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PERFECTIONNEMENTS RELATIFS A LA DEGRADATION DU DEXTRANE.
La¯présente invention se rapporte à la dégradation du dextrane.,
On peut utiliser très avantageusement le dextrane dégradé (ou partiellement dépolymérisé) comme substituant essentiel de produits de rem- placement du plasma sanguin et d'autres fluides thérapeutiques. On peut obtenir le dextrane lui-même grâce à l'action de micro-organismes, tels que ceux appartenant à la famille des leuconostoques sur le surcrose pur. Le destrane ainsi obtenu est constitué par des macro-molécules d'hydrate de carbone de dimensions différentes, chacune de ces molécules étant elle-même constituée par un agrégat de molécules individuelles ayant la composition C6H10O5.
Ces'macro-molécules sont très grandes, et pour rendre possible l'utilisation d'un dextrane dans un produit de remplacement du plasma san- guin ou pour d'autres injections dans le corps animal, il est nécessaire de réduire ces macro-molécules à une dimension ou à un poids moléculaire in- férieur. En outre, on sait que de telles macro-molécules de dimension exces- sive sont incompatibles avec les conditions que présente le courant sanguin humain et que celles présentant des dimensions excessivement réduites peuvent provoquer des effets nuisibles sur'certains organes, en particulier les reins.
Par conséquent, il était nécessaire-jusqu'à présent de traiter le dextrane dégradé,après sa dégradation en vue de réduire ses dimensionsmoll[culaiess moyennes, pour éliminer à la fois les molécules de. dimension insuffisamment réduite et celles qui étaient trop petites.
Bien qu'il soit difficile de mesurer avec précision les poids moléculaires des différents dextranes, on peut déduire les dimensions et le poids moyen des molécules de la viscosité relative d'une solution de dextra- ne. Sous ce rapport, on doit mentionner qu'il n'est pas certain,si le dex- trane forme une solution véritable ou s'il se trouve en dispersion colloï- dale dans le solvant.
Au cours de la présente description, le terme "solu- tion" se rapporte aussi bien à un dextrane dissous qu'à un dextrane èn dis-
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persion colloïdal
On en tend par le terme "viscosité relative" (pour autant qu'il est utilisé dans la présente description), le rapport de la viscosité ciné- matique d'une solution de 6 g de dextrane dans 100 cm3 d'eau distillée à
37 C, exprimée en centistokes, à la viscosité cinématique de l'eau distil- lée à la même température en utilisant des tubes viscosimètres en U corres- pondant au N 1 ou 2 de la norme britannique t'British Standard Specifica- tion". La viscosité relative du dextrane avant dégradation est élevée et peut être de l'ordre de 8000 Pour son utilisation particulière comme pro- duit de.remplacement du plasma sanguin,
le dextrane doit avoir une visco- sité relative faible comprise de préférence entre 2,7 et 8. Dans cette gam- me relative de viscosité, le dextrane est éminemment approprié à l'usage in- tra-veineux et peut être utilisé comme-véhicule pour l'injection de produits pharmaceutiques intra-dermiques ou infra-musculaires. Pour ce dernier usage, le dextrane peut, cependant, présenter une viscosité relative quelque peu plus élevée, bien qu'encore faible, comme par exemple 20.
Jusqu'à ce jour, on a réalisé couramment la dégradation grâce à l'hydrolyse acide. On a utilisé également l'hydrolyse alcaline, mais celle-ci est moins facile à effectuer et à régler que l'hydrolyse acide.
En outre, on a proposé d'utiliser la dégradation par les enzymes qui com- porte également une hydrolyse. Tous ces procédés hydrolytiques donnent un produit dégradé dont les molécules varient largement en poids, et il est nécessaire de faire intervenir un traitement ultérieur. Par suite de ce traitement, une proportion notable du dextrane initial est éliminée et per- due.
Conformément à la présente invention, on effectue. la dégrada- tion en utilisant la pyrolyse, c'est-à-dire en chauffant le dextrane de ma- nière à provoquer la rupture des liaisons les plus faibles et, en particu- lier, des liaisons hydrogénées dans les grandes molécules .
Il est'bien connu que l'application excessive de la chaleur à n'importe quelle-molécule-d'hydrate de carbone, soit à l'état humide à n'importe quel pH, soit à l'état sec, donne lieu à une destruction oxydante.
Cette destruction se manifeste par la formation d'oxyaldéhydes et'd'acides qui se combinent ensemble pour donner des substances polymérisées de couleur foncée que l'on appelle les caramels. Conformément à la présente invention on empêche la destruction oxydante massive en effectuant le procédé sous des conditions non oxydantes. Il est évidemment également nécessaire de ne pas utiliser une température élevée.
