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"PROCEDE DE PREPARATION D'ACIDE NUCLEINIQUE ET DE PRODUITS DE DISSOCIATION NUCLEOSIDIQUES A PARTIR DE LEVURE OU DE MICROORGANISMES ANALOGUES,. A L'AIDE DE BACTERIES ".
On connaît le procédé consistant à préparer de l'acide nueléini- que à partir de levure, à l'aide de soude caustique liquide ou de solutions de sel de cuisine, par séparation des liaisons protéine-acide nucléinique.
On a décrit une extraction à l'aide de soude caustique liquide dans le livre "Méthode der Fermentforschung" de Bamann et Myrbâck tome 1, Editions Hirzel, Leipzig 1941.
Suivant ce procédé, dans lequel, jusqu'à présent, on n'a pu em- ployer avec succès le plus souvent que de la levure vivante ou de la le- vure venant d'être tuée, les acides nucléiniques se mettent en solution et peuvent en être précipités par acidification. Les rendements maxima étaient d'environ 2,4 - 4 % d'acide nucléinique, par rapport au poids sec de la levure. On n'a pu augmenter le rendement en prolongeant la durée de l'extraction, étant donné que, dans ce cas, on courait le risqué d'une sé- paration de l'acide nucléinique, à cause de la longue durée du chauffage.
On connaît également des procédés selon lesquels on éliminait tout d'abord l'acide nucléinique de la levure, sous forme d'un sel de fer ou d'un autre sel de métal lourd, celui-ci étant soumis à l'extraction à l'aide d'une solution aqueuse d'acétate de sodium, l'acide nucléinique étant ensuite aspiré pour être séparé de l'hydroxyde de fer obtenu et étant ensuite précipité du filtrat, à l'aide d'acide chlorhydrique additionné d'alcool (Brevet allemand N 448.947).
Comme inconvénient de ces procédés connus, on pouvait considérer l'emploi de produits chimiques, tels que la soude caustique liquide ou le sel de cuisine, dont la présence, entre autres, était souvent nuisible à un traitement ultérieur, dans des buts déterminés, de l'extrait dont on avait éliminé l'acide nucléinique.
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On a constaté à présent, de façon surprenante, que, par voie biolo- gique, et ce, à l'aide de bactéries, grâce aux substances actives de celles- ci il se produisait une séparation impeccable des nucléoprotéides en pro- téine et en acide ribonucléinique. Après séparation, de la levure de la phase liquide, par sédimentation, centrifugation ou filtration, on préci- pite de la phase liquide, par acidification, un acide nucléinique très pur en gros flocons, qui se dépose très rapidement et qui peut être isolé par simple décantation. Les rendements sont considérés comme élevés. On connaît l'action des bactéries pour la protéolyse en général, mais on n'a jamais pensé à dissocier les nucléoprotéides à l'aide de bactéries.
Parmi les nombreuses bactéries conviennent particulièrement bien certains cocons, par exemple le genre streptocoque ou staphylocoque; mais parmi les bactéries en bâtonnets, certaines espèces également peuvent con- venir pour le nouveau procédé. Un procédé stérile pendant l'introduction des batéries est nécessaire. Les bactéries sont en majeure partie éliminées avec la levure et celles qui, dans certaines circonstances, pourraient pé- nétrer dans l'acide nucléinique sont éliminées au cours du traitement ulté- rieur du produit final et ne peuvent donc pas nuire à celui-ci.
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Une augmentation supplémentaire du rendement peut être obtenue en broyant la levure sèche dont on part, avant l'extraction, à l'aide d'un broyeur à solloides ou autre dispositif mécanique, 'en des particules infé- rieures aux dimensions des cellules.
Sans modification des conditions d'extraction, on obtient des rendements en acide nucléinique qui n'ont pu être obtenus à l'aide d'aucun autre procédé connu jusqu'à présent et qui pourraient correspondre en substance à la teneur réelle en acide nucléinique de la levure traitée. Cela est rame- né au fait qu'-après la destruction de la paroi des cellules, effectuée dans des conditions optima, l'acide nucléinique est sensiblement plus facilement accessible à l'agent d'extraction ou aux substances actives des bactéries, sans pour cela être modifié ou détruit par le broyage.Le traitement préa- lable est particulièrement important pour la récupération de l'acide nucléi- nique concentré dans le noyau de la cellule.
Il est nécessaire d'attacher la plus grande valeur aux conditions optima pendant l'opération de brcyage et de maintenir de faibles températures. Une telle désagrégation ou plutôt broyage de la levure sèche suivant la présente invention peut, par exemple, être obtenue a l'aide d'un broyeur vibrant. Une augmentation de 1,2 - 1,8 % du rendement en acide nucléinique est obtenue également lors du brqyags pré- alable de la levure sèche, avant une extraction à l'aide de produits chimi- ques, par exemple à l'aide de soude caustique liquide, de sel de cuisine, etc:..
Pour améliorer une extraction de lipoïdes, on a déjà proposé un broyage préalable de la levure sèche avec du sable de quartz. Mais cette opé- ration était très compliquée et l'amélioration n'était pas considérable.
Le broyeur à boulets ne convenait pas non plus à la destruction mécanique des cellules, étant donné que des excès de chauffe trop importants se pro- duisaient localement. (Zeitschrift fur Untersuchung der Lebensmittel, 1943, p. 497). On n'avait pas encore, jusqu'à présent, proposé ce procédé, en vue de la,préparation de l'acide nucléinique.
Selon une autre caractéristique de l'invention, on peut également, à l'aide de bactéries, réaliser une séparation de l'acide nucléinique pour obtenir des nucléosides, par exemple à l'aide de bactéries'du genre eubac- terialis. Apres neutralisation,-par exemple à l'aide d'hydroxyde de sodium, il faut ajouter, comme substance nutritive, aux solutions pures d'acide nucléinqieu, des matières appropriées, par exemple de l'extrait de levure, en faible quantité. La concentration de l'acide nucléinique employé peut s'élever à 3 à 8 % environ (par rapport à la solution) et, suivant la con- centration choisie, la séparation complète par les enzymes isolées des bac- téries dure aviron de 14 à 30 jours.
On peut reconnaître la fin de la sé- paration au fait que, lorsqu'elle est complètement achevée, le substrat constitue un gelo Ce gel est dû à la formation de guanosine.
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Après élimination de la guanosine par centrifugation, les autres produits de dissociation peuvent être récupérés de la manière usuelle.
Pendant la préparation des solutions, il faut veiller à ce que la valeur du pH et la température soient réglées à un degré correspondant aux conditions optima pour les microorganismes. En outre, il faut prendre les précautions nécessaires en vue d'une opération stérile, pour éviter les in- fections dues aux facteurs étrangers, qui pourraient provoquer une disso- ciation plus intense des acides nucléiniques, jusqu'en leurs bases. L'acide nucléinique qui doit être traité ou mieux les solutions correspondantes peu- vent,'par exemple, être stérilisés à la vapeur.
On peut également procéder à la séparation de l'acide nucléinique en cultivant les microorganismes en question, dans des conditions de stéri- lisation, dans une solution nutritive contenant de faibles quantités d'acide nucléinique, le mycélium étant traité suivant des méthodes courantes pour l'obtention des enzymes et étant aiouté ensuite à la solution d'acide nucléi- nique. La valeur du pH de la solution d'acide nucléinqieu doit être réglée à un degré convenable, par exemple à -un pH de 7 8.
Exemple 1
5 litres d'une suspension de levure torula vivante contenant un poids sec de levure de 750 gr. sont réglés à un pH de 7,0, sont stérilisés et sont refroidis à 32 C. Après $ avoir ajouté 2 cm3 d'une culture liquide de bactéries, par exemple des bactéries de la famille des streptocoques, la suspension de levure est conservée pendant 18 - 24 heures, à 32 C, et dans des conditions stériles. Ensuite ont lieu la séparation de la levure de la phase liquide et le lavage subséquent à l'eau de ville ordinaire. Les fil- trats sont acidifiés à un pH de 3, à l'aide d'acide chlorhydrique, sur quoi l'acide nucléinique précipite. Après le dépôt, le liquide qui le recouvre est versé et le précipité, en vue d'une purification supplémentaire, est encore repris par de l'acide à 1 % environ et est de nouveau décanté.
Le rendement..est de 42 gr d'acide nucléinique, correspondant à 5,6 % par rap- port au poids sec de la levure.
Exemple 2.
