BE624526A

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Publication number: BE624526A
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Description


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  "Vaccin obtenu à partir du virus Vivant atténué de la rougeole". 



   La présente invention se rapporte à un procédé de production d'un vaccin de la rougeole amélioré et à un vaccin de la rougeole amélioré servant à immuniser les êtres humains contre la rougeole.   L'invention   concerne également un procédé de production du virus de la rougeble de la souche. dite de Schwarz. 



   Des chercheurs ont réussi à adapter le virus de la      

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 rougeole de manière qu'il puisse se développer et se propager dans des cultures de tissus ou de cellules n'appartenant pas à des êtres humains. Il a été démontré que des souches du virus de la rougeole qui sont appropriées pour une inoculation aux être humains peuvent être obtenues par atténuation dans de telles cultures de cellules n'appartenant pas à des êtres nu- mains. 



   Des essais cliniques du virus vivant de la rougeole, adapté et atténué, ainsi obtenu, ont prouva qu'il est capable de former des anti-corps dans les sujets inoculés en les immu- nisant contre l'infection par la rougeole. Malheureusement, des réactions indésirables telles qu'une fièvre élevée peuvent se manifester à un degré important chez les personnes inoculées. 



  Une grande partie des enfants auxquels on a inoculé des vac- cins obtenus à partir de la souche adaptée et atténuée des vi- rus de la   rougeole   dont on disposait jusqu'ici ont été sujets à de fortes éruption et à d'autres   réactions   dues à l'inocula- tion. 



   Les effets secondaires indésirables pourraient être supprimés ou éviter uns une certaine mesure par l'injection simultanée de globuline gamma qui a un effet marqué en ce qui concerne la prot ction des enfants contre les symptômes plus sévères des réactions indésirables. La prévention des réactions par application combinée uu vaccin de lu rougeole et de la glo-   buline   gamma est peu commode et coûteuse et ne convient généra- lement pas pour des programmes d'inoculation à grande échelle. 



   On a actuellement constata qu'on peut éviter les effets secondaires appréciables et les symptômes indésirables ou tout au moins les réduire fortement chez les personnes ino- culées si l'on utilise, pour l'immunisation, un vaccin amélioré qui est obtenu à partir de la souche dite de Schwarz du virus vivant de la rougeole. Avec ce nouveau vaccin, il n'est pas re- quis d'injecter simultanément de la globuline gamma. On peut obtenir actuellement une action aussi bonne ou meilleure en ce 

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 qui concerne la fréquence et la sévérité des réactions chez les personnes inoculées en utilisant le vaccin amélioré de la rou- geole conforme à la présents invention seul. 



   La souche Schwarz du virus de la rougeole se dis- tinbue des   souches   du virus de lu rougeole cunnues jusqu'ici par l'absence d'effets secondaires et de réactions indésirables chez les personnes inoculées avec ce vaccin et par l'absence notable des symptômes pathologiques habituels de la rougeole sans réduction apparente de sa capacité d'immunisation et de son efficacités 
La sécurité et l'action améliorée de la euche Schwartz du virus de la rougeole peuvent être obtenues par l'atténuation d'un virus adapté de la rougeole, de manière tel- le que la virulence du virus soit affaiblie à un degré plus élevé que dans le cas des procédés d'atténuation qui ont été utilisés jusqu'à ce jour. 



   Les vaccins nouveaux et perfectionnés de la présente invention contenant un virus vivant atténué de la rougeole peuvent être facilement obtenus conformément à la   présenta   in- vention par la propagation et la croissance de la souche Schwarz du virus de la rougeole dans un milieu de culture   comprenant   des cellules animales vivantes, après quoi les cellules et les débris sont séparés du milieu de culture. Le vaccin obtenu de cette manière peut être utilisé directement ou être stockée et les agents habituels de dilution, de stabilisation, etc peu- vent être ajoutés à n'importe quel moment. Le stockage est facilité si le vaccin est congelé et est maintenu dans cet état en vue d'une utilisation ultérieure. 



   Si la propagation de la souche Schwarz du virus de la rougeole a lieu dans des conditions et à des températures telles que le virus ait la possibilité de reprendre une forme plus virulente, il eat bon de prendre la précaution de faire appel, au cours de la fabrication et/ou de la préparation de réserves   d'ensemencement   à partir de la souche Schwarz existante 

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 du   virus, à   plusieurs passades dans des conditions réductrices de la virulence, par exemple de cultiver le virus pendant plu- 
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 sieurs passades & des températures inférieures à 35*0 et plus avantageusement inférieures à 3200.

   Si, en dépit de toutes les   précautions,  la souche Schwarz du virus revient à une forme plus virulente, elle   ce=.se   de constituer une matière de départ   appropriée     pour   la aise en oeuvre ce la présente invention et 
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 on doit la remplacer par une substance nouvelle rpondant à la définition d,9 ny  plus haut pour la souche Schwarz du virus de la   rougeole.   



     Selon,   l'utilisation envisabée, le vaccin obtenu à partir du   Milieu   de culture peut être dilué avec un diluant appropriâtde préférence avec de l'eau distillée et stérilisée. 



  Dans une   variante,      on   peut sécner le vaccin par congélation 
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 pour .'sut6sç.xax et le reconstituer ",vue un diluant aruprié, de préférence   en.   ajoutant de l'eau distillée et stérilisée, avant de l'utiliser. 



   Il est   souvent   avantageux d'ajouter au vaccin un 
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 atoent assumât sa stabilisation. On a pu constater qu'une solu- tion de   lactose   et de glutamate constitue un agent stabilisant   excellent   pour le vaccin. 



   Le   virus   vivant de la rougeole appartenant à la sou- 
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 che 8chwa^aw virus qui constitue la matière de départ pour la production des   vaccina   améliorés conformes à la présente inven- tion, peut être facilement obtenu par l'adaptation du virus de la rougeole, de manière telle qu'il puisse croître dans un tis- su   cellulaire   vivant n'appartenant pas   à   un être humain ou dans un milieu contenant ces cellules vivantes et par atténuation 
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 du virus adapté Krtee à plusieurs passades à travers un milieu de culture comprent des cellules animales vivantes, aans des conditions réduisant la virulence et à des températures infé- rieures 4 37*0 mais .supérieures à celles à laquelle la propaga- tion du virua cesse.

   Comme mentionné plus haut, le procédé de 

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 production de la souche Schwarz uu virus de la rougeole entre également dans le cadre de la présente invention. Au lieu d'a- dapter des virus natifs de la rougeole, il est également   possi-   ble d'utiliser comme matière de départ une souche adaptée du vi- rus de la rougeole  telle que celle que des chercheurs ont pu obtenir antérieurement en adaptant et en atténuant la   soudhe     Edmoneton   du virus de la rougeole, comme la souche   .fondera.   L'at- ténuation des souches adaptées disponibles grâce à.

   plusieurs passages du virus dans un milieu de culture contenant des cel- lules vivantes n'appartenant pas à des être humains, de la ma- nière réductrice de la virulence décrite ci-dessus, donne la souche Schwarz du virus de la rougeole. 



   Il est préférable qu'au moins une partie del'incu- bation, dans le processus d'atténuation, soit exécutée a une température inférieure à 35 C et plus avantageusement inférieure à 32 C. Au moins plusieurs passages ou une partie des passages, quand leur nombre est important, doivent être exécutés à une température inférieure à 35 C et plus avantageusement comprise entre 28 et 32 C. Toutefois, si on le désire, tous les passages du processus d'atténuation du virus peuvent être exécutés feux températures inférieures qu'on vient de mentionner. 



   On peut facilement adapter le virus   de.;la   rougeble de manière   qu'il   soit capable de se propager dans des tissus d'embryon de poulet ou dans un milieu ae culture contenant des cellules vivantes de ce tissu.Ce même tissu ou un milieu nu- tritif contenant les cellules vivantes de ce   tisbu   peuvent également servir de milieu de croissance pour la production du vaccin à partir de la souche Schwarz du virus. 



   Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de production de la souche Schwarz du virus de la   rougeole   les cultures d'un tissu animal sont obtenues de façon classique dans un fluide   nu.ritif,   qui n'est pas toxique   vis-à-vis     diïl   virus de la rougeole et qui entretient la   croissance   de ce tis- su, puis on les inocule avec le virus vivant de la rougeole. 

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  On fuit ensuite incuber les cultures de tissu inoculées, a ?7'* 3? G et pensum, un certain laps de temps, puis on fuit pusaer le virus, à plusieurs reprises sur le même   tisu   animal et pen- dant un nombre de passades suffisant pour assurer l'adaptation du virus à lu croissance sur le tissu particulier utilisé. De cette façon, on a constaté par exemple que le virus de la rou- 
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 6aele peut être adapté à la croissance sur un tissu provenant du rein de chien, da rein de boeuf, du rein de porc, et sur un tissu d'embryon de poulet.

   Après cette culture d'adaptation, on fait ensuite passer le virus en série dans une culture de tissu, sur le support particulier auquel un l'a adapté, l'in- cubation du virus étant exécutée à des températures inférieures 
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 à la normale et comprises entre environ 28 et 32 C pour modifier le virus, ce qui fait que le virus modifié, quand4l est&njecté à des enfants qui ne sont pas immunisés contre lu rougeole, est capable de stimuler la production d'anti-corps protecteurs de la rougeole sans produire d'éruption appréciable, une fièvre 
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 notable ou d'autres symptômes pathologiques usuels de la rùu- - geole . Le procédé précite de culture du virus de la rougeole, quand il est exécuté sur des tissus avians, en particulier des tissus d'embryon de poulet, représente un mode de réalisation préféré de la présente invention. 



   Dans un autre mode de production de lu souche Schwarz du virus de la rougeole,   conformément   à la présente in- vention, on inocule le virus vivant initial de la rougeole dans une culture de tissu unimal et on le fait incuber à des tempé- 
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 ratures inférieures à la normale, cvwme mentionné ex# iessus, sans adaptation préalable au tisitu particulier a des températu- res d'incubation normales. nsu.l.te, on continue le transfert en série et l'incubation à ces températures inférieures à la normale, de préférence entre environ ..6 et ?<i 0, pendant un nom- bre de passées suffisants pour obtenir l'atténuation désirée du virus. 