On peut effectuer cette pyrolyse ou dégradation thermique de plu- sieurs manières. On peut ainsi transformer le dextrane en poudre que l'on peut chauffer à l'état sec ou en suspension dans un liquide chimiquement iner- te. Cependant, on chauffe de préférence le dextrane en solution aqueuse tout en maintenant le pH entre 7,00 et 7,05, c'est-à-dire en maintenant la solution à un état aussi voisin que possible de la neutralité, ce que l'on peut réaliser . en ajoutant une substance tampon à la solution.
Dans cettetgamme de pH, augune-ac- tion hydrolytique importante ne peut se produire et la dégradation est pres- que totalement pyrolytique. Ce fait est important étant donné que l'action hydrolytique occasionne la scission au hasard du dextrane, catalysée par la présence d'ions hydroxyl et hydrogénés, ce qui a pour conséquence que les molécules dégradées présentent des poids très différents. Grâce à la présen- te invention, on peut cependant supprimer en grande partie cette scission au hasard, de sorte que la rupture se fait de préférence sur des liaisons fai- 'bles d'un espacement plus régulier, susceptibles dé subir la rupture'thermi- que. En conséquence, on peut contrôler bien plus efficacement la dégrada- tion et on perd moins de dextrane.
Bien que l'on effectue de préférence la dégradation de manière qu'il ne puisse pas ou presque pas se produire d'hy- drolyse, il est possible de traiter une solution correspondant à une gamme plus étendue de pH, si on le désire, gamme allant d'environ 6,5 à 9,5, tout en réalisant la plus grande partie de la dégradation grâce à une rupture ther- mique. Il ne se présente que de faibles inconvénients à procéder du côté
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alcalin de la neu@ alité, tandis que du côté acide, la régularité du poids moléculaire se perd rapidement à mesure que le pH s'abaisse,de sorte qu'il est hautement désirable d'éviter d'utiliser un pH inférieur à 7.
Lorsqu'on chauffe le dextrane sous la forme de solution aqueuse, il peut être présent en une concentration allant jusqu'à 50%. L'utilisation de solutions très diluées est peu économique et des solutions très concentrées sont visqueuses et on ne les chauffe pas facilement d'une manière uniforme.
On préfère utiliser des solutions aqueuses ayant une concentration d?au moins 12 % en poids/volume, et mieux encore une concentration de 20 à 30 %. Cela représente un avantage important par rapport au procédé d'hydrolyse acide qui est pratiquement limité à l'utilisation de solutions aqueuses dont la concentration est considérablement inférieure à 12 % en poids/volume.
Au lieu d'incorporer une substance tampon à la solution, on peut régler son pH à un taux suffisant pour éviter qu'il s'écarte de la gamme dé- sirée.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, la température de chauffe est située de préférence entre 115 et 230 C. On peut utiliser des témpératures inférieures à 115 C; mais alors la pyrolyse est extrêmement lente et, par conséquent, ilvaut mieux travailler à 140 C ou davantage.
On peut utiliser des.températures supérieures à 230 C, mais une limite supé- rieure s'impose du fait que le dextrane charbonne lorsqu'on le chauffe à une température par trop élevée, et des considérations pratiques rendent indési- rable d'utiliser une température supérieure à 200 C.
En général, lorsqu'on utilise une solution aqueuse de dextrane d'une concentration de 20 à 30% en poids/volume, on constate que, pour obte- nir un produit quelque peu homogène, il est nécessaire d'utiliser un taux de réaction faible mesuré d'après le rapport viscosité relative: temps.
On a avantage à opérer sous des conditions qui ne sont-non seu- lement oxydantes, mais,également réductrices. Le sulfite de sodium consti- tue un agent réducteur particulièrement utile, bien que l'on.puisse utiliser d'autres agents réducteurs , qu'ils, soient - solides, liquides ou gazeux. On cité cornue exemples d'agents réducteurs solides d'autres sulfites métalliques, le sulfure métallique, l'aluminium en poidre, l'hydroquinone et le pyrogal- lol. Le fer-carbonyle est un exemple d'un agent réducteur liquide et le dioxyde de soufre un exemple d'un agent réducteur gazeux. Evidemment, l'a- gent réducteur que l'on choisit ne doit pas réagir chimiquement avec le dex- trane sous les conditions qui existent lors de la dégradation.
