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M. von LILLIENSKIOLD, résidant à DORMAGEN Rheinland (Allemagne).
PERFECTIONNEMENT AU PROCEDE DE PREPARATION DE PRODUITS DE DECOMPOSITION DE
LA DEXTRANE.
L'invention concerne un procédé de préparation de la dextrane d'un poids moléculaire compris entre 104 et 4 x 105, à usage pharmaceutique, en particulier sous forme dissoute pour injections, telle qu'on l'obtient par fermentation de solutions de sucres et hydrolyse des solutions de dextrane obtenues.
Pour obtenir, à partir de la dextrane, un produit facile à dis- soudre et pouvant servir en particulier sous forme d'injections intra-vei- neuses, il est nécessaire de la dépolymériser partiellement. Ce résultat peut être obtenu de diverses manières, par exemple par hydrolyse acide (voir Sta- cey & Yound, Bioohem, Journal 32, 1943-1945, (1938) et le brevet américain n 2.565.507) par hydrolyse alcaline (voir le brevet allemand n 836.704) et par décomposition enzymatique (voir le brevet allemand n 837. 007, le brevet français n 1.015.147 et le brevet autrichien n 172.062).
De plus, il est nécessaire d'obtenir à partir de l'hydrolyse mo- léculairement dispersée des molécules d'une grosseur telle qu'elles ne pas- sent pas trop vite dans le rein, ni, en raison de leur poids moléculaire trop élevé, donnent lieu à des manifestations secondaires indésirables, tel- les qu'un accroissement de dépression sanguine et une accumulation. De pré- férence, les poids moléculaires considérés comme satisfaisants sont compris entre 25. 000 et 200.000.
Or, un procédé universellement connu permet de séparer les corps de poids moléculaire élevé, polydispersés au moyen d'un mélange d'un solvant et d'un agent non solvant en deux fractions de poids moléculaires différents, dont la moins soluble a le poids moléculaire le plus élevé.
Les principes théoriques de cette précipitation fractionnée ont été étudiés par G. V. Schulz (voir Journal Phys. Chem. A, 179. 321-355 (1937).
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Ce procédé a été appliqué plus tard par H.J. Staudinger au glycogène (voir Makromal, Chemie 2,89 (1948) et par Schoch aux amidons (voir Journal Am.
Chem. Soc. 64., 2957-2961, (1942). Une dissertation de G.Swift, Birmingham, 1946, pages 93-94, donne pour la première fois la description d'un procédé de fractionnement de la dextrane par l'alcool. Ce procédé a été appliqué en- suite dans la technique, et le fractionnement par l'acétone a été décrit par exemple dans le brevet américain n 2. 565.507 et principalement par l'al- cool dans le brevet suisse n 282.873, dans le brevet anglais n 673.103, dans le brevet français n 1.015.148 et dans le brevet autrichien n 172.943.
La précipitation fractionnée de la dextrane donne lieu à la for- mation de deux phases liquides, dont la séparation par décantation ou siphon- nage dure plusieurs jours.
Suivant l'invention, on accélère notablement le traitement de la dextrane décomposée en n'effectuant pas la séparation des phases liquides de poids spécifiques différents par l'action de la pesanteur, mais en l'ef- fectuant au moyen de séparateurs, lorsqu'il s'agit de quantités importan- tes, on emploie des séparateurs diviseurs et pour les petites quantités, des séparateurs décanteurs. Dans certains cas, il convient de faire passer l'ef- fluent du séparateur diviseur dans un séparateur décanteur.
Pour gagner du temps, il est avantageux d'employer une combinai- son des deux séparateurs, en ne conservant pas le faible débit de passage ordinaire dans le séparateur diviseur, mais en rendant légèrement trouble la phase légère par une circulation plus rapide et en faisant disparaître ce trouble dans un séparateur décanteur. Les traces de la phase lourde res- tant alors dans le tambour du séparateur décanteur et peuvent être réunies à l'effluent sortant à la partie inférieure du séparateur diviseur ou mieux, introduites dans un nouveau mélange à fractionner. On sépare ainsi des fractions de poids moléculaire intermédiaire qu'on désire obtenir, non seu- lement les fractions de poids moléculaire trop faible, mais encore les frac- tions de poids moléculaire trop élevé.
Dans l'un des cas, on utilise direc- tement les fractions lourdes et dans l'autre, les fractions légères, tan- dis qu'on fait subir de nouveau à la phase inutilisable l'opération de pré- paration. En choisissant une cloison de séparation appropriée dans le sépa- rateur, on peut obtenir la couche supérieure ou la couche inférieure indé- pendamment l'une de l'autre.
L'agent non solvant peut être ajouté à la solution aqueuse de dextrane à la température ambiante et la centrifugation peut s'effectuer à cette température. Mais, de préférence, on précipite d'abord partiellement la solution aqueuse à la température ambiante par l'addition de l'agent non solvant, on la chauffe jusqu'à ce qu'elle soit de nouveau dissoute, et elle ne subit la centrifugation qu'une fois refroidie. On peut aussi ajouter l'a- gent non solvant à chaud, et refroidir la solution ensuite. En principe, la centrifugation peut s'effectuer à n'importe qu'elle température inférieure au point de séparation d'une phase liquide du mélange de solvants, cepen- dant, la température ambiante est la plus avantageuse, étant donné qu'il est avantageux d'effectuer la centrifugation à température constante.
On peut accélérer la vitesse de refroidissement par un refroidissement artificiel et, par suite, effectuer la centrifugation peu de temps après avoir ajouté l'agent non solvant.
L'invention concerne les applications industrielles ainsi que les applications pharmaceutiques,,en particulier sous forme dissoute de la dextrane convenant aux injections, d'un poids moléculaire compris entre 104 et 4 x 105 et préparée par fermentation de solutions de sucres et par hydrolyse acide de la solution de dextrane obtenue.
Suivant l'invention, on prépare ces solutions en séparant la dextrane brute obtenue par fermentation de solutions de sucre et par préci- pitation par l'alcool des solutions fermentées, en la broyant en particules très fines, en la faisant gonfler par l'acide chlorhydrique, de préférence
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de 1 à 10 % ou par une solution d'eau oxygénée de préférence à 0,15 % et en hydrolysant les gels ainsi obtenus par addition d'eau et chauffage. La décomposition par l'eau oxygénée s'effectue extrêmement vite à une tempé - rature comprise entre 40 et 90 C et la vitesse de décomposition augmente avec la température. Cependant, on ne dépasse pas de préférence la tempé- rature d'ébullition du liquide pour empêcher la dextrane de se colorer par caramélisation.
De plus, il convient de maintenir le pH de la solution à une valeur égale à 7, par exemple en ajoutant des alcalis ou sels alcalins pour neutraliser les acides qui se forment, par exemple l'anhydride carbo- nique. On surveille d'une manière continue, en déterminant la viscosité, la décomposition de la molécule, de même que par les procédés de décomposi- tion connus par l'acide chlorhydrique. Dès qu'on a obtenu la viscosité qu'on désire, on peut empêcher la décomposition de continuer par addition d'agents réducteurs, par exemple de glycose ou d'acide ascorbique.
Puis on fractionne le produit de l'hydrolyse.
Pour préparer la matière première, on ajoute d'une manière con- nue à des solutions de sucres bruts, par exemple à 12 %, des sels nutritifs et on les ensemence avec des bactéries appropriées, par exemple une culture pure de Leuconostoc mésentéroides et on les fait fermenter pendant trois jours, par exemple à 25 C. On précipite par l'alcool la dextrane brute ain- si formée, on lave le précipité par l'alcool pour ledéshydrater dans la plus large mesure, on le broie, on le sèche et on le broie encore une fois en particules extrêmement fines.
EXEMPLE 1.-
On ajoute à 82 litres d'une solution de dextrane à 8 % obtenue en dissolvant la dextrane brute dans HCl à 0,056 N, d'une viscosité rela- tive = 2,96, à une concentration = 3,63 %, 60 litres d'alcool à 93 %. La solution se trouble à 48 C On la refroidit pendant 45 minutes en l'agi- tant avec de l'eau, et on lui fait subir une centrifugation = à 18 C, à une vitesse de 60 litres par heure. La viscosité relative de la dextrane contenue dans la phase légère est égale à 4,33 à une concentration de 5,96 % en solution aqueuse, tandis que la viscosité relative de la frac- tion de poids moléculaire élevé = 9,14 avec un résidu de 6,01 %.
EXEMPLE 2.-
On fait subir à une solution de dextrane à 5 % d'une viscosité relative = 8,8, l'action de dextranase du Celvibric fulva jusqu'à ce que la valeur ait diminué à 4,1 puis on la chauffe à 6l C, on ajoute de l'al- cool, jusqu'à ce qu'elle se trouble légèrement on la chauffe jusqu'à ce que le trouble ait disparu et on la refroidit à la température ambiante.
On sépare les deux phases ainsi obtenues dans un séparateur du type Laval.
La vitesse de passage étant de 60 litres à l'heure,la phase légère ne comporte pas de gouttelettes en suspension. En la précipitant par un excès d'alcool, on obtient un précipité d'une viscosité relative = 2,6 à une con- centration = 5,9 %.
EXEMPLE 3.-
On chauffe une solution de dextrane en grande partie de faible poids moléculaire dans l'alcool aqueux qu'on a obtenu en séparant la dex- trane de faible poids moléculaire, par fractionnement, de solutions de dextrane polydispersées dissoutes dans HCl, jusqu'au point d'ébullition et on y ajoute de l'alcool jusqu'à ce qu'elle se trouble légèrement. Après re- froidissement, il ne se forme qu'une faible quantité de la phase lourde. On fait passer le mélange simplement dans un séparateur-décanteur et on ob- tient un effluent limpide, d'une viscosité relative = le 42 seulement à une concentration de 6,04 %. La viscosité relative de la phase qui reste dans le tambour = 2,51 à une concentration de 5,90 %.
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EXEMPLE 4.-
On ajoute à chaud de l'alcool à une solution de dextrane obtenue par dissolution dans l'acide chlorhydrique, d'une viscosité relative = 3,61 avec un résidu de 5,97 % et qu'on avait débarrassée par fractionnement an- térieur de la majeure partie des hauts polymères, jusqu'à ce qu'un faible trouble commence à apparaître à 80 C. Après refroidissement, on sépare la solution à l'aide d'un séparateur. La viscosité relative de la phase lour- de, après élimination de l'alcool, est égale à 5,86 à une concentration de 5,95 %. On fait subir une nouvelle centrifugation à la phase légère pour la rendre limpide et sa viscosité relative en solution aqueuse est égale à 2,48 avec un résidu de 6,23 %.
EXEMPLE 5. -
On continue à décomposer par hydrolyse par l'acide chlorhydrique une fraction de dextrane de poids moléculaire trop élevé. On ajoute à la so- lution à 7 % d'une viscosité relative de 3,63 à une concentration de 5,68 %, une quantité d'alcool suffisante pour que le mélange commence à se troubler à 40 C. Après avoir refroidi le mélange à la température ambiante, on le sépare dans un séparateur-diviseur. La phase légère n'est pas encore abso- lument limpide et on la rend limpide à deux reprises au moyen d'un sépara- teur-décanteur. La viscosité de la dextrane contenue dans la phase lourde est égale à 6,73 à une concentration de 5,79 % tandis que celle de la dextra- ne de la phase légère est égale à 3,54 à une concentration de 5,99 %.
EXEMPLE 6. -
On hydrolyse pendant 50 minutes à 84 C une solution de dextrane d'une viscosité relative = 8,91 à une concentration de 6,0 % dans une solu- tion de HC1 à 0,34 %. La viscosité de la solution une fois neutralisée = 4,55 à une concentration de 5,75 % et on y ajoute à une concentration de 7 Bx mesurée au moyen d'un réfractomètre, une quantité d'alcool suffisante pour faire apparaître un trouble à 49 C. On la refroidit à 13 C et on la sépare en deux phases dans un séparateur-diviseur. La couche la plus légè- re peut être rendue complètement limpide par une seconde opération et con- tient de la dextrane d'une viscosité relative de 3,01 à une concentration de 5,95 %, tandis que la viscosité relative de la dextrane de la couche in- férieure est égale à 6,25 à une concentration de 5,85.