   Dans une variante,   quand   le virus natif frais de la 

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 rougeole constitue la matière de départ, il est   fréquemment   dé- sirable d'effectuer la multiplication initiale du virus dans une culture de tissu humain, comme une culture d'un   tissu.de   rein humain, d'un tissu amniotique humain ou d'un tissu de coeur humain, ou d'un tissu animal dont on sait qu'il peut servir facilement de tissu porteur pour la multiplication de ce virus      natif, par exemple une culture d'un   tiwsu   de   rej.n   de chien.

   Dans un tel cas, il peut être désirable de poursuivre la culture sur ce tissu humain ou ce tissu de chien pendant plusieurs passages en série, jusqu'à ce que l'identité et la pureté du virus puis- sent être établies, Ensuite, on procède à l'adaptation du virus à d'autres tissus animaux et l'atténuation de ce virus par incubation à des températures basses de la manière décrite ci- dessus. Dans n'importes quelles opérations d'adaptation anté rieures à l'amorçage de l'incubation à des températures infé- rieures à la normale, il est compréhensible   c.u'on   peut procéder à des transferts intermédiaires sur d'autres tissus ou sur des oeufs   ambryonnaires   par des techniques classiques sans sortir du cadre de la présente invention.

   Il est étalement possible de procéder à l'atténuation conformément à la présente invention avec des souches existantes de virus de la rougeole qui sont adaptées en vue d'une croissance dans des tissus animaux ou dans un milieu de croissance contenant des cellules de ces tis- sus, par exemple avec la souche   Enders   du virus de la rougeole. 



   Dans l'un des procédés, on forme une culture de tis- su animal de la manière décrite précédemment et; lorsqu'on peut constater une croissance satisfaisante sur le tissu, la charge initiale de fluide nutritif est remplacée par du fluide nutritif frais et on inocule les cultures avec le, virus vint de la rougeole. Pendant l'incubation du virus, on peut   abiter   doucement les récipients de culture, par exemple au moyen d'un ensemble à tambour et galets. Oh peut aussi appliquer des pro- cédés ue culture statique, à condition de faire en sorte que 

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 les cellules tissulaires soient immergées dans le fluide nutritif. La multiplication du virus est habituellement   démon-   trée par un effet cytopathogène distinct sur les cellules tissu. laires qu'on peut observer au microscope.

   Toutefois, dans cer- tains cas, en particulier au début de l'adaptation du virus à un nouveau type de cellules, un effet   cytopathogène   n'est vi- sible   qu'après   une   longue   période d'incubation, si même il est visiole. Toutefois, dans ces cas, on peut suivre la   multiplica-   tion du virus par titrage d'une partie du fluide ae culture du tissu inoculé dans une culture de tisau humain, comme le tissu amniotique humain, le tissu au coeur humain ou un tissu analo- sensible gue à ce virus. Ce genre de tissu montre rapidement un effet   cytopathogène   typique quand on l'infecte avec le virus de la   rou-   geole.

   Dans le mode de mise en oeuvre préféré, on fait passer le virus en succession à travers des cultures successives de tissu animal, frais, avec incubation à 35 C, pendant quelques- uns de ces passages, de préférence environ une dizaine de pas- sages, pour assurer une adaptation au tissu particulier utilisé. 



  En tout cas, on procède ensuite à plusieurs passages en série dans cette culture de tissu, avec incubation du virus à des tem- p6ratures inférieures à la normale, de préference comprise en- tre environ 28 et 32 C, pour obtenir l'atténuation désirée du virus. Le nombre exact des passages successifs à la température inférieure qui est nécessaire dépend de facteurs tels que la souche particulière du virus de la rougeole qui est utilisée, l'histoire antérieure de sa culture et le tissu particulier utilisé dans la culture sur le tissu.

   Dans une culture de tissu d'embryon de poulet, on obtient de bons résultats en ce qui concerne l'atténuation, avec environ quarante passades en série du virus à une température d'incubation de 28 à 32 C 
Quand on a atténué le virus de la manière   précéden-   te, la Boucha Schwarz atténuée du virus peut être maintenue sur un tissu du même type que celui auquel le virus a été adapté 

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 en poursuivant l'incubation à des températures de 28 à 32 C En général, il est désirable, mais non pas nécessaire, de trans- férer le virus dans des cultures de tissu frais quand environ 
20 à 75%, de préférence 25   à.   50%, des cellules contenues dans une quantité donnée d'une culture de tissu inoculée, montrent un effet   cytoputhogene.   



   On utilise des techniques similaires pour multipli- er le virus atténué en vue d'obtenir des réserves pour la pré- paration des vaccins. Dans ces dernières opérations, on fait      incuber la culture jusqu'à ce que le virus se soit mu tiplié de façon telle qu'on en   obtienne   une concentration utile et on'récolte le fluide provenant des récipients de culture sur tissu, par exemple par décantation dans des conditions aseptique puis on le clarifie par centrifugation, filtration, etc, . Le produit résultant peut être utilisé directement sous la forme d'un vaccin ou, selon sa concentration en virus, on peut le di- luer avec.un diluant injectable approprié ou une solution sta- bilisante, non toxique   vis-à-vis   du virus, pour préparer un vaccin liquide final.

