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PROCEDE DE RECUPERATION DE LA VITAMINE B 12
Cette invention se rapporte à la fabrication de vitamine B12 et spécialement à l'obtention de rendements accrus en vitamine B12 à partir de matières brutes contenant des substances étroitement apparentées à la vita- mine B12, mais possédant une activité physiologique sensiblement plus faible (c'est-à-dire activité contre l'anémie pernicieuse et activité de facteur de protéine animale) que celle de la vitamine B120 Cette invention se rap- porte plus particulièrement à des procédés nouveaux de transformation de tel- les substances semblables à la vitamine B12 en vitamine Bb12
Suivant la présente invention;
, on obtient la vitamine B12 à par- tir d'une matière de départ consistant en bouillons de fermentation obtenus par la propagation d'un micro-organisme produisant la vitamine B12 dans un milieu nutritif approprié, ou en concentrés de ceux-ci en traitant la matiè- re de départ par une substance fournissant des ions cyanure et en obtenant ainsi un mélange de réaction qui contient une quantité accrue de vitamine B12
Divers procédés d'obtention de la vitamine B12 à partir de foie et de bouillons de fermentation ont été exposés dans la littérature.
Par exemple,, Rickes et autres dans Science 108 634-35 (déco 3,1948) ont montré que 1 on peut obtenir la vitamine B12 à partir de bouillons de fermentation produits par le S treptomyces griseus Pierce et autres J.A.CS 71 :
2952, ont également montré que l'on peut 'obtenir la vitamine B12 à partir de bouillons de fermentation produits par le Streptomyces aureofaciens Tan- dis que les bouillons de fermentation obtenus par la propagation de micro- organismes produisant la vitamine B12 fournissent une source pratique pour la fabrication commerciale de la vitamine B12 on a trouvé que de tels bouil- lons contiennent également des produits de fermentation que l'on mentionne ici comme matières semblables à la vitamine B12 mais qui ne montrent qu'une fraction de Inactivité contre l'anémie pernicieuse et de l'activité de fac- teur de protéine animale présentée par la vitamine B12 elle-'même.
Dans la fabrication de vitamine B12 de pureté uniforme, l'élimination de ces matiè-
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res semblables à la vitamine B12 a suscité un problème difficile. Par suite de l'étroite parenté entre ces matières et la vitamine B12, il n'a été pos- sible de séparer la vitamine B12 pure., cristallisée,, qu'en utilisant des pro- cédés compliqués et coûteux.
On a découvert maintenant qu'il est possible de transformer pres- que quantitativement ces matières semblables à la vitamine B12 jusqu'ici in- désirables, en vitamine B12, ce qui simplifie matériellement le procédé d'ob- tention de vitamine B12 pure,, tout en augmentant en même temps considérable- ment le rendement en vitamine B12 que l'on peut'obtenir à partir de bouil- lons de fermentation.
Considéré sous certains de ces aspects les plus larges, le nou- veau procédé conforme à la présente invention consiste à faire réagir les matières semblables à la vitamine B12 avec une substance fournissant des ions cyanure et à transformer ainsi ces matières en vitamine B12 Ainsi, par exemple, en traitant des bouillons de fermentation ou des concentrés con- venables de ceux-ci, contenant les uns et les autres la vitamine B12 et les substances semblables à la vitamine B12, au moyen d'une source d'ions cyanu- re, on découvre qu'on obtient des rendements considérablement accrus en vi- tamine B12 pure. En outre, comme indiqué précédemment,la séparation de la vitamine B12 est considérablement facilitée.
Comme autre réalisation de cette invention, on a découvert que l'on peut effectuer cette transformation dans des conditions diverses en uti- lisant diverses sources d'ions cyanure. En général, on effectue la réaction en mettant les substances semblables à la vitamine B12 en contact intime avec les ions cyanure, et en transformant ainsi ces substances en vitamine B12., Par exemple, on peut traiter des solutions de substances semblables à la vi- tamine B12 au moyen de composés qui fournissent les ions cyanure (entre autres les cyanures métalliques, le cyanure ammonique ou l'acide cyanhydrique).
Parmi les milieux dissolvants appropriés, on compte l'eau, les mélanges dis- solvant organiques-aqueux ou des solvants organiques contenant des.ions cya- nure et dans lesquels les substances semblables à la vitamine B12 sont solu- bleso Pour des fins pratiques, on estime qu'il est très commode d'effectuer la réaction dans un milieu aqueux.
Bien qu'une étude de la réaction montrerait qu'il faut une môle d'ions cyanure par môle de substance semblable à la vitamine B12;, on préfère ordinairement utiliser un excès d'ions cyanure pour assurer Inachèvement de la transformation. Lorsqu'on traite une solution aqueuse de substances sem- blables à la vitamine B12 par un.
excès de cyanure métallique, comme le cya- nure sodique ou le cyanure ammonique, ce qui donne une sclution alcaline., on forme un complexe intermédiaire de couleur pourpre, qui apparaît être iden- tique à la substance qui se forme lorsqu'on ajoute du cyanure sodique à une solution aqueuse de vitamine B12 Lorsqu'on acidifie une solution contenant ce complexe pourpre, la solution reprend la couleur rouge qui est caractéris- tique de la vitamine B12 Cependant, en l'absence d'un excès de cyanure mé- tallique ou d'un pH alcalin, ce processus d'acidification n'est pas nécessai- re étant donné que le complexe pourpre ne se forme pas. Lorsqu'on utilise l'acide cyanhydrique comme source d'ions cyanure, le complexe pourpre ne se forme pas, même lorsqu'on utilise un excès considérable.