20 gr de levure sèche ayant une teneur en matière sèche de 92,45 %, une teneur en azote de 8,86 % et une teneur en phosphore de 2,1 % (P) par rapport à la levure dite "atro" sont soumis à l'extraction, d'une part, bro- yés, suivant l'invention, en des particules inférieures à la dimension des cellules, et d'autre part, non broyés, et ce, chaque fois en deux prises d'essai. La levure a été broyée à sec, dans un broyeur vibrant de la firme Siebt echnik G.m.b.H Mühlheim-Ruhr.
L'extraction par bactéries a lieu de la façon suivante :
20 gr de levure mélangés à 200 cm3 d'eau sont amenés au pH 7, sté- rilisés deux fois dans une marmite à vapeur, à un intervalle de 24 heures, additionnés de bactéries et conservés pendant 24 heures, dans l'étuve, à une température d'environ 37-40 C. Après avoir éliminé la levure par centri- fugation, on lave deux fois. Du produit centrifugé et de l'eau de lavage, et après refroidissement à 5 C, l'acide nucléinique à un pH de 3 est précipité, centrifugé et lavé avec de l'acide chlorhydrique dilué. Après l'avoir rincé dans un petit gobelet avec de l'alcool méthylique, l'acide nucléinique est séché à une température constante de 1050C.
En.vue d'obtenir une possibilité de comparaison en ce qui concerne la pureté et la composition de l'acide nucléinique, on détermine finalement la teneur en azote et en phosphore, et le rapport N P
On obtient les valeurs suivantes:
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EMI4.1
<tb> Acide <SEP> nucléinqiue <SEP> extrait <SEP> par <SEP> bacté- <SEP> Acide <SEP> nucléinique <SEP> extrait <SEP> par <SEP> bacries <SEP> Broyé <SEP> téries <SEP> Non <SEP> broyé
<tb>
<tb>
<tb> Prise <SEP> Prise
<tb> .d'essai <SEP> % <SEP> N <SEP> % <SEP> P <SEP> N:F <SEP> d'essai <SEP> % <SEP> N <SEP> % <SEP> P <SEP> N:
P
<tb>
<tb> 1 <SEP> .7,14 <SEP> 12,77 <SEP> 5,98 <SEP> 2,11/1 <SEP> 4,97 <SEP> 12,48 <SEP> 5,85 <SEP> 2,13/1 <SEP>
<tb>
EMI4.2
6 , 88 12,3 5,95 2,07/1 5,34 17,8 7,98. 2,21/1
Les essais montrent l'influence favorable de la destruction des parois des ¯cellules par broyage de la levure à des dimensions inférieures à celles des .' cellules, par exemple dans un broyeur vibrant.
Exemple 3.
La levure, dans les quantités indiquées dans l'exemple 2, est bro- yée'dans un broyeur supersonique de la Supraton G.m.b.H., Berlin, en suspen- sion dans l'eau, c'est-à-dire à l'état mouillé.
On obtient les mêmes résultats que dans l'exemple 2.
Exemple 4, 3 0 gr d'acide nucléinique, avec addition de 10 gr d'extrait de le- vure, sont dissous dans 1000 cm3 d'eau de ville et, à l'aide d'une solution de soude caustique, on donne un pH de 7,5 à la solution. Après stérilisation suffisante dans un courant de vapeur, on vaccine la solution avec le microor- ganisme approprié dissociant l'acide nucléinique et elle est maintenue pen- dant environ 10 jours à une température de 35 C. Après ce temps, la dissocia- tion de lucide nucléinique en nucléosides est complète. Rendement: 10,8 gr de guanosine; 7,0 gr d'adénosine.
Exemple 5.
On donne à 1000 cm3¯de solution d'acide nucléinique à 3 %, à l'ai- de d'une solution. tampon, un pH de 7,5; on ajoute 2 gr d'une poudre d'enzyme du microorganisme dissociant l'acide nucléinique et on maintient la solution à une température de 35 C. Dissociation complète après 9 jours. Rendement: 11,4 gr de guanosine et 7,6 gr d'adénosine.
REVENDICATIONS.
1. - Procédé de préparation d'acide nucléinique à partir de levure ou de champignons analogues à la levure, caractérisé en ce qu'une suspension de levure, après stérilisation, est vaccinée avec une suspension de bacté- ries et en ce qu'après la dissociation des nucléoprotéides, on procède à une élimination connue en soi des particules de levure non dissoutes.