   Quand une partie appréciable des cellules , de tissu contenues dans la culture n'a pas été désintégrée par l'effet cytopathogène de la croissance du virus, un fluide frais, comme une solution appropriée de   stabilisation   du vacc in, une solution saline équilibrée, un milieu nutritif frais ou un pro- duit analogue, peut être introduit dans les récipients de cul- ture après la décantation, et on fait passer ces récipients et leur contenu par un cycle de congélation et de décongélation pour libérer de nouvelles quantités de virus des cellules des tissus* On recueille le fluiue résultant et on le réunit à celui qu'on a récolté   précédèrent,   pour obtenin un concentré de vaccin.

   On débarrasse ce dernier des cellules de tissus et des débris d'une manière appropriée, comme mentionné plus haut, puis on normalise la teneur en virus par   titrabe,   par exemple en fonc- tion des-cellules de culture de tissus humains. Ensuite, si on 

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 le désire, on peut   utili   er le concentré de vaccin directement pour la vaccination d'êtres humains non immunisés, ou bien, 
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 on peut le diluer avec un aent stabilisant stérile comme une solution de lactose et, de glutamate   et,   le stocker à l'état con- gelé, de   préférence   à une température comprise entre -20 et 
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 "j0 C, jusqu'au moment de son Utilisation.

   Dans une variante. le vaccin stabilisé peut être séché par congélation, ce qui donne un vaccin sec qui peut être facilement stocké et   qu'on   peut reconstituer avec de l'eau stérilisée ou une substance ana- loue au moment de son utilisation. 
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  Bien qu'on profère poursuivre'incubation aux tempe- ratures inférieures à la normale, prescrites pour assurer   l'at"   
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 ténuation désirée du virus en vue de produire la souche echwart du virus avec le plus petit nombre possible de passades succès-' sifs, on peut apporter des modifications mineures. Ainsi, par 
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 exemple, les passais en série à e8-3,eOC peuvent être interrom- pus par un ou plusieurs passades à des températures plus élevées, à condition que le nombre total de passades à la température inférieure à la normale soit suffisant pour assurer l'atténua- tion désirée.

   De façon similaire, lorsque l'atténuation dési- 
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 3ët est obtenue, ont peut procéder à un ou deux passades de multiplication pf-ur propager la réserve du vaccin à des tempé- ratures plus élevées appropriées, si on le désire, 
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 EXi-TPLE 1 Technique de culture sur tissu. 



   On découpe finement des embryons de poulets de 8 à 10 jours, dans aes conditions   asceptiues,   après avoir enlevé les yeux, et on lave le tissu émincé ainsi obtenu avec une solu- 
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 tion saline tamponnée au phosphate. On traite le tivsu lavé avec de   la   trypsine, de la manière habituelle, en utilisant un flacon d'Erlenmeyer pour-vu d'un agitateur magnétique. On cen- 
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 trifuge le tissu ainsi traité à une vitesse de 1.uuO taurs/minu te et pendant > minutes, après quoi les cellules concentrées ré- sultantes sont mises en suspension dans un milieu de culture , 

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 4 raison de 5UU.UUU à 6GU.OuU cellules par ml.

   Le milieu de cul- ture est une solution saline basique de   JSarle   (6,8 gr de   chloru-   re de sodium, 0,4 gr de chlorure de   potassium,0,2   gr de chloru- re de calcium, 0,2 gr de sulfate de magnésium   heptahydraté,     0,15   gr de phosphate disodique, 1,0 gr de glucose, 2,2 gr de bicaroonate de souae et 0,02 gr de rouge de phénol dissous dans l'eau en-quantité suffisante pour faire 1000 ml) contenant 5% 
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 de sérum de veau et 0,5ira d'hydrolysat de lactalbumine et con- tenant en outre 600 unites de péniciline et 400 microgrammes de streptomycine, par ml. On inocule des quantités de   1   ml de la suspension résultante dans des tubes stériles et on fait in- 
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 cuber pendant 24 à 48 heures à 35*G.

   On procède également de la même manière pour former de plus grandes masses en   introduisant   60 à 70 ml de la suspension dans des flacons de culture de Blake ou de Roux. 
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  Après la période d'incubation initielo es cellules de tissu d'embryon de poulet, on en enlève le milieu de cul- ture, on lave les cellules à deux reprises avec le milieu n  199 
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 de Morgan et Parker (Morgan et autres, "proceedings of the Society for Expérimental Biology and liedil.-ine" 1950, 7,IJP.l-d), et ensuite, 2 ml du milieu n  1t,9, rs contenant pas de sérum et ajusté au pH de 7'*7<2 sont introduits dans chaque tube, ou bien 100 ml de ce milieu dans chaque flacon.

