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Il Procédé de préparation et de purification de-s a 0- tiques Il.
L'invention a trait aux antibiotiques basiques ou alcalins du type de la streptomycine c'est-à-dire aux éléments du genre se composant de la streptomycine et des composés basiques à action antibiotique qui, comme la strep- tomycine, peuvent former des sels solubles dans l'eau avec des acides tels que l'acide sulfurique et des sels insolu- bles dans l'eau avec des réactifs précipitant les bases organiques, par exemple les dérivés de streptomycine, tels que la dihydrostreptomycine et les antibiotiques à action analogue, tels que la streptothricine.
En 1944, Schats, Bugie et Waksman (Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 1944, 57, 244) ont montré qu'un antibiotique
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puissant appelé "streptomycine" se forme au cours de la or croissance de l'/ganisme "Actinomyces griseus" (appelé maintenant "Streptomyces griseus") et on a constaté, depuis, que cet antibiotique est extrêmement utile en clinique médicale.
On a découvert ensuite que plusieurs strep- tomycines se forment en même temps. La première strepto- mycine obtenue sous forme cristallisée, pure (à l'état de reineckate) et complètement caractérisée est appelée maintenant "streptomycine A" ; laseconde streptomycine caractérisée est appelée maintenant "Streptomycine B".
De plus, on possède des indications d'après lesquelles d'autres streptomycines se forment et/ou peuvent se for- mer en même temps en changeant les conditions de la cul- ture ; et il doit être bien entendu que chacun de ces anti- biotiques et leurs mélanges (sous forme de base libre ou de leurs sels solubles dans l'eau) seront désignés par le mot "streptomycine" à moins d'indication contraire.
La streptomycine a été purifiée jusqu'à présent par divers procédés, tous compliqués et/ou inefficaces (et par conséquent coûteux). Par exemple un procédé ap- pliqué dans une large mesure antérieurement à l'inven- tion comporte, en principe les opérations suivantes : 1 on traite un liquide primaire contenant la streptomy- cine avec du charbon de bois activé qui adsorbe sélecti- vement la streptomycine; 2 on extrait la streptomycine du charbon de bois par un acide minéral aqueux soluble dans l'eau, de préférence en élevant légèrement la tempé- rature (par exemple à environ 30-50 C); 3 on traite l'extrait avec un réactif de précipitation des bases organiques, de préférence l'acide phosphotungstique ; et 4 on décompose le précipité.
L'expression "liquide pri- maire contenant la streptomycine" doit être considérée comme désignant en particulier : a) le liquide de culture
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obtenu en faisant proliférer le streptomyces griseus dans des conditions et dans un milieu de culture convenant à la formation de la streptomycine et en séparant les ma- tières solides du milieu ; le liquide de culture de pouvoir amélioré obtenu par acidification de cette cultu- re (par exemple par 1?acide chlorhydrique ou sulfurique), le liquide étant neutralisé ; etc) le liquide obtenu par extraction par un acide des matières solides séparées de la culture, le liquide étant neutralisé).
Un des objets de l'invention réside en procédés simples, efficaces et avantageux à d'autres points de vue de purification des antibiotiques basiques du type de la streptomycine et en particulier, de la streptomycine; et un autre objet de l'invention réside dans des procédés de préparation de certains dérivés du type salin (réaction d'un acide et d'une base) des antibiotiques basiques du type de la streptomycineo
Il a été découvert que les antibiotiques basi- ques du type de la streptomycine réagissent avec des agents à activité superficielle ou agents de mouillage du type des acides inorganiques polybasiques organique- ment substitués en formant certaines combinaisons du type salin, qui sont beaucoup moins solubles dans l'eau et plus solubles dans certains solvants organiques ne se mé- langeant pas avec l'eau que les antibiotiques;
et il a été encore découvert que ces dérivés du type salin des antibiotiques basiques peuvent être décomposés pour recueillir les antibiotiques.