La vitamine B12 obtenue par cette réaction est en tous points identique à la vitamine B12 obtenue directement à partir de bouillons de fer- mentation. On a établi cette identité en comparant les spectres d'absorption ultra-violet., visible et infra-rouge, la rotation optique, les analyses élé- mentaires, la structure cristalline, les points de fusion ou de décomposi- tion;, la solubilité en phase, le comportement polarographique et le coeffi- cient de partage aussi bien que par l'activité microbiologique et l'activité clinique.
Lorsqu'on effectue le procédé de la présente invention, on peut faire réagir des matières semblables à la vitamines B12 à divers stades de récupération à partir de bouillions de fermentation., avec une substance four- nissant des ions cyanure. Ainsi par exemple,on peut traiter le bouillon
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de fermentation par une petite quantité dun cyanure approprié comme le cya- nure potassique ou sodique, ou bien on peut traiter en alternative,des con- centrés de matières semblables à la vitamine B12seuls ou en combinaison avec la vitamine B12 au moyen d'une substance fournissant des ions cyanure.,
Lorsque on traite un bouillon de fermentation contenant à la fois la vitamine B12 et des substances semblables à la vitamine B12 conformément à la présente invention,
on ajoute au bouillon une certaine quantité de sub- stance fournissant un excès dions cyanure pour effectuer la transformation des matières semblables à la vitamine B12 en vitamine B120 On enlève alors la vitamine B12 de cette solution par adsorption sur un adsorbant approprié comme la terre de Fuller, le charbon de bois, etc...
On peut utiliser ce pro- duit d'adsorption comme un supplément de vitamine B12 pour fortifier les nour- ritures animales ou alternative, comme matière de départ pour la séparation de la vitamine B12 pureo
Il est cependant préférable, lorsqu'on effectue la procédé de lâ présente invention, d'employer un concentré de substances semblables à la vitamine B12 car cela réduit le volume de matières à manier et diminue la difficulté et les dangers qu'il y a à se débarrasser du cyanure qui n'a pas réagi.
On préfère également traiter un concentré contenant à la fois la vitamine B12 et les matières semblables à la vitamine B12, car comme on l'a indiqué plus haut, l'un des avantages pratiques du nouveau procédé est d'é- liminer les procédés difficiles impliqués, nécessaires à la séparation de ces matières.
On traite la solution ou le concentré solide contenant les ma- tières semblables à la vitamine B12 au moyen d'une substance fournissant un excès d'ions cyanure, d'une façon qui assure un contact intime des réac- tifs et l'achèvement de la réaction. Il est préférable d'agiter soigneuse- ment le mélange et de le laisser alors reposer pendant un court laps de temps,c'est-à-dire 15 à 45 minutes environ. On peut employer toute sub- stance fournissant un excès d'ions cyanure,comme par exemplel'acide cyan- hydrique liquide ou gazeux, un sel métallique ou ammonique de l'acide cyan- hydrique, ou des mélanges d'un cyanure métallique et d'un acide., qui forme in situ de l'acide cyanhydrique.
Il faut seulement que le cyanure métalli- que utilisé, en milieu neutre ou alcalin, fournisse des ions cyanure dans les conditions de réaction utilisées. Les cyanures alcalins et alcalino- terreux remplissent cette condition. On a découvert, par exemplequ'on peut employer effectivement les cyanures sodique, potassique, de baryum, calcique et de strontium.
Lorsqu'on traite un concentré solide par de l'acide cyanhydrique liquide ou gazeux, il y a une ionisation suffisante de l'acide cyanhydrique pour que la réaction se fasse en l'absence d'un solvant quoique l'on puisse employer un solvant avantageusement. On effectue cependant de préférence la réaction entre les matières semblables à la vitamine B12 et les sels de l'acide cyanhydriqueen présence d'un solvant qui favorise l'ionisation du sel, comme par exemple l'eau, les alcools ayant un à trois carbone et des mélanges dissolvant organiques-aqueux, dans lesquels les matières semblables à la vitamine B12 et la substance fournissant les ions cyanuresoient solu- bles. Dans une opération à grande échelle il est très commode et économique d'effectuer la réaction en solution aqueuse.alcaline.
Lorsqu'on déclare qu'on utilise un excès d'ions cyanure, il faut comprendre que cela signifie plus que la quantité en dessous de laquelle le rendement en vitamine B12 pure commence à diminuer. Le mieux est de déter- miner cette quantité expérimentalement pour chaque matière de départ brute, car on verra que la composition de divers bouillons ou concentrés varie con- sidérablement, On peut également déterminer approximativement la quantité d'ions cyanure nécessaire, en mesurant la densité optique d'un échantillon de la matière à traiter en utilisant la lumière de 55000A de longueur d'onde qui est l'un des maximums d'absorption caractéristiques de la vitamine Bl2o La valeur obtenue, qui représente la couleur due à la vitamine B12, lors
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qu'elle est présente,
plus celles qui sont dues aux substances semblables à la vitamine B12 est comptée comme vitamine B12 potentielle. Pour chaque milligramme de vitamine B12 potentielle ainsi calculé, on préfère utiliser environ 0,5 2 mg d'ions cyanure., ce qui apparaît comme un excès considé- rableo
On comprendra qu'il y a ordinairement en présence de nombreuses impuretés non identifiées avec les matières semblables à la vitamine B12 Pour autant que ces impuretés soient capables de réagir avec l'ion cyanure, il est nécessaire de fournir un excès suffisant de cet ion pour satis- faire leur demande ainsi que suffisamment pour assurer la complète trans- formation des matières semblables à la vitamine B12
Lorsqu'on effectue la réaction dans une solution aqueuse en uti- lisant un cyanure métallique à un pH alcalin,
la formation du complexe pour- pre mentionné ci-dessus, constitue une indication visuelle commode de l'ad- dition d'un excès de cyanure.
