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PROCEDE DE PREPARATION DE MATIERES THERAPEUTIQUES ET PIUS PARTICULIEREMENT
DE LA VITAMINE B.12.
La présente invention concerne un développement nouveau et un per- fectionnement du procédé décrit dans le brevet belge n 488.271.
Le brevet antérieur concerne un procédé de préparation de la vita- mine B12 à partir de préparations de foie actives à l'égard de L.L.D. et de produits d'élaboration de Streptomyces griseus.
On a découvert maintenant qu'on obtient des résultats supérieurs, particulièrement en ce qui concerne le rendement en vitamine B12 purelors- qué la matière de départ qu'on soumet à une extraction et qu'on purifie pour récupérer des concentrés de vitamine B12, est un concentré brut actif à l' égard du L.L.D., composé de façon prédominante d'un produit d'élboration de variétés de Streptomyes griseus produisant de la griséine ou de la Strep- tomycine.
On a également découvert qu'on peut obtenir la vitamine B12 comme sous- produit de la fabrication des antibiotiques streptomycine et griséine.
Une façon de procéder consiste à préparer le concentré brut-de départ en cultivant dans un milieu nutritif approprié une variété des micro- organismes Stroeptomyeces grisseus qui produise outre la griséine, des ingré- dients actifs à l'égard du L.L.D. dont on peut séparer la vitamine B12 com- me décrit dans cette spécification, en adsorbant la matière active du bouil- lon de culture à 1:1 aide d'un adsorbant approprié, du charbon de bois activé de préférence, en lessivant la fraction adsorbée au moyen d'un solvant ap- proprié tel qu'une solution aqueuse de pyridine ou un produit de substitu- tion alkylé de la pyridine et en concentrant la lessive brute, à siccité.
On a découvert que ces concentrés contiennent en plus de la griséine, des ingrédients actifs à l'égard du L.L.D. qui conviennent pour séparer la vi- tamine' B12 par le procédé revendiqué.
Par le traitement proposé, on élimine la griséine éventuellement présente dans le concentré de départ et les produits qu'on obtient en sont
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exempts.
On a également découvert qu'il est possible de récupérer la vi- tamine B12 des concentrés préparés en cultivant une variété de Streptomyces griseus qui produise en plus de streptomycine, des ingrédients actifs à l' égard du L.L.D. dont on peut séparer la -vitamine B12. Il est avantageux en pratique, de séparer et de récupérer la streptomycine avant d'effectuer le procédé relatif à la vitamine B12, en mettant le bouillon en contact avec une résine échangeuse d'ion dont la capacité d'échange provienne d'un grou- pe carboxylique grâce auquel ladite résine adsorbe la streptomycin,e On trai- te le bouillon dont on a éliminé la streptomycine à l'aide d'un adsorbant comme le carbone, on lessive la fraction adsorbée avec de la pyridine en so- lution aqueuse et on évapore la lessive jusqu'à un petit volume.
On précipi- te alors le concentré brut qu'on utilise comme matière de départ dans le procédé proposé, par dilution de la lessive.concentrée avec du méthanol et par addition d'éther.
Lorsqu'on utilise les concentrés contenant la vitamine B12 et la streptomycine sans éliminer d'abord la streptomycineon débarrasse le bouil- lon de l'organisme propagateur, on le traite par le carbone et on lessive la vitamine B12 de la fraction adsorbée par le carbone avec de la pyridine. Le procédé proposé élimine la streptomycine éventuellement présente dans le con- centré de départ utilisé et les produits obtenus en sont exempts.
Les pro- duits contenant la vitamine B12 décrits dans cette spécification sont par conséquent exempts de streptomycine aussi bien que de griséine. On peut ex- traire le concentré brut obtenu de cette façon, à l'eau ou au moyen d'un al- cool aliphatique inférieur soluble dans l'eau, l'alcool méthylique de pré- férence. Le choix du liquide d'extraction est déterminé par la manière adsor- bante à utiliser dans le fractionnement chromatographique.
Dans la pratique de cette invention, on peut utiliser divers ad- sorbants comprenant le carbone activé, l'alumine activée et les matières semblables. L'alumine est l'adsorbant préféré pour la ou les étapes chroma- tographiques. Lorsqu'on utilise des colonnes chromatographiques contenant du carbone, on emploie des extractions aqueuses et des extractions à l'aide d'alcool aliphatique inférieur soluble dans l'eau lorsque les colonnes sont constituées d'alumine activée. On charge de préférence la colonne à l'état humide par remplissage avec l'adsorbant et le solvant utilisé dans l'extrac- tion et par drainage subséquent du solvant jusqu'à ce que son niveau attei- gne le sommet de la matière adsorbante dans la colonne. Il est commode d'u- tiliser comme support de l'adsorbant une toile métallique recouverte d'une couche de sable.
Lorsqu'on utilise une colonne d'alumine pour la chromatographie, on verse l'extrait alcoolique, méthanolique de préférence, à la surface su- périeure de l'adsorbant dans la colonne et on le laisse s'écouler à travers l'adsorbant soit par gravité soit sous pression. On développe ensuite la colonne au moyen de quantités supplémentaires de solvant d'extractions pour développer dans la colonne des zônes de matière adsorbante contenant la vi- tamine B12 en quantités différentes et à différents degrés de pureté et on recueille les fractions convenables de la lessive au fur et à mesure que les zones sortent du fond de la colonne. On concentre séparément ou en mélange en mélange en un sirop épais les fractions présentant une activité suffisan- te révélées par un examen microbiologique ou en vertu de leur couleur rose.
On mélange ensuite ce concentré avec un alcool aliphatique inférieur et on ajoute un liquide non sissolvant miscible comme l'acétone dans lequel la substance active est insoluble. On recueille le précipité rouge floconneux qui se forme.
On peut purifier davantage le précipité rouge floconneux en le dissolvant dans un dissolvant de la vitamine B12 tel que l'alcool éthylique ou l'alcool méthylique ou l'eau, et en le précipitant au moyen d'un liquide miscible ne dissolvant pas la vitamine B12, tel que l'acétone, une ou plu- sieurs fois. Pendant ce traitement on peut filtrer la solution si elle n'est pas limpide avant d'ajouter le réactif de précipitation, pour en éliminer
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les impuretés insolubles; le nombre de ces précipitations et de ces traite- ments désirables varie avec les différents lots. L'absence de couleur bru- nâtre ou jaunâtre dans le liquide qui surnage après la précipitation four- nit une indication quant au nombre de précipitations utiles.
Dans quelques cas,, après plusieurs de ces traitements, on peut cristalliser la vitamine B12 d'une solution aqueuse en ajoutant de l'acétone jusqu'au point de tur- bidité commençante et en laissant se former des cristaux aciculaires rouges.
Cependant, lorsqu'on désire un produit cristallin d'une grande pureté, il est souvent désirable de soumettre le produit provenant du pre- . miel' fractionnement chromatographique (soit avant soit après une ou plusieurs étapes de précipitation mentionnées ci-dessus) à un second fractionnement
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l omatograph3quea On effectue ceci en dissolvant le produit amorphe dans un alcool aliphatique inférieure On peut alors introduire la solution dans une seconde colonne dalumine activée et on peut recueillir les fractions les plus actives de la lessive décelées comme'ci-dessus et les concentrer à sic- cité. On peut dissoudre le résidu ses dans de l'alcool méthylique et ajouter à la solution de 1?acétone qui provoque la séparation d'un précipité rouge de vitamine B12.
On peut dissoudre ce précipité dans de l'eau et ajouter à la solution de l'acétone qui provoque la séparation de cristaux rouges. On peut recristalliser de façon répétée la vitamine B12 d'une solution eau acé- tone pour éliminer toutes les impuretés qui subsistent encore.
La vitamine B12 obtenue dans un état de pureté substantielle, con- formément à cette invention, est un composé rouge dont l'analyse suivante donne une composition type approximative déterminée sur deux échantillons
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séchés sous vide pendant deux heures à 100cor s 056.3556.116.726.72 N1lo511Lo75f2427; Colol.2408o On pense que la totalité de la différence entre la somme des pourcentages'donnés et 100% en substance est constituée par de l'oxygène. L'analyse spectrale n'indique pas la présence d'autres métaux.
La vitamine B12 possède à peu près la formule empirique
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approximative basée sur l'analyse précédente - ,,6l-54TT86-92.J-13rr, La vitamine B12 est substantiellement soluble dans l'eau, l'alcool méthy- lique, l'alcool éthylique, et le phénol et substantiellement insoluble dans
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!-'acétone, l'éther et le chloroforme'. La vitamine B12 possède un coeffi- oient de partage apparent d'environ l0%6 dans le système; 75% de toluène- 25% do thoorésol/eauo On a trouvé que la vitamine B12 a un coefficient de partage d'environ 1 2 dans le système eau/alcool b--nzylique.
La vitamine B12 cristallise à partir de solutions appropriées telles que l'acétone aqueux en cristaux rouges ayant les propriétés cris-
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tallographiques suivantes; indices de réfraction, Io 619; Io 6.9; Tp 659o Les cristaux de la vitamine B12 neont pas de point de fusion défini mais foncent à environ 2:020'C Le spectre cpadsorption de la vitamine B12 est caractérisé par des maxima a 27 80 (Elem 114.7) à 36Io ) (E = 203-5) et 5500 1 Iem Ism (EI = 62 7) Le spectre ne change pas de façon marquée par un changement ivom de pH; en solution acide, lintensité de la bande de 3610 diminue d9envi- ron 10% et en solution alcaline, il y a d'autres petits changements et la structure fine se marque moins.
Le spectre d'absorption infra-rouge a été déterminé avec un ré=-
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fractomètre PerI.nmElr 12A soigneusement calibré. On a observé les maxi- ma d'adsorption suivants
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<tb> Longueur <SEP> d'onde <SEP> en <SEP> Mu <SEP> (10-4cm)
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<SEP> 10.00 <SEP> S
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<tb> 12.35 <SEP> M
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S.M. et W signifient forte, moyenne et faible intensités d'absorption.
La vitamine B12 possède une grande valeur thérapeuthique dans le traitement de l'anémie pernicieuse d'Addison et d'autres anémies macrocyti- ques. Les doses requises varient selon le cas particulier et dépendent de la sévérité et de la durée de la condition pathologique et de la réponse thérapeuthique du patiento On estime que la dose effective minimum adminis- trée par voie intramusculaire sous la forme d'une solution aqueuse saline ou isotonique est approximativement I microgramme par jour ou des multi- ples de cette quantité à intervalles plus longs, par exemple approximative- ment 7 microgrammes par semaines.
Il existe dans la littérature des compte-rendus de recherches cliniques sur la thérapie de la vitamine B12 dans le traitement des anémies macrocytiques : Spies, T.D. Stone, R.H., Garcia Lopez.G., Milanes, F., Lopez Toca, R. et A- ramburu, T., "Thymine, Folie Acid, andVitamin B12 in nutritional Macrocytic Anemia, Tropical Sprue, and Pernicious Anemia," Lancet, 2.519-522, October 2919480
Hall, B.E., et Campbell, D.C., "Effect of Vitamin B12 On the Hema- topoietic and Nervous Systems in Addisoniam Pernicious Anemia", Journal of Laboratory and Clinical medicine, 33,:
1646, December 19480
La vitamine B12 pure possède une valeur thérapeutique tellement élevée dans le traitement des anémies macrocytiques que l'on peut employer un concentré de vitamine B12 provenant de sources microbiologiques en con- formité avec le procédé proposé et contenant une quantité aussi faible que 65.000 unités de L.L.D./mg. ou seulement environ 0,6% de vitamine B12, dans le traitement de l'anémie pernicieuse. Pour autant qu'on le sache ce concen- tré est beaucoup plus puissant que n'importe quel concentré contre l'anémie pernicieuse précédemment disponible L'administration par voie buccale d' une dose unique de concentré à 3% de vitamine B12 équivalent à 600 micro- grammes de vitamine B12 a produit une réaction hématologique maximum chez un patient.
Chez un autre, une quantité de concentré à 5% équivalent à 25 microgrammes s'est montrée active au point de vue hématopoiétique après injection par voie intramusculaire en une dose unique. On avait préparé cette matière pour injection en dissolvant le concentré de vitamine B12 dans une solution saline,, On a déterminé l'activité des produits mention- nés dans cette demande par une méthode d'essai de réaction de croissance microbiologique qui utilise le Lactobacillus lactis Dorner comme organisme de test, On donne ci-dessous une brève description de la méthode d'essai qui
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a été utilisée.
On a signale que le Lactobacillus lactis Dorner exige deux fac-
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teurs de croissance, T,J. et LL.D. Des modifications de milieu introduites dans la formule décrite ci-dessous ont éliminé la nécessité du facteur T.J. et l'essai tel qu'il est présenté est spécifique de L.L.D. Ce microorganis- me révèle la réaction du facteur L.L.D. à la vitamine B12. On utilise la vitamine B12 cristallisée comme standard de l'essai et on évalue toutes les inconnues en terme d'activité microbiologique favorisant la croissance, é- quivalent à l'activité microbiologique de la vitamine B12,
On peut se procurer l'organisme Lactobacillus lactis Dorner, A.
T.C.C. 10, 697, utilisé dans cette méthode d'essai dans la collection amé- ricaine de culture type. On maintient des cultures de réserve de l'organis- me dans un milieu de croissance qui consiste en :
I% d'extrait de ferment Difco 0.02% de sérum de jus de tomate
I% de dextrose anhydre
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1.5% d'agar.
Le milieu utilisé pour l'inoculation consiste dans le milieu de base ou milieu d'essai auquel on a ajouté I unité de vitamine B12 par ce.
On lave les cellules d'inoculation avec de l'eau distillée stérile et on les dilue pour former une suspension donnant, au photomètre d'Evelyn, une lectu- re comprise entre 90% et 95% de transmission lumineuse, avec un filtre de 520 mu.
La composition du milieu d'essai, de force double est énumérée ci-dessous. On peut sans inconvénient prélever les ingrédients de solutions de réserves
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<tb> DL <SEP> isoleucine <SEP> 200mg <SEP> Dextrose <SEP> 10 <SEP> gm
<tb>
<tb> DL <SEP> alpha-alanine <SEP> 200mg <SEP> acétate <SEP> sodique <SEP> 6 <SEP> gm
<tb>
<tb> DL <SEP> acide <SEP> aspartique <SEP> 200mg <SEP> acide <SEP> fumarique <SEP> 0.5 <SEP> gm
<tb>
<tb> DL <SEP> valine <SEP> 200mg <SEP> Ethyloxalacétate <SEP> sodique0o5 <SEP> gm
<tb>
<tb> riboflavine <SEP> 200mcg.
<tb>
<tb>
DL <SEP> methionine <SEP> 200mg <SEP> pantothenate <SEP> calcique <SEP> 200mcg.
<tb>
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Il acide glutamique 200mg thiamine HOl 200go DL threonine 200mg acide nicotinique 200mcg. DL serine 200mg P.1ridoxamin 400mcg.
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<tb> DL <SEP> phenylalanine <SEP> 200mg <SEP> Acide <SEP> para-amino <SEP> benzoique <SEP> 40mcg
<tb>
<tb> DL <SEP> leucine <SEP> 200mg <SEP> Biotine <SEP> 0,4mcg
<tb>
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L histidine 200mg MgSOIo'7H20 200 mg.
Il tryptophane 400mg NaC 1 10 mg.
L arginine 200mg Fes04o7HZO 10 mg. lysine 100 mg MnSOl,H20 10 mgo
EMI5.7
<tb> acide <SEP> amino <SEP> acétique200 <SEP> mg <SEP> @
<tb>
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cystine 200 mg K2HP04 500 mga
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<tb> DL <SEP> norleucine <SEP> 200 <SEP> mg <SEP> KH <SEP> P04 <SEP> 500 <SEP> mg.
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<tb>
<tb>
.1 <SEP> tyrosine <SEP> 200 <SEP> mg <SEP> acide <SEP> folique <SEP> 2mcg.
<tb>
<tb>
<tb> caséine <SEP> hydrolysée <SEP> l.0gm.
<tb>
<tb>
<tb> eau <SEP> jusqu'à <SEP> 500 <SEP> cc.
<tb>
On prépare le milieu de base en combinant les acides aminés, en ajoutant ensuite le dextrose, l'acétate sodique et l'acide fumarique, en chauffant pour dissoudre et en réajustant immédiatement le pH à 7. On ajou-
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te alors l'éthyloxalacétate sodique et les vitamines, on les dissout et on réajuste les solutions au pH 70Finalement, on ajoute les sels, l'acide folique, la caséine hydrolisée, on dissout et on ajoute le pH à 6.6.
On dilue une solution ou suspension aqueuse de l'échantillon à essayer, de sorte que la solution contienne 0.2 unité type de L.L.D. par
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ce. qu'on ajoute alors aux tubes à essai en quantité de 0o5, 1.09 1.5y 200 et 205 CCo On ajuste alors tous les tubes au volume de 205 cc. avec
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de l'eau, on ajoute 2.5 ce. de milieu de base, on tamponne finalement les tubes et on les stérilise en les chauffant à 120 C. pendant 13 minutes
Après refroidissement à la température ambiante, on inocule les tubes au moyen d'une goutte de la suspension standardisée de L.Lactis et on soumet à incubation à 37 C pendant 40 heures. Après l'incubation,, on ti- tre les tubes directement avec de l'hydroxyde de sodium 0,05 N jusqu'à vi- rage au bleu vert du bleu de bromothymol.
On peut déterminer ensuite l'activité de l'échantillon à partir de la courbe standard au moyen de la quantitéd'hydroxyde de soude qui a été nécessaire.
On prépare la courbe standard avec de la vitamine B12 cristalli- sée. Un milligramme de vitamine B12 pure cristallisée contient 11 fois 106 unités. On dilue une solution de réserve et on ajoute 0.0. 0,05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 et 2.0 unités à une double série de tubes.
On ajoute de l'eau pour ajuster le volume à 2.5 ce. On suit pour le stan- dard la méthode décrite ci-dessus pour les échantillons soumis à l'essai.
Les valeurs de titration suivantes sont typiques pour les séries standard énumérées ci-dessus :1.5, 2.0, 2.7, 4.3, 5.7, 6.6, 7.5, 7.9, 8.0 et 8.4 respective- ment, exprimés en millilitres d'hydroxyde de soude 0.05 N nécessaire pour neutraliser l'acide produit par culture de L.Lactis.
Les exemples suivants illustrent les méthodes de réalisation de la présente invention mais on doit comprendre que ces exemples sont donnés principalement en guise d'illustration et non de limitation.
EXEMPLE I.
On a préparé un bouillon de culture en cultivant une variété produisant de la griséine du micro-organisme Streptomyces griseus dans un milieu de culture approprié. On a débarrassé le bouillon résultant de l' organisme propagateur et autre matière solide et on l'a traité au moyen d'un adsorbant comme le carbone. On a lessivé la matière active de l'alpha-picolice. sorbant avec un agent de lessivage tel que la pyridine en solution aqueu- se ou chromatographiquement On a évaporé la lessive jusqu'à un petit volume, on l'a dilué avec de l'alcool méthylique et on a précipité le concentré actif à l'éther. On a alors séché le concentré. Ce concentré séché possé- dait une activité microbiologique d'environ 1500 à 2000 unités de L.L.D. par mg.
On a ajouté 750 gr. de ce concentré séché à environ 2. 5 litres d'alcool méthylique anhydre: On a agité le mélange pendant à peu près 30 minutes et on l'a filtré ensuite. On a alors ajouté environ 2.5 litres d'alcool méthylique anhydre au résidu solide et on a agité et filtré le mélange. On a répété ce processus avec deux portions successives de 2.5 litres d'alcool méthylique anhydre. Les filtrats réunis possédaient une activité microbiologique totale d'environ 1.2 billion d'unités de L.L.D.
On a fractionné a réuni les filtrats réunis, par adsorption sur 7;5 kg d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthy- lique. On a alors passer de l'alcool méthylique à travers la colonne et on a recueilli un certain nombre de fractions de la lessive. On les fractions possédant une activité élevée (généralement au moins 10.000 uni- tés de L.L.D./ml) déterminée microbiologiquement et indiquée habituellement par une coloration rose qu'on a concentrées à environ un dixième de leur volume initial ' une température inférieure à 30 C. et sous une pression moindre que la pression atmosphérique. On a éliminé par filtration une petite quantité de matière blanche insoluble qui s'est formée. On a alors concentré le filtrat sous vide en un sirop épais.
On a ajouté de l'alcool éthylique absolu au sirop et on a éliminé le précipité blanc insoluble qui s'est séparé de la solution . On a ajouté alors un volume égal d'acétone à la solution rouge limpide'dans l'alcool éthylique qui a provoqué la sépa- ration d'un, précipité rouge floconneux de la solution.
On a dissous la matière active précipitée de l'alcool éthylique
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par l'addition d'acétones dans approximativement 2 ml d'eau et on l'a pré- cipité à nouveau sous la forme d'une huile rouge par l, addition d'environ 12 volumes d'acétone. On a. séparé l'huile et on l'a dissoute dans environ 1 ml d'eau et on a traité la solution avec de l'acétone jusqu'à ce qu'on ob- serve un trouble. Après repos la vitamine B12 s'est séparée de la solution sous forme d'amas de petits cristaux rouges en aiguilles.
Exemple¯2.
On a purifié à nouveau un précipité floconneux formé par l'addi- tion d'acétone à la solution rouge limpide dans l'alcool éthylique obtenue comme dans l'exemple l selon le processus suivant. Après lavage du préci- pité avec de l'acétone et séchage, on a obtenu une substance possédant une activité microbiologique d'environ 4 millions d'unités de L.L.D. par mg. ou environ 36% de vitamine B12. On a récupéré une seconde portion possédant une activité analogue par addition à la liqueur mère d'un second volume d' acétone. La nouvelle addition d'acétone à la liqueur mère a entraîné la pré- cipitation d'une huile rouge qu'on a récupérée.
On a traité l'huile au moyen d'un mélange d'alcool éthylique et d'acétone qui a précipité un solide amor- phe rouge possédant une activité microbiologique d'environ 1.5 million d'u- nités de L.L.D. mg. ou environ 13.5% de vitamine B12 qu'on a récupée.
On a réuni les différentes fractions séchées, insolubles dans l' acétone qu'on a dissoutes dans approximativement 4 ml d'alcool méthylique et on a adsorbé la solution sur environ 10 gr. d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographique. On a' ensui- te développé la colonne avec de l'alcool méthylique et une bande rouge fon- cé à traversé la colonne. Dès l'apparition de la couleur rouge dans la les- sive on a prélevé des fractions successives de 10 ml. jusqu'à ce que le li- quide sorte réellement incolore. On a réuni les trois premières fractions contenant la plus grande partie de la couleur rouge qu'on à évaporé à siccité à une pression inférieure à la pression atmosphérique et à une température inférieure à 25 C.
On a dissous le résidu sec dans environ 2 mlo d'alcool méthylique et on a traité la solution avec environ 8 volumes d'acétone provo- quant la séparation d'un précipité rouge amorphe de la solution. On a récu- péré ce précipité par centrifugation et on l'a reprécipité d'une façon simi- laire d'un mélange d'alcool méthylique et d'acétone. Le précipité rouge amor- phe consistait en vitamine B12 dans un état à 50% de pureté approximativement 5 millions d'unités de L.L.D. mg).On a dissous une portion de cette matiè- re (5 mgo sur un total de 21.8 mg.) dans approximativement 0.5 ml. d'eau et on a traité la solution avec environ 5 ml.
d'acétone. Après repos, la vitami- ne B12 s'est séparée de la solution sous forme d'amas de petits cristaux .-ou- ges en aiguilles possédant une activité mierobiologique d'environ 11 millions d'unités de L.L.D. mg. qu'on a récupérés.
.Exemple 3
On a ajouté environ 1388 grammes d'un concentré sec préparé comme la matière de départ de l'exemple l, à partir de produits délaboration d' une variété de Streptomyces griseus produisant de la griséine qui possède une activité microbiologique d'environ 2000 unités de L.L.D. mg., à environ 16 litres d'alcool méthylique anhydre. On a agité le mélange pendant 30 mi- nutes environ et on a filtré. On a adsorbé le filtrat sur environ 15 kg. d' alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographiue. On a ensuite développé la colonne avec de l'alcool méthy- lique et on recueilli un certain nombre de fractions de la lessive.
On a réuni les fractions chromatographiques possédant Inactivité microbiologique la plus prononcée qu'on a concentrée sous vide à environ un dixième de leur volume initial. On a filtré le concentré et on a concen- tré à nouveau le filtrat sous vide en un sirop épais. On a ajouté de l'al- cool éthylique à ce sirop et on a filtré le mélange. On a alors traité le filtrat avec une quantité suffisante d'acétone en agitant pour provoquer la
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précipitation complète de la matière rouge y contenue.
On a recueilli le précipité rouge qu'on a redissous dans environ 100 ml. d'alcool méthyli- que. On a alors versé lentement la solution dans environ un litre d'acé- tone, en agitant. Une matière rouge claire, floconneuse, a précipité dé la solution. On l'a recueillie. Après lavage et séchage du précipité, on a obtenu 7.8 gr. d'une poudre rouge possédant une activité microbiologi- que d'environ 65.000 unités de L.L.D. mg., ou environ 0.6% de vitamine B12.
On note que dans cet exemple la teneur en vitamine B12 du pro- duit obtenu en une étape chromatographique (0.6% de vitamine B12) était beaucoup plus faible que dans les autres exemples et beaucoup plus faible que ce doive être le cas. On a donné cet exemple pour illustrer le fait que le traitement proposé, même lorsqu'il n'est pas conduit pour retirer l'activité maximum du traitement chromatographique, donne un produit qui est beaucoup plus actif que tous les concentrés précédemment connus contre l'anémie pernicieuse, avec lesquels on est familiarisé, et qu'on peut uti- liser pour des fins cliniques sans nouvelle concentration si on le désire.
Les facteurs qui augmentent la teneur en vitamine L.L.D. du produit obtenu dans les étapes chromatographiques proposées, sont en générais (1) accroissement du rapport du poids de l'adsorbant à l'alumine, au poids des solides adsorbés; (2) le soin apporté à éliminer l'eau du concentré adsorbé et du solvant alcoolique utilisé; et (3) soin apporté à choisir le plus puissant facteur.
Exemple 1....
On a dissous dans de l'alcool méthylique 10.0 grammes de concen- tré du type décrit dans l'exemple précédente possédant une activité moyen- ne de 80.000 unités de mg., et on a adsorbé la solution sur environ 500 grammesd'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographique. On a ensuite développé la colonne avec de l'alcool méthylique et on a recueilli des fractions séparées de lessive.
On a sélectionné les fractions possédant une activité microbo- logique prononcée qu'on a réunies et évaporées à siccité sous une pression moindre que la pression atmosphérique. On a extrait le résidu à l'alcool éthylique absolu et on a éliminé la substance blanche qui ne s'est pas dis- soute. On a traité la solution rouge dans l'alcool éthylique avec un excès d'acétone qui a provoqué la séparation d'une huile rouge insoluble. On a récupéré cette huile qu'on a dissoute dans environ 10 ml. d'eau. On a pré- cipité à nouveau la matière active, avec un peu de matière inerte incluse, sous forme d'huile par addition d'un excès d'acétoneo On a redissous la matière rouge hautement active dans environ 3 ml. d'eau et on a traité la solution avec de l'acétone jusqu'à ce que l'on observe un léger trouble.
Après repos, des cristaux en aiguilles de vitamine B12 se sont séparés de la solution.
Exemple 5.
On a extrait à trois reprises 1305 kg. de concentré précipité à l'éther possédant une activité à l'égard de L.L.D. d'environ 2000 unités/ mg., préparé comme dans 1-'exemple l, en agitant pendant 30 minutes avec 13 gal. d'alcool méthylique. On a chromatographié les extraits réunis, dans 17 colonnes ayant chacune six pouces de diamètre et contenant 7,5 kg. d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique. On a développé chaque colonne avec de l'alcool méthylique et on a recueilli une série de fractions.de 1,5 litre de lessive dès l'apparition de la couleur rouge ca- ractéristique de la vitamine B12 dans la lessive.
On a réuni les trois premières de ces fractions de lessive pro- venant de toutes les colonnes, qu'on a évaporé à environ 500 ml. sous pres- sion réduite et à une température inférieure à 30 C. On a débarrassé la so-
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lution par filtration, d'une matière blanche insoluble et on a traité avec de l'acétone jusquà précipitation-essentiellement complète de la couleur rouge sous forme d'une huile rougeOn a éliminé le liquide brun-jaunâtre surnageant.
On a redissous le résidu huileux rouge dans une quantité mini- mum d'alcool méthylique et on a traité à nouveau la solution avec de 1-lacé- tone jusqu 9a précipitation substantiellement complète de la substance acti- ve rougeo On a répété ce processus jusquà ce que le liquide surnageant cons- titué daloool et d'acétone soit substantiellement exempt de couleur brune- jaunâtre.