Lorsqu'on utilise des conditions non oxydantes et non réductrices,on peut chauffer le dextrane sous forme de poudre et en solution au sein d'une atmosphère inerte constituée, par exemple, par de la vapeur, par de l'azote ou par de l'h[lium,ou encore au sein de l'air, dont on a éliminé la plus grande par- tie de l'oxygène.
Lorsqu'on met en oeuvre la présente invention de la manière pré- férée, en utilisant comme agent réducteur le sulfite de sodium, on peut uti- liser du dextrane dégradé comme constituant essentiel d'un produit de rempla- cement du plasma sanguin. En d'autres'termes? il n'est pas nécessaire d'uti- liser une précipitation fractionnée et 'les molécules du dextrane dégradé sont au contraire toutes d'un poids moléculaire approprié. Sous ce rapport, les produits obtenus grâce à la mise en oeuvre du procédé préféré se distinguent du dextrane obtenu par dégradation hydrolytique..
On va décrire maintenant, à titre non limitatif, un certains nom- bre d'exemples de mise,en oeuvre du procédé conforme à la présente invention.
EXEMPLE 1.
Cet exemple se rapporte au mode opératoire préféré pour la mise en oeuvre,de l'invention. On précipite du dextrane macro-moléculaire à par- tir d'une liqueur de fermentation en ajoutant un volume égal d'acétone.' On décante le liquide surnageant de la matière gommeuse, puis on dissout celle-ci dans de l'eau en introduisant avec précaution de la vapeur vive dans le dex-
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trane en vue de f, .-mer une solution contenant 12% en poids/volume 'de dex- trane. On ajoute à cette solution 25% de sulfite de sodium anhydre / 20%
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de bicarbonate de sodium et 2 % de carbonate de calcium (ces pouréanta-. ges étant pris en poids par rapport au dextrane).
On ajoute le sulfite et le bicarbonate sous forme de solutions concentrées et le carbonate de calcium insoluble sous forme d'unepâte épaisse. On procède ensuite à la:- digestion du mélange dans un récipient agité à double enveloppe à une tem- pérature d'environ 110 C pendant une heure, une dégradation n'intervenant pratiquement pas à cette température. On ajoute le bicarbonate de sodium pour neutraliser l'acide produit initialement dans le dextrane pendant la' digestion et on ajoute le carbonate de calcium pour neutraliser l'acide pro- duit au cours des dernières phases de la digestion. On élimine l'acétone qui.reste dans la gomme et le dioxyde de carbone gazeux en procédant à une ventilation des vapeurs que l'on contrôle fréquemment.
A la fin de 'la di- gestion, on ajuste le pH à 7,00, en utilisant du phosphate monosodique, qui sert'comme tampon pour maintenir également le pH sensiblement à 7,00.
On verse le mélange qui présente, dans cet état, une viscosité relative de 300 dans un autoclave et on le chauffe à une température de 160'0 C sous une pression de vapeur de 4,9 à 5,6 kg/cm2. On mesure l'abaissement de la viscosité à des temps espacés, la réaction étant arrêtée après 20 heures, lorsque la viscosité est tombée à 4,48. L'abaissement de la visco- sité relative est représenté sur le tableau ci-après :
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<tb> Viscosité <SEP> relative
<tb>
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Après chauffage pendant 2 heures ................. 146.
Il il 6 Il ....0... *...... *. 41,3 " il fi 10 Il l6,l fi Il fi 12 Il ................. 7,00 Il Il Il 15 Il 61/' , il fi Tl 17 " ................. z50
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<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 20 <SEP> Il <SEP> ................. <SEP> 4,,50
<tb>
Pour purifier le produit, on filtre le mélange dégradé et on précipite le fil- trat avec de l'acétone jusqu'à ce que la matière non constituée par du dextra-
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ne soit sufisamment éliminée, le dextrane étant redissous dans de l'eau après chaque précipitation. Après une filtration finale et une évaporation pour chasser toutes traces d'acétone, on obtient une solution claire comme l'eau de dextrane présentant la viscosité désirable de 4,50.
On prépare un produit de remplacement du plasma sanguin en ajus- tant à 7 le pH d'une solution à 6% en poids/volume d'un dextrane après avoir ajouté 0,9% en poids/volume de chlorure de sodium. On hydrolyse ensuite la solution et elle est prête à l'usage.
EXEMPLE 2.