Les procédés suivant l'invention consistent en principe à amener en.contact intime une solution aqueuse d'un antibiotique basique du type de la streptomycine (en particulier la streptomycine) avec un agent à activité superficielle, ou agent de mouillage, du type d'un acide inorganique polybasique organiquement substitué et un
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solvant organique, ne se mélangeant sensiblement pas à l'eau, des savons (y compris les savons invertis, c'est- à-dire ceux dans lesquels la cation est organique au lieu de l'anion, comme dans les savons ordinaires), de préfé- rence avec un alcool aliphatique ne se mélangeant sensible- ment pas avec l'eau et, en particulier, avec des mélanges d'alcool amylique;
les procédés de purification suivant l'invention consistent, en principe, à amener en contact intime une solution aqueuse d'un antibiotique basique impur du type de la streptomycine, (par exemple un liquide primaire contenant de la streptomycine ou une solution aqueuse de streptomycine partiellement purifiée, tel que l'extrait dont il a été question précédemment) avec un agent à activité superficielle du type d'un acide inorga- nique polybasique organiquement substitué et un solvant organique des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau, à recueillir la phase du solvant organique, et à transformer le dérivé du type salin de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'anti- biotique,
de préférence en amenant en contact intime la solution dans le solvant organique avec un acide aqueux soluble dans l'eau relativement fort (en particulier avec un acide minéral aqueux soluble dans l'eau, relativement fort), et à recueillir la phase aqueuse. Le sel soluble dans lteau (de l'antibiotique basique du type de la strep- tomycine) recueilli dans la solution aqueuse ainsi obtenue est beaucoup plus pur que l'antibiotique traité, et la récupération de l'activité antibiotique réalisée au cours du traitement de purification est d'un ordre élevé. En appliquant ltinvention dans la pratique, il est possible d'obtenir régulièrement des rendeents élevés en strepto- mycine relativement pure possédant par exemple un pouvoir antibiotique supérieur à 400 unitésjmg environ.
Parmi les agents à activité superficielle du
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type des acides inorganiques polybasiques organiquement substitués convenant au procédé suivant l'invention, on peut citer ceux qui sont représentés par la formule R-O-X-O-Y dans laquelle R désigne le radical d'un composé hydroxyle organique ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau; -0-X-0- désigne le radical acide divalent d'un acide inorganique polybasique soluble dans l'eau, (par exemple l'acide sulfurique ou phosphorique), et Y désigne un élément du groupe formé par H et les sels solu- bles dans l'eau formant des cations avec l'anion R-0-X-0.
Parmi les agents de mouillage convenant au procédé suivant l'invention, on peut citer particulièrement ceux dans les- quels l'acide inorganique polybasique est l'acide sulfuri- que, l'acide étant partiellement estérifié avec un alcool aliphatique supérieur, c'est-4-dire les agents de mouil- lage du groupe formé par les monoesters (aliphatiques su- périeurs) d'acide sulfurique et leurs sels solubles dans l'eau.
D'autres agents à activité superficielle pouvant être choisis de préférence du type des acides x inorgani- ques polybasiques organiquement substitués convenant au procédé suivant l'invention sont ceux du groupe formé par les acides sulfoniques aromatiques, les huiles sulfonées, les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés et leurs sels solubles dans l'eau.
Parmi les alkyl-esters supérieurs partiels d'acide sulfurique pouvant être utilisés dans l'applica- tion de l'invention dans la pratique, on peut citer : le groupe des sels de sodium des sulfates des alcools aliphatiques supérieurs synthétiques, tels que C4H9CH
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(C2H5)G2H4CH(S04Na)C2CH(C2H5)2 (par exemple le Tergitol Penetrant 7), C'H9CH(CZHS)CZH'CH(S0*Na)CHZCH(CH3)2 (par exemple le Tergitol Penetrant 4), et C4H9CH(C2H5)CH2SO4Na (par exemple le Tergitol Penetrant 08); et la série des
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esters partiels d'acide sulfurique des alcools aliphati- ques supérieurs et leurs sels, tels que les sulfates d'octyl sodium, d'oleyl sodium, de cétyl sodium, de stéa- ryl sodium et de lauryl sodium (par exemple l'Aurinol, le Wétanol, les Duponols et les Gardinols).