EXEMPLE 7 . -
On fait bouillir pendant 7 heures une dextrane de viscosité relative = 8,15 à une concentration de 5,9 % dans une solution de NaOH à 10 % jusqu'à ce que la viscosité de la dextrane ait diminué à 5,3 à une concentration de 5,76 %. Puis on la neutralise et on la précipite dans l'alcoolOn ajoute à une solution à 8 % de cette dextrane d'une viscosité relative = 5,30 avec un résidu de 5,76 % et à une température de 56 C, une quantité d'alcool suffisante pour faire apparaître un trouble intense. De ce fait, la température s'est abaissée à 49 C.
On lui fait prendre en l'a- gitant et en la refroidissant une température de 19 C Puis on la sépare en deux phases au moyen d'un séparateur-diviseur et on resépare à deux reprises la phase légère qui contient les molécules de grosseur convenant aux applications pharmaceutiques au moyen d'un séparateur-décanteur. La viscosité relative de la dextrane de la couche légère = 2,46 dans l'eau à une concentration de 5,76 % et celle de la dextrane de la couche lourde = 8,75 à une concentration de 5,98 %.
EXEMPLE 8.-
On décompose la dextrane brute par chauffage dans une solution d'eau oxygénée à 0,15 % à une viscosité relative = 2,85 à une concentra- tion de 3,23 %. On ajoute à la solution à 59 C en agitant une quantité d'alcool suffisante pour faire apparaître un trouble très intense et pour faire descendre la température à 51 C. On la chauffe jusqu'à ce que le
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trouble disparaisse, et après refroidissement à la température ambiante on la sépare au moyen d'un séparateur et on rend la phase légère complètement limpide par une seconde opération. La viscosité relative de la dextrane con- tenue dans cette phase = 2,63 en solution aqueuse à une concentration de 6,03 %, tandis que la viscosité de la phase lourde = 8,91 à une concentra- tion de 6,00 %.
EXEMPLE 9.-
On dissout dans l'eau à la température ambiante 21,47 kg de dex- trane brute contenant 92,33 % de substance sèche = 19,83 kg de dextrane sè- che dans 350 litres d'eau et on y ajoute 1, 275 % H2O2, proportion calcu- lée d'après celle de la dextrane sèche. On élève la température à 60 C en 40 minutes et on maintient la solution à cette température.
La solution ini- tiale titre 5,0 Bx, son pH = 7 et sa viscosité relative est de :
EMI5.1
<tb> Au <SEP> bout <SEP> de <SEP> 120 <SEP> minutes <SEP> 14,6
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<tb> " <SEP> " <SEP> 180 <SEP> " <SEP> 10,4
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<tb> 0 <SEP> il <SEP> 300 <SEP> " <SEP> 4, <SEP> 65 <SEP>
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<tb> " <SEP> " <SEP> 360 <SEP> " <SEP> 3,90
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<tb> " <SEP> " <SEP> 480 <SEP> " <SEP> 2,76
<tb>
L'eau oxygénée est consommée entotalité; on règle le pH de la solution à une valeur = 7 au moyen de NaOH et on la fait bouillir EXEMPLE 10. -
On dissout à 20 C 24,17 kg de dextrane brute = 21,75 kg de dex- trane sèche dans 450 litres d'eau.
On ajoute 1,3 H2O2, on élève la tempe- rature à 80 C et on maintient la solution à cette température à un pH = 7.
Sa viscosité relative est égale à :
EMI5.2
<tb> Au <SEP> bout <SEP> de <SEP> 90 <SEP> minutes <SEP> 10,9
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> 120 <SEP> " <SEP> 6,86
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> 120 <SEP> " <SEP> 5,40
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> 170 <SEP> " <SEP> 4,72
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> 190 <SEP> " <SEP> 4,02
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On interrompt la décomposition oxydante par l'addition de 500g de glucose. On règle son pH à une valeur = 7 au moyen de Na2CO3 et on fait bouillir la solution.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.