Cet exemple se rapporte au chauffage d'une solution sous des con- ditions non oxydantes et sans la présence d'agent réducteur. On chauffe une solution aqueuse à 12% en poids/volume de dextrane contenant du carbonate de calcium à concurrence de 20% en poids/ poids du dextrane dans un autocla- ve, tout en agitant, à 150 c, l'air et par conséquent, l'oxygène qu'il con- tient étant chassés par l'échappement de vapeur au début du processus. On prend soin d'ajuster le pH de la solution par l'addition d'acide sulfurique aussi près que possible de 7,00, et on chauffe au total pendant 24 heures, temps après lequel on ajuste le pH par intervalles à la neutralité et on prend des échantillons de la solution afin de s'assurer de la progression de la dégradation.
Après ce traitement, la viscosité relative qui était initia- lement de 800 tombe à 3,65.
Après l'isolement et l'élimination des impuretés de ce produit, on prépare un produit de remplacement du plasma sanguin en ajustant la con- centration à 6% en poids/volume et le pH à 7,00 et en ajoutant 0,9 % en poids/
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volume de cnlcrur- de sodium? le mélange obtenu étant finalement stérili- sé dans un autocïave.
EXEMPLE 3.
Cet exemple est une variante de l'exemplé 2, dans laquelle on utilise un agent réducteur. On réduit le carbonate de calcium à 10% en- poids/poids et on ajoute 20% en poids/poids de sulfite de sodiumpuis on chauffe pendant 9 heures seulement tout en maintenant le pH dans là gamme allant de 6,8 à 7,1. A la fin dé la réaction,, la viscosité relative du produit a une concentration de 6% en poids/volume et de 4,2 pour une valeur initiale de 800. Le produit que l'on obtient ainsi en présence d'un'agent' réducteur est moins coloré que celui de l'exemple précédent qui se trouvait exposé à l'action de l'oxygène atmosphérique pendant le temps nécessaire peur prélever des prises pour mesurer le pH.
EXEMPLE 4.
Cet exemple se rapporte à la dégradation d'une poudre sèche.
On prépare tout d'abord une solution de dextrane et on ajoute'du sulfite de sodium en une quantité correspondant à 25% en poids/poids du dextrâne, et on ajuste le pH de la solution à 7,00 en ajoutant de l'acide sulfurique.
On sèche le mélange dans un four sur des plateaux peu profonds à 110-120 C, ce qui abaisse la viscosité de 800 à environ 50, c'est-à-dire qu'une cer- taine dégradation se produit pendant le séchage. Le pH reste fixe à 7,00 et il ne se produit pas de coloration sauf une légère couleur jaune pâle.
Le dextrane séché se présente sous la forme de flocons que l'on réduit'dans un broyeur à l'état de poudre fine et que l'on soumet à un nouveau chauffa- ge de 45 minutes dans un four tournant, à chauffage électrique et à-réglage thermostatique à une température de 160 C. On redissout la poudre dans l'eau et on constate que la viscosité relative est de 4,80. Après isolement et pu- rification du produit, on prépare un produit de remplacement du plasma san- guin en ajoutant une solution de 0,9 % en poids/volume de chlorure de sodiun à une solution à une solution à 6 % en poids/volume du produit et en ajustant le pH du mélange à 7,000 On stérilise ensuite cette solution dans un auto- clave. - - - .
On peut aussi chauffer le produit en poudre par un certain nombre d'autres moyens en chambre chaude, comme par exemple par les radiations infra- rouges ou par l'effet de l'électricité à haute fréquence.
EXEMPLE '5
Cet exemple se rapporte au chauffage d'un produit en poudre au sein d'un liquide inertao On sèche une dispersion aqueuse à 12% en poids/ volume de dextrane contenant 20 % en poids/poids de sulfite de sodium à un pH compris entre 7,0 et 7,2 et on le pulvérise. On disperse ensuite la poudre dans la paraffine purifiée ayant un point d'ébullition de 200 C et on la chauffe pendant 90 minutes à 150 C, puis on la laisse déposer. On dé- cante la paraffine et on lave le résidu avec de l'acétone. Finalement, après dispersion dans 1?eau distillée, 'on purifie le produit comme dit, ci-dessus et on constate que la viscosité relative d'une solution aqueuse à 6% en poids/ volume s'est abaissée, de 400 à 3,5.
Il est bien entendu qu'il est difficilement possible d'éliminer les dernières traces d'humidité du dextrane pulvérisé ou d'exclure les moin- dres traces d'humidité d'un récipient de réaction. Les faibles quantités d'humidité qui sont nécessairement présentes pendant le chauffage de la pou- dre desséchée technique suffisent pour fournir les radicaux nécessaires pour se fixer'sur les liaisons interrompues des molécules de dextrane de grande dimension.