CH318813A

CH318813A - Procédé pour l'oxydation microbiologique de stéroïdes

Info

Publication number: CH318813A
Authority: CH
Inventors: Fried Josef; William Thoma Richard; Perlman David; Owen Titus Elwood
Original assignee: Olin Mathieson
Priority date: 1952-04-10
Filing date: 1953-04-10
Publication date: 1957-01-31
Also published as: BE519106A; FR1080612A

Description


  <B>Procédé pour l'oxydation</B>     microbiologique   <B>de stéroïdes</B>    L'invention a pour objet un procédé de pré  paration de dérivés     11a-hydroxylés    de stéroïdes,  par oxydation     microbiologique    de ces stéroïdes.  Ces dérivés 11     a-hydroxylés    de stéroïdes, en  particulier les dérivés 11     a-hydroxy    de stéroïdes  du groupe comprenant les     3-oxo-20-céto-pré-          gnènes    et les     3-oxy-20-céto-prégnènes;    sont des  intermédiaires pour la préparation d'hormones  corticales et/ou d'autres produits utiles.  



  Il a été établi que les stéroïdes non subs  titués en position 11 peuvent être transformés  en les dérivés 11     a-hydroxy    en les soumettant,  en présence d'oxygène, à l'action d'enzymes  d'une espèce oxydante d'aspergillus. L'action  des enzymes peut être utilisée soit en faisant  réagir ensemble, dans un milieu aqueux, le sté  roïde, l'oxygène et les enzymes à cellules non  proliférantes de l'aspergillus, soit, de préférence,  en incorporant le stéroïde dans une culture  aérée de l'aspergillus.  



  Les espèces oxydantes d'aspergillus utilisa  bles dans la pratique de l'invention compren  nent, entre autres, l'aspergillus piger, l'aspergil  lus     amstelodami,    l'aspergillus     nidulans    et l'as  pergillus désigné sous la référence<I>A. T. C. C:</I>  11,267 (ce nombre représentant l'identification  donnée au     microoiganisme    lors du dépôt à -la       American    Type Culture Collection, Washington,    D. C.).

   De préférence, l'espèce d'aspergillus pi  ger utilisée est celle identifiée sous la référence       Wisc.    (Wisconsin) 72-2  , ou son équivalent,  la dérivation de cette espèce étant décrite par       Perlman,        Kita    et     Peterson    dans     Arch.    of     Bio-          chemistry,    volume II, p. 123 (1946).  



  D'une manière générale, les conditions de  culture de l'aspergillus pour les buts envisagés  par l'invention sont (à l'exception de ce qui se  passe pour l'inclusion du stéroïde à oxyder) les  mêmes que celles de .la culture de microorga  nismes pour la production d'autres métabolites,  par exemple l'acide citrique ; ainsi l'aspergillus  piger est développé au contact d'un agent nu  tritif approprié (dans ou sur cet agent) en la  présence d'oxygène     (air).    Un agent nutritif ap  proprié comprend essentiellement une source de  matières azotées et une source assimilable de\  carbone et d'énergie. Cet agent peut être un hy  drate de carbone (tel que sucre, mélasse, glu  cose, maltose, amidon ou dextrine), et/ou le  stéroïde lui-même.

   Cependant, de préférence,  l'agent comprend une source assimilable de car  bone et d'énergie en sus du stéroïde ; et de pré  férence également, cette source est au moins  pour sa partie essentielle un membre du groupe  comprenant (1) des acides gras ayant au moins  14 atomes de carbone et (2) des graisses. L'em-      Aloi de cette source lipoïde de carbone et d'éner  gie (en particulier l'emploi d'une huile grasse)  est avantageux en raison du fait     qu'il    augmente  la quantité de stéroïde.  



  Parmi les matières grasses utilisables dans ce  but, on peut citer: l'huile de lard, l'huile de soja,  l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile d'arachide,  l'huile de coco, l'huile de maïs, l'huile de ricin,  l'huile de sésame, l'huile brute de     palme,    le suif  de la graisse de mouton, l'huile de spermaceti,  l'huile d'olive, la     tristéarine,    la     tripalmitine,    la       trioléine    et la     trilaurine.    Parmi les acides gras  utilisables dans ce but on peut citer : l'acide  stéarique, l'acide .palmitique, l'acide oléique,  l'acide linoléique et l'acide     myristique.     



  La source d'azote peut être organique (par  exemple farine de soja, liqueur d'une infusion  de maïs, extrait de viande et/ou des produits so  lubles de distillerie) ou synthétique (par exem  ple en étant constituée par des composés sim  ples, organiques et inorganiques susceptibles  d'être obtenus par synthèse, tels que des sels  d'ammonium, des azotates alcalins, des acides  aminés ou l'urée).  



