BE493423A - - Google Patents

Description

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  PROCEDE DE PREPARATION DE NUCLEOSIDES PAR VOIE CHIMIQUE. 



   La préparation de nucléosides par dissociation hydrolytique d'aci- de nucléinique peut avoir lieu, suivant le procédé connu, à l'aide d'un trai- tement par l'ammoniaque à une température   de.175    à   180 C,   d'une durée dé 3 à 4 heures. On obtient ainsi un mélange de nucléosides de purine et de pyri-   -midine,   
L'inconvénient de ce procédé consiste en ce que le rendement est très faible et en ce que l'on doit travailler avec des récipients sous pres- sion. Si l'on opère à des conditions moins difficiles, par exemple à   115 C,   l'acide   nualéinique   n'est décomposé que jusqu'aux   mononucléotides.   



   Pour cette raison, on a proposé (brevet allemand n    693.416)   l'em- ploi de bases organiques volatiles, telles que la pyridine, la chinoline, etc... la dissociation de l'acide nucléinique étant achevée après 96 heures environ. Le rendement en guanosine et adénosine est sensiblement meilleur que   lorsqu'on.emploie   de l'ammoniaque; mais la pyridine est toutefois un pro- duit de dissociation très coûteux. 



   On a constaté à présent et de façon surprenante,- que l'hydrolyse de l'acide nucléinique peut réussir également sans l'emploi des bases inor- ganiques et organiques employées jusqu'à présent, lorsqu'on opère dans une solution aqueuse neutre avec un pH de 6,5 à 8, de préférence de 7 à 7,5, et que la valeur du pH est maintenue constante, en liant l'acide phosphorique libéré pendant la dissociation au moyen de produits d'addition appropriés, par exemple en le transformant en un tampon phosphatique insoluble ou par alcoolyse. 



   Ce résultat peut, entre autres, être atteint en ajoutant à l'aci- de nucléinique en solution aqueuse,-le cas échéant,-accompagné de solvants organiques, qui peuvent dissoudre l'acide nucléinique, tels que par exemple les   alcools;,   les polyalcools, les éthers, etc...,- des hydroxydes ou des      

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 sels métalliques difficilement solubles, qui, avec l'acide phosphorique, for- ment des phosphates insolubles. 



   A ce but répondent particulièrement l'hydroxyde de plomb, l'hy- droxyde de zinc,, et les hydroxydes ou les carbonates de magnésium, de calcium et de   baryum.   Pour la réalisation de l'hydrolyse, on chauffe la suspension d'acide nucléinique jusqu'à séparation complète de l'acide phosphorique. On a comme avantage que la dissociation a lieu dans des conditions particulière- ment favorables et que l'emploi de produits chimiques coûteux n'est pas né- cessaire. 



   L'hydroxyde métallique précipité suivant les procédés connus, par exemple à l'aide d'une solution de soude caustique à une température appro- priée, des sels de plomb solubles dans l'eau ou analogues, par exemple de l'a- cétate de plomb, et qui est ensuite lavé, est ajouté, en excès de   10-20 %   (par rapport à l'acide phosphorique) et conjointement avec de l'eau, à l'acide nu-   oléinique.   La dissociation a lieu soit par une ébullition prolongée, par exem- ple à la pression ordinaire pendant 50-80 heures, avec agitation, soit par chauffage dans un récipient sous pression, à 100 -140 C.

   Le pH du mélange doit être compris entre 4 et 9, et de préférence doit être maintenu à une va- leur constante comprise entre 7 et 8; 
En cas d'hydrolyse avec l'hydroxyde de   pl@@b   et après avoir élimi- né les résidus de phosphate de plomb, la guanosine se sépare par cristalli- sation, lors du refroidissement de la solution de réaction ; elle est recueil- lie et purifiée. A partir du filtrat, on produit l'adénosine et les autres nucléosides suivant des procédés connus en eux-mêmes, Les méthodes indiquées dans les   exemples se   sont avérées particulièrement avantageuses. 



   En cas d'hydrolyse avec de l'hydroxyde de zinc, on retrouve dans le résidu les sels de zinc des nucléotides, qui peuvent être séparés l'un de l'autre suivant les méthodes connues de la précipitation fractionnée ou qui peuvent être dissociés encore en nucléosides, à l'aide d'eau à   150 C,   au cours d'une seconde phase. 



   Les valeurs du pH favorables à la dissociation peuvent être   :main-   tenues également de façon simple, par addition de solutions tampons inorgani- ques ou organiques. L'acide phosphorique libéré est repris par la solution tampon et ne peut donc plus décomposer les nucléosides produits. Dans la dissociation désirée de l'acide nucléinique par hydrolyse, il ne s'agit donc pas d'un effet spécifique de l'agent de dissociation mais de moyens permet- tant de maintenir une certaine gamme de pH. 