On transforme le complexe pourpre formé, en vitamine B12, en aci- difiant le mélange de réaction à un pH d'environ 5 ou plus faible. On peut employer pour l'acidification, des acides ordinaires comme l'acide chlorhydri- que, sulfurique ou acétique.
Il faut comprendre que l'utilisation d'un excès de cyanure n'est pas essentielle, car on peut obtenir un rendement en vitamine B12 considéra- ble ment accru en utilisant une quantité de cyanure qui ne réagit pas avec la totalité des matières semblables à la vitamine B12 Il est cependant pré- férable d'utiliser un excès, ce qui donne le rendement maximum en vitamine B12 et rend également inutile le processus difficile d'élimination des ma- tières semblables à la vitamine B12 lorsqu'on isole celle-ci à l'état pur.
Après achèvement de la réaction, on élimine le cyanure qui n'a pas réagi par évaporation partielle, à un pH acide. On peut effectuer cet- te évaporation à une température aussi élevée que 50 - 60 C et sous pres- sion réduite de préférence. On effectue l'évaporation jusqu'à ce que l'ex- cès acide cyanhydrique soit substantiellement entièrement éliminé. Lors- qu'on fait réagir un concentré solide avec de l'acide cyanhydrique liqui- de ou gazeux, on peut éliminer le cyanure qui n'a pas réagi par évapora- tion sous vide ou à la pression atmosphérique. D'autre part, lorsqu'on fait réagir une solution avec le cyanure., il est parfois judicieux d'utiliser un courant d'azote ou d'air pour accélérer l'élimination du cyanure qui n'a pas réagi.
Après le traitement au cyanure, l'acidification (lorsqu'elle est nécessaire) et l'élimination sous forme d'acide cyanhydrique., du cyanure n'ayant pas réagi, on poursuit le traitement du mélange de réaction pour en obtenir la vitamine B12 pure. On connaît diverses méthodes de traitement de mélanges contenant la vitamine B12 pour obtenir la vitamine B12 pure et la présente invention ne se limite pas à l'utilisation d'une méthode parti- culière de récupération.
L'un de ces procédés qu'on peut employer de façon pratique pour récupérer la vitamine B12 comprend la saturation d'une solu- tion de vitamine B12 au moyen d'un sel inorganique (entre autres le sulfate ammonique., le chlorure sodique, le sulfate sodique ou le sulfate d'aluminium) et l'extraction de la solution saturée par l'alcool benzylique, ensuite le séchage de l'extrait à l'alcool benzylique comme par exemple en chauffant dans le vide à une température d'environ 75-80 C et l'addition d'éther à la solution sèche dans l'alcool benzylique pour effectuer la précipitation de la vitamine B12 brute. On dissout alors le précité dans de l'eau satu- rée d'alcool benzylique et contenant environ 2-3% d'acide acétique glacial.
On introduit cette solution et un volume approximativement équivalent d'eau saturée d'alcool benzylique dans des récipients appropriés et on les ex- trait successivement au moyen de portions approximativement équivalentes d'alcool benzylique saturé d'eau. On peut effectuer ces extractions de fa- çon continue ou en extrayant successivement les deux premières solutions men- tionnées avec 6 à 8 portions d'alcool benzylique saturé d'eau. On sèche alors les extraits à l'alcool benzylique réunis et on les traite à l'éther pour
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précipiter la vitamine B12 purifiée. On peut dissoudre ce précipité dans' l'eau et le faire cristalliser pour obtenir de la vitamine B12 à 95% de pu= reté qui est préférable pour l'usage clinique.
On peut effectuer une pu- rification supplémentaire en faisant recristalliser dans l'eau.
Dans le cas où le précipité obtenu après l'extraction à l'alcool benzylique ne serait pas suffisamment purifié pour fournir de la vitamine
B12 à 95% de pureté ou plus par cristallisation, on peut purifier davanta- ge le précipité en dissolvant dans du méthanol, en enlevant la vitamine B12 de la solution par adsorption sur une colonne d'alumine activée et en dé- veloppant la colonne et en lessivant au méthanol. Le liquide sortant con- centré, traité à l'éther fournit un nouveau précipité de vitamine B12 puri- fiée. En alternative, on peut effectuer la précipitation supplémentaire en répétant le processus d'extraction à l'alcool benzylique.
Dans cette con- joncture, on comprendra qu'on peut traiter à nouveau les résidus aqueux de l'extraction à l'alcool benzylique et les fractions de lessive à faibles te- neurs en vitamine B12 de l'étape de purification chromatographique, par l'ion cyanure comme on l'expose ici et qu'on peut les réintroduire dans le pro- cessus pour produire des quantités additionnelles de vitamine B120
Pour s'assurer de la quantité de vitamine B12 présente dans di- vers concentrés intermédiaires et pour déterminer la quantité de vitamine
B12 présente avant et après le traitement au cyanure., il est nécessaire d'a- voir une méthode d5essai, On a trouvé avantageux d'utiliser une modifica- tion de l'extraction à contre courant à l'eau-alcool benzylique,
comme mé- thode d'essai. Cette méthode se base sur un coefficient de partage déter- miné expérimentalement de la vitamine B12 de 1,2 pour le système eau-alcool benzylique.
Dans l'exécution de la méthode de contrôle, on soumet la matière ayant une teneur inconnue en vitamine B12 à une distribution à contre-cou- rant à huit plateaux, entre des portions d'eau et d'alcool benzylique de vo- lumes égaux. On a découvert que les substances semblables à la vitamine B12 et d'autres produits interférant possèdent des coefficients de partage con- sidérablement plus élevés et qu'on les trouvera dans les trois premiers pal- teaux de la distribution. En outre, on décèle la présence dans certains cas., de substances à coefficients de partage plus faibles qu'on trouvera dans les trois derniers plateaux de la distribution. La courbe de partage de la vita- mine B12 atteint un maximum au,quatrième plateau.
On mesure la densité op- tique des contenus, du quatrième-(ou cinquième) plateau à 5500 , et la valeur obtenue représente la couleur due à la vitamine B120 En comparant avec la densité optique de la vitamine B12 pure Ltemine 63n on peut calculer la te- neur en vitamine B12 du plateau. Le quatrième plateau contient 29,1 % (24,2% dans le cinquième plateau) de ia totalité de vitamine B12 présente dans-la matière inconnue. De cette façon, on peut calculer la quantité totale de vitamine B12 présente. Cette méthode de contrôle fournit ordinairement une valeur absolue pour la vitamine B12 lorsque la matière inconnue possède une ! teneur élevée en vitamine Bl2, c'est-à-dire plus de 75% environ selon la na- ture des impuretés.
A pureté décroissante, la méthode est moins sûre pour déterminer des valeurs absolues à cause des impuretés supplémentaires qui interfèrent; la méthode d'essai indique alors la quantité maximum de vitami- ne B12 présente. On peut soumettre des matières brutes à très faibles te- neurs en vitamine B12 et contenant des couleurs qui interfèrent à une dis- tribution à contre-courant suivie d'un essai LLD du quatrième (ou cinquième) plateau, au lieu d'une détermination de couleur, et on calcule alors la quan- tité maximum de vitamine B12 présente sur la base de 11,000,000 d'unités LLD par mg de vitamine B12 La méthode suivante constitue une façon de réaliser la méthode d'essai qui précède%
On ajoute à chacun des huit tubes de centrifugation de 15 ml, 5 ml d'eau saturée d'alcool benzylique, Au premier tube,
on ajoute la matiè- re salide à essayer, en quantité qu'on estime contenir 1-10 mg de vitamine
B12 On ajoute alors au premier tube 5 ml d'alcool benzylique saturé d'eau, on agite le tube, et on sépare les phases par centrifugation. On transfère la phase inférieure (alcool benzylique) dans le second tube, où on répète
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le processus. On continue à procéder ainsi avec chaque tube successivement jusqu'à ce que la phase d'alcool benzylique soit en équilibre avec l'eau du huitième tube. On fait alors passer une seconde portion de 5 ml d'alcool benzylique saturé d'eau dans chaque tube successivement, de la même façon jusqu'à ce qu'elle soit en équilibre avec l'eau du septième tube.
On conti- nue à procéder ainsi avec six portions supplémentaires d'alcool benzylique, après quoi, les huit tubes contiennent tous deux phases en équilibre. On ajoute au contenu du quatrième tube (ou cinquième)., 10 ml de chloroforme pour transférer la vitamine B12 dans la couche aqueuse. On détermine alors la densité optique de la couche aqueuse à 550 dans une cellule de I cm On calcule alors la quantité totale de vitamine B12 présente, à partir de cette valeur, comme décrit ci-dessus.
Les exemples suivants montrent diverses méthodes pour traiter les matières semblables à la vitamine B12 par l'ion cyanure pour les trans- former en vitamine B12,en même temps qu'ils indiquent le rendement accru en vitamine B12 obtenu en faisant réagir avec l'ion cyanure des mélanges contenant à la fois la vitamine B12 et des matières semblables à la vitami- ne B12 Il faut comprendre, toutefois, que ces exemples sont donnés comme illustration et non comme limitation.
EXEMPLE 1. = Préparation préliminaire d'un concentré de vitamine B12
On a acidifié au pH 2,5 environ 2200 gal de bouillon de fermen- tation obtenu par l'élaboration d'une souche de S griseus et titrant 4630 unités par ml d'acivité LLD, au moyen d'acide phosphorique et on a effectua une clarification préliminaire par filtration au moyen de terre de diato- méeso On a neutralisé au pH 7-8 avec l'hydroxyde de sodium et on a filtré à nouveau au moyen de terre de diatomées. On a alors traité le filtrat par 88 livres de charbon de bois activé pour adsorber les facteurs actifs. A- près l'avoir éliminé par filtration, on a agité le charbon de bois avec 45 gala de n-butanol pendant 15 minutes.
On a ajouté au mélange 35 gal, d'eau et 25 livres d'aide filtrant et on a agité le mélange pendant 45 minutes.
On a éliminé la matière solide par filtration dans une centrifugeuse à bol et on a alors lavé plusieurs fois dans la centrifugeuse avec une quantité totale d'environ 40 gal d'eau préalablement saturée de butanol. On a réu- ni le filtrat et les eaux de lavage et on a séparé les couches de butanol e t d'eau. On a filtré la couche d'eau qui contenait pratiquement toute la ma- tière possédant l'activité LLd pour éliminer les fines de carbone.
On a ajouté aux 85 gal de couche d'eau filtrée obtenus, 13 gal d'alcool benzylique et 425 livres de sulfate ammoniqueo On a agité le mé- lange pendant 15 minutes et on l'a alors laissé reposer pendant une heure.
On a séparé la couche aqueuse et on l'a extraite à nouveau au moyen de 8,5 gal d'alcool benzylique, On a réuni les extraits à l'alcool benzylique et on les a séchés,sur du sulfate sodique anhydre. Le volume des extraits secs était d'environ 28 gala (l'augmentation de volume était due à la présence de butanol)
On a alors chromatographié la solution dans l'alcool benzylique, sur 20 kg d'alumine activée. La solution entière ayant été incorporée à la colonne, on a lavé celle-ci avec un mélange de méthanol et d'acétone dans le rapport 1 2 jusqu'à ce que le liquide sortant soit clair comme l'eau.
On a alors développé la colonne au moyen de méthanol et on a recueilli com- me fraction riche tout le liquide sortant contenant une coloration rouge.
On a obtenu cinquante deux litres de fraction riche.
On a concentré sous vide le liquide sortant, riche, en dessous de 35 C jusqu'à deux litres environ et on l'a fait précipiter en ajoutant un volume d'acétone et 4 volumes d'éther.
On a extrait le précipité par portions au moyen de méthanol jus- qu'à ce qu'il reste un résidu blanc. La mesure de la densité optique de la solution de méthanol à 5500 indiquait un maximum de 416 mg de vitamine B12 et de matières semblables à la vitamine B12 On a traité une partie a- liquote de la solution dans le méthanol, au moyen d'éther pour effectuer la
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précipitation et on a soumis le précipité à une distribution à contre-cou- rant à huit tubes dans le système alcool benzylique-eau.
La quantité maximum de vitamine B12 présente déterminée par la méthode d'essai à contre-courant, était de 187 mg.
Transformation des matières semblables à la vitamine B12 au moyen de cyanure.
On a divisé en deux le restant de la solution et on a traité une moitié à l'éther pour effectuer la précipitation. On a dissous le précipité dans environ 100 ml d'eau. On a ajouté huit ml d'une solution aqueuse à 1% de cyanure de potassium en agitant, et on a laissé reposer la solution pen- dant environ 15 minutes. On a alors traité la solution par l'acide chlorhy- drique jusqu'au pH 4 On a ajouté septante grammes de sulfate ammonique et on a extrait le mélange au moyen de portions de 20 ml, 10 ml et 10 ml d'al- cool benzylique. On a séché les extraits à l'alcool benzylique en chauffant sous vide à 75-80 C on a filtré la solution résultante et on l'a traitée par l'éther pour effectuer la précipitation.
On a dissous le précipité dans 20 ml d'eau préalablement saturée à l'alcool benzylique et à laquelle on avait ajouté 0.5 ml d'acide acétique. glacial. On a introduit la solution dans un tube à centrifugation de 40 ml On a ajouté dans un second tube à centrifugation de 40 ml, 20 ml d'eau satu- rée d'alcool benzylique, On a alors fait passer sept portions de 20 ml d'al- cool benzylique saturé d'eau à contre-courant dans les deux tubes, chaque portion d'alcool benzylique étant utilisée pour extraire en premier lieu le,
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tube 1:-Jo 1 etT en.suite' le tube- 2a Les- solut,i<1>:i1s dans l'alcool benzylique ont alors été réunies, on les a séchées par chauffage'"'sous vide et traitées à l'éther pour effectuer la précipi,'-U-a.-tion.
On notera que cetterméthode d'ex- traction à contre-courant est réellement équivalente à la distribution à con- tre-courant pour la séparation de la vitamine B12 de toutes matières résiduel- les semblables à la-vitamine B12 Il n'est pas nécessaire de conserver à part
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les derniers tubes de la distribution à contre-courant étant donné quà av;.; point ils contiennent tous essentiellement la vitamine B12 pure.
On a dissous le précipite obtenu dans 1,1 ml d'eau et on l'a lais- sé cristalliser. On a enlevé les cristaux par centrifugation et on les a fait recristalliser en les dissolvant dans 10 ml d'eau, en ajoutant de l'a- cétone (environ 120 ml) jusqu'à formation d'un trouble et en laissant repo- ser la solution. On a obtenu 127 mg de cristaux (séchés à 100 sous vide) à 95% de pureté déterminée par l'essai de distribution à contre-courant.
On a contrôlé l'identité de ces cristaux avec la vitamine B12 authentique en comparant les propriétés physiques et chimiques. Les résultats figurent dans le tableau suivant
Comparaison du produit du procédé au cyanure avec la vitamine
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------------- =------- B12 authentique, --------------------- ==============
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<tb> Produit <SEP> du <SEP> procédé <SEP> au <SEP> Vitamine <SEP> B12
<tb>
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=.=#= cyanure. '"'" ='" mmom=mmmm
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<tb> Coefficient <SEP> de <SEP> partage <SEP> 1,2 <SEP> 1,2
<tb>
<tb> eau/alcool <SEP> benzylique
<tb>
<tb> Spectre <SEP> d'absorption
<tb>
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A max.
(î) 27899 3615, 5500 2780, 3610, 5500
EMI7.8
<tb> Absorption <SEP> infra-rouge <SEP> Les <SEP> deux <SEP> substances <SEP> correspondent <SEP> en <SEP> détail
<tb>
EMI7.9
Indices de réfraction 10618 00002 10616 + + 0,002 10650 + 00002 10652 0,002 1.650 - 0.002 1.652 0002 10668 = 00002 1.664 - 00002 Rotation optique M 23 61 + 9 59 + 9
EMI7.10
<tb> 6563A
<tb>
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uomparaison des Soub1es : La aenennina-cion ae la so1ua11lte absolue en solution aqueuse aussi bien que de la solubi-
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lité en mélange dans une solution saturée de vitami- ne B12 authentique ont indiqué que les deux matières étaient identiques.
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On a traité à nouveau la solution aqueuse restante;, provenant de la distribution à contre-courant modifiée décrite ci-dessus, par le cyanure potassique en solution aqueuse. On a acidifié à nouveau la solution et on l'a alors extraite avec une solution de tétra chlorure de carbone et de cré- sol dans le rapport 2 1 et on a traité les extraits à l'éther pour effec- tuer la précipitation. On a dissous lé précipité dans une petite quantité de méthanol et on a traité à nouveau à l'éther pour effectuer la précipita- tion. On a alors dissous le précipité dans 0,13 ml d'eau et on l'a laissé cristalliser. On a obtenu 47 mg de cristaux (séchés à 100 C. sous vide).
On a déterminé par un essai de distribution à contre-courant que les cris- taux étaient de la vitamine B12 à 73% de pureté.
On a obtenu ainsi l'équivalent de 153.3 mg de vitamine B12 pure à partir de 1100 gal de bouillon de fermentation en utilisant le nouveau procédé.
On a obtenu de la seconde moitié de la solution méthanolique ini- tiale, un rendement de 50 mg de vitamine B12 après l'avoir traitée substan- tiellement de la même façon que la première moitié, en exceptant l'omission du cyanure. Ceci indique que le traitement au cyanure a pour effet de tri- pler la quantité de vitamine B12 isolée,
Lorsqu'on répète le procédé précédent en utilisant les cyanures ammonique, de barium et calcique au lieu du cyanure potassique, les résultats montrent dans chaque cas une augmentation approximativement triple de la quan- tité de vitamine B12 recueillie, grâce au traitement au cyanure.
EXEMPLE 2
On a purifié un concentré intermédiaire obtenu par la propagation de S griseus, contenant de la vitamine B12 et des substances semblables à la vitamine B12 par une distribution à contre-courant entre de l'eau et de l'alcool benzylique, en utilisant deux tubes d'eau et en faisant passer dans chacun successivement un total de sept portions d'alcool benzylique, de la façon décrite dans l'exemple 1 Le concentré n'avait pas été traité aupa- ravant par du cyanure. On a continué à traiter la matière purifiée se trou- vant dans les extraits à l'alcool benzylique,.pour.obtenir la vitamine B12 pure. On a réuni les couches aqueuses contenant des matières semblables à la vitamine B12 une petite quantité de vitamine B12 et des impuretés incon- nues et on les a traitées à l'éther.
Il s'est formé un précipité amorphe qu'on a séparé et séché. En opérant conformément aux méthodes antérieures, on a retraité ce précipité normalement avec d'autres fractions de rebut pour obtenir une petite récupération supplémentaire de vitamine B12 après de nombreuses étapes de purification. Cependant, il y avait encore une perte considérable des substances actives présentes.
On a traité une partie du précité amorphe à des fins de compa- raison et on a traité plusieurs portions par le cyanure de la façon sui- vante a) On a dissous dans l'eau une portion du précipité et on en a fait une analyse spectrographique. On a observé des maxima d'absorption à 3610 et 5200 On a alors soumis la solution à une distribution à contre-courant entre l'eau et l'alcool benzylique de la façon décrite dans la méthode d'essai. Les mesures de densité optique du cinquième tu- be de la distribution à contre-courant ont indiqué que 51% au maximum de l'ensemble de la vitamine B12 et des matières semblables à la vitami- ne B12 présentes, étaient effectivement de la vitamine B12, représentant 09112 mg de vitamine par mg de matière solide' initiale.
b) On a dissous dix et cinq dixièmes de mg du précipité amor- phe dans 3 ml d'eau et on a ajouté 0.2 ml d'acide cyanhydrique liquide On a laissé reposer la solution pendant une courte période et on l'a chauffée
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à 50-60 C pour éliminer l'excès d'acide cyanhydrique.
Des analyses spec- tographiques de la solution résultante ont montré des maxima d'absorption- à 3610 A, 5200 A, et 5500 , ce qui indique un déplacement vers le spectre de la vitamine B12 On a soumis la solution à une distribution à contre- courant entre l'eau et l'alcool benzylique, Une mesure de la densité opti- que de la solution du cinquième tube a montré que 88.3 % de l'ensemble de la vitamine B12 et des matières semblables à la vitamine B12 présentes, étaient de la-vitamine B12 représentant 0,220 mg de vitamine B12 par mg de matière de départ, soit une augmentation de 96% c) On a dissous neuf et six dixièmes de mg de précipité amorphe dans 2 ml de méthanol et on a ajouté 0,2 ml d'acide cyanhydrique liquide.
On a laissé reposer la solution pendant une période de 15 minutes dans un bain glacé et on l'a chauffée à 50 - 60 jusqu'à siccité. On a dissous le résidu dans de l'eau, Des analyses spectrographiaues de.la solution résultante ont montré des maxima d'absorption à 3610 5200 A 5500 Ä indi- quant un déplacement vers le spectre de la vitamine B12
On a soumis la solution aqueuse à une distribution à contre-cou- rant entre l'eau et L'alcool benzylique, La mesure de la densité optique de la matière du cinquième tube a montré que 81% de l'ensemble de la vitami- ne B12 et des matières semblables à la vitamine B12 représentant 0.219 mg de vitamine B12 par mg de matière de départ étaient de la vitamine B12,
soit une augmentation de 95.5%
On a traité trois fraction supplémentaires du précipité amorphe par l'acide cyanhydrique anhydre liquide, en solution dans l'éthanol, l'al- cool benzylique et le crésol respectivement, au lieu de la solution métha- noliqueo On a obtenu des augmentations de teneur en vitamine B12 dans tous les cas, ces augmentations étant du même ordre de grandeur que celles qu'on obtient en utilisant le méthanol. d) On a mélange soigneusement dix et huit dixièmes de mg de pré- cipité amorphe avec 2,2 ml d'acide cyanhydrique liquide anhydre et on a lais- sé reposer jusqu'à ce que l'acide cyanhydrique se soit évaporé. On a dissous le résidu dans l'eau.
Des analyses spectrographiques de la solution résultante ont montré des maxima d'absorption à 3610 A 5200 et 5500 A indi- quant un déplacement vers le spectre de la vitamine B12. On a soumis la so- lution aqueuse à une distribution à contre-courant entre l'eau et l'alcool benzylique. Des mesures de la densité optique du cinqième tube ont montré que 81% de l'ensemble de la vitamine B12 et des matières semblables à la vi- tamine B12, représentant 0.198 mg de vitamine B12 par mg de matière de dé- part étaient de la vitamine B12 soit une augmentation de 77%.
EXEMPLE 3
On -9 soumis trois mille gal de bouillon de fermentation prove- nant de plusieurs lots, obtenus par la propagation d'une souche de S.gri seus à une adsorption sur du charbon de bois, à une désorption au moyen de butanol et d'eau, à une extraction à l'alcool benzylique, à une analyse chromatographique et à une précipitation comme décrite dans l'exemple 1 On a extrait les matières solides précipitées au méthanol jusqu'à ce qu'il reste un résidu blanc.
La mesure de la densité optique de la solution ma- thanolique obtenue, mesurée à 5500 et comparée à la valeur relative à la vitamine B12 pure a montré la présence de 540 mg de vitamine B12 et de matières semblables à la vitamine B12a0n a ajouté de l'acétone et de 1'é- ther à la solution méthanolique pour effectuer la précipitation;, jusqu'à ce que les liqueurs ne contiennent plus de coloration rosé.
On a dissous le précipité dans 300 ml d'eau et on a ajusté le pH à 8 au moyen d'une solution aqueuse d'hydroxyde sodique. On a ajouté à cet- te solution 2,7 gr de cyanure sodique et on a laissé reposer la solution en agitant un peu, pendant 45 minutes. (La solution possédait une couleur pourpre indiquant qu'on avait ajouté un excès marqué de cyanure). On a a- lors acidifié la solution au pH 3 avec de l'acide chlorhydrique et on a fait passer de l'azote dans la solution pour éliminer l'acide cyanhydrique.
On a ajouté 210 gr de sulfate ammonique à la solution et on l'a extraite avec
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des portions de 50 ml, 25 ml, 25ml 25 ml et 10 ml d'alcool benzylique. On a séché les extraits par chauffage à 75-80 C sous vide, et on a filtré les extraits secs sur un entonnoir en verre fritte., On a ajouté de l'éther au filtrat pour effectuer la précipitation,
On a dissous le précipité dans 100 ml d'eau additionnée de 2 ml d'acide acétique glacial et on a introduit 100 ml d'alcool benzylique satu- ré d'eau dans un second tube. On a effectué une opération de distribution à contre-courant modifiée en faisant passer sept portions de 100 ml d'alcool benzylique saturé d'eau dans chaque tube successivement, comme décrit dans l'exemple I, et on a réuni les extraits à l'alcool benzylique après les avoir retirés du second tube.
On a séché les extraits réunis par chauffage à 75- 80 C, sous vide,. On a ajouté de l'éther aux extraits séchés pour effectuer la précipitation.
On a dissous le précipité dans du méthanol, et on l'a chromatogra- phié sur de l'alumine activée, en développant la colonne avec du méthanol.
On a traité le liquide sortant riche par l'éther pour effectuer la précipi- tation On a mis les queues de la chromatographie en réserve pour être re- traitées. Elles contenaient à 5500 à une couleur qui, calculée en vita- mine B12 était équivalente à environ 90 mg de vitamine B12 On a dissous le précipité dans.1.9 ml d'eau et on l'a laissé cristalliser. On a dissous les cristaux rouges dans 20 ml d'eau et on a filtré la solution. On a uti- lisé 20 ml supplémentaire d'eau pour laver l'appareillage et on les a ajou- tés à la solution. On a ajouté 520 ml d'acétone et la cristallisation s'est produite. On a séparé les cristaux par centrifugation, on les a lavés à l'a- cétone et on les a séchés à 560 C sous vide, On a obtenu 324.7 mg de cris- taux rouges.
