Procédé pour la préparation de la streptomycine. L'invention a trait à un procédé pour la préparation de la streptomycine.
Il a déjà été établi que 1 Un produit à pouvoir antibiotique, de la streptomycine, existe dans un liquide de culture obtenu lorsque l'organisme Acti- nomyces griseus est cultivé, en contact avec (c'est-à-dire dans ou sur) certains milieux liquides; 2 La composition du milieu dans lequel est cultivé l'organisme a une importance considérable dans la production du produit antibiotique;
3 La présence de peptone (ou d'un autre hy drolysat de protéine, tel que le tryptone) et d'une substance spécifique sans laquelle l'organisme ne peut vivre et fournie par un extrait de viande (ou une liqueur de macération de maïs) est nécessaire pour la production du produit antibiotique (Schatz, Bugie et Waksman, Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1944, 55; 66).
Cependant il a été établi dans la pratique que l'hydrolysat de protéine (ou certains constituants de ce composé) et/ou l'extrait de viande rendent difficile l'isolement du produit antibiotique, et que l'emploi de milieux contenant ces composés est indési rable pour cette raison, ainsi que pour d'au tres. Il a été également établi qu'en utilisant la liqueur de macération de maïs comme source sensiblement unique de composés azotés pour le microorganisme, il ne se forme pratiquement aucun produit antibiotique.
Il a été maintenant découvert que cer taines famines (végétales), fleurs de farines, macérations de farines et de fleurs de farines peuvent être utilisées comme source unique de substances azotées pour l'Actinomyces griseus, ce qui ne rend plus nécessaire l'em ploi d'un hydrolysat de protéine et d'un extrait de viande et supprime par consé quent les inconvénients qui en découlent, et que la substitution de ces produits à la peptone (ou tryptone) et à l'extrait de viande (ou liqueur de macération de maïs) dans les milieux de culture non seulement n'empêche pas la formation du produit antibiotique,
mais en général augmente le rendement en ce dérnier.
Le procédé selon l'invention, pour la préparation de la streptomycine, est carac térisé en ce qu'on cultive l'organisme Acti- myces griseus dans ou sur un milieu nutritif liquide dont pratiquement la seule source de substances azotées à disposition dudit orga nisme est constituée par un produit obtenu d'une graine oléagineuse. Ce produit peut être une farine, une fleur de farine, ou une macération de farine ou de fleur de farine. La graine oléagineuse peut être une fève, par exemple une fève de soja, de jack, de Lima ou de ricin, ou une graine d'arachide, de coton ou de lin. On utilise de préférence, comme source de substances azotées, de la farine de soj a.
La streptomycine se rencontre à la fois dans le liquide et dans les solides (mycélia, spores et autres solides susceptibles de sédimentation) d'une culture de ce genre; ce produit peut être récupéré des solides par extraction avec un acide aqueux.
Le liquide de culture contenant la streptomycine et/ou l'extrait des solides de la culture peuvent être traités (soit séparé ment, soit ensemble) pour obtenir la strepto mycine sous une forme fortement purifiée ou sensiblement pure.
Le présent procédé est de préférence exécuté en culture immergée, qui s'adapte plus rapidement et mieux à une production sur une large échelle.
Outre la source de substances azotées spécifiées, le milieu de culture peut contenir de faibles proportions d'autres sources de substances azotées (farine, fleur de farine, macération de ces farines), qui alors ne gênent pas l'isolement du produit antibio tique. De préférence toutefois, le produit obtenu d'une graine oléagineuse constitue la source unique de substances azotées à dispo sition du microorganisme dans le milieu.
Les termes farine , fleur de farine et i macération sont utilisés ici dans leur sens accepté communément. Ainsi, une farine de fève est un produit obtenu en broyant grossièrement des fèves et en éliminant toute l'huile ou une partie de cette huile, qui peut être extraite par pression ou par extraction avec des solvants organiques. L'expression fleur de farine désigne un produit obtenu en broyant finement une farine; et le terme macération désigne un extrait aqueux obtenu, par exemple, en chauffant dans l'eau une farine ou une fleur de farine et en filtrant.
Les termes farine et fleur de farine en globent également les formes purifiées de ces produits; mais les formes impures sont s préférées au point de vue du rendement en produit antibiotique.
La proportion d'une telle source d'azote (calculée en substance sèche) peut varier entre des limites relativement larges, maïs elle est comprise de préférence entre 0,5 et <B>' 2</B> ,50/, du milieu, cette proportion étant parti- culièrement avantageuse dans le cas de la farine de soja.
Les milieux nutritifs liquides utilisés dans la mise en oeuvre du procédé peuvent, bien entendu, contenir également un sel nutritif et un hydrate de carbone assimilable par l'organisme cultivé. Les sels nutritifs utili sables sont de préférence des sels de sodium, tels que le chlorure de sodium et le sulfate i de sodium; mais il est possible d'utiliser un certain nombre d'autres sels nutritifs usuels ou leurs combinaisons (chlorure de sodium plus chlorure de magnésium, et chlorure de sodium plus sulfate de sodium, entre autres).