Parmi les acides sulfoniques aromatiques, les huiles sulfonées et les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés qui peuvent servir dans l'application de l'invention dans la pratique, on peut citer les sulfonates de sodium des esters d'aci- des gras supérieurs et des amides, tels que le sel de sodium d'oléate d'éthyle sulfoné (ou autre alkyl oléate) (par exemple l'Igepon AP Extra) et C17H33CONHC2H4SO3Na (par exemple l'Igepon T); les sulfonates de sodium des hydrocarbures de pétrole (par exemple l'Ultrawet); le sel de sodium d'un acide polyalkyl benzène sulfonique conte- nant 10 atomes de carbone (par exemple l'Ultrawet 40A), et d'autres alkyl-aryl-sulfonates de sodium (par exemple le Nacconol NRSF); et l'buile de rouge turc (c'est-à-dire l'huile de ricin sulfonée).
Parmi les esters partiels des acides phosphoriques qui peuvent être utilisés dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, on peut citer le phosphate de dicrésyle, la lécithine et un alcool supé- rieur phosphoré représenté par la formule (capryle)5Na5- P 6 0 20 (par exemple le W.A. 58).
Les solvants organiques des savons ne se mélan- geant sensiblement pas avec l'eau, qui peuvent être uti- lisés dans la mise en oeuvre pratique de l'invention sont entre autres : les alcools aliphatiques, tels que l'alcool n-amylique (1-pentanol), n-butanol (1-butanol), butanol secondaire, méthyl-isobutyl-carbinol, méthyl-amyl-carbinol, méthyl-isopropyl-carbinol, isobutyl-carbinol, 2-éthyl- hexanol, et les mélanges d'alcool amylique, tels que l'al- cool amylique de fermentation, les esters d'alcool alipha- tique des acides gras inférieurs, tels que l'acétate de ,
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méthyl-isobutyl-carbinol et l'acétate d'amyle; les cétones aliphatiques, telles que la méthyl-isobutyl-cétone ; éthers aliphatiques, tels que le di-n-butyl éther et le diéthyl éther ; hydrocarbures, tels que le benzène et le toluène;
et les hydrocarbures halogénés, tels que le dichlorure d'éthylène, le chloroforme et le téthrachlorure de carbone.
Parmi les acides solubles dans l'eau, relative- ment forts, qui peuvent servir à recueillir les antibio- tiques dans leurs combinaisons du type salin avec les agents à activité superficielle, on peut citer l'acide sulfurique, chlorhydrique, phosphorique, oxalique, citri- que, sulfamique et nitrique.
Pour réaliser un rendement maximum, il convient que l'agent à activité superficielle soit en excès par rapport à la quantité qui est nécessaire pour combiner la totalité de l'antibiotique contenu dans la solution traitée, la proportion la plus avantageuse dépendant, par suite, de la concentration de la solution traitée et du pouvoir de l'antibiotique.
Suivant une des mises en oeuvre de l'invention, une solution aqueuse d'un antibiotique impur du type de la streptomycine est amenée en contact intime avec une solution de l'agent à activité superficielle dans un sol- vant des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau; la phase du solvant organique est recueillie et est amenée en contact intime avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort soluble dans l'eau; la phase aqueuse est recueillie et séchée, de préférence par congé- lation (c'est-à-dire qu'on la congèle et on lui fait subir l'action d'un vide poussé pour séparer l'eau par sublimation).
On peut aussi réaliser le contact intime entre la solution de l'antibiotique, l'agent à activité superficielle et le solvant organique en mélangeant d'a- .
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bord de la solution de l'antibiotique avec l'agent à activité super- ficielle et en amenant ensuite le mélange en contact intime avec le solvant organique; ou en mélangeant d'abord la solution de l'anti- biotique avec le solvant organique et en amenant ensuite le mélange en contact intime avec l'agent à activité superficielle.
De préférence et surtout lorsque le solution aqueuse de l'an- tibiotique impur traité est un filtrat de culture, la solution obte- nue dans le solvant organique est lavée à l'eau avant de la traiter avec la solution :aqueuse d'acide, l'eau de lavage entraînant une quantité considérable de matières solides inactives, mais pratique- ment pas d'antibiotique.
Le coefficient de répartition de la combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent à activité superficielle entre la phase .' aqueuse et la phase du sol- vant organique dépend de la valeur du pH. Par exemple lorsqu'on emploie une solution dans l'alcool n-amylique de l'Ultrawet 40A, la quantité de streptomycine qui se sépare de la solution aqueuse est maximum lorsque le pH de la phase aqueuse est réglé à une valeur comprise entre environ 2 et environ 8, de préférence entre environ 3 et 4.
Suivant une variante, le combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent à activité super- ficielle peut être recueillie dans la solution dans le solvant organique et être transformée ensuite en un sel soluble dans l'eau, ou être utilisée telle quelle à titre d'agent thérapeutique. Par exemple, on peut recueillir le dérivé du type salin de l'antibiotique en chassant le solvant organique par évaporation dans le vide (ou lorsque le solvpnt organique se prête à cette manière d'opérer, comme par exemple dans le cas du benzène, en séchant la solution par congélation). On peut aussi obtenir le dé- rivé du type salin de l'antibiotique plus directement par le procédé de précipitation décrit dans le brevet déposé
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en lèlgique, ie é, i/Ài<1 sous le n03f,f1-Par la demande-
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resse.
Ces dérivés du type salin des antibiotiques sont généralement solubles dans l'huile ou peuvent s'y disper- ser ; ils peuvent servir en thérapeutique, par exemple en les administrant par la bouche tels quels ou en milieux huileux pour traiter les maladies intestinales en ayant recours aux fonctions intestinales pour mettre l'antibio- tique en liberté sous forme soluble dans l'eau) ou en les administrant également en milieux huileux (ou par impré- gnation dtune pastille d'une matière solide) pour obtenir une action antibiotique prolongée. Lorsqu'on se propose de préparer le dérivé du type salin de l'antibiotique au lieu de le purifier, on peut employer une solution aqueu- se reconstituée de l'antibiotique (par exemple une solu- tion aqueuse de l'antibiotique très purifié ou pur).
Les diverses opérations dtextraction des procé- dés suivant ltinvention peuvent évidemment s'effectuer par les procédés de la technique à contre-courant ; les solutions épuisées et/ou les extraits peuvent servir de nouveau dans le procédé permettant de recueillir encore l'activité et/ou de concentrer encore le produit extrait.
Par exemple le liquide épuisé contenant l'antibiotique peut être extrait avec une nouvelle charge d'agent de mouillage et de solvant organique ; solvant organique épuisé peut être extrait avec une nouvelle charge d'une solution aqueuse d'acide relativement fort soluble dans l'eau ou ce solvant peut servir avec une nouvelle charge du liquide contenant l'antibiotique; et/ou l'extrait aqueux d'acide peut servir à traiter une nouvelle charge de la solution dans le solvant organique, pour en augmen- ter la concentration en antibiotique.
L'invention est plus aisée à comprendre d'après les exemples suivants, (toutes les solutions ou dilutions dont il est question étant des solutions ou des dilutions dans l'eau, à moins que le solvant ou le diluant ne soit
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spécialement indiqué):
EXEMPLE 1 a) Un dissout 350 mg de chlorhydrate de strep- tomycine dans 70 cm3 d'eau saturée de n-butanol ; mélan- ge la solution avec 70 cm3 d'une solution à 7 % d'alcool oléylique sulfaté (par exemple d'Aurinol DS) dans le n-butanol saturé avec de l'eau; on agite le mélange dans un entonnoir séparateur pendant 5minutes à la betuperet bu- re ambiante et on recueille la couche de n-butanol formée en laissant reposer le mélange.
On extrait ainsi environ 94,9% de la streptomycine de la solution aqueuse dans le n-butanol (sous forme de combinaison du type salin de streptomycine et d'alcool oléylique sulfaté).
De même, on peut extraire environ 90-98 % de la streptomycine contenue dans les solutions aqueuses en concentrations de 400-4000 unités/cm3 dans le n-butanol à l'aide d'autres esters partiels d'acide sulfurique d'al- cools aliphatiques supérieurs (par exemple de Duponol-C ou d'huile de rouge turc).
En extrayant de la même manière un filtrat de culture contenant de la streptomycine (obtenue en faisant
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proliférer le sbreptomycos grisous eu cu.Liuie bubmyéd en milieux aqueux contenant de la farine de soja, du dex- trose et du chlorure de sodium, en acidifiant la culture ensemencée et en filtrant) ayant un pouvoir de 391 unités/ cm3 et un pH d'environ 5-7, et de préférence d'environ 6,1, on extrait environ 80-95% de l'activité du filtrat de culture dans le n-butanol ;
en extrayant de la même manière un extrait contenant de la streptomycine (obtenu en traitant un filtrat de culture contenant de la strepto- mycine avec du charbon de bois activé et en éliminant la streptomycine du charbon de bois par l'acide chlorhydrique, nitrique ou sulfurique dilué) ayant un pouvoir de 201 unités/cm3 et un pH égal à 6,8, on extrait environ 90-98%
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de l'activité de l'extrait dans le n-butanol. b) 48 cm3 de la solution dans len-butanol de la combinaison du type salin de streptomycine et d'alcool oléylique sulfaté sont agités avec 48 cm3 d'eau dans un entonnoir séparateur à la température ambiante et de l'acide chlorhydrique à 5 % est ajouté goutte à goutte en agitant jusqu'à ce que le pH devienne égal à 2,0.
Un fait passer la phase aqueuse limpide séparée dans une colonne de résine d'échange d'anions (par exemple d'Am- berlite IR-4B, voir le brevet américain n 2.402.384 du 18 juin 1946) pour faire prendre au pH une valeur attei- gnant 7,6, puis on la sèche par congélation. Le pouvoir du chlorhydrate de streptomycine ainsi obtenu avec un rendement d'environ 53 % est d'environ 542 unités/mg.
Les combinaisons du type salin de streptomycine et d'autres esters partiels d'acide sulfurique et d'al- cools aliphatiques supérieurs ou d'huile de rouge turc obtenues de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple 1 peuvent être décomposées de la même manière. b : variante) On refroidit 80 cm3 de la solution dans le n-butanol de la combinaison du type salin de- streptomycine et d'alcool oléylique sulfaté ; les fait passer dans une colonne de 127 mm. (32 gr.) d'alumine lavée par l'acide sulfurique (pH = 4,0) par aspiration et on extrait la colonne avec une solution normale à 0,1 d'acide chlorhydrique dans le méthanol anhydre.
On recueille l'extrait par fraction chacune de 10 cm3; les fractions actives (ou fractions 3 à 9 incluses) sont com- binées et traitées avec de l'éther anhydre pour précipiter le chlorhydrate de streptomycine. Le précipité est séparé par centrifugation, dissous dans une quantité minimum de méthanol anhydre et reprécipité avec de l'éther anhydre.
Le précipité, (séparé par centrifugation) est dissous
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dans environ 5 cm3 d'eau et la solution est séchée par congélation. Le pouvoir du chlorhydrate de streptomycine ainsi obtenu (avec un rendement global d'environ 56 %) est d'environ 636 unit6s/mg.
Laécomposition analogue des combinaisons du type salin obtenues avec les streptomycines et les agents de mouillage suivants, donne le chlorhydrate de strepto- mycine possédant à peu près les pouvoirs indiqués avec les rendements approximatifs indiqués ci-dessous :
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Combinaison .dù type s,âl3n de '.Chlorhydrate de streptomycine séché par congélation
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<tb> sulfurique <SEP> et <SEP> d'alcool
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<tb> aliphatique <SEP> supérieur
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<tb> (p. <SEP> ex.
<SEP> Duponol <SEP> C)
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<tb> Extrait, <SEP> 3
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EXEMPLE 2 a) 170 cm3 d'une solution aqueuse à 25 % de l'agent de
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mouillage C4oH9CH{C2H5)C2tA{S04oNa)C2H4oCH{C2H5)2 (par exem- ple Tergitol Penetrant 7) sont ajoutés à 4 litres d'un filtrat de culture (contenant de la streptomycine, ayant un pouvoir de 142 unités/cm3; la valeur du pH du mélange est réglée à 6,35 par une solution de soude caustique à 10 % en agitant, et 670 cm3 dialcool amylique de fermenta- tion raffiné sont ajoutés puis le mélange est agité pendant 5 minutes.
La phase d'alcool amylique séparée par centri- fugation contient environ 85 % de l'activité du filtrat de culture. b) 250 cm3 d'eau sont ajoutés à la solution d'alcool amylique et la valeur du pH du mélange est réglée à une valeur de 0,5 en ajoutant de l'acide sulfurique à 10 yo en agitant. L'extrait aqueux formé par la sépara
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tion des couches est agité avec une résine d'échange d'a- nions du type précité (par exemple l'Amberlite IR-4B) de façon à diminuer le degré d'acidité une valeur du pH de 5,7. L'extrait aqueux qui contient environ 60 % de l'acti- vité du filtrat de culture est séché par congélation, don- nant environ 7,1 gr. de sulfate de streptomycine ayant un pouvoir d'environ 33 unités/mg.
EXEMPLE 3 a) 50 cm3 d'une solution aqueuse saturée d9un sulfonate de monosodium benzène alkylé contenant plusieurs groupes alkyle totalisant 10 atomes de carbone (par exem- ple l'Ultrawet, 40 A) sont mélangés avec 300 cm3 d'alcool amylique obtenu par fermentation et raffinage et on règle la valeur du pH du mélange à 2,0 par l'addition dtacide sulfurique en agitant.
On sépare la couche d'alcool amylique et on l'ajoute à 3 litres d'un extrait contenant du chlor- hydrate de streptomycine ayant un pouvoir de 296 unités/ cm3; on règle la valeur du pH du mélange à 3,3 par l'addi- tion d'une solution aqueuse de soude caustique en agitant; on agite le mélange pendant 1 heure et on recueille la couche d'alcool amylique. b) L'extrait d'alcool amylique est recueilli à trois reprises avec des portions de 75 cm3 d'une solu- tion aqueuse d'acide sulfurique ayant un pH = 0,5 ; extraits par l'acide sont combinés et traités avec une solution d'hydroxyde de baryum pour obtenir une valeur du pH = 8-10; on sépare le précipité formé par filtrage.
La valeur du pH du filtrat est réglée à 6,2 par addition d'a- cide sulfurique; on sépare le précipité de sulfate de ba- ryum par filtrage et on sèche le filtrat par congélation en obtenant environ 1,0 gr. de sulfate de streptomycine ayant un pouvoir dtenviron 433 unités/mg.
Pour abréger, les détails d'autres exemples d'essais effectués d'une manière analogue à celui de l'e-
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xemple 3, mais représentant des variantes de l'invention sont donnés sous forme de tableau :
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TABLEAU I
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EXEMPLE 9 a) La valeur du pH de 3,5 litres d'extrait de chlorhydrate de streptomycine (280 unités/mg) est réglée à 5,0 avec une solution de soude caustique et on y ajoute 40 gr dthuile de ricin sulfonatée et 500 cm3d'acétate d'amyle. Le mélange est agité pendant 1 heure et la couche d'acétate dtamyle se sépare. b) La solution d'acétate d'amyle est extraite avec une solution d'acide sulfurique à N/10; la couche aqueuse est séparée, neutralisée avec une solution d'hydro- xyde de baryum et filtrée ; le filtrat est séché par congélation, donnant environ 0,3 gr. de sulfate de strep- tomycine (pouvoir environ 337 unités/mg).
EXEMPLE 10 a) Le pH de 4 litres d'un extrait de chlorhy- drate de streptomycine (185 unités/cm3 est réglé à une va- leur de 7,0 par addition d'une solution de soude caustique et on sépare par filtrage le précipité formé. Au filtrat sont ajoutés 20 gr. du sel de sodium solide de sulfonate de polyalkyl benzène (par exemple Ultrawet E), le pH est réglé à une valeur de 3,5 par addition d'acide sulfurique dilué, on ajoute 1 litre d'alcool amylique de fermentation raffiné, on agite le mélange pendant une heure et on re- cueille la couche d'alcool amylique. b) La solution d'alcool amylique est extraite à 4 reprises avec des portions de 50 cm3 d'acide sulfurique dilué (pH = U,5);
les extraits à l'cide eont combinés et réglés à un pH 12,0 par addition d'hydroxyde de baryum. Un sépare par filtrage le précipité formé on règle le pH du filtrat à 5,9 par addition d'acido sulfurique dilué et on filtre ; puis le filtrat est séché par congélation, donnant environ 2 gr. de sulfate de streptomycine (pouvoir environ 291 unités/mg).