On a dissous alors le précipité rouge huileux dans une quantité minimum d'alcool méthylique et on a versé lentement la solution obtenue dans 10 volumes d'acétone.On a séparé par filtration le précipité rouge amorphe qui s'est formé, en l'a lavé à l'acétone et on l'a séché sous vide à la température ordinaireoSon activité à l'égard de L.L.D. correspond à environ 5% de vitamine Bl2. L'administration par voie- buccale en une seule dose d' un concentré à 5% en vitamine Bl2, équivalent à 600 microgrammes de vitamine Bl2, a produit une réaction hématologique maximum chez un patient. Chez un' autre, une quantité équivalente à 25 microgrammes injectée par voie intra- musculaire en une seule dose a été active au point de vue hématopodtique.
On a préparé cette substance pour injection en dissolvant le concentré de vitamine B12 dans une solution saline.
@ Exemple 6.
On a préparé un bouillon en cultivant une variété du micro-orga- nisme Etre produisant de la streptomycine, dans un milieu de culture approprié. On a débarrassé le bouillon obtenu de 1-'organisme propaga- teur et autre matière solide et on l'a mis en contact avec une résine échan- geuse dion dont la capacité de'change provienne de groupes carboxyliques grâ- ce auxquels la streptomycine s'est adsorbée sur ladite résine. On a alors trai- té le bouillon dont on a éliminé la streptomycine par du carbone. On a lessivé la matière active de la matière adsorbée par le carbone avec de la pyridine en solution aqueuse, on a évaporé la lessive à un petit volume et on a précipité le concentré actifavec de l'éther. On a séché le concentré.
On a broyé le concentré solide sec précipité à l'éther, qui pos- sédait une activité à 1-'égard de L.L.D. de 2500 unités/ mgo (l'628 grammes, comprenant 700 grammes de matière facilitant la filtration) en une poudre fi- ne qu'on a extraite quatre fois en agitant pendant 30 minutes avec 3500 ml. d'alcool méthylique, et qu'on a filtré. On a chromatographie les extraits dans l'alcool méthylique réunis, sur 15 kg. d'alumine activée et on a lavé la colon- ne avec de l'alcco. méthylique. On a recueilli une série de fractions de 3000 ml. dès l'apparition de la couleur rouge caractéristique de la vitamine B12 dans le liquide sortant.
On a réuni les 5 premières fractions contenant un total de 673 millions d'unités de L.L.D., qu'on a concentrées sous vide à une température inférieure à 40 C jusqu'au volume de 120 mlOn a récupéré la vi- tamine B12 impure en versant la solution dans 120 ml d'acétone; On a séparé par centrifugation le précipité rouge formé, qu'on a lavé avec de l'acétone et qu'on a séché à la température ambianteo On a obtenu une purification plus poussée en dissolvant le solide dans 5 ml. 0 d'alcool méthylique et en ajoutant 25 mo. d'acétone. On a recueilli par centrifugation le précipité formé;, on l' a lavé avec de 1-acétone et séché.Le rendement était de 89.8 mg.
On a dissous le solide rouge ci-dessus dans 3 ml. d'acool méthy- lique et on l'a chromatographie sur 4.5 grammes d'alumine activée.On a lavé la colonne avec de l'alcool méthylique.On a recueilli une série de fractions de trois à quatre ml.lorsque la couleur rouge caractéristique de la vitami- ne B12 est apparue dans la lessivée On a évaporé séparément à siccité les cinq premières d'entre elles, contenant substantiellement toute la couleur rouge, on les a dissous dans environ 3 ml.
d'eau, et on a traité la solution avec de 1-acétone jusqu'à ce qu'elle devienne légèrement trouble. Après un repos de 24 heures, des cristaux rouges en aiguilles se sont formés dans chacun des cinq tubeso On a recueilli les cristaux qu'on a réunis, lavés à 1,'acétone et séchés.Le rendement était de 14.l mgo de vitamine B12 cristal-
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Usée. On a essayé ce produit qu'on a trouvé actif au point de vue clinique.
Les divers produits décrits dans cette spécification, qui possè- dent une activité à l'égard de L.L.D.de 65.000 unités de L.L.D.à 11.000.000 d'unités de L.L.D.par milligramme, conviennent tous pour l'usage clinique.
Il est avantageux de les administrer sous la forme de solutions thérapeu- tiques dans l'eau., de solutions salines, de solutions isotoniques ou simi- laires. Les concentrations désirables de vitamine Bl2 dans ces solutions peu- vent varier dans de larges limites qui dépendent des exigences des cas in- dividuels.