  Parmi les stéroïdes non substitués en posi  tion 11, qui peuvent être transformés en lesdits  dérivés     hydroxylés,    il faut citer ceux de la sé  rie- des 3 -     oxo    (ou     oxy)    - 20     -céto-prégnènes    (ou       prégnanes)    et de la série des     3-oxo    (ou     oxy)-17-          c6to    (ou     hydroxy)-androstènes    (ou     andostranes),     la série des     d4-prégnène-3,

  20-diones    (notam  ment la     progéstéronë    et la     11-désoxy-17-hydr-          oxy-corticostérone,    ou l'acétate de ces composés)  étant préférée. Ces stéroïdes sont par exemple  la     progéstérone,    la     16a-hydroxy-progéstérone,     la     17a-hydroxy-progéstérone,    la     11-désoxy-          a        17a-hydroxy-corticostérone    (composé S de  Reichstein), l'acétate de-     11-désoxy-17a-hydr-          oxy-corticostérone,    la     11-désoxy-corticostérone,

       l'acétate de     11-désoxy-corticostérone,    la pré  gnanoloie, la     d5-prégnènolone,    la     3-succinoyl-          d5-prégnènolone,    la     d4-androstène-dione-3,17,     la     16-déhydro-progéstérone    et la testostérone.  Là où un groupe     hydroxy    oxydable est présent  dans le stéroïde, ce groupe peut être transformé  en un groupe résistant à l'oxydation et suscep  tible de reconversion en un groupe hydroxyle    par exemple un ester, un éther ou un groupe       halogéné.     



  Les exemples qui suivent illustrent divers  modes de mise en     aeuvre    de l'invention; tous les  points de fusion     (P:F.)    sont indiqués en degrés  centigrades et toutes les rotations spécifiques  sont mesurées dans le chloroforme, à moins  d'indication contraire.

      <I>Exemple 1</I>    <I>a) Fermentation</I>    On prépare un milieu ayant la composition  suivante  
EMI0002.0041     
  
    Solides <SEP> provenant <SEP> d'une <SEP> liqueur <SEP> d'une
<tb>  infusion <SEP> de <SEP> maïs <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3 <SEP> g
<tb>  NH4H2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 3 <SEP> g
<tb>  CaCO3 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb>  Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,2 <SEP> g
<tb>  Progéstérone <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,20 <SEP> g       Eau distillée : quantité pour faire 1 litre.  



  Le<I>pH</I> du milieu est réglé à 7,0   0,1 (avec  une solution d'hydroxyde de sodium) ; des por  tions de<B>100</B> ml du milieu sont réparties dans  des ballons     Erlenmeyer    de 500 ml, et les     bal-          lont    sont bouchés avec du coton et sont sté  rilisés à l'autoclave pendant 30 minutes à 120 .  Lorsque les ballons sont froids, chacun d'eux  reçoit 5 à 10 % d'un ensemencement d'asper  gillus     niger        (Wisc.    72-2 ; voir     Perlman,        Kita    et       Peterson,        Arch.    of     Biochemistry,    vol.

   II, p. 123,  1946 ; également     D.A.        Kita,    thèse de bache  lier ès sciences, Université de Wisconsin, 1944),  obtenu comme décrit ci-après. Les ballons sont  soumis à une agitation mécanique pendant 7-2  heures dans une chambre maintenue à     25     ;

    puis le contenu des ballons est refroidi, est ré  glé à un<I>pH 4,0  </I> 0,2 avec de l'acide sulfuri  que et est filtré par succion à travers des tam  pons filtrants     Seitz.    L'ensemencement utilisé  est développé à partir de cultures sur souches  (fiole lyophilisée ou     agar)    pendant 24-72 heu  res dans un milieu ayant la composition sui  vante  15 g de solides provenant d'une liqueur  d'une infusion de maïs,<B>10</B> g de sucre brun, 6 g       NaN03,    0,001<I>g</I>     ZnS04,    1,5<I>g</I>     KH2pOQ    an  hydre, 0,5<I>g</I>     MgS04.7H20,   <I>5 g</I>     CaC03,   <I>2 g</I>      d'huile de lard,

   et de l'eau distillée en quantité  suffisante pour faire un litre,  le milieu étant stérilisé à l'autoclave pendant 30  minutes à 120e C.  



  <I>b) Extraction de produits d'oxydation</I>  1880 ml d'un filtrat de culture obtenu  comme décrit en a) sont épuisés avec 4 por  tions de 1 litre de chloroforme et l'extrait au  chloroforme (combiné) est filtré et est évaporé  jusqu'à siccité dans le vide. Le résidu est repris  dans 15 ml de méthanol (aqueux) à 80 %, et  la solution est épuisée avec 4 portions de 15 ml       d'hexane    (qui élimine les impuretés graisseuses).  La solution dans le méthanol est alors concen  trée sous un faible volume et est épuisée avec  3 portions de 20 ml de chloroforme. L'extrait  au chloroforme (combiné) est séché sur du sul  fate de sodium et est évaporé jusqu'à siccité en  laissant un résidu (environ 411 mg) qui cris  tallise en le laissant reposer.  



