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PROCEDE POUR L'OXYDATION MICROBIOLOGIQUE DE STEROIDES.
L'invention a trait à un procédé pour l'oxydation microbiologique de stéroïdes et a pour objet la préparation de certains dérivés oxydés de séroïde, avec des procédés particulièrement avantageux pour obtenir ces dérivés. Ces dérivés oxydés de stéroïdes, en particulier les dérivés llahydroxy de stéroïdes du groupe comprenant les 3-oxo-20-cé to-pregnenes et les 3-oxy-20-cé to-pregnenes, sont des intermédiaires pour la préparation d'hormonescorticales et/du d'autres produits utiles.
Il a été établi que des stéroides peuvent être transformés en les dérivés oxydés (en particulier les sté roï des non-'substitués en position 11 en les dérivés lla-hydroxy) en les soumettant à l'action d'enzymes d'un caractère oxydant d'aspergillus en la présence d'oxygène. L'action des enzymes peut être utilisée soit en faisant réagir ensemble, dans un milieu aqueux, le sté roï de, l'oxygène et les enzymes S cellules non-proliférantes de l'aspergillus,soit, de préférence, en incorporant le stéroide dans une culture aérée de l'aspergillus.
Les espèces oxydantes d'aspergillus utilisables dans la pratique de l'invention comprennent, entre autres, l'aspergillus niger, l'aspergillus amstelodami, l'aspergillus nidulans et l'aspergillus désigné sous la référence A.T.C.C. Il,267 (ce nombre représentant l'identification donnée au microorganisme lors du dépôt à la American Type Culture Collection, Washington, D. C.). De préférence, la tension de l'aspergillus niger utilisé est celle identifiée sous la référence "Wisc. (Wisconsin) 72-2", ou son équivalent, la dérivation de cette tension étant décrite par Perlman, Kita et Peterson dans Arch. of Biochemistry, volume II, p. 123 (1946).
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D'une manière générale, les conditions de culture de l'aspergillus pour les buts envisagés par 1'invention sont (à l'exception de ce qui se
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passe pour l'inclusion du stéroïde à oxyder) les mêmes que celles de la culture de microorganismes pour la production d'autres métabolites, par exem- ple l'acide citrique; ainsi l'aspergillus niger est développé au contact d'un agent nutritif approprié (dans ou sur cet agent) en la présence d'oxygène (air). Un agent nutritif approprié comprend essentiellement une source de facteurs azotés et une source assimilable de carbone et d'énergie.
Cet agent peut être un hydrate de carbone (tel que sucrose, mélasses, glucose, maltose, amidon ou dextrine), et/ou le stéroïde lui-Sine. Cependant, de préférence, l'agent comprend une source assimilable de carbone et d'énergie en sus du stéroïde; et de préférence également, cette source est au moins une partie essentielle d'un membre du groupe comprenant (1) des acides gras ayant au moins 14 atomes de carbone et (2) des graisses. L'emploi de cette source lipoïde de carbone et d'énergie.(en particulier l'emploi d'une huile graisseuse) est avantageux en raison du fait qu'il enrichit l'utilité du stéroide en vue de la transformation envisagée.
Parmi les graisses utilisables pour le but de l'invention, on peut citer : l'huile qui provient du lard, l'huile de soja, l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile d'arachide, l'huile de coco, l'huile de grain, l'huile de ricin, l'huile de sesame, l'huile brute de palme, le suif de la graisse de mouton, l'huile de spermaceti, l'huile d'olive, la tristearine, la tripalmitine, la trioleine et la trilaurine. Parmi les acides gras utilisables pour le but de l'invention, on peut citer : l'acide stéarique; l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide linoléique et l'acide myristique.
La source des facteurs azotés peut être organique (par exemple farine de soja, liqueur d'une infusion de grains, extrait de viande et/ou des produits solubles de distillerie) ou synthétique (par exemple en étant constituée par des composés simples, organiques et inorganiques susceptibles de synthèse, tels que des sels d'ammonium, des azotates alcalins, des acides aminés ou l'urée).
Parmi les stéroïdes qui peuvent être transformés en les dérivés oxydés utiles par la pratique de l'invention, il faut citer ceux de la série des 3-oxo (ou oxy)-20-céto-pregnenes (ou pregnanes) et de la série des 3-oxo (ou oxy)-17-céto (ou bydroxy)-androstenes (ou andostranes), la série des 4-pregnene-3,20-diones (notamment la progesterone et la 11-desoxy-17- hydroxycorticosterone, ou l'acétate de ces composés) étant préférée.
Ces stéroïdes sont indiqués à titre d'exemple par la progesterone, la 16a-hydro-
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xyprogesterone, la l'a-hydroxyprogesterone, la 11-désoxy-17-hydroxycorticos- térone (composé S de Reichstein), l'acétate de ll-désoxy-17-hydroxycorticos- térone, la désoxycorticostérone, l'acétate de désoxycorticostérone, la pregnanolone, la ¯ 5-pregnenolone., la 3-succinyl- ¯ 5-pregnenolone, la
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anârostenedione-3,17,16-déhydroprogesterone et la testosterone. à où un groupe hydroxy oxydable est présent dans le stéroïde et où son oxydation possible n'est pas désirée, ce groupe peut être transformé en un grou- pe résistant à l'oxydation et susceptible de reconversion en un groupe hydroxyle; par exemple un ester, un éther ou un groupe halogéné.
Les exemples qui suivent sont uniquement donnés pour illustrer à titre d'exemple divers modes de mise en oeuvre de l'invention (toutes les températures de fusion (M.P.) étant en centigrades et toutes les rotations spécifiques étant dans le chloroforme à moins d'indication contraire).
EXEMPLE I (a) Fermentation.-
On prépare un milieu ayant la composition suivante : solides provenant d'une liqueur d'une infusion de grains 3 g.
Nh4H2PO4 3 g.
CaCO3 2,5 g.
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huile de soja 2,2 g. progestérone 0,20 g.
Eau distillée quantité pour faire un litre le pH du milieu est réglé à 7,0 ¯ 0,1 (avec une solution d'hydroxyde de so- dium); et 100 ml. de portions du milieu sont réparties dans 500 ml. de bal- lons Erlenmeyer, et les ballons sont bouchés avec du coton et sont stérili- sés à l'autoclave pendant 30 minutes à 120 . Lorsque les ballons sont froids, chacun d'eux reçoit 5 à 10% d'un ensemencement végétal de aspergillus niger (Wisc. 72-2; voir Perlman, Kita et Peterson, Arch. of Biochemistry, vol. II, p. 123, 1946) également D.A. Kita, thèse de bachelier es-sciences, univer- sité de Wisconsin, 1944), obtenu comme décrit ci-après.
Les ballons sont soumis à une agitation mécanique pendant 72 heures dans une chambre mainte- nue à 25 ; puis le contenu des ballons est refroidi, est réglé à un pH 4,0 ¯ 0,2 avec de l'acide sulfurique et est filtré par succion à travers des tampons filtrants Seitz. (L'ensemencement végétal utilisé est développé à partir de cultures sur souches (fiole lyophilisée ou plantes d'agar) pen- dant 24-72 heures (avec ou sans périodes successives de 24-72 heures) dans un milieu ayant la composition suivante : 15 g. de solides provenant d'une liqueur d'une infusion de grains, 10 g. de sucre brun, 6 g. NaNO3, 0,001 g.
ZnSO4, 1,5 g. KH2PO4 anhydre, 0,5 g. MgSO4,7H2O, 5 g. CaC03, 2 g. d'huile provenant de lard, et de l'eau distillée en quantité suffisante pour faire un litre, le milieu étant stérilisé à l'autoclave pendant 30 minutes à 120 .
(b)Extraction de produits d'oxydation.
1880 ml. d'un filtrat de culture obtenu comme décrit en a sont épuisés avec 4 parties de 1 litre de chloroforme et l'extrait au chloro- forme (combiné) est filtré et est évaporé jusqu'à siccité dans le vide. Le résidu est repris dans 15 ml. de méthanol (aqueux) à 80 %, et la solution résiduelle est épuisée avec 4 parties de 15 ml. d'hexane (qui élimine les impuretés graisseuses). La solution de méthanol est alors concentrée sous un faible volume et est épuisée avec 3 parties de 20 ml. de chloroforme.
L'extrait au chloroforme (combiné) est séché sur du sulfate de sodium et est évaporé jusqu'à siccité, en laissant un résidu (environ 411 mg. ) qui cristallise en le laissant reposer.
(c) Séparation des constituants I et II.
Le résidu (contenant des constituants désigné comme I et II) est dissous dans de l'acétone chaude, puis on le laisse cristalliser. Le constituant I (une dihydroxyprogesterone) est difficilement soluble dans l'acétone et par suite se sépare de la solution, alors que le constituant II (lla-hydroxyprogesterone) reste dans la liqueur-mère. Après répétition de la cristallisation quatre fois par redissolution du résidu cristallisé dans de l'acétone chaude puis en laissant cristalliser (en recueillant la liqueur-mère chaque fois), le constituant I est obtenu sensiblement pur avec un rendement d'environ 8 mg. Lors de la recristallisation dans de l'éthanol à 95%, le constituant I a les propriétés suivantes :M.P. environ 250-2530 (par capillarité); Ó )23 + 100 (c. 0,28); U.V., # alc.max. 236 m/u @ 15.000) ; . R.
D 2,98/u(0) , z89 max. 6,04 = 15.000); I.R. Nujol 2,98 u (OH), 589 u (20-cétone), et 6,04 u ( ¯max. 4-3-cétone); analyse (calculée pour C21H30O4; C, 72,80; H, 8,73) C. 72,66, et H. 8,75. Ces indications représentent le constituant I comme étant une dihydroxyprogesterone, probablement la 6,11a-=dihydroxyprogestero- ne (oxydation avec l'acide chromique fournit une tétracétone et l'acétyla- tion fournit un diacétate, montrant que les deux groupes hydroxy sont se- condaires).
(d) oxydation du constituant I pour une tétracétone.
A une solution de 550 mg. de la dihydroxy-progesterone (I)
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obtenue cone décrit en c dans 4 ml. d'acide acétique glacial, on ajoute 31,3 mg. d'acide chromique dans 3 ml. d'acide acétique. Après avoir fait reposer à la température ambiante-pendant 1/2 heure, 1 ml. d'alcool est a- jouté et la solution est concentrée jusqu'à siccité dans le vide. Le rési- du est repris dans 2 ml. d'eau et 15 ml. de chloroforme et la phase de chloroforme est lavée avec une solution diluée de bicarbonate de sodium, puis avec de l'eau. Après séchage sur du sulfate de sodium, le solvant est évaporéjusqu'à siccitédans le vide,laissant un résidu (pesant environ 55,6 mg.), qui cristallise au contact du frottement avec de l'acétone.
Le résidu cristallisé est dissous dans 2 ml. de benzène et est adsorbé dans une colonne d'alumine lavée à l'acide sulfurique (lg.); puis la colonne est soumise à une élution avec du benzène (10 fractions, formant au total 250 ml.),fournissant environ 40 mg. de cristaux d'un jaune clair. Après deux recristallisations dans un mélange acétone-hexane, le produit (une té- tracétone) a les propriétés suivantes : M.P. environ 144 - 146 ; ( Ó )23 + 143 (c, 0,87); U.V., alc.max. 249 m/u ( = Il.500); # 2%max. KOH dans du méthanol 255 m/u ( c 9.800), 370 m/u ( #= 8.900); analyse (calculée pour c21lH26o4 : C. 73,66; H. 7,65) C. 73,77 et H, 7,66.
Le spectre d'absorption, qui précède est caractéristique des 3,6- ¯ 4-endiones, et l'un des groupes hydroxyles du constituant I est par conséquent en position -6. Le second groupe hydroxy du constituant I est indiqué comme étant en position lla par les contributions à la rotation moléculaire faite par ce groupe hydroxyle dans le constituant I ( ¯ (M)D = -10 ), par le groupe acétoxy correspondant dans le diacétate de 1 (-37 ) et par le groupe céto dérivé du précédent par oxydation pour donner la tétracétone précitée (+ 407 ). Les contributions des groupes lla-hydroxy, lla-acétoxy et 11-céto, lorsqu'ils sont attachés à la progesterone, sont (M)D - 16 , -51 et +302 , respectivement.
(d alternatif) Acétylation du constituantI.
18,3 mg. de la dihydroxyprogesterone (I) obtenue comme décrit en c est acétylée par traitement avec 1 ml. de pyridine et 1 ml. d'anhydri- de acétique pendant 16 heures ; les agents d'acétylation sont éliminés par évaporation dans le vide ; etle résidu (pesant environ 24 mg. ) est cristal- lisé dans un mélange éther-étbylique-hexane. Le produit (un diacétate de la formule C25H3406) a les propriétés suivantes ; M.P. environ 154-155 ; ( Ó )23 + 80,6 (c., 0,92); analyse (calculée : c, 69,74; et H, 7,96) C, 69,74 et H. 8,09.
(e) Isolement de la 11a-hydroxyprogesterone (constituant II)
Toute la liqueur-mère provenant de la cristallisation du con- stituant I (voir section c) est combinée et est dissoute dans 2 ml. de chlo- roforme et 4 ml. de benzène; et la solution est soumise à une chromatogra- phie sur une colonne de 6 g. d'alumine lavée à l'acide sulfurique. La colon- ne est soumise à une élution avec 150 ml. d'un mélange de 1 partie de chlo- roforme et de 2 parties de benzène, et les solvants sont évaporés dans le vide, fournissant environ 163 mg. d'une fraction cristallisée qui est puri- fiée par cristallisation dans un mélange acétone-éther.
Le produit, la lla- hydroxyprogesterone, a les propriétés suivantes : M.P. environ 166-167 ; (Ó)22 +177,5 (c.1,22); U.V., # alc. 241 m/u (#-17.000); I.r., D max.
# Nujol 2,91 /u (OH), 5,85 u (20-cétone) et 5,97 /u ( 4-3-cétone); analyse (calculée pour C21H30O3:C. 76,33; H. 9,16) C. 76,12 et H. 9,28.
Le produit n'est pas identique à la 11 ss -hydroxyprogesterone connue, qui fond à 187 - 188 ; il forme un monoacétate; et il peut être oxydé pour don- ner la 11-oetoprogesterone connue.
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(f) Acetylation de la 11a-hydroxyprogesterone.
19,2 mg. de la lla-hydroxyprogesterone obtenue comme décrit en e sont acétylés par traitement avec 1 ml. de pyridine et 1 ml. d'anhydride acétique pendant 16 heures ; agents d'acétylation sont éliminés par éva- poration dans le vide ; et le résidu (pesant envir.on 21,4 mg. ) est cristal- lisé dans un mélange acétone-hexane. Le produit, un acétate de la formule C23H3204, a les propriétés suivantes : M.P. environ 172-174 ; analyse (calculée : C.74,16; H. 8,66) C. 73,91, et H. 8,50 et ( Ó (23 + 1550 (c.
0,379).
(f alternatif) oxydation de la 11a-hydroxyp[rogesterone pour obtenir la 11- cétoprogesterone.
8,5 mg. d'acide chromique dans 2,5 ml. d'acide acétique gla- cial sont ajoutés à une solution de 20,8 mg. de lla-hydroxyprogesterone ab- tenue comme décrit en dans 2 ml. d'acide acétique glacial. Après avoir laissé reposer à la température ambiante pendant 1 heure, 1 ml. d'alcool est ajouté et la solution est évaporée jusqu'à siccité dans le vide. Le ré- sidu est repris dans 2 ml. d'eau et 15 ml. de chloroforme, et la phase de chloroforme est lavée avec une solution diluée de bicarbonate de sodium, puis avec de l'eau. Après séchage sur du sulfate de sodium,le solvant est éliminé dans le vide, laissant un résidu (pesant environ 20,4 mg.) qui cris- tallise spontanément.
Le produit (11-cétoprogestérone), lorsqu'il a recris- tallisé dans un mélange acétone-hexane (ou dans l'éther) a les propriétés suivantes : M.P. environ 170-171,5 (capillarité); ( ) 23 + 276 (c., 0,29), + 229 (c., 0,52 dans l'acétone). Fuchs et Reichstein, Helv., 23, 684 (1940) ont indiqué que la 11-cétoprogesterone fondait à 173-175 (bloc) et ( Ó) 14 + 238,4 (acétone) Un exemple de 11-cétoprogesterone préparée
D à partir de la corticostérone suivant le procédé de Fuchs et Reichstein et fondant à 170,5 - 172 , avait ( Ó) 23 + 221 (c. 0,51 dans l'acétone).
D
Lorsque cet échantillon est mélangé avec de la 11-cétoprogesterone obtenue comme décrit ci-dessus, le point de fusion est d'environ 169-172,5 ; et les spectres dans l'infra-rouge de ces 11-cétoprogesterone préparées dans des conditions différentes sont identiques à tous égards.
EXEMPLE 2
Un milieu ayant la composition suivante est préparé : 3 g. de so- lides provenant d'une liqueur d'une infusion de grains ; 2go d'huile de soja ; 3 g. NH4H2PO4; 0,15 g. d'acétate de 17-hydroxy-11-désoxycorticostérone; et la quantité d eau distillée pour faire 1 litre, le pH du milieu étant réglé à 6 avec une solution d'hydroxyde de sodiumo 50 ml. de ce milieu sont répartis dans 250 ml. de ballons d'Erlenmeyer et les ballons sont obturés avec du coton et sont stérilisés à la manière usuelle (à l'autoclave).
Lors- que les ballons sont froids, chacun est ensemencé avec 2 % d'un ensemence- ment végétal d'aspergillus niger (Wisc. 72-2) qui s'est développé sur le même genre de milieu mais sans le stéroide pendant 72 heures, et les bal- lons sont maintenus à 25 sur un agitateur mécanique pendant 48 heures. A- près incubation, le contenu des ballons est refroidi et est épuisé trois ,fois avec un volume égal de chloroforme. La présence d'un dérivé oxydé du substrat de stéroïde dans l'extrait de chloroforme est indiquée par un es- sai par le procédé chromatographique à cloison de papier-filtre de Zaffaroni et autres (Science, vola III, p. 6, 1950) (système toluène-propylène-gly- col), le dérivé oxydé ayant une mobilité égale ou analogue à celle de la hydrocortisone.
EXEMPLE 3
Dans les mêmes conditions de fermentation que celles décrites dans la section a de l'exemple 1,à l'exception du fait que la teneur en prohesterone du milieu est 0,5 g. par litre et que l'organisme d'ensemence-
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ment est l'aspergillus type A.T.C.C. 11,267, et, en utilisant les mêmes pro- cédés d'épuisement, de séparation et d'isolement que ceux décrits dans la section b et suivantes de l'exemple 1, la 6,lla-dihydroxyprogesterone et la lla-hydroxyprogesterone sont obtenues dans le même ordre de pureté et de rendement.
EXEMPLE (a) Fermentation.
Les mêmes conditions de fermentation que celles décrites dans la section de l'exemple 1 sont employées à l'exception du fait que la 11- désoxy-17-hydroxycorticosterone (composé S de Reichstein) est incorporée avec une teneur de 0,50 g. par litre à la place de la progestérone.
(b) Epuisement et séparation des produits d'oxydation.
3100 ml. du filtrat de culture obtenu en a (en se basant sur une fermentation de 1,75 g. du composé S) sont épuisés avec 5 parties de 1,5 litre de chloroforme et l'extrait au chloroforme combiné est filtré et est évaporé jusqu'à siccité dans le vide, la température du liquide qui dis- tille n'excédant pas 40 . Le résidu semi-cristallisé (pesant environ 1,00 g.) est mis en suspension dans 20 ml. de chloroforme chaud, et le précipi- té cristallisé (pesant environ 424 mg.) est séparé par filtration.
Lors de la recristallisation, le produit obtenu ( ¯ 4-pregnene-11a,17a,21- triol-3,20-dione) a les propriétés suivantes : aiguilles prismatiques, M.P. environ 216-219 ; ( Ó) 24 + 117 (c.0,46 dans l'éthanol absolu);
D alc.max. 242 m/u # = 15,000); analyse (calculée pour C21H30O5; C, 69,50, et H. 8,34) C. 69,46 et H 8,390 (c) Isolement d'un autre produit d'oxydation.
La liqueur-mère au chloroforme combiné, obtenue dans b est éva- porée jusqu'à siccité, et le résidu est repris dans un petit volume d'acé- tone. En refroidissant dans un réfrigérateur, un produit cristallisé est obtenu ; et deux recristallisations avec le même solvant fournissent un pro- duit ayant les propriétés suivantes : M.P. environ 248-250 ; ( Ó) 24 +
D 97 (c. 0,50 dans l'éthanol absolu); alc. 241 m/u ( # D 16,000); max. analyse (calculée pour C21HEO5; c. 69,58 et H. 8,34) C. 69,45 et H. 8,53.
Le produit est isomère avec la .6 r-pregnene-11a,17a,21-triol-3,20=dione.
(d) Acétvlation de la 4-=pregnene-11a,17a,21-triol-3,20-dione.
14 mg. de ¯ 4-pregnene-11a,17a,21-triol-3,20-dione (voir sec- tion b) sont acétylés par traitement avec 1 ml. de pyridine et 1 ml. d'anhy- dride acétique pendant 20 heures à la température ambiante. Les agents d'a- cétylation sont éliminés par évaporation dans le vide, le résidu est dissous dans l'éther, et l'éther est laissé s'évaporer spontanément à la température ambiante. Il s'ensuit une cristallisation; et après recristallisation deux fois dans un mélange acétone-éther, le monoacétate est obtenu sous forme de prismes ayant les propriétés suivantes : M.P. environ 205,5-208 ; (Ó)
22 + 117 (c. 0,84); analyse (calculée pour C25H34O7: C.67,25 et H. 7,68)
C. 67,34 et H. 7,67.
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(d alternatif) Oxydation de la ¯ 4-pregnene-11a,17a,21-triol-3,20-dione pour obtenir l'adrénostérone.
Une solution de 27,2 mg. d'acide chromique dans 5,5 ml. d'acide acétique glacial est ajoutée à une solution de 18,0 mg. de ¯ 4-pregnene- lla,17a,21-triol-3,20-dione (M.P. 216-219 ) dans 2 ml. d'acide acétique gla- cial, l'addition étant effectuée en cinq fois sur un intervalle d'une heure.
Après avoir laissé reposer deux nouvelles heures à la température ambiante, 1 ml. d'alcool est ajouté et le mélange est concentré dans le vide pour fai- re un sirop. Le résidu est réparti entre 3 ml. d'eau et 15 ml. de chlorofor- me; et la phase de chloroforme est séparée, et est épuisée à l'eau, puis à une solution de bicarbonate de sodium et à nouveau à l'eau. Le chloroforme est alors évaporé, laissant un résidu cristallisé pesant environ 13 mg; et, après deux recristallisations dans l'alcool, le produit a les propriétés suivantes : M.P. environ 221-225 ; ( ¯ D 24 + 284 (c. 0,51); et l'ana- lyse (calculée pour C19H24O3: C. 75,97 et H. 8,05) C. 75,71 et H. 7,97.
Le produit, l'adrenostérone, ne peut pas se distinguer d'un échantillon authen- tique de ¯ 4-androstène-3,11,17-trione (adrenostérone) préparée par oxy- dation de la cortisone avec de l'acide chromique, en ce qui concerne le point de fusion (aucune dépression lors du mélange), la rotation spécifi- que et le spectre dans l'infra-rouge.
(d alternatif 2) Transformation de ¯ 4-pregnene-11a,17a,21-triol-3,20- dione en l'acétate de cortisone.
100 mg. de 4-pregnene-11a,17a,21-triol-3,20-dione (M. P.216- 2l9 ) sont dissous dans 0,5 ml. de pyridine qui a été séchée entièrement sur BaO, et 0,97 ml. d'une solution de 159,6 mg. d'anhydride acétique dans 5 ml. de pyridine sèche sont ajoutés à la température ambiante. On laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant 12-16 heures, puis le mélange est évaporé jusqu'à siccité dans le vide ; le résidu est repris dans du chloroforme. La solution est épuisée avec de l'acide chlor- hydrique dilué, une solution de bicarbonate de sodium et de l'eau ; le chloroforme est alors éliminé dans le vide.
Le résidu amorphe (pesant en- viron 109 mg.) est dissous dans 2 ml. d'acide acétique glacial et, tout en agitant, une solution de 22 mg. de Cr03 dans 2 ml. d'acide acétique gla- cial est ajoutée goutte à goutte. Après que le mélange de la réaction a reposé à la température ambiante pendant 1 heure, 1 ml. d'alcool est ajouté et le mélange est concentré pour former un sirop. Le sirop est réparti en- tre 3 ml. d'eau et 15 ml. de chloroforme et l'extrait au chloroforme est lavé à l'eau (jusqu'à ce qu'il soit débarrassé du chloroforme), puis avec une solution de bicarbonate de sodium et à nouveau à l'eau. La solution au chloroforme est séchée sur du sulfate de sodium et est évaporée jusqu'à siccité dans le vide, laissant un résidu cristallisé pesant environ 93 mg.
Ce résidu est recristallisé dans l'acétone : le premier produit, pesant environ 51 mg. fond à 237,8 ; et un second produit d'environ 11 mg. est ob- tenu. Après recristallisation deux fois dans l'acétone, le produit (de l'a- cétate analytiquement pur de cortisone) a les propriétés suivantes : M.P.
243-244 , les cristaux tournant à une couleur opaque à 85-90 et ne montrant aucune dépression dans le point de fusion lors de leur mélange avec un é- chantillon authentique d'acétate de cortisone fondant à 242-244 et deve- nant opaque à 84-95 ; ( Ó) 22 + 1680 (c.0,63 dans l'acétone), + 204 (C.0,63) analyse (calculée pour C23H3006 : C. 68,65 et H. 7,46) C. 68,67 et H. 7,54. Le spectre d'infra-rouge du produit est identique à celui d'un échantillon authentique d'acétate de cortisone.
EXEMPLE 5 (a)Fermentation.
Les mêmes conditions de fermentation que celles décrites dans la
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section a de l'exemple 1 sont utilisées à l'exception du fait que l'acétate de ll-désoxy-17-hydroxycorticostérone est incorporé avec une teneur de 0,50 g. par litre à la place de progestérone.
(b) Epuisement du produit d'oxvdationo
EMI8.1
Le filtrat de culture obtenu en .a'par fermentation de 1,9 g. d'acétate de ll-désoxy-17-hydroxycorticostérone est épuisé avec du chloroforme et le chloroforme est éliminé de l'extrait comme décrit dans la section b de l'exemple 4. Le résidu, pesant environ 420 mg., lorsqu'il est traité ultérieurement comme décrit dans cette section b fournit environ 156 mg. de cristaux. Après deux recristallisations avec l'acétone, le produit 4-pregnene lIa,17a,21-triol 3,2-dione fond à 215-218 .
(Du mycélium séché de cette fermentation, l'acétate de ll-désoxy-17-hydroxycorticostérone est récupérable par épuisement avec l'hexane pour éliminer la matière lipoïde, puis avec de l'acétone, l'élimination de l'acétone dans le vide laissant un résidu cristallisé pesant environ 1,35 g.; et la recristallisation du résidu avec de l'acétone fournissant environ 930 mg. du composé pur fondant. à 234-2380).
EXEMPLE 6 (a) Fermentation.
Les mêmes conditions de fermentation que celles décrites dans la section.5!:. de l'exemple 1 sont utilisées, à l'exception du fait que la désoxycorticostérone est incorporée à une teneur de 0,25 g. par litre à la place de progestérone.
EMI8.2
(b) Isolement de leépicorticostérone.
3,58 litres de filtrat de culture obtenu en .si (en se basant sur la fermentation de 1 g. de désoxycorticostérone) sont épuisés avec 4 parties de 2 litres de chloroforme, et les extraits au chloroforme sont refroidis et concentrés, fournissant environ 1,01 g. d'un produit solide amorphe. Ce produit solide est dissous dans 5 ml. de chloroforme et 20 ml. de benzène et la solution est chromatographiée sur une colonne de 30 g. de gel de silice.
L'élution se produit comme suit :
EMI8.3
<tb>
<tb> Eluat <SEP> Volume <SEP> Solides
<tb> fiai.) <SEP> (mg.)
<tb> Chloroforme-benzène <SEP> (1:4) <SEP> 300 <SEP> Traces
<tb> Chloroforme-benzène <SEP> (1:1) <SEP> 500 <SEP> Traces
<tb> Chloroforme <SEP> 400 <SEP> Traces
<tb> Acétone-chloroforme <SEP> (1: <SEP> 9) <SEP> 340 <SEP> Traces
<tb> Acétone-chloroforme <SEP> (1:4) <SEP> 850 <SEP> 670,2
<tb> Acétone-chloroforme <SEP> (1:1) <SEP> 525 <SEP> 103,2
<tb> Acétone <SEP> 250 <SEP> 19,5
<tb>
Les produits solides ayant subi une élution avec le mélange acétone-chloroforme (1: 4) cristallisent aisément sous forme de barreaux à partir de mélanges acétone-éther, ou sous forme de prismes à partir d'acétate d'éthyle, ayant les propriétés suivantes :
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M.P. 153-154 ;
( al ) 22,5 + 168 (c. 0,7); analyse (calculée pour cZlH3o 4;
D C. 72,80 et H. 80,73) C. 72,90 et H. 8,76. Le produit est la ¯ 4-pregnene-
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11a,21-diol-3,20-dione, telle quelle est préparée par la transformation suivante.
(c) Transformation en l'acétate'de déhvdrocorticostérone.
Une portion de 34,3 mg. de ¯ 4-pregnene-11a, 21-diol-3,20-dione obtenue comme décrit dans la section b est dissoute dans 1,0 ml. d'une so- lution de 114,0 mg. d'anhydride acétique dans 10,0 ml. dans de la pyridine sèche. Après avoir laissé reposer la solution à la température ambiante pen- dant 12-16 heures,les solvants sont éliminés par concentration dans le vi- de ; et le résidu est dissous dans du chloroforme, est lavé avec de l'acide chlorhydrique dilué, une solution de bicarbonate de sodium et de l'eau, et est séché sur du sulfate de sodium. La solution est alors concentrée jusqu'à siccité et l'acétate-21 brut est dissous dans 1,5 ml. d'acide acétique gla- cial. 1,1 mlo d'une solution de 53,3 mgo d'acide chromique dans 5,0 ml. d'a- cide acétique est ajouté.
Au bout de 35 minutes, un ml. de méthanol est a- jouté et la solution est concentrée jusqu'à siccité dans le vide, puis le résidu d'un vert sombre est repris dans du chloroforme et de l'eau, et la phase claire de chloroforme est lavée avec une solution de bicarbonate de sodium et à l'eau puis est séchée sur du sulfate de sodium. Le chloroforme est alors évaporé, laissant environ 36,9 mg. d'un résidu sirupeux qui com- mence à cristalliser spontanément. Le produit est recristallisé avec un mélange d'acétone et d'éther, fournissant 18,6 mgo d'aiguilles se ramollis- sant à 169 et fondant à 172-177 . La recristallisation avec la même paire de solvants élève le point de fusion à 177,5 - 179 .
(Un échantillon au- thentique d'acétate de déhydrocorticostérone fond à 178 - 179,5 ; il n'y a pas de dépression dans le point de fusion d'un mélange; et les spectres dans l'infra-rouge des deux produits sont identiques.) Le produit présente les propriétés supplémentaires suivantes :(Ó) 22 + 239 (c. 0,5) ; analyse (calculée pour C23H3005 : C. 71,46 et H. 7,84) C. 71,54 et H. 7,99.
EXEMPLE 7 (a) Fermentation
Les mêmes conditions de fermentation que celles décrites dans la section a de l'exemple 1 sont utilisées, à l'exception du fait que la 17a-hydroxy-progesterone est incorporée avec une teneur de 0,25 g. par li- tre à la place de la progestérone.
(b) Epuisement et isolement de produits d'oxvdationo
Le filtrat de culture obtenu en .Si (en se basant sur la fermen- tation de 1 g. de 17a-hydroxyprogestérone) est épuisé avec du chloroforme comme décrit dans la section b de l'exemple 4. Le résidu, pesant environ 514 mg., est dissous dans du chloroforme et la solution est chromatographiée sur 15 g. de silice. Le chromatogramme subit une élution avec 1300 ml..d'un mélange de 5 % d'acétone dans du chloroforme et les solvants sont-évaporés, laissant environ 245 mg. de cristaux incolores, qui sont recristallisés avec un mélange acétate d'éthyle-hexane.
Le produit, qui est isomère avec la 11a, 17a-dihydroxyprogestérone décrite ci-après et est supposé être la 17a-méthyl- D-homo- ¯ 4-androsténe-11a, 17a-diol-3,20-dione (composé X)' a les propriétés suivantes : M.P. 261-262 ; ( Ó) 3 + 46 (c. 0,74); analyse (calcu- lée pour C21H30O4: C. 72,80 et H. 8,73) C 72,92 et H. 8,840
Une nouvelle élution du chromatogramme avec 550 ml. d'acétone à 10% dans du chloroforme et une évaporation des solvants fournissent envi- ron 150 mg. d'un produit cristallisé.
Lors de la recristallisation avec un mélange acétate d'éthyle-éther, le produit est obtenu sous forme de plaques incolores ayant les propriétés suivantes M.P. 219-221 ; (Ó) 22 + 87
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(c.0,57); et analyse (calculée pour C21H30O4 : C. 72,80 et H.8,73) C. 73,11 et H. 8,70. Le produit est la lla, 17a-dihydroxyprogestérone telle qu'elle est préparée lors de son oxydation pour former la # 4-pregnene-17a-ol- 3,11,20-trione connue.
(c) Oxydation du composé X.
24,3 mg. du composé X sont oxydés avec 15 mg. d'anhydride chro- mique dans de l'acide acétique glacial, et le mélange de la réaction est re- pris comas décrit dans la section de l'exemple 6 et le produit est cris- tallisé avec un mélange acétone-éther. La 11-cétone ainsi obtenue sous for- me de plaques incolores a les propriétés suivantes : M.P. 238-242 ; ( Ó) 22 + 121 (co 0,48); et analyse (calculée pour C2lH2804 C,73,23 et H.
8,19) C. 73,33 et H. 8,34.
(d) Oxydation de la 11a,17a-dihydroxyprogestérone.
37,9 mg. de lla,17a-dihydrqxyprogestérone sont oxydés avec 20 mg. d'anhydride chromique comme décrit précédemment et les produits d'oxy- dation sont cristallisés avec un mélange acétate d'éthyle-éther sous forme de tétrahedrone incolore ayant les propriétés suivantes :-M.P. 232-235 ; ( Ó)22 + 186 (c. 0,33); et analyse (calculée pour C21H28O4: C. 73,23 et H. 8,19) C. 73,24 et H. 8,37. Le point de fusion et la rotation spécifi- que concordent avec les indications rapportées par Kritchevsky et autres, J.A.C.S. 74, 483 (1952).
(d alternatif) Acétylation de 11a,17a-dihydroxyprogestérone.
22,1 mg. de lla,17a-dihydroxyprogestérone sont acétylés par trai- tement avec 0,5 ml. de pyridine et 0,5 ml. d'anhydride acétique à la tempé- rature ambiante pendant 18 heures. Les agents d'acétylation sont éliminés par évaporation dans le vide et le résidu cristallisé est recristallisé -dans un mélange acétone-éther, fournissant de larges prismes ayant les pro- priétés suivantes :M.P. 205-208 ; ( Ó) 24 + 65 (c.0,61); et analyse (calculée pour C23H32O5 :C. 71,10 et H. 8,30) C. 71,01 et H. 8,16.
EXEMPLE 8 (à) Fermentation.
Les mêmes conditions de fermentation que celles décrites dans la section de l'exemple 1 sont utilisées, à l'exception du fait que l'asper- gillus type A.T.C.C. 11,267 est employé à la place du aspergillus- niger et que la 17a-hydroxyprogestérone est incorporée, avec une teneur de 0,25 g. par litre, à la place de la progestéroneo (b) Epuisement de produits d'oxydation.
Le filtrat de culture obtenu en a (en se basant sur la fermen- tation de 875 mg. de 17a-hydroxyprogestérone) est épuisé avec du chlorofor- me comme décrit dans la section Il de l'exemple 1 et le chloroforme est éli- miné, laissant un résidu d'environ 536 mg. Le résidu est dissous dans le chloroforme et la solution est chromatographiée sur 15 g. de silice. L'élu- tion avec 300 ml. de chloroforme élimine environ 35 mg. de sous-produits non identifiés; une nouvelle élution avec 200 ml. de 5 % d'acétone dans du chloroforme élimine environ 20 mg. du composé D-homo décrit dans l'exemple
7;
et une élution avec 1500 ml. de 10 % d'acétone dans du chloroforme éli- mine environ 410 mg. du produit primaire de lla,17a-dihydroxyprogestérone, fondant à 215-219 et ayant ( Ó) 24 + 87 (c. 0,52),
D
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EXEMPLE 9 (a) Fermentation.
Les mêmes conditions de fermentation.que celles décrites dans la section a de l'exemple 1 sont utilisées, à l'exception du fait que la 5pregnenolone est incorporée, avec une teneur de 0,50 g. par litre, à la place de la progestérone.
(b) Epuisement et isolement de produits d'oxydation.
Le filtrat de culture obtenu en a (en se basant sur la fermenta-
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tion de 1 g. de A 5-pregnenolone) est épuisé avec du chloroforme - cpmme dé- crit dans la section b de l'exemple 1, fournissant 169 mg. d'un produit de stéroïde exempt de graisse. Le produit est dissous dans la ml. d'un mélange de chloroforme et de benzène dans les proportions 1:3, et la solution est chromatographiée sur 4 g. d'alumine lavée à l'acide sulfurique. L'élution du chromatogramme avec 150 ml. d'un mélange chloroforme-benzène (1: 1) et l'évaporation des solvants fournissent environ 40 mgo de lla-hydroxyproges- térone, et après recristallisation dans un mélange acétone-éther, le pro- duit fond à 156-159 et a ( Ó) 24 + 171 (c. 0,52).
D
Une nouvelle élution du chromatogramme avec 150 ml. de chlorofor- me puis l'évaporation du chloroforme fournissent environ 75 mg. d'un pro- duit (probablement la 6,lla-dihydroxyprogestérone) qui, après recristalli- sation dans l'acétone, fond à 247-250 et a # alc. 235 m/u ( = max.
14,000).
La ¯ 5-pregnenolone non oxydée peut être récupérée en épuisant le mycélium sec avec du chloroforme, en éliminant le¯chloroforme dans le vide, en maintenant en suspension le résidu dans l'hexane, en filtrant les
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cristaux résulta"% (pesant environ 654 mg.), et en recristallisant dans l'acétone. La àl -pregnenolone récupérée fond à 186-190 et à ( o: ) D 2+ + 24 (c.l,4).
EXEMPLE 10
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Utilisant le procédé décrit dans les sections n et ¯b de l'exem- ple 4, mais avec l'aspergillus.type AoToCoCo 11,267 comme organisme de fermentation à la place du aspergillus niger, on obtient 582 mg. de cristaux insolubles dans le chloroforme et ayant les propriétés suivantes : M.P. 216-
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219 ; ( 0<.) 23 + 117 (c. 1,00 dans l'éthanol absolu); et l'analyse (calculée pour CzlHp05 : Co 69,58 et Ho 8,34) C. 69,88 et H. 8,090 Le produit, après recristallisation dans l'acétone montre dans l'infra-rouge un spectre identique à celui de la L1 4-pregnene-lla,l7a,21-triol-3,20-dione authen- tique.
EXEMPLE11
Dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 10, mais en faisant fermenter la 11-desoxy-17-hydroxycorticostérone avec une teneur de 1 g. par litre, on obtient, en partant de 1 g., un rendement de 467 mgo de
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-pregnene-lla,17a,2l-triol-3,20-dioneo
EXEMPLE 12 Dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 10, mais en
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utilisant l'acétate de 11-desoxy-17-hydroxycorticostérone$ on obtient un rendement d'environ 204 mg. de 6. 4-pregnene-l1a,17a,21-triol-3,20-dioneo
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EXEMPLE 13
Dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 12, -mais en doublant la durée de fermentation, on obtient un rendement d'environ 220
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mgo de d 4-pregnene-lla,17a,21-triol-3,20-dione.
EXEMPLE 14
Dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 4,.mais en utilisant un mélange brut de saponification de 11-désoxy-17-hydroxycorti- costérone, on obtient environ 589 mgo de ¯ 4-pregnene-lla,17a,21-triol- 3,20-dione.Le mélange brut de saponification pour l'addition à 2 litres du milieu est préparé en mettant en suspension 1,0 go de ll-désoxy-17hydroxycorticostérone dans un mélange de 47 ml. de méthanol et d'une solution de 700 mgo de bicarbonate de potassium dans 13 ml. d'eau, puis en agitant la suspension pendant 18 heures à la température ambiante dans un ballon bouché.
EXEMPLE 15
Dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 4, mais en incorporant le stéroïde avec une teneur de 0,25 go par litre et en utilisant le microorganisme aspergillus amstelodami à la place du aspergillus niger, environ 383 mg. d'un produit stéroïdal sont obtenus à partir de
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0,5 gag de 11-désoxy 17-hydroxycorticostéronee Ce produit est repris dans 10 ml. de chloroforme et le précipité cristallisé (pesant environ 164 mg.) est récupéré par filtration et est recristallisé dans l'acétoneo Le produit fond à 217-220 et son spectre à l'infra-rouge est identique à celui de la
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4¯pregnene-lla,17a,2l-triol-3,20-dione authentique.
La liqueur-mère au chloroforme est évaporée jusqu'à siccité, est reprise dans un peu d'acétone et est refroidie, et les cristaux qui en résultent (pesant environ 33 mgo) sont recristallisés dans l'acétone. Le produit fond à 248,5 - 250 et son spectre d'infra-rouge est identique à celui du produit décrit dans la section c de l'exemple 4.
EXEMPLE 16
Dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 4,mais en utilisant l'aspergillus nidulans à la place du aspergillus niger, environ 732 mg. d'un produit stéroidal sont récupérés à partir de 1,0 g. de 11-désoxy- 17-hydroxycorticostérone. A partir de ce produit stéroidal, on obtient en-
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viron 571 mg.
de /), 4-pregnene-lla,17a,21-triol-3,20-dionl qui, après re- cristallisation dans l'acétone, fond à 216-219 .et montre le spectre d'infra-rouge correcto
D'autres milieux que ceux décrits dans les exemples qui précèdent peuvent être utilisés pour les buts envisagés dans l'invention, la seule exigence résidant bien entendu dans le fait que ces milieux doivent être aptes à supporter le développement ou la prolifération de l'aspergillus particulier en la présence d'oxygène.
Tout acide citrique obtenu comme sous- produit (comme dans le cas de l'utilisation de sucrose ou de mélasses, par exemple comme partie ou comme tout de la source de carbone et d'énergie), ou tous autres produits précieux obtenus (par exemple des amylases ou des protéinases, peuvent être récupérés suivant les procédés conventionnels pour la récupération de ces produits en partant de cultures d'aspergillus.
Une alimentation appropriée en oxygène (stérile) peut être maintenue pen- dant la fermentation, ce qui peut être effectué suivant le procédé conven- tionnel d'assurer des fermentations en la présence d'oxygène, c'est-à-dire en exposant une large surface du milieu à l'air ou en immergeant une cul- ture aérée. La durée d'incubation peut déterminer le degré d'oxydation avec
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certains substrats de stéroïdes et l'incubation est arrêtée bien entendu lorsque l'agent contient la teneur la plus élevée du produit désiré, ce qui est aisé à déterminer pour chaque sorte de conditions.
Dans les exemples indiqués précédemment, le substrat de stéroïde est incorporé dans l'agent de fermentation avant l'ensemencement avec l'aspergillus ; et, dans un cas de ce genre, le substrat de stéroïde est dissous de préférence dans du chloroforme pour faciliter la manipulation (par exemple 1 mlo de chloroforme pour 100 ml. du milieu), le chloroforme étant éliminé du milieu pendant la stérilisation (c'est-à-dire avant l'ensemencement).
Cependant, le substrat de stérofde peut être ajouté après l'ensemencement et même après que s'est produite une prolifération sensible de l'as- pergilluso Donc le substrat de stéroïde peut être transformé en un produit d'oxydation en amenant en contact commun le stéroïde et l'air dans une suspension aqueuse de cellules non-proliférantes de l'aspergillus ou en amenant en contact commun le stéroïde, l'air et des enzymes de l'aspergillus dans un agent aqueux exempt de cellules.
Ainsi une culture de trois jours d'aspergillus niger proliféré sur le même milieu que celui utilisé dans l'exemple le mais sans la progestérone, est soumise à une centrifugation, est à nouveau mise en suspension dans l'eau distillée, est soumise à une nouvelle centrifugation, est encore mise en suspension dans l'eau distillée ; la suspension est placée dans un flacon; la progestérone (par exemple) est ajoutée ; flacon est agité à 25 pendant 24 heures ; la suspension est filtrée, et la lla-hydroxyprogestérone formée est récupérée par épuisement au chloroforme du filtrat et par un nouveau traitement tel que celui décrit dans les sections b et suivantes de l'exemple 1. D'autres expédients qui sont conventionnels dans la fermentation peuvent être utilisés pour la mise en oeuvre pratique de l'invention.
C'est ainsi que l'aspergillus peut être développé sur un milieu le mieux adapté à sa prolifération, le mycélium peut être séparé du liquide de culture après une prolifération sensible, et le mycélium peut être remis en suspension dans un nouveau milieu contenant le substrat de stéroïde (par exemple le milieu décrit dans l'exemple 1). Egalement le mycelium d'aspergillus peut être utilisé d'une manière répétée, c'est-à-dire que le liquide de culture contenant le dérivé oxydé du stéroïde peut être séparé du mycelium, le premier étant traité pour récupérer ledit dérivé, alors que le dernier est remis en suspension dans une nouvelle quantité du milieu de substrat de stéroïde.
Les dérivés oxydés des stéroïdes obtenus dans la mise en oeuvre pratique de l'invention sont des intermédiaires pour la préparation d'hormones corticales et/ou d'autres produits utiles. C'est ainsi que la llahydroxyprogestérone est convertible en la 11-céto-progestérone connue comme décrit précédemment, aussi bien qu'en l'acétate de cortisone par exemple.
A titre d'illustration, la lla-hydroxyprogestérone peut être réduite par voie catalytique avec du palladium dans de l'acétate d'éthyle pour former la allopregnane-lla-ol-3,20-dione; cette dernière peut être réduite avec de l'hydrure de lithium et d'aluminium en l'allopregnane-3,11a,20-triol; ce dernier peut être traité avec un agent acylant (par exemple un agent d'acétylation) dans des conditions douces pour obtenir le dérivé 3-acyle (par exemple l'acétate d'allopregnane-3,lla,20-triol-3); ce dernier peut être oxydé avec de l'acide chromique pour former la 3-acétoxy-allopregnane-11,20- dione ; et cette dernière peut être convertie, par des procédés décrits dans la technique (par exemple par Rosenkranz, Pataki et Djerassi, J.A.C.S.
73, 4055, 1951),en l'acétate de cortisone. Une telle conversion peut, par exemple, être effectuée en traitant la 3-acétoxy-allopregnane-11,20-dione avec de l'anhydride acétique et de l'acide p-toluène-sulfonique pour obte-
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nir l'acétate de 11'20-dienol de la 3-acétoxy-allopregnane-11'20-d.ione et, sans isolement, être traitée avec un excès d'acide perbenzoïque dans du chloroforme, suivi par saponification avec une solution d'hydroxyde de sodium-2N pour obtenir la allopregnane-3,17a-diol-11,20-dione; cette dernière est bromée dans du chloroforme pour obtenir la 21-bromo-allopragnane-3,17a- diol-11,20-dione;
cette dernière est traitée avec de l'iodure de sodium
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dans de l'aoétone, suivi par de l'acétate de potassium, pour fournir l'acé- tate d'allopregnane-3,17a-21-triol-11,20-dione-21 (composé D de Reichstein); cet acétate est oxydé avec la N-bromo-acétamide pour fournir l'acétate d'al- lopregnane-3,11,20-trione-17a,21-diol-21; cet acétate est bromé et, sans i- solement,est traité avec de l'iodure de sodium pour obtenir l'acétate de ¯ 4-2-iodo-pregnene-17a,21-diol-3,11,20-trione-21;
et cet acétate est traité à son tour avec de la poussière de zinc dans du dioxane et de l'étha- nol pour fournir l'acétate de cortisoneo La ¯ 4-pregnene-lla,17a,21-triol- 3,20-dione est convertible en la adrenostérone connue comme décrit précé- demment, aussi bien qu'en l'acétate de cortisone par exemple, cet acétate faisant l'objet de la section d alternatif 2 de l'exemple 4. La ¯ 4-pre- gnene-11a,21-diol-3,20-dione est convertible en l'acétate de déhydrocor- ticostérone connu tel que décrit précédemment. La 11a,17a-dihydroxyproges- térone est convertible en la # 4-pregnene-17a-ol-3,11,20-trione connue comme décrit précédemment.
L'invention peut être mise en oeuvre avec des variantes sans sor- tir du cadre de cette invention.