   Ensuite, on inocule 0,2 ml d'une suspension de virus vivant et actif de la   rougeole -   
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 dans chaque flacon ou bien 1 ml de cette suspensioee virus dans chaque tube, et on fait incuber les cultures résultantes à 32-3800, pendant un laps de temps permettant d'obenir la mul- tiplication du virus, En général, la croissance du virus est   aise   en évidence par le fait que les cellules contenues dans la 
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 culturEtsui' tissu présentent un effet cytopathogène, et on procè- de habituellement à un passade eh série du virus dans un nou- veau   milieu   de culture sur tissu quand environ 25 à 50% des cellules   ontenues   dans le milieu de culture inoculé présentent 

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 un effet cytopathogène.

   Dans une variante, on peut suivre la croissance du virus dans la culture sur tissu en titrant le mi- lieu de culture dans une culture de cellules de tissu humain, comme des tissus amniotiques humais, des tissus du coeur ou 
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 d'autres tis&us humains appropries, par le procéda décrit par Schwarz et Zirbel dans "roceedlnbs of the dociety for JSxperi- mental Biology ana 14edicine"g 1;59, vol. lu2, pp. 711-714. 



  Lorsqu'on a exécuté un nomure de passades suffisant 
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 pour atténuer le virus de la façon désirée, on procède à un ou plusieurs passades supplémentaires dans une culture de tibtsu d'embryon de poulets, à  i8-;$c:oC, sur une échelle assez grande pour multiplier le virus à un degré suffisant pour obtenir une réserve de concentré de vaccin. On récolte le concentré de vac- cin de la manière habituelle par décantation, congélation et décongélation, puis   lavage.   On clarifie le vaccin de réserve par centrifugation du liquide de culture et par lavage de ce li- 
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 quiue jusqu'à ce qu'il soit exempt de cellules de tissus et de débris du cellules. 



  E.J#!.:PLE 2 Préparation et essais du vaccin 
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 Lors de la préparation d'un vaecin conformément au mode de réalisation préféré de   l'invention,   on maintient une souche Edmonston du virus de la rougeole, telle que décrite par   Endors   et autres,   grâce   à plusieurs passages en série dans 
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 une culture de tissu d'embryon de .poulet, avec incubation à :'5 0, 'plilndant 19 passages successifs. Ensuite, on soumet ce vi- t'us adapté sur embryo de poulet, en utilisant la teczique de l'exemple 1, à 37 passages successifs dans ur.e culture de tissu d'embryon de poulet avecs incubation à "0.

   Le virus atténué résultant obtenu après le 37mie passage est soumis à trois passa- ges terminaux de dilution dans une culture de tissu   d'embryon   de poulet, puis à deux passades dans une telle culture de tissu pour multiplier le virus et produire une réserve de vaccin.

   A chacun de cen derniers passages, on fait incuber la culture à 

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 3S"0< Les! concentrés de vaEie!tl résultants sont séparés des cel- lules des tissus ai deà débris et on les dilue avec le mme volume de solution do lactose et de glutamate servant e:6abi- lisant, La composition du la solution stabilisante de lactose et de glutamate est la suivante : 
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 Glutamate de potassium O,56 gr NaHPO z 5 gr KHi'04 ou52 gr 
Lactose 100,00 gr 
Eau,   @@@.   pour 1 litre On titre une portion du vaccin termine en fonction de cellules du tissu du coeur humain. On constate que les vaccins   contien-   
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 nent de 103e5 à 10 493 doses infectieuses de culture de tissu (TOID50) pour 0,2 ml.

   On essaie chaque réserve de vaccin par inoculation dans un milieu nutritif bactérien au thioglyco1ate, par inoculation par vu1e intrapéritoaéale et sous-cutanée à des cobayes et des souris, et par inoculation intramusculaire et in- tracérébrale à des singes cynomolotues, et on constateue ces réserves sont exemptes de contamination. On injecte à 9 en- fants, qui,ne sont pas immunisés contre la rougeole,des doses de 
0,2 ml du vaccin, par voie intramusculaire chez deux des en- - fants   et 'par   voie   sous-cutanée   chez les 7 autres enfants. Aucun 
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 deolentants inoculés ne montre de sibne d'éruption de la rougeole et l'un d'entre eux seulement à une fièvre notable, qui n'est que temporaire, pendant la période   d'ubservation   qui suit la Vaccination. 
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  EX-ELLE 3 
On poursuit les passages en   srie   du virus après le   @     3e   passade à basse température de l'exemple 2, de la même   maniè-   re que dans cet exemple, jusqu'à obtention d'un total de 65 pas- 
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 sages à la température d'incubation de 72 C. On prépare des ré- serves de vaccin avec le stabilisant lactose-glutamate comme dé- crit précédemment et on les sèche par congélation. Le titre du vaccin reconstitua à partir de cette substance séchée par congé- 

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 lation est compris entre 1041 - 5 et 10,''S TOLD 50 pour 0,2 mlr On conserve ébaletélit une partie du vaccin par conbélation diz 1 sa   1 recta.   On essaie le vaccin en ce qui concerne/sécurité de la manière décrite dans l'exemple 2. 
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  On inocule 0,2 ml dos vaccins décrits c1MuesuUW, par voie sous-cutanée, à chacun d3 70 enfants MW soumis à des teste concernant les anti-corps de neutralisation et de fixa- tion cte l'alexine et ne* présentât pas ces ant3-corpâ une dilution 1 : 2 de sérum, après quoi on met les enfants en ob- servation pendant plusieurs semaines, sous la surveillance   d'un   personnel médical éprouvé. On n'observe pas de réaction locale 
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 ou immédiate chez aucun des enfants, sauf une réaction jbe uri- carienne moyenne se produisant approximativement 4 heures après la vaccination. On prend la température des enfants au moins une fois par jour et celle de la plupart des enfants deux fois par jour, pendant la   période   d'observation.