  <I>c) Séparation des constituants 1 et II</I>  Le résidu (contenant des constituants dé  signés ensuite comme I et II) est dissous dans  de l'acétone chaude, puis on le laisse cristalli  ser. Le constituant I (une     dihydroxy-progésté-          rone)    est difficilement soluble dans l'acétone et  par suite se sépare de la solution, alors que le  constituant II     (11a-hydroxy-progéstérone)    reste  dans la liqueur-mère.

   Après répétition de la  cristallisation quatre fois par     redissolution    du  résidu cristallisé dans de l'acétone chaude puis  en laissant cristalliser (en     recueillant    la     liqueur-          mère    chaque fois), le constituant I est obtenu  sensiblement pur avec un rendement d'environ  8 mg.

   Lors de la recristallisation dans de l'étha  nol à 95 %, le constituant I a les propriétés sui  vantes :     P.F.    environ 250-253e (dans un tube  capillaire) ;     (a)23        +    100e (c. 0,28) ;     U.V.        ÂD        m        Y.     236 mou     (S    =<B><I>15.000)</I></B> ;     I.R.        ?,huile    de     paraffine     <B>Max.</B>  



  2,98     ,u   <I>(OH),</I> 589     /1        (20-cétone),    et 6,04     ,u          (._14-3-cétone);    analyse: (calculé pour     C91H3004:     C, 72.80 ; H, 8.73) ; trouvé: C, 72.66 et H,  8.75.

   Ces indications montrent que le consti  tuant I est une     dihydroxy-progéstérone,    proba  blement la     6,11a-dihydroxy-progéstérone    (l'oxy  dation avec l'acide chromique fournit une     tétra-          cétone    et     l'acétylation    fournit un     diacétatë,    mon-         trant    que les deux     groupes        hydroxy    sont secon  daires).  



  Ce constituant I est transformable en une       tétracétone    par oxydation à l'aide d'acide     chro-          mique    dans de l'acide acétique. Il peut être     acé-          tylé    par traitement avec de l'anhydride acétique  en présence de     pyridine.     



  <I>d) Isolement de la 11</I>     a-hydroxy-progéstérone     <I>(constituant II)</I>  Toute la partie liquide restant après la cris  tallisation du constituant I (voir section c) est  mélangée avec 2 ml de chloroforme et 4 ml  de benzène ; et la solution est soumise à une  chromatographie sur une colonne de 6 g d'alu  mine lavée à l'acide     sulfurique.    La     colonne    est  soumise à une     élution    avec 150 ml d'un mé  lange de 1 partie de chloroforme et de 2 par  ties de benzène; et les solvants sont évaporés  dans le vide, fournissant environ<B>163</B> mg d'une  fraction cristallisée qui est purifiée par cristal  lisation dans un mélange acétone-éther.

   Le pro  duit, la     lla-hydroxy-progéstérone,    a les pro  priétés suivantes : P. F. environ 166 - 167  ;  (a) D      -I-    177.5 (c., 1.22) ;     U.V.        Âmâ\.    241 mu       (s    = 17.000) ;     I.R.,        @        Nuiel        2,91,u        (OH),    5.85<I>,u</I>       Max.     



       (20-cétone),    et 5.97     ,u        (44-3-cétone)    ; analyse  calculé pour     C1H3003    : C, 76.33 ;<I>H,</I> 9.16)  trouvé: C, 76.12 et H, 9.28. Le produit n'est  pas identique à la     11fl-hydroxy-progéstérone     connue, qui fond à 187-188e ; il forme par trai  tement avec de l'anhydride acétique et de la     py-          ridine,    un     monoacétate    ; il peut être oxydé à  l'aide d'acide chromique, dans de l'acide acéti  que, pour donner la     11-céto-progéstérone    con  nue.

      <I>Exemple 2</I>    Dans les mêmes conditions de fermentation  que celles décrites dans la section a) de l'exem  ple 1, à l'exception du fait que la teneur en     pro-          géstérone    du milieu est 0.5 g par litre et que  l'organisme d'ensemencement est l'aspergillus  type     A.T.C.C.    11,267, et, en utilisant les mê  mes procédés d'épuisement, de séparation et  d'isolement que ceux décrits dans la section b)  et suivantes de l'exemple 1, la     6,11a-dihydroxy-          progéstérone    et     1a11        a-hydroxy-progéstérone         sