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Procédé de préparation d'un accélérateur de la coagulation du sang.
L'invention concerne les fractions de globuline du plasma possédant des propriétés puissantes de coagulation, et les procédés de préparation de ces fractions.
La Demanderesse a découvert qu'une portion de plasma possédant des propriétés puissantes de coagulation peuvent être séparées du plasma au moyon du sulfate d'ammonium en diverses concentrations. Plus particulièrement la fraction coagulante est la portion du plasma qui ne se précipite pas avec le sulfate d'ammonium en concentration d'énviron 20 %, mais se précipite lorsque cette concentration est d'environ 30 %.
L'invention peut être expliquée par l'exemple suivant, aux détails duquel elle ne doit cependant pas être considérée comme limitée.
EXEMPLE - a) on fait couler du sang de lapin provenant d'un animal immunisé ou normal dans un volume égal d'une solu- tion de citrate à la manière habituelle. On élimine les cellules du plasma par essorage centrifuge. On ajo'ute au plasma dilué et centrifugé 200 grammes de sulfate d'ammo- nium cristallisé pari litre de plasma dilué, de façon à obtenir une teneur d'environ 20 %.en sulfate d'ammonium.
Il se forme un précipité floconneux, qu'on laisse déposer, on décante le liquide surnageant, et on le recueille. b) on recueille le précipité de l'opération a) après décantation, et on le redissout dans l'eau en quantité égale à à peu près la moitié du volume total de la charge de l'opé- ration a).On ajoute à cette solution des cristaux de sulfate d'ammonium en quantité suffisante pour former une solution à environ 2C %.
Il se forme de nouveau un précipité, et après dépôt de ce précipité on décante le liquide surnageant et on le recueille; c) on répète l'opération b), d) on mélange les liquides surnageant receuillis dans les opérations a), b) et c), et on y ajoute une quantité supplémentaire de sulfate d'ammonium cristallisé pour obtenir une teneur d'envi-
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ron 30 %. On laisse déposer le précipité qui se forme, et on élimine le liquide surnageant par décantation, ou de toute autre manière; e) on dissout le précipité de l'opération d) dans l'eau et on ajoute une quantité de sulfate d'ammonium suffisante pour obtenir une solution à 30% environ ; un précipité se forme de nouveau, et après dép8t on le sépare du liquide;
f) on dissout le précipité de l'opération e) et on le reprécipite de la même manière que dans l'opération e) pour le précipité de l'opération d);
Dans chacune des opérations a) à f) incluses, on règle la valeur du pH de la solution de préférence à environ 7,4 par l'addition d'hydroxyde de sodium ou substance analogue, en employant le rouge de phénol à titre d'indicateur. Dans les opérations a) à c) incluses, les solutions sont main- tenues de préférence à une température, d'environ 37 C., et maintenues à l'état d'agitation par un agitateur mécanique ou analogue.
Quoiqu'on obtienne de meilleurs rendements par ces modifications, elles ne sont pas indispensables. g) on recueille le précipité de l'opération f), on le dissout dans une faible quantité d'eau, et on introduit la solu- tion dans des sacs ou enveloppes en cello'phane, et on la dialyse dans l'eau courante jusqu'à élimination totale du sulfate d'ammo- nium; on dilue la solution dialysée de façon qu'elle contienne environ 10 % de matière solide, et elle contient ainsi la fraction de globuline que l'on désire obtenir, et qui possède des proprié- tés de coagulation puissantes.
Le pouvoir coagulant de la dernière solution obtenue prr l'opération g), peut être mis en évidence -en ajoutant C,l cm de cette solution à C,9 cm3 de plasma normal de cheval contenant 0,P5% d'oxalate de potassium dans un tube de Wassermann. On introduit le tube dans un bain-marie à 370 C, et on enregistre la durée de coagu- lation. Au cours de cet essai, le plasma est coagulé au bout de 30 secondes.
Un essai analogue étant effectué avec des dilutions à 1 : 100 de cette solution coagulante de globuline, la coagulation du plasma de cheval contenant l'oxalate s'effectue en 30 minutes au maximum, Cette propriété de coagulation du plasma a té également observée avec du plasma traité par de nombreuses autres substances qui servent généralement à empêcher la coagulation, telles que l'héparine, le citrate, la germanine, etc...
Si on le désir.e, on peut faire prendre au pH de la solu- tion coagulante de globuline provenant des sacs en cellophane après dialyse eilectuée suivant l'opération g) une valeur de 5,3 (élec- trode en verre), avec de l'acide lactique à 1/N, ou d'autres acides appropriés relativement faibles. Après avoir réglé la valeur du pH, on dilue la solution avec de l'eau distillée, en quantité suffisan- te pour obtenir un précipité maximum. On détermine séparément la quantité d'eau en dilution en introduisant plusieurs échantillons d'un cm de la solution non diluée dans plusieurs tubes d'essai et en y ajoutant des quantités d'eau variables.
La proportion relative d'eau qui fournit le précipité maximum avec l'échantillon essayé sert de mesure de la dilution de la charge principale de solution dialysée. gn laisse reposer la solution diluée à une température d'environ 5 C pendant environ 16 à 18 heures. On décante le li- quide surnageant, et on le recueille, et en le reconcentrant à une teneur d'environ 12 % en matière solide, on constate qu'il possède sensiblement le même pouvoir coagulant que le produit initial avantélimination de la fraction insoluble dans l'eau.
On dis- sout la précipité restant aprèsdécantation dans une solution de sel à 0,1 % dans une quantité telle que la solution contienne environ 5 à 6 % de proteines, On constate que les propriétés coagu- lantes de cette solution sont notablement plus fortes que celles de la solution coagulante de globuline initiale. On peut continuer la purification en réglant de nouveau la valeur du pH de la solu- tion à 5,3 par l'acide lactique comme précédemment, et en laissant
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le précipité se déposer. On décante le liquide surnageant du pré- cipité déposé, et le pouvoir coagulant de ce liquide est encore plus fort que celui des solutions antérieures.
On peut redissoudre le précipité pour obtenir une solution possédant également un fort pouvoir coagulant, mais cette globuline coagulante n'est pas entièrement débarrassée d'autres substances, et contient certaines substances lipoides et colorantes.
La fraction de globuline qu'on désire obtenir peut aussi être précipitée dans ces solutions aqueuses par l'addition de quantités appropriées d'acétone. A titre d'exemple, la solution dialysée provenant de l'opération g) peut servir de source appro- priée à cet effet, et on ajoute à cette solution une quantité d'acétone suffisante pour précipiter la fraction de globuline. On sépare le précipité dans l'acétone du liquide par exemple par fil- trage, et on peut le laver avec des mélanges d'acétone et d'éther, puis avec de l'éther. En évaporant l'éther du précipité on ob- tient une poudre sèche, qu'on peut utiliser directement à titre d'agent hémostatique, ou dont on peut former des solutions avec d'autres matières telles que celles qu'on emploie dans le commerce à titre de cautérisants. La poudre sèche se disout facilement dans des solutions salines.
Le pouvoir.coagulant de ces diverses solutions est le même que celui des solutions qui ont servi à préparer la poudre car la précipitation et le séchage n'exercent aucune influence sur le pouvoir initial de la fraction de globuline; Ces solutions coagulantes de globuline peuvent aussi être obtenues sous'forme de poudre en sechant les solutions ou les précipités dans le vide, Qu par tout autre moyen approprié. Le séchage dans le vide des solutions à l'état congelé est un procé- dé particulièrement commode, Si on le désire on peut broyer le produit séché. La solution dialysée de l'opération g) peut servir par exemple à préparer la poudre sèche. Cette poudre coagule le sang lorsqu'on l'applique directement, ou on peut le redissoudre dans l'eau etl'ajouter ensuite au sang ou au plasma.
Le séchage ne provoque p asde diminution appréciable du pouvoir coagulant.
Les produits secs ainsi que le.s solutions sont relativement sta- bles si elles ne subissent pas des conditions physiques ou chimi- ques rigoureuses.
Au lieu de partir du sang ou plasma de lapin ainsi qu'il a été décrit en particulier, on peut employer du sang pro- venant du cheval, du cochon, du chien, du chat, du boeuf ou de l'homme. Les fractions de globuline coagulantes provenant,de ces sources possèdent les mêmes caractéristiques coagulantes avanta- geuses que la fraction de plasma de lapin, et peuvent être utili- sées de la même manière en .produisant sensiblement les mêmes effets.
Une autre propriété remarquable des produits suivant l'invention consiste dans le fait qu'ils coagulent le plasma privé de ses propres propriétés coagulantes par absorption du plasma par l'hydroxyde de magnésium. Le plasma ainsi adsorbé ne se coagule pas par recalcification mais se coagule facilement si on y ajoute la globuline coagulante suivant l'invention avec ou sans addition de calcium.
Les globulines coagulantes suivant l'invention sous une forme quelconque de solution ou de poudre sèche peuvent être appliquées sur les blessures saignantes des hommes et des animaux en provoquant la formation immédiate d'un caillot, et sans exercer aucun effet nuisible sur les tissus sur lesquels on les applique. Ces ,résultats ont été observés sur des animaux héparinisés ainsi que sur les animaux normaux et la coagulation du sang humein a été observée même dans des conditions aussi critiques que l'hémophilie . On a constaté que la fraction de
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globuline spécifique séparée suivant l'invention provoque la coagu- lation du sang complet ou plasma sous une forme quelconque, et ce résultat a été mis en évidence dans le plasma traité par les substan- ces connues qui servent normalement à empêcher la formation du cial- lot.
Tant que le sang ou le plasma contient de la fibriogène qui peut être transformée en fibrine, les globulines,coagulantes suivant l'in- vention provoquent la formation du caillot.
Le sulfate d'ammonium décrit dans l'exemple choisi peut être remplacé par d'autres sels, pour provoquer la précipitation fractionnée de la globuline qu'on désire obtenir, et la séparer des autres substances avec lesquelles elle est combinée dans le plasma.
Parmi ces sels on peut citer le sulfate de sodium, le chlorure de sodium, le phosphate de sodium, etc... Dans chaque cas les sels doivent être employés en proportion appropriée. La fraction que l'on désire peut être obtenue à l'état pur au moyen de précipitations et dissolutions répétées. D'autres procédés peuvent également servir à isoler la fraction de globuline du plasma, possédnnt des propriétés puissantes de coagulation. On a constaté qu'en réajoutant de faibles quantités d'autres fractions du plasma à la fraction de globuline coagulante, on fait disparaître dans certains cas les propriétés coagulantes du sang de la fraction coagulante,
REVENDICATIONS ----------------------------
1.
Procédé de préparation d'un accélérateur de la coagula- tion du sang caractérisé en ce qu'on ajoute au plasme une quantité de sulfate,d'ammonium suffisante pour obtenir une solution à 2C % environ de ce sulfate, et on forme ainsi un précipitée on sépare le précipité du liquide, on ajoute une quantité de sulfate d'ammonium supplémentaire au liquide suffisante pour obtenir une teneur d'environ 20 % en sulfate d'ammonium on laisse le précipité se former, on sépare le précipité formé, on redissout ce dernier précipité, et on élimine le sulfate d'ammonium de la dernière solution.