   Même en n'utilisant pas des récipients sous pression, on peut réa- liser l'hydrolyse en un temps beaucoup plus court qu'il ne l'était possible jusqu'à présent . Les conditions de solubilité également sont souvent telle- ment favorables que certaines nucléosides,..telles que, par exemple, la guano- sine,   précipitent   directement de la solution de réaction, lors du refroidis- sement de celle,-ci, et peuvent être recueillies sous une forme relativement pure. Les méthodes nouvelles constituent donc, tout en assurant les mêmes rendements en nucléosides, une simplification technique considérable et sont beaucoup moins coûteuses que les méthodes connues jusqu'à présent. 



   Le procédé suivant la présente invention peut également être mis en oeuvre de façon telle que l'on puisse réaliser la dissociation de l'acide nucléinique, d'une manière avantageuse, à l'aide d'amides acides solubles dans l'eau ou d'amides acides substituées solubles dans l'eau, en présence d'eau. De même que par l'emploi de pyridine, la dissociation de l'acide nu- cléinique a lieu pendant le chauffage avec les amides acides. En comparai- son avec les bases organiques citées, les amides acides présentent l'avanta- ge que la dissociation est beaucoup plus rapide et que les produits chimiques employés sont beaucoup moins chers. Si, par exemple, on emploie de la forma-   mide, la dissociation est achevée en 10 à 13 heures.

   En outre, les conditions de solubilise sont particulièrement favorables : tandis que les acides nu-   cléiniques sont dissous très facilement, la guanosine précipite immédiatement lors du refroidissement de la portion hydrolysée et peut être recueillie. 

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  Avec l'usage fait jusqu'à présent de la pyridine, il fallait d'abord évapo- rer le solvant avant de recueillir la guanosineo Pour la dissociation de l'acide nucléinique, on peut employer toutes les amides acides simples et substituées. La'réaction a lieu normalement. Lors du refroidissement, la guanosine est isolée. A partir du filtrat, on peut obtenir, suivant des méthodes connues, de l'adénosine et les nucléosides pyrimidiniques. 



   On peut également réaliser la dissociation désirée de l'acide nu- cléinique, de façon avantageuse, à l'aide d'éthers acycliques ou cycliques solubles dans l'eau. Au cours de l'ébullition de l'acide nucléinique avec de telles solutions se produit une dissociation aisée, avec de l'acide phos-   phoriqueo   La réaction est plus rapide qu'avec de la pyridine, et les réac- tifs employés sont beaucoup moins coûteux,. 



   On a constaté que de l'eau de dioxane et des mélanges aqueux de tétrahydrofurane donnaient des résultats particulièrement favorables. Pen- dant le refroidissement, après la réaction, la guanosine est isolée. A partir du filtrat de ces précipités, on peut recueillir, suivant des métho- des connues,de l'adénosine et les nucléosides pyrimidiniques. 



   EXEMPLE I. 



   A 100 gr d'acide nucléinique brut dans 1000 cm3 d'eau, que l'on a neutralisé par addition d'une solution de soude caustique à un pH de 7, on ajoute   40   gr de carbonate de calcium précipité et on soumet le mélange, pen- dant 7 jours, à une ébullition avec réfrigération à reflux. 



   Après avoir éliminé la partie non dissoute, la guanosine est iso- lée par cristallisation et peut être recueillie. Si la guanosine précipite sous forme de gelée, elle peut être purifiée selon le procédé connu, à l'ai- de d'un composé de plomb. A partir du filtrat, on peut préparer, de la façon connue, de l'adénosine et les nucléosides pyrimidiniques. 



  Rendement : 10 gr de guanosine et 8 gr d'adénosine. 



   EXEMPLE II. 



   100 gr d'acide nucléinique brut, mélangés avec de l'hydroxyde de plomb fraîchement précipité et lavé (provenant de 135 gr d'acétate de plomb) et avec 600 cm3 d'eau, sont chauffés à ébullition sous agitation constante dans un ballon muni d'un réfrigérant à reflux. 



   A la fin de l'hydrolyse, on aspire à chaud et on lave une fois avec la quantité d'eau bouillante correspondant au filtrat. Les filtrats mélangés sont conservés sur glace, pendant une nuit. On isole par centri- fugation la guanosine précipitée; il se forme 11 - 12 gr de guanosine pure cristallisée à partir de l'eau chaude. Le filtrat est évaporé sous vide, à une température de bain de 40 - 50 C, jusqu'à environ 80 à 100 cm3, pour ac- quérir la consistance du sirop, et est précipité complètement avec du métha- nol. La solution séparée par centrifugation du précipité floconneux est concentrée sous vide et on ajoute un peu d'adénosine à l'huile qui forme le résidu. Après conservation sur glace, l'adénosine est isolée par cristalli- sation ; elle est aspirée et est recristallisée à partir d'eau, ce qui donne 6,5 gr d'adénosine pure. 



