Wasser an einem Rückflusskühler :gekocht wurde. Nach Ab kühlung wurde die Seifenlösung in 1 Liter destilliertes Wasser ausgegossen und ,die wäs serige Seifenlösung wurde fünfmal mit ins- gesamt <B>1,1</B> Liter Äther ausgeschüttelt. Die ätherisehe Lösung wird fünfmal mit jedesmal 7.00 em3,destilliertem Wasser .ausgeschüttelt,
mit Na.,S04 .getrocknet und filtriert. Es blieb nach Abdestillation des Äthers eine feste rotgelbe Masse mit,einem Gewicht von 7,5 g zurück. Dieser rohe unverseifbare Teil des Muschelfettes wurde in 50 cm' 96,%igem Alkohol, :dann in 2:
5 cm-' 96 % igem Alkohol und schliesslich in<B>110</B> cm''' Methylalkohol ge löst und jedesmal umkristallisiert. Die a.uf diese Weise hergestellte Sterinfraktion hatte ein Gewicht von 2,5 g und bestand aus einer lichtgelben kristallinischen Masse.
Es wurde durch Messung des Absorptionsspektrums dieser Kristalle festgestellt, dass die charak- teristischen Absorptionsbänder des Provit- amin.s in einer Stärke vorhanden waren, die einem E.rgosteringehalt des Stoffes von 16 % entspricht. Wie bereits angegeben, ist es vor teilhaft, die Ätherbehandlungen möglichst kurz,dauern zu lassen.
<B>150</B> mg der gewonnenen Kristalle wurden in peroxy:dfreiem Äther gelöst und diese Lö sung wurde unter stetigem Rühren im Vakuum mit .dem von einer Xylollösung filtrierten Lichteiner Quarzqueeksilberlampe bestrahlt, bis etwa 40 bis a)0 % des vorhandenen Pro vitamins umgewandelt worden waren. Die bestrahlte Lösung wurde, immer noch im Vakuum, in 2a00 cm' Arachisöl eingeführt und der Äther im Vakuum abgedampft.
Die antirachitische Wirkung der Öllösung wurde an Ratten untersucht, im Vergleich zu der internationalen Normallösung von Vitamin D und an Kücken im Vergleich zu einem Le bertran, der<B>100</B> internationale Ratteneinhei ten Vitamin D enthielt.. Es ergab sich aus dem Rattenversuch, dass die Öllösung <B>1000</B> internationale Vitamin D Einheiten je cm' des Vitamins D enthielt.
Es ergab sich aus dem Kückenversuch, dass die O11ösung um zehnmal stärker als der benutzte Lebertran war. 150 mg Muschelsterin ergaben also ins gesamt etwa 200 000 internationale Einheiten Vitamin D, d. h. etwa. 1330 internationale Einheiten je mg.
In einem weiteren Beispiel wurde ein etwas anderes Verfahren. angewendet. Die Muscheln wurden 5 Minuten in einer grossen Menge kochendes Wasser eingetaucht gehal ten. Dann wurden die Schalen entfernt und das Fleisch während 10 Stunden in einem sich .drehenden Vakuumextraktor getrocknet, wobei die Temperatur bis auf etwa<B>80'</B> C am Ende dieses Vorganges gesteigert wurde.
Das getrocknete Fleisch wurde dann mit Petrol- äther (Siedepunkt 40 bis 60 C) vollkommen extrahiert; die Auszüge wurden vereinig und der Petroläther wurde abdestilliert. Das erhaltene Fett wurde mit einer alkoholischen KOH-Lösung (5 Teile KOHL 10 Teile Fett, 90 Teile 80 % iger Alkohol) verseift und :
der unverseifbare Anteil wurde mit Hilfe von Petroläther aus dieser Seifenlösung extra hiert. Der nach Verdampfung des Lösungs mittels erhaltene unverseifbaxe Teil wurde umkristallisiert, zunächst aus 3 Teilen 96%iger Alkohol, dann aus etwa 4 Teilen Petrolä:ther (Siedepunkt 40 bis<B>60'</B> C) und schliesslich aus 5 Teilen 9-,6 %.igen Alkohol.
Die Ausbeute war ein praktisch weisses, 11 Provitamin enthaltendes Steringemisch, in einer Menge von 1,4 g (0,15g Provitamin) je Kilogramm Muschelfleisch.
<I>Beispiel 2:</I> kg hreiel.:chnecken (Littorina littorea) wurden in einer Hammermühle zermahlen. Die erhaltene Masse wurde zweimal mit. 96 % igem Alkohol (insgesamt 40 Liter) gut gerührt. Die auf diese Weise von Wasser befreite Masse wurde mit Petroläther einige Male extrahiert und der Alkohol wurde nach Verdünnung bis zu<B>50%</B> mit Petroläther aus geschüttelt.
Nach Waschen, Trocknen und Abdestillieren wurden 100 g Fett erhalten. Das Fett wurde mit 50 g KOH in 50 g Was ser und 400 cm' 96%igem Alkohol während
EMI0007.0001
zwei <SEP> :Stunden <SEP> an <SEP> einem <SEP> Rückflusskühler <SEP> ver seift, <SEP> die <SEP> .Seifenlösung <SEP> wurde <SEP> mixt <SEP> 2 <SEP> Liter
<tb> Wasser <SEP> verdünnt <SEP> und <SEP> :der <SEP> unverseif <SEP> bare <SEP> 'feil
<tb> wurde <SEP> mit <SEP> Hilfe <SEP> von <SEP> Äther <SEP> :
extrahiert. <SEP> Er gebnis <SEP> 17 <SEP> g. <SEP> Aus. <SEP> diesem <SEP> unverseif <SEP> baren <SEP> "feil
<tb> wurde <SEP> durch <SEP> Umkrisstalläsierung <SEP> aus <SEP> Alkohol
<tb> und <SEP> aus <SEP> Methylalkohol <SEP> (.zweimal) <SEP> die <SEP> Sterin fraktion <SEP> erbalten. <SEP> Ergebnis <SEP> 3:,815. <SEP> g. <SEP> Anus <SEP> dem
<tb> Absorptionsspektnum <SEP> :ergab <SEP> sich, <SEP> dass <SEP> :dieses
<tb> Präparat <SEP> etwa <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Provitamin <SEP> enthielt.
<tb>
<B>ä90, <SEP> mg</B> <SEP> rdieses <SEP> Piräpar <SEP> ates <SEP> wurden <SEP> be strashlt, <SEP> bis <SEP> 30, <SEP> % <SEP> (des <SEP> Provitamins- <SEP> umgewan delt <SEP> worden <SEP> war; <SEP> der <SEP> bestrahlte <SEP> Stoff <SEP> wurde
<tb> auf <SEP> die <SEP> in <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP> beschriebene <SEP> Weise <SEP> in
<tb> 2501 <SEP> cm' <SEP> Aracmsöl <SEP> eingeführt. <SEP> Es <SEP> wurde <SEP> ge funden, <SEP> dassr <SEP> die <SEP> antirachitische <SEP> Aktivität <SEP> auf
<tb> Ratten;
<SEP> 815 <SEP> Internationale <SEP> Einheiten <SEP> je <SEP> cm.'
<tb> betrug. <SEP> Für,die <SEP> Kückenprüfung <SEP> wurde <SEP> diese
<tb> Lösung <SEP> mit,dem. <SEP> Futter <SEP> in <SEP> einer <SEP> .Menge <SEP> ver mischt, <SEP> die <SEP> <B>7,5</B> <SEP> Internationalen <SEP> Einheiten <SEP> Vi ta<U>min</U> <SEP> D, <SEP> je <SEP> 100 <SEP> g <SEP> Futter <SEP> entsprach. <SEP> Es. <SEP> ergab
<tb> sich, <SEP> @dassi <SEP> im <SEP> Vergleich <SEP> zu <SEP> einer <SEP> gleich <SEP> gro ssen <SEP> Menge <SEP> Vitamin <SEP> D <SEP> in <SEP> der <SEP> Form <SEP> von <SEP> Le bertran <SEP> das, <SEP> aus <SEP> Kreiselschnecken <SEP> hergestellte
<tb> Präparat <SEP> vollkommen <SEP> wirksam <SEP> war.
<SEP> Bei <SEP> dem
<tb> in <SEP> diesem <SEP> Versuch <SEP> erreichten <SEP> Umwandlungs grad <SEP> hatten <SEP> 590 <SEP> mg <SEP> dieses <SEP> Präparates <SEP> also
<tb> 204 <SEP> 000 <SEP> internationale <SEP> Einheiten <SEP> Vitamin <SEP> D
<tb> oder <SEP> rund <SEP> 3,50 <SEP> internationale <SEP> Einheiten <SEP> je <SEP> mg
<tb> geliefert.