Pour abréger, les détails d'autres exemples d'es-
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sais effectués d'une manière analogue à celui de l'exemple 10, mais représentant d'autres variantes de l'invention sont donnés ci-après sous forme de tableau
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TABLEAU II
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EXEMPLE 15
On dissout 1 gr. de streptomycine ayant un pou- voir de 228 unités/mg dans un litre d'eau et on ajoute 25 cm3 d'une solution de Tergitol Penetrant 7 (cf. exem- ple 2), puis 100 cm3 d'alcool amylique obtenu par fermen- tation et raffinage ;
règle le pH du mélange à une va- leur de 3,3 en agitant, et on continue à agiter pendant une demi-heure ; on recueille la couche d'alcool amy- lique formée. La solution d'alcool amylique contenant en- viron 75 % de la streptomycine dans la solution aqueuse traitée est extraite avec l'acide sulfurique dilué (pH = 0,5) et l'extrait aqueux par l'acide, contenant en- viron 80 % de la streptomycine de la solution dans l'al- cool amylique, est à; nouveau traité de la manière décrite précédemment.
EXEMPLE 16 a) 150 cm3 d'une solution aqueuse à 25 % de
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l'agent de mouillage C'H9CH(C2H5)CZH'CH(S0'Na)CHZCH(H3)z (par exemple Tergitol Penetrant 4) et 500 cm3 d'alcool amylique obtenu par fermentation et raffinage sont ajoutés à 3 litres d'un filtrat de culture contenant de la strep- tomycine (pouvoir 50 unités/cm3; pH = 1,5); on règle le pH à 4,0 et on agite le mélange.
On détruit l'émulsion ainsi obtenue par centrifugation et on recueille la couche d'alcool amylique (contenant environ 95 % de l'activité du filtrat de culture). b) On extrait la solution dans l'alcool amyli- que avec l'acide sulfurique à 25 % jusqu'à ce que le pH de la solution atteigne 0,5 ; couche aqueuse formée est recueillie, neutralisée avec l'hydroxyde de baryum à une valeur du pH de 6,8 et filtrée ; lefiltrat est séché par congélation, donnant un solide de couleur blanche dont l'activité représente environ 97 % de celle de la solution dans l'alcool amylique.
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Suivant une variante du procédé détaillé en a) an traitant un filtrat de culture contenant de la strepto- mycine ayant un pouvoir de 115 unités/cm3 et un pH de 1,7 avec 200 cm3 d'une solution à 25 % d'un sulfate d'alcool aliphatique supérieur (par exemple un Duponol) au lieu du Tergitol Penetrant 4, et en réglant le pH à 3,5 au lieu de 4,0, on obtient une solution dans l'alcool amylique conte- nant environ 90 % de l'activité du filtrat de culture.
EXEMPLE 17 a) On ajoute 150 cm3 d'une solution aqueuse à 25 % de Tergitol Penetrant 4 (cf. exemple 16) et 500 cm3 d'alcool amylique obtenu par fermentation et raffinage sont ajoutés à 3 litres d'un filtrat de culture contenant de la streptomycine (pouvoir 150 unités/cm3; pH 1,6).
On règle le pH à une valeur de 3,5 et on continue le trai- temant du mélange de la manière décrite dans les paragra- phes a) et b) de l'exemple 16 de façon à obtenir une cou- che d'alcool amylique épuisée et un extrait acide aqueux. fuis on se sert de l'alcool wnylique épuisé avec un supplé- ment de 50 cm3 de Tergitol Penetrant 4 pour extraire 3 litres dtun nouveau filtrat de culture contenant de la streptomycine et ltalcool amylique épuisé (et cette extrac- tion peut servir à son tour à extraire un nouveau filtrat de culture de la même manière). L'extrait aqueux acide est traité de la manière décrite encore dans le paragraphe b) de l'exemple 16.