   A partir de la lessive-mère, on peut encore précipiter une autre adénosine sous forme de picrate. Après avoir recueilli ce produit, on peut préparer les nucléotides de pyrimidine de la manière habituelle. 



   EXEMPLE III. 



   110-120 % de la quantité d'acétate de plomb théoriquement nécessai- re, calculée sur base de la teneur en P205 de l'acide nucléinique, par exem- ple 170-185 gr d'acétate de plomb lorsque la teneur en P205 est de 19,0 %, sont dissous en chauffant dans environ 500 cm3   d'eau.   Par addition d'une so- lution de soude caustique, on fait précipiter l'hydroxyde de plomb, qui est lavé avec de l'eau (pH   = 7 - 8).   Le traitement subséquent correspond aux indications de l'exemple II. 

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   EXEMPLE   IV.   



   L'hydroxyde de plomb précipité est mélangé avec de l'eau pour ob- tenir un volume de 500 cm3 et est ajouté à l'acide nucléinique mélangée avec de l'eau dans un ballon à trois tubulures. Le   mélahge   est chauffé sous agi- tation et au commencement de l'ébullition, on règle le pH exactement à 7,5. 



  Il est alors soumis à ébullition pendant 72 heures, tout en maintenant cons- tante la valeur du pH. Le traitement subséquent est semblable à celui de l'exemple II. 



     EXEMPLE   V. 



   La lessive-mère d'adénosine préparée suivant l'exemple II, conte- nant de l'albumine, et dont on a éliminé la guanosine, est évaporée sous vi- de à une température de bain de 40 - 50 C, jusqu'à la consistance du sirop. 



  Le sirop est repris avec de l'eau jusqu'à un volume total de 100 - 150 cm3 et est précipité avec le triple de son volume de méthanol. Le traitement ultérieur est semblable à celui de l'exemple II. 



   EXEMPLE   VI,,   
100 gr d'acide nucléinique brut, dans 750 cm3 d'eau, avec un fai- ble excès d'acétate de plomb, sont chauffés avec agitation, dans une marmite sous pression, jusqu'à une température intérieure de 135 C, pendant 1 1/2 à 2 heures, tout en maintenant un pH de 7. Après traitement tel qu'indiqué dans l'exemple II, on obtient environ 8 gr de guanosine et 35 gr de picrate d'adénosine, à partir duquel on peut obtenir, de la façon habituelle, de l'adénosine pure. 



   EXEMPLE VII. 



   100 gr d'acide nucléinique brut, maintenus à un pH de 7, sont chauffés à reflux, jusqu'à ébullition, avec agitation, en présence d'un ex- cès d'hydroxyde de zinc fraîchement précipité et de 750 cm3 d'eau. Après une durée d'hydrolyse de 36 à 50 heures, on filtre à chaud : le filtrat ne contient qu'une faible quantité de matière organique; la partie la plus im- portante de celle-ci est combinée au zinc et elle peut être obtenue à partir du résidu, par précipitation fractionnée des sels de zinc et d'ammonium, sous forme de nucléotides (acide guanylique, acide adénylique, acide cytidy- lique et acide uridylique), suivant des méthodes connues en elles-mêmes. 



  (Jones et Perkins, J.Biol.Chem.55.557). 



   EXEMPLE VIII. 



   Le dépôt de zinc provenant d'un précipité contenant 175 gr d'aci- de nucléinique brut, suivant l'exemple VII, est mis en suspension dans 1 li- tre d'eau et est chauffé   à'l'autoclave,   à une température intérieure de 150 C, pendant 1 1/2 ,heure. On aspire à chaud et on sépare ensuite par cristallisa- tion la guanosine du filtrat et l'on comprime ensuite le filtrat. Suivant le mode opératoire indiqué dans l'exemple II, on recueille alors 11,2 gr d'a- dénosine. 



   Le dépôt de zinc aspiré après la première hydrolyse fournit, après une nouvelle hydrolyse dans les mêmes conditions, une quantité supplémentaire de guanosine et d'adénosine sous forme de picrate (20 gr de picrate brut), a partir duquel on peut encore préparer 7,2 gr d'adénosine pure. 