<tb>
<I>Beispiel <SEP> 3:</I>
<tb> 524 <SEP> g <SEP> Mehlwürmer <SEP> @(Tenebrio <SEP> molitor)
<tb> wurden <SEP> in <SEP> einer <SEP> 11ackfleischmühle <SEP> zermahlen
<tb> und <SEP> gemäss <SEP> Beispiel <SEP> 2 <SEP> mit <SEP> Alkohol <SEP> und <SEP> Pe troläther <SEP> (Siedepunkt <SEP> 40 <SEP> bis <SEP> <B>60'</B> <SEP> C) <SEP> behan delt. <SEP> Das <SEP> Fett <SEP> (44,5 <SEP> g) <SEP> wurde <SEP> mit,22 <SEP> g <SEP> KOR
<tb> in <SEP> 2,2 <SEP> cm' <SEP> Wasser <SEP> und <SEP> 150 <SEP> cm' <SEP> 9;
6 <SEP> % <SEP> igem
<tb> Alkohol <SEP> verseift <SEP> und <SEP> der <SEP> unverseifbaxe <SEP> Teil
<tb> würde <SEP> mit <SEP> Äther <SEP> extrahiert, <SEP> wobei <SEP> 1,08 <SEP> g
<tb> Rohprodukt <SEP> .erhalten <SEP> wurde. <SEP> Bei <SEP> einmaligem
<tb> Umliristallssieren <SEP> aus <SEP> Alkohol <SEP> und <SEP> viermali gem <SEP> Umkristalliskeren <SEP> aus <SEP> Methylalkohol
<tb> blieb <SEP> eine <SEP> schwerlösliche, <SEP> butterartige <SEP> Sub stanz <SEP> zurück; <SEP> die <SEP> Sterinfraktion <SEP> (0;14 <SEP> g)
<tb> wurde <SEP> in <SEP> Form <SEP> eines <SEP> nahezu <SEP> weissen <SEP> Kristadl pulvers <SEP> erhalten. <SEP> Aus <SEP> dem <SEP> Absorptionsspek trum <SEP> ergab <SEP> sich, <SEP> dass <SEP> der <SEP> Provitamingehalt
<tb> dieses <SEP> Sterips <SEP> etwa <SEP> 10,% <SEP> betrug.
62,7 mg :dieses, Präparates wurden be- strahlt,;bis,30% desProvitaminsumgewandelt worden waren. Der bestrahlte Stoff wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise in 250 em3 Arachisöl eingeführt. Es .stellte sich heraus,
@dassi die an Ratten untersuchte anti rachitische Aktivität 180 internationale Ein heiten je cm@ betrug.
Für eine Kückenprü- fung wurde diese, Lösung mit dem Futter vermischt in einer Menge, die 90 internatio nalen Einheiten Vitamin D_ je 1.0,0 g ent sprach;
:diese Menge erwies sich :im Vergleich zu Lebertran als vollkommen wirksam: Bei dem in diesem Versuch erzielten Umwand- lvngsgrad hatten 6.2,7 mg dieses aus 1VLehl- wü;rmern hergestellten Präparates. mithin 45 000 internationale Einheiten Vitamin D oder 720 internationale Einheiten je mg ge liefert.
<I>Beispiel</I> .4: 404 g Regenwürmer (Lumbricus.) wurden in einer H.ackfleischmühle zermahlen und mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60 C) auf die im Beispiel 2 angegebene Weise behandelt. Der Extrakt, 4;3:
.g, wurde mit 2,2 .g KOH in 2,2 ein' Wasser und 16 cm' Alkohol verseift. Aus dieser Masse wurde idurch Extraktion mit Äther 0,9 g erhalten,
was nach Umkristallisieren aus Alkohol und Methylalkohol eine .Sterinfrak- tion (weisse Kristalle) mit einem Gewicht von 0,3 g ergab. Der auf spektrographischem Wege bestimmte Provitamingehalt betrug 11 %.
In einem andern Fall wurde aus 9,7 kg Regenwürmern, seine Sterinfraktion von f2,5 g mit etwa 16% Provitamin erhalten.
A2,4 mg des beschriebenen Präparates wurden bestrahlt, bis<B>30%</B> des Provitamins umgewandelt worden war;
der bestrahlte Stoff wurde auf die im Beispiel 1 beschrie bene Weise in ,250 cm3 Arachisöl eingeführt. Es stellte sich heraus, dass die auf Ratten untersuchte antirachitische Aktivität 200 internationale Einheiten je cm' betrug.
Für die Prüfung auf Kücken wurde diese Lösung mit :dem Futter in einer Menge vermischt. die 100 internationale Einheiten Vitamin I) je 100 g Futter entsprach. Es zeigt sich, dass diese Menge im Vergleich zu Lebertran vollkommen wirksam war.
Bei :dem bei die sem Versuch :erzielten Umwandlungsgrad hatten 62,4 mg dieses aus Regenwürmern hergestellten Präparates mithin 50 000 inter nationale Einheiten Vitamin D oder 800 in ternationale Einheiten je mg geliefert.
<I>Beispiel 5:</I> 500 .g Blutegel (Hirudinea) wurden in einer Hackfleischmühle zermahlen und ge mäss Beispiel 2 mit Alkohol und Petrolä.tber (Siedepunkt 40 bis 60 C) behandelt. Der Extrakt, 7,4 g, wurde mit 3, 7 g KOH in 3,7 em@ Wasser und 25 cm' Alkohol verseift und ergab einen unverseifbaren Teil mit einem Gewicht von 1,5 g.