Dans des conditions analogues, l'hydrate de carbone est de préférence le dextrose, mais il est possible d'utiliser d'autre hydrates de carbone assimilables par l'Actinomyces gri- seus (l'amidon par exemple). La proportion, du dextrose dans le milieu peut être avanta geusement comprise entre 0,5 et 3,0%.
Les milieux nutritifs utilisés dans le pré sent procédé pour la préparation de la strep tomycine peuvent avantageusement être employés aussi pour la préparation d'un en semencement de spores d'Actinomyces gri- seus. Ainsi, une culture d'Actinomyces gri- seus sur un tel milieu constitue un excellent ensemencement de spores pour la prépara- a tion de la streptomycine.
Un milieu de ce genre peut être obtenu, par exemple, en faisant bouillir une suspen sion aqueuse à 2% de farine de soja, en filtrant et en ajoutant au filtrat 0,2-1% de i dextrose, 0,5% de chlorure de sodium et, si on le désire, 2% d'agar.
Les exemples qui suivent illustrent la mise en aeuvre du procédé selon l'invention. L'unité de potentiel mentionnée correspond à la quantité de streptomycine nécessaire pour inhiber complètement la multiplica tion de 500 à 1000 cellules de K. pneumoniae, en culture dans des conditions standardisées dans un milieu contenant I /a de tryptone. Une unité est l'équivalent de 1 gamma de base libre de streptomycine.
<I>Exemple 1:</I> 100 ml d'un milieu aqueux contenant 1,0 i, de farine de soja (déshuilée à la presse), 1,01/ü de dextrose (anhydre), et 0,50/ü de chlorure de sodium sont placés dans un flacon d'Erlenmeyer à 500 ml, puis sont stérilisés. Le milieu stérilisé, dont le pH est de 6,2, est ensuite ensemencé avec 0,5 ml d'une suspen sion de spores d'Actinomyces griseus, puis est soumis à une incubation à 24 C dans un appareil à agitation (100 coups par minute).
Au bout de six jours, la culture, dont le po tentiel est de 265 unités/ml, est centrifugée et la portion qui surnage est utilisée pour en extraire la streptomycine.
Exemple <I>2:</I> 3600 litres d'un milieu aqueux contenant 1,51/ü de farine de soja (déshuilée à la presse), 1,01/" de dextrose (anhydre) et 0,5 de chlo rure de sodium, placés dans un bac de 6000 litres, sont stérilisés et ensemencés avec 2 litres d'une suspension de spores d'Acti- nornyces griseus. Le milieu ensemencé est soumis à une incubation à 25 C sous une pression de<B>1,5-25</B> cm (de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant (à une vitesse de 130 t/min).
Au bout de 78 heures d'incubation, la culture, dont le potentiel est de 173 unités/ml, est centrifugée; la portion qui surnage est utilisée pour en extraire la streptomycine.
<I>Exemple 3:</I> a) 1800 litres d'un milieu aqueux conte nant 1,5 /ü de farine de soja, 1,01/" de dex trose et 0,51/ü de chlorure de sodium, placés dans un bac de 6000 litres, sont stérilisés et ensemencés avec un mélange de spores et de mycélium d'Actinomyces griseus; le milieu ensemencé est soumis à une incubation à 2550 C sous une pression de 50 à 75 cm (de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant (à une vitesse de 130 t/min).
h) Au bout de 100 heures d'incubation, une portion de<B>100</B> ml de la culture, qui. a un potentiel de 27,6 unités/ml, est ajustée à un pH de 3,5 en ajoutant de l'acide chlorhy drique à 371%, et la culture acidifiée est agitée pendant 24 heures à 4 C. La culture dont le potentiel s'est élevé par ce traitement à 38,6 unités/ml, est centrifugée; la portion qui surnage est utilisée pour en extraire la streptomycine.
c) La culture restant, après prélèvement de la portion de 100 ml est centrifugée. La portion qui surnage est utilisée pour en extraire la streptomycine, tandis que le sédiment est recueilli et lavé, par centrifuga tion, avec deux portions d'un litre d'eau dis tillée. (Les eaux de lavage ont un potentiel inférieur à 4,5 unités/ml, aussi peuvent-elles être écartées). On ajoute un litre d'eau dis tillée au sédiment lavé et on agite le mélange pour former une bouillie lourde homogène c contenant environ<B>3,7</B> mg de solides par ml.
d) Une portion de 50 ml, de la bouillie obtenue dans le paragraphe précédent est ajustée à un pH de 2,15 avec de l'acide sulfu rique 5-normal, et le mélange est agité à 50 C s pendant une heure. Ce mélange est ensuite centrifugé; la portion claire qui surnage (extrait), dont le potentiel est de 96,2 uni tés/ml (ce qui représente une récupération de 25,8 unités par mg de solides séchés), est utilisée pour en extraire la streptomycine.