   Dans certains cas, une réponse fébrile moyenne durant environ 2 joura peut être notée 7 ou   6   jours après la vaccination. La température rectale 
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 maximum moyenne chez tous les enfants vaccinés est de 38*Co On observe une éruption moyenne analogue à celle de la rougeole chez deux enfants seulement, les lle et 13e jourijaprès la vao- cination. Aucune complication sérieuse d'un type quelconque 
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 n'est constatée pendant les essais e on ne constate pas de com plication nerveuse. On   prélève, 5   à 6 semaines après la vaccina- 
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 tion, un échantillon de sérum du san de chaque enfant ot on l' e.ssae en ce qui concerne les anticorps de neutralisation et de fixation de l'alexine de la rougeole.

   LQ6éveloppement;nti- corps chez 9?tlv des enfants est comparable à celui qui a lieu à la suite d'une infection naturelle de la rougeole. 



  EXhL.t:L.4 En appliquant le procédé de l'exemple 2, on soumet le virus de la ruu0eole provenant du 37e passade à 32 0 dudit exemple à 10 passades ;;u1,pl'menL;.;.ire-s, avec incubation à 32'>Cg suivis de 15 passades avec insubut-ton à 2oOû. Les vaccins pré- 

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 parés à partir du virus provenant du 15e passage à 28 C sont utilisés pour l'inoculation d'enfants non   immunisés.   la miss en   ,observation   des enfants inoculés et les tests   auxquels   on les soumet indiquent que le virus a été atténué en ce qui concerne la sévérité de leur réaction vis-à-vis de celui-ci, sans perte. décelable de son pouvoir antigène. 



   De façon similaire, on peut atténuer le virus   d   la rougeole en le cultivant sur un tissu isolé, à environ 28-32 C, en utilisant un tissu tel que le tissu du rein de boeuf.'Lors- qu'on prépare les cultures de tissus, on peut utiliser des en,. zymes protéolytiques autres que la trypsine pour dispenser les cellules des tissus. En outre, on peut utiliser d'autres   flui-   des de culture, tels que le milieu basique de   fiable  le milieu n  199 avec 5 à 10% de sérum de cheval inactivé ou un milieu formé de 8 parties de solution saline   basique   de   Earle,   de 1 partie d'un bydrolysat à 5% de lactalbumine et de 1 partie de sérum inactivé de cheval ou d'agneau. 



   REVENDICATIONS 
1. Un procédé de production d'un vaccin de la rougeole à partir d'un virus vivant-et atténué de la rougeole, qui cousis. te à provoquer la propagation et la croissance de la souche Schwarz du virus de la rougeole dans un milieu de culture qui comprend des cellules animales vivantes, et à séparer les   cellu-   les et les débris du milieu de culture.

Claims

2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel on congèle la vaccin qu'on maintient dans cet état en vue d'une utilisation ultérieure.

3. Procédé suivant les revendications 1 ou 2, dans lequel le vaccin obtenu à partir du milieu de culture est dilué avec un diluant approprié.

4.' Procédé suivant la revendication 3, dans lequel le diluent est de l'eau distillée et stérilisée* 5. Procédé suivant les revendications 1 ou 2, dans <Desc/Clms Page number 16> lequel on sèche le vaccin par congélation et on le reconstitue avec un diluant approprié avant de l'utiliser.

6. Procédé suivant la revendication 5, dans lequel on reconstitue le vaccin séché par congélation en y ajoutant de l'eau stérilisée et distillée.

7. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6, dans lequel on ajoute au vaccin un stabilisant pour celui-ci.

8. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7, dans lequel le stabilisant est une solution lactose- glutamate.

9. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8, dans lequel on utilise une souche de virus de la rougeole qu'on a obtenue en adaptant un virus natif ae la rou- geôle de manière qu'il soit capable de se développer dans un tissu cellulaire animal ou dans un milieu contenant ces cel- lules animales et en atténuant le virus adapté grâce à des pas- ; sages multiples successifs à travers un milieu de culture com- prenant des cellules animales vivantes, à une température in- férieure à 35 C mais supérieure à celle à laquelle le virus cesse de se propager.

10. Procédé suivant la revendication 9, dans lequel on utilise une Bouche de virus de la roubeole qui a été obtenue ' en atténuant une souche d'Enders du virus de la rougeole. @ 11. Procédé suivant les revendications 9 ou 10, @ dans lequel on utilise une souche de virus de la rougeole qu'on @ a obtenue en adaptant et, en atténuant une souche du virus de la rougeole à une température inférieure à 35 C mais supérieure à celle à laquelle le virus cesse de se propager.

12. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 9 à 11, dans lequel on utilise une souche de virus de la rougeole qu'on a obtenue en adaptant et en atténuant un virus natif de la rougeole, tel que la souche Edmontson au virus de la rougeole, par un procède dans lequel au moins une partie de l'im- <Desc/Clms Page number 17> oubation du processus d'atténuation a été exécutée à une tempé- rature inférieure à 35 C mais supérieure à celle à laquelle le virus cesse de se propager.

13. Procédé suivant.!/ une quelconque des revendica- tions 9 à 12, dans lequel on utilise une souche de virus de la- rougeole qui a été obtenue par l'adaptation et l'atténuation du virus natif de la rougeole, tel que la souche d'Edmonston du virus de la rougeole, par un procédé aans lequel on a effectué au moins une partie de l'incubation du processus d'atténuation à une température de l'ordre de 28 à 32 C.

14. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 9 à 13, dans lequel on utilise une-souche de virus de la rougeole qui a été obtenue par l'adaptation et l'atténua- tion du virus natif de la rougeole, tel que la souche d'Edmons- ton du virus de la rougeole, par un procédé dans lequel au moins plusieurs des passages du processus d'adaptation et d'atténua- tion ont été exécutés à une température comprise entre 28 et 32 C.

15. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 9 à 14, dans lequel on utilise une souche de virus de la rougeole qui a été obtenue par l'adaptation et l'atténuation du virus natif de la rougeole, tel que la sauche d'Edmonston du virus,de la rougelole. par une procédé dans lequel tous les passages.d'atténuation du virus ont été exécutés entre 28 et 32 C.

16. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 9 à 15, dans lequel on utilise une souche de virus de la rougeole qui a été obtenue par l'adaptation et l'atténuation du virus natif de la rougeole, tel que la souche d'Edmoston d vi- rus de la rougeole, par une procédé dans lequel le processus d'atténuation du virus comprend au moins 40 passages.

17. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 9 à 16, dans lequel on utilise une souche de virus de la <Desc/Clms Page number 18> rougeole qui a été obteuue par l'adaptation et l'atténuation du virus natif de la rougeole, tel que la souche d'Edmonston du virus de la rougeole, par un procédé dans lequel on a effectué un l'atténuation dans un tissu embryonnaire avien ou dans/ milieu de culture contenant ces cellules vivantes de ce tissu.

16. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 9 à 17, dans lequel on utilise une souche de virus de la rougeole qui a été obtenue par l'adaptation et l'atténuation du Virus natif delà rougeole, tel que la souche d'Edmonston du Virus de la rougeole, par un procédé dans lequel on a effectué l'atténuation dans un tissu d'embryon de poulet ou dans un mi- lieu de culture contenant des cellules vivantes de ce tissu.

19. Un proche de production de la nouvelle Bouche Schwarz ou souche de virus de la rougeole, utilisée dans le pro- cédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel on adapte un virus de la rougeole, de manière qu'il soit capable de se développer dans un tissu cellulaire animal vivant ou dans un milieu contenant ces cellules, et on atténue le virus adapté par des passades successifs à travers un mileU de culture comprenant des cellules animales vivantes, à une tem- pérature inférieure à 35 C mais supérieure à celle à laquelle le virus cesse de se propager.

20. Un procédé suivant la revendication l;, dans @@@ lequel on adapta et on atténue la souche Edmonston du virus de la rougeole.

21. Un procédé suivant les revendications 19 ou 20, dans lequel on exécute au moins une partie de l'incubation fai- sant partie du processus d'atténuation à une température infé- rieure à 35 C mais supérieure à celle à laquelle le virus cesse de se propager.

22. Un procédé suivant l'une quelconque des revendi- cations 19 à 21, dans lequel au moin une partie ce ladite in- cubation est effectuée à une température comprise entre 28 et 32 C. <Desc/Clms Page number 19>

23. Un procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 19 à 22, dans lequel au moins plusieurs passages ont lieu à une température comprise entre 28 et 32 C.

24. Un procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 19 à 23, dans lequel tous les passages du processus d'atténuation du virus ont lieu 4 une température comprise en- tre 28 et 32 C.

25. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 19 à 24, dans lequel le processus d'atténuation comprend au moins 40 passages.

26. Un procédé suivant l'une quelconque des revendi- cations 19 à 25, dans lequel on procède à l'atténuation dans un tissu embryonnaire avien ou dans un milieu de culture conte- nant des cellules vivantes de ce tissu.

27. Un procédé suivant l'une quelconque des revendi- cations 19 à 26, dans lequel on utilise un tissu d'embryon de poulet ou un milieu de culture contenant des cellules vivantes de ce tissu pour réaliser l'atténuation.

28. Un vaccin contenant un virus vivant atténué et convenant pour immuniser des être humains contre la rougeole, ce vaccin contenant, comme facteur immunisant, la souche Schwarz du virus de la rougeole.

29. Un vaccin suivant la revendication 28, qui con - tient, comme facteur immunisant, une souche de virus de la rou- geole qu'on a obtenue en adaptant un virus natif de la rougeole de manière qu'il soit capable de se développer dans un tissu de cellules vivantes n'appartenant pas à un être humain ou dans un milieu contenant ces cellules vivantes, et en atténuant le virus adapté rce à des passages multiples en série à travers un milieu de culture comprenant des cellules animales vi- vantes, à une température inférieure à 35 C mais supérieure à celle à laquelle le virus cesse de se propager, 30.

Un vaccin suivant les revendications 28,29, <Desc/Clms Page number 20> qui contient comme facteur immunisant une souche du virus de la rougeole qui a été obtenue par atténuation d'une souche Enders du virus de la rougeole.

31. Un vaccin suivant l'une quelconque des revendis cations 28 à 30, qui contient, comme facteur immunisant , une ouche du virus de la rougeole qui a été connue en atténuant une suuche adaptée du virus de la rougeole à une température inférieure à 35 C, mais supérieure à celle à laquelle le virus cesse de se propager.

32. Un vaccin suivant l'une quelconque des revende . cations 28 à 31, qui contient, comme facteur immunisant, une souche du virus de la rougeole qui a été obtenue par adaptation et atténuation du vlrus oatf de la rougeole, tel que la sou- che Edmonston du virus de la rougeole, par un procédé dans le- quel au moins une partie de l' incubation faisant partie du processus d'atténuation a été exécutée à une température infé- rieure à 35 C mais supérieure à celle à laquelle le virus cesse de se propager.

33. Un vaccin suivant l'une quelconque des revendis cations 28 à 32, qui contient, comme facteur immunisant, une sou- che du virus de la rougeole qui a été obtenue par adaptation et atténuation du virus natif de la rougeole, tel que la souche Edmonston du virus de la rougeole, par un procédé dans lequel au moins une partie de l'incubation faisant partie du proces- sus d'atténuation a été exécutée 4 une température comprise en- tre 28 et 32 C.

34, Un vaccin suivant l'une quelconque des revendi- cations 28 à 33 qui contient, comme facteur immunisant, une sou- che de virus de la roséole,qui a été obtenue par l'adaptation et l'atténuation d'un virus natif de la rougeole, teue la souche Edmonston du virus de la rougeole, par un processus dans lequel on a effectué au moins plusieurs passades à une tempéra- ture de l'ordre de 28 à 32 C.

35. Un vaccin suivant l'une quelconque des revendis <Desc/Clms Page number 21> cation 28 à 34, qui contient, comme facteur immunisant, une sou- che de virus de la rougeole, qui a été obtenue par l'adaptation et l'atténuation du virus natif de la ruugeole, tel que la souche Edmonston du virus de la rougeole, par un processus dans lequel tous les passages pour l'atténuation du virus ont été réalisés à une température de l'ordre de 28 à 32 C.

36. Un vaccin suivant l'une quelconque des revendi- cations 28 à 35, qui contient, comme facteur immunisant, une souche de virus de la rougeole, qui a été obtenue par l'adapta- tjon et l'atténuation du virus natif délia rougeole, tel que la souche Edmonston du virus de larougeole, par un processus dans lequel on a effectué l'atténuation par au moins 40 passages.

37. Un vaccin suivant l'une quelconque des revendi- cations 28 à 36, qui contient, comme facteur immunisant, une souche de virus de la rougeole, qui a été obtenue par l'adapta- tion et l'atténuation du virus natif de la rougeole, tel que la souche Edmonston du virus de la rougeole, par un processus dans lequel on procède à l'atténuation dans un tissu embryon- naire avien ou dans un milieu de culture contenant des cellu- les vivantes de ce tissu.

38. Un vaccin suivant l'une quelconque des revendi- ; cations 28 à @@ 37, qui contient, comme facteur immunisant, une. souche de virus de la rougeole, qui a été obtenue par l'adapta- tion et l'atténuation du virus natif de la rougeole, teue la souche Edmonston du virus deÇLa rougeole, par un processus dans lequel on utilise un tissu d'embryon de poulet ou un milieu de culture contenant des cellules vivantes de ce tissu pour réali- per l'atténuation.

39. Un vaccin, lorsqu'il est produit par un procédé suivant les revendications 1 à 18.

40. Un vaccin,lorsqu'il est produit en partant de la souche du virus de la rougeole telle qu'obtenue par le procédé suivant les revendications 19 à 26.

41. Un procédé de production d'un vaccin contenant <Desc/Clms Page number 22> un virus vivant de la rougeole en vue d'immuniser les être hu- mains contre cette maladie sans produire d'effets secondaires indésirables appréciables chez les personnes inoculées,, ni les symptômes pathologiques habituels de la rougeole, tel que dé- crit ci-dessus, notamment dans les exemples.

42. Un vaccin contenant un virus vivant capable d'immuniser les être humains contre la rougeole sans produire d'effets secondaires indésirables appréciables chez les per- sonnes inoculées, tel que décrit ci-dessus, notamment dans le$ exemples.

43. Procédé de production d'un virus vivant atténué convenant pour immuniser les être humains contre la rou- geole sans produire d'effets secondaires indésirables apprécia- bles ches les personnes inoculées,ni les symptômes pathologi- ques habituels de la rougeole, tel que décrit ci-dessus, notam- ment dans les exemples.