Nach L-mkristalli- sieren aus Alkohol und iyiethyla-lkohol wurde eine aus weissen Kristallen bestehende Sterin fraktion mit einem Anreicht von 0,68 g er- halten, deren auf spektrographischem Wege bestimmter Provitamingehalt 4,2% betrug.
179 mg dieses Präparates wurden bestrahlt, bis 40% des Provitamins umgewandelt worden waren; der bestrahlte Stoff wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise in 250 cm' Arachisöl eingeführt. Es wurde ge funden, dass die auf Ratten untersuchte antirachitische Aktivität 300 internationale E.inh-eiten je cm' betrug.
Für die Prüfung auf Kücken wurde :diese Lösung mit dem Futter in einer 150 internationalen Einheiten je 100 g Futter entsprechenden Menge ver mischt; es stellte sich heraus, dass diese ifenge in Vergleich zu Lebertran vollkom men wirksam war. Bei dem in diesem Ver such erreichten Umwandlungsgrad hatten <B>179</B> mg dieses aus Blutigel hergestellten Prä parates mithin 7 5 000 internationale Einhei ten Vitamin D oder 420 internationale Ein heiten ,je mg geliefert.
<I>Beispiel 6:</I> 5 kg Nordseeschwämme (Halichon:dria. panicea) wuxd.en in einer Hackfleischmüble zermahlen und auf die im Beispiel 2 ange gebene Weise mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis<B>60'</B> C) behandelt. Der Extrakt, 26,7 g, ergab bei Verseifung mit 14 g KOH in 11 cm' Wasser und 100 cm Alkohol und nach Extraktion mit Äther einen unverseifbaren Rückstand von<B>7,7</B> g.
Hieraus wurde durch Umkristall:isieren aus Alkohol und Methylalkohol 3,85 g Sterin, hellgelbe Kristalle, erhalten. Aus .dem Ab sorptionsspektrum ergab sich, dass der Pro- vita,mingehalt <B>0"6%</B> betrug.
1245 mg dieses Präparates wurden bestrahlt, bis<B>15%</B> des Provita.mins umgewandelt worden waren. Der bestrahlte Stoff wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise in 250 cm' Araehisöl eingeführt. Es wurde ge funden, dass die auf Ratten untersuchte anti- iacliitische Aktivität 101 internationale Ein heiten je cm\ betrug.
Für die Prüfung auf bücken wurde die Lösung mit dem Futter in einer<B>100</B> internationalen Einheiten Vitamin D je 100 g Futter entsprechenden Menge vermischt. Es stellte sich heraus, dass im Vergleich zu Lebertran diese Menge vollkom men wirksam war.
Bei. dem in :diesem Ver such erreichten L:mwandlungsgra,d hatten 1245 mg dieses aus Schwämmen hergestellten Präparates mithin 25 000 internationale Ein heiten Vitamin D oder 20 internationale Ein heiten je mg geliefert.
<I>Beispiel</I> i 6,8 kg Seesterne (asterias i@ibens) wurden in einer Hackfleischmühle zermahlen. und ge mäss Beispiel 2, mit Alkohol und Petroläther behandelt. Der Extrakt, 115 g, wurde mit 60 g KOH in 60 cm:
' \asser und 400 cm' Alkohol verseift, mit Äther extrahiert und ergab einen unverseifbaxen Rückstand mit einem Gewicht von 18 g. Aus diesem Rück stand wurden durch zweimaliges Umkristal- lisieren aus Alkohol 5,5 g hellros@aTarbi,ge Kristalle erhalten.
Aus dem Absorptions spektrum ergab sich, dass der Provitaminge- halt 0, 7 % betrug. 1.015 mg dieses Präparates wurden bestrahlt, bis N% des Provitamins umgewandelt worden waren:
der bestrahlte Stoff wurde auf die im Beispiel 1. beschrie bene Weise in 250 am' Arachisöl eingeführt. Es wurde gefunden, dass die auf Ratten un- tersuchte antirachitische Aktivität 100 inter- nationale Einheiten je. cm, betrug.
Für die Prüfung auf Kücken wurde die Lösung mit dem Futter in einer 100 internationalen Einheiten Vitamin D je 100g Futter ent sprechenden Menge vermischt. Es stellte sich heraus, dasse im Vergleich zu Lebertran diese Menge vollkommen wirksam war.
Bei dem in diesem Versuch erreichten Umwandlungs- grad hatten 1-015 mg dieses aus .Seesternen hergestellten Präparates mithin 25 000 inter- nationale Einheiten Vitamin D oder 25 in- ternationale Einheiten je mg geliefert.