     EXEMPLE   IX, 
100 gr d'acide nucléinique brut sont mis en suspension dans 200 cm3 d'eau, on règle au pH 7 à l'aide d'une solution de soude caustique, et on   dilue   le mélange à l'aide de 10 à 20 fois sa quantité d'une solution tam- pon (citrate de .sodium et solution de soude caustique) ayant un pH de 7 ;   mélange obtenu est soumis à ébullition pendant 9 à 10 heures, dans un ballon -.    muni d'un réfrigérateur à reflux. La guanosine précipitée est isolée par filtration. le rendement est de 10 gr. Ensuite, on isole l'adénosine direc- tement ou sous forme de combinaison difficilement soluble. 



  Rendement : 8 gr d'adénosine. 

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   EXEMPLE X. 



   50 gr d'acide nucléinique brut sont chauffés avec 200 cm3 d'un mélange de formamide et d'eau (l:l), pendant 11 heures, à 130 C, dans un bal- lon muni d'un réfrigérateur à reflux. Lots du refroidissement, la solution se solidifie en une masse solide gélatineuse. 



   La solution de réaction refroidie et solidifiée est centrifugée et le résidu volumineux de guanosine est isolé par cristallisation, avec ad- dition d'eau chaude. Après- une double cristallisation,   on @@tient   6 gr de guanosine sous forme d'aiguilles cristallisées d'un blanc neigeux et d'un brillant soyeux. 



   On peut également conserver la masse solide gélatineuse pendant quelques heures dans la glace, la centrifuger et la cristalliser 3 fois en partant d'eau, pour obtenir de la guanosine pure (rendement également de 6 gr). 



   Au lieu de formamide, on peut également employer d'autres amides acides ou amides acides substituées, telles que la formamide méthylique ou la formamide diméthylique. 



   A partir des filtrats de guanosine, on peut préparer de l'adénosi- ne et les nucléosides pyrimidiniques de la manière habituelle. 



   EXEMPLE XI. 



   100 gr d'acide nucléinique brut avec 200 cm3 de dioxane et 400 cm3 d'eau sont soumis à ébullition pendant 3 jours, dans un ballon muni d'un ré- frigérateur à reflux. Après le refroidissement, la guanosine se sépare. A partir du filtrat, on peut préparer directement l'adénosine suivant des pro- cédés connus en eux-mêmes. Le rendement en guanosine est de 10 gr et en adénosine, de 8 gr. 



   REVENDICATIONS. 



   1. - Procédé de préparation de nucléosides à partir d'acide nu- cléinique, par dissociation hydrolytique de l'acide phosphorique avec des agents de dissociation organiques ou inorganiques, à une température plus élevée, caractérisé en ce que la dissociation a lieu dans une solution   aqueu-   se neutre, ayant un pH de 6,5 à 8, de préférence de 7 à 7,5, et en ce que cet- te valeur du pH est maintenue constante en combinant l'acide phosphorique libéré pendant la dissociation, à l'aide de produits d'addition appropriés, par exemple en le transformant en phosphates insolubles, par formation de tampons ou par alcoolyse.

Claims (1)

1. 2. - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on réalise la dissociation de l'acidé nucléinique avec de l'eau, en présence de -substances difficilement solubles, par exemple d'hydroxydes métalliques, de sels métalliques ou d'hydroxydes ou carbonates de magnésium, de calcium ou de baryum, qui éliminent l'acide phosphorique du mélange de réaction, avec formation de phosphates insolubles.

   3.- Procédé suivant là revendication 2, caractérisé en ce que la dissociation de l'acide nucléinique a lieu avec de l'eau, en présence d'hy- droxyde de plomb ou d'hydroxyde de zinc.

   4. - Procédé suivant les revendications 2 et 3, caractérisé en ce que l'on emploie 110 - 120 % de la quantité d'hydroxyde métallique théori- quement nécessaire à la dissociation, en se rapportant à la teneur en P205 de l'acide nucléinique qui doit être dissocié.

   5. - Procédé suivant les revendications 2 à 4, caractérisé en ce que pour la précipitation de l'albumine, on emploie une quantité telle d'al- cool, par exemple de méthanol, que la teneur en alcool s'élève à 70 - 80 %.

   6. - Procédé suivant les revendications 2 et 3, caractérisé en ce que tout d'abord, on prépare les nucléotides, sous forme de sels de zinc, par dissociation à l'aide d'hydroxyde de zinc, les sels de zinc étant ensuite dé- <Desc/Clms Page number 6> composés,avec de l'eau, dans une marmite sous pression à une température de 1400 - 150 C.

   7.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la dissociation de l'acide nucléinique a lieu avec de l'eau en présence de sub- stances tampons inorganiques ou organiques.

   8.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide nucléinique est traité par des amides acides simples ou substituées, jusqu'à dissolution des combinaisons d'acide phosphorique.

   9.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on traite l'acide nucléinique avec des éthers acycliques ou cycliques so- lubles dans l'eau.