Un échantillon des cristaux a perdu 5 % de son poids par sé- chage à 100 C L'échantillon sec s'est montré être de la vitamine B12 à 94% de pureté par un essai de distribution à contre-courant, indiquant la récu- pération de 290 mg de vitamine B12 pure.
On a trouvé qu'on obtenait substantiellement les mêmes résultats en effectuant le traitement au cyanure dans une solution aqueuse méthanoli- que et dans une solution aqueuse éthanoliqueo EXEMPLE 1......
On a appliqué le traitement au cyanure pour la transformation de matières semblables à la vitamine B12, à un bouillon de fermentation et on a évalué la transformation en utilisant la méthode d'essai à contre-courant.
On a traité 3 litres de bouillon de fermentation obtenu par l'élaboration d'une souche de S.griseus par 201 gr de cyanure sodique dissous dans une petite quantité d'eau. On a agité la solution pendant deux heures et on l'a portée au pH 4 avec de l'acide chlorhydrique concentré. On y a appli- qué le vide de sorte que de l'air a barbotté toute une nuit à travers la so- lutiono On a.ajouté à la solution 2150 gr de sulfate ammonique et 30 ml d'al- cool benzylique On a agité le mélange, on l'a laissé déposer et on en a re- tiré la couche,,-d'alcool benzylique. On a extrait alors à-nouveau la couche aqueuse avec-une portion de 20 ml et trois portions de dix ml d'alcool ben- zylique. La couche d'eau consommée qui ne contenait aucune activité LLD a été écartée.
On a dilué les extraits à l'alcool benzylique réunis,avec deux volumes de chloroforme et on les a extrait avec trois portions de 5 ml d'eau.
On a soumis dix ml de la solution aqueuse contenant environ 300.000 unités LLD par ml à une distribution à contre-courant à huit plateaux avec de 1'al- cool benzylique en utilisant des phases de 10 mlo Les résultats de la dis- tribution à contre-courant sont indiqués dans le tableau ci-joint.
On a effectué le même traitement sur trois litres du même bouil- lon à l'exception de l'addition de cyanure sodique. On a soumis encore la solution aqueuse initiale obtenue par extraction à l'alcool benzylique à une distribution à contre-courant d'alcool benzylique. Les résultats supplé- mentaires sont indiqués dans le tableau.
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Effet du cyanure sodique sur la transformation de 1'ac- tivité LLD dans un bouillon en vitamine B12
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-------------------------------------------------- (Résultats d'essai de distribution à contre-courant dans le système alcool benzylique=eau}0 Pourcentage de répartition
EMI11.2
--------------------------------------
EMI11.3
<tb> Tube <SEP> N <SEP> Il <SEP> Bouillon <SEP> non <SEP> traité <SEP> " <SEP> Bouillon <SEP> traité <SEP> Il <SEP> Vitamine <SEP> B12 <SEP> pure
<tb>
<tb>
<tb> --------------------------------------------------------------------------
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 28,7 <SEP> 1 <SEP> 1.4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 19.1 <SEP> 6.1 <SEP> 8.3
<tb>
EMI11.4
3 23.4 29.0 20'09
EMI11.5
<tb> 4 <SEP> 15,
5 <SEP> 29.2 <SEP> 29.1
<tb>
EMI11.6
5 5.4 20.9 24.2
EMI11.7
<tb> 6 <SEP> 3.9 <SEP> 11.2 <SEP> 12.1
<tb>
EMI11.8
7 2.6 2.6. 3.3 8 0.7 0.9 O4
Le tableau ci=dessus montre un déplacement marqué dans le com- portement dans la distribution à contre-courant, de Inactivité LLD par rapport au comportement typique de la vitamine B12 après le traitement du bouillon par le cyanure sodique. A partir des données ci-dessus, il est impossible de calculer exactement les quantités de vitamines B12 contenues dans les bouillons traité et non traité. On peut voir cependant que la répartition du bouillon traité est différente de celle du bouillon non trai- té et très semblable à celle de la vitamine B12 pure.
En outre, il est évident que lacivité du bouillon traité dans le quatrième tube (tube qui montre une teneur maximum en vitamine B12) est presque le double de celle du bouillon non traité.
EXEMPLE 50
On a obtenu un bouillon de fermentation par la propagation d'une
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souche de S. sriseus# On a acidifié 100 litres de bouillon au pH 2.5 avec de l'acide chlorhydrique. On a alors traité le bouillon par 220'mg de cya- nure sodique et on a agité le lot pendant 10 minutes. On a àjouté 100 gr de terre de Fuller et 100 gr de terre de diatomées, on a agité la bouillie résultante pendant 30 minutes, on a séparé le produit d'adsorption par fil- tration et on l'a séché à 50 C Le produit d'adsorption a montré une ac-
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tivité de 8430000 unités par gr mesurée sur le Lnlactis Dorner dans le Ileup essay" et a montré une action favorable à la croissance des poulets.
Essentiellement toute la matière active du bouillon s'adsorbe par traitement à la terre de Fuller dans les conditions décrites, La teneur en vitamine B12 du bouillon étant augmentée de façon marquée par le traitement au cyanure;, comme le montre l'exemple 4., la teneur en vitamine B12 du produit d'adsorption ainsi préparé à partir du bouillon traité, s'accroît proportion- nellement,
Divers changements ou modifications dans les méthodes précédentes viendront à l'espirt des experts en cette matière et pour autant que ces chan- gements ou modifications soient compris dans les revendications ci-après, on doit comprendre qu'ils sont parties intégrantes de l'invention.
REVENDICATIONS.