<I>Exemple 4:</I> En utilisant un milieu aqueux contenant 1,5ü/, de farine de soja (déshuilée à la presse), 1,01/ü de dextrose (anhydre) et 0,51/ü de e sulfate de sodium à la place du milieu de l'exemple 1, mais dans les mêmes conditions, on obtient un liquide de culture ayant le même potentiel de 265 unités/ml.
<I>Exemple 5:</I> f Si l'on utilise un milieu aqueux contenant 1,51/ü de farine de soja (déshuilée à la presse), 0,51/o de dextrose (anhydre) et 0,51/ü de chlorure de sodium à la place du milieu de l'exemple 1, dans les mêmes conditions, sauf en ce qui concerne l'incubation qui est prolongée pendant 7 jours, le liquide de cul ture obtenu a un potentiel de 192 unités/ml. <I>Exemple 6:
</I> 100 ml d'un milieu aqueux (eau distillée) contenant 0,6% de farine d'arachide, 3,0% de dextrose (anhydre) et 0,5% de chlorure de sodium sont placés dans un flacon d'Erlen- meyer de 500 ml et sont stérilisés.
Le milieu stérilisé est alors ensemencé avec 5 ml d'un ensemencement d'Actinomyces griseus (dé crit ci-après) et est soumis à une incubation, à 24-25 C, dans un appareil d'agitation par oscillations (105-110 oscillations par minute). Au bout de trois jours, la culture a i un potentiel de 137 unités/ml. Au bout de six jours, la culture a un potentiel de 206 unités/ml et elle est centrifugée.
La portion qui surnage est utilisée pour l'extraction de streptomycine.
En utilisant 0,6% d'une farine d'arachide obtenue d'une autre source et en procédant dans les mêmes conditions, sauf que l'incu bation se poursuit pendant 7 jours, le liquide de culture obtenu a un potentiel de 310 unités/ml.
L'ensemencement est un mycelium an cien de 43 heures, obtenu en ensemençant 100 ml d'un milieu standard de farine de soja (voir l'exemple 1) avec 0,5 ml d'une suspension de spores d'Actinomyces griseus. <I>Exemple 7:</I> Si l'on utilise 0,60/, de farine de coton à la place de la farine d'arachide de l'exemple 7 et si l'on procède dans les mêmes conditions, 5 le liquide de culture obtenu a un potentiel de 128 unités/ml.
<I>Exemple</I> 8.: Si l'on utilise 0,6% de farine de lin à la place de la farine d'arachide de l'exemple 7 @ et si l'on procède dans les mêmes conditions, le liquide de culture obtenu a un potentiel de 111 unités/ml.
<I>Exemple 9:</I> Si l'on utilise 0,6% de farine de fève de 5 ricin à la place de la farine d'arachide de l'exemple 7 et si l'on procède dans les mêmes conditions, sauf que l'incubation se poursuit pendant 7 jours, le liquide de culture obtenu a un potentiel de 237 unités/ml.
<I>Exemple 10:</I> a) 5000 litres d'un milieu aqueux (eau du robinet) contenant<B>2,25%</B> de farine de soja, 1,62 /o de cérélose hydraté (dextrose), 0,75% de chlorure de sodium NaCl et<B>180</B> g de NaOH sont placés dans un bac de fermera- tation en acier au carbone de 6000 litres, ce bac étant équipé d'un agitateur et d'un pur geur d'air; le bac est stérilisé pendant une heure à 120 C.
Lorsque la température at teint 25 C, 225 litres d'un ensemencement d'Actinomyces griseus (décrit ci-après) sont ajoutés; le milieu ensemencé est soumis à une incubation à 25 C sous une pression de 15-30 cm (de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant (à une vitesse de i 120 t/min). Pendant l'incubation, 5,6 litres d'une solution à 3% d'octadécanol dans de l'huile de saindoux sont ajoutés, goutte à goutte, comme agent antimoussant.
L'ensemencement est constitué par un mycélium ancien de 50 heures et obtenu avec un milieu standard de farine de soja (voir l'exemple 1), dans un bac d'acier du carbone de 450 litres, en stérilisant, en ensemen çant avec une suspension de spores d'Acti- ; nomyces griseus et en soumettant à une in cubation dans les conditions décrites dans le paragraphe précédent.
b) Au bout' de 89 heures d'incubation, un potentiel de 195 unités/ml est atteint dans f la culture, dont le pH est de 6,7; le pH est ajusté à 1, 5 avec de l'acide sulfurique concentré, et l'on ajoute 2% d'une poudre de diatomées et 0,5% de charbon activé, comme auxiliaires de filtration ; le mélange est alors filtré à f travers un filtre-presse. Le filtrat, qui a un potentiel de 230 unités/ml, est utilisé pour en extraire la streptomycine.