Suivant une variante, l'extrait aqueux acide est aussi utilisé pour extraire l'extrait d'alcool amylique obtenu avec une nouvelle charge de filtrat de cul- ture contenant de la streptomycine, en augmentant ainsi la concentration du sulfate de streptomycine dans l'extrait aqueux acide.
EXEMPLE 18 a) 100 cm3 d'une solution aqueuse de chlorhydrate de streptomycine ayant un pouvoir de 10400 unités/cm3 sont
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mélangées intimement avec 50 cm3d'éther contenant 11,3 cm3 de Tergitol Penetrant 7 (solution aqueuse à 25 %). Après avoir laissé reposer le mélange, on recueille la couche d'éther formée qui contient environ 97 % de l'activité de la solution aqueuse traitée.
En remplaçant l'éther par le benzène, on obtient une extraction d'environ 98 % de l'activité. On remédie aux difficultés auxquelles donne lieu l'émulsification par ce solvant en laissant reposer le mélange pendant 12 à 16 heu- res, à froid, avant de séparer les couches. b) Une solution dans l'éther obtenue de la maniè- re décrite dans le paragraphe a) contenant un dérivé de streptomycine équivalent à 1.016.000 unités de streptomy- cine, est mélangée avec une solution de 5 gr. d'Alcl3 dans 25 cm3 d'éther; le précipité formé est éliminé par centri- fugation et dissous dans l'eau ; solution aqueuse est neutralisée avec une solution diluée de potasse caustique; puis la solution est filtrée et séchée par congélation, en donnant environ 3,b2 gr. de chlorhydrate de streptomycine possédant un pouvoir de 222 unités/mg.
(Rendement d'environ 79 %).
Le chlorure d'aluminium AlCl3 servant à la décom- position du dérivé du type salin de streptomycine peut être remplacé par des sels équivalents tels que ZnCl2 ou Fecl3.
Parmi les antibiotiques basiques du type de la streptomycine qu'on peut traiter par les procédés suivant l'invention, on peut citer la streptothricine et la dihydro- streptomycine ; et, parmi d'autres antibiotiques basiques pouvant servir à la préparation des combinaisons du type salin avec les agents de mouillage suivant l'invention, on peut citer la streptomycine A, la streptomycine B, la dihy- drostreptomycine A et la dihydrostreptomycine B pures ou sensiblement pures.
Les antibiotiques basiques du type de la strepto-
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mycine purifiés par le procédé suivant l'invention peuvent être purifiés davantage en répétant le même procédé de pu- rification. De même, ils peuvent subir une purification préliminaire ou ultérieure par d'autres procédés, en parti- culier par un des procédés suivants :
1) On amène en con- tact intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un acide carboxylique sensiblement insoluble dans l'eau et un solvant organique de l'acide carboxylique, ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau, on recueille la phase du solvant organique et on transforme le dérivé du type salin de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (Voir la demande de brevet déposée aux Etats-Unis d'Amérique le 19 juillet
1947 sous le n 762.205)./On traite une solution aqueuse de l'antibiotique avec un sel soluble dans l'eau d'un acide carboxylique, sensiblement insoluble dans l'eau,
on recueil- le la combinaison précitée du type salin de l'antibiotique et de l'acide carboxylique et on la transforme en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (Voir la demande de brevet déposée aux Etats-Unis d'Amérique le 19 juillet
1947 sous le n 762.206) et 3) On amène en contact intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un agent de mouillage du type d'un acide inorganique polybasique, or- ganiquement substitué, on recueille la combinaison précipitée du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage et on la transfonne en un sel soluble dans l'eau de l'an- tibiotique (Voir la demande de brevet déposée en Belgique par la demanderesse /le sous le n 376.517.
L'invention ne doit pas être considérée comme limitée aux modes de mise en oeuvre décrits ci-dessus, qui n'ont été choisis qu'à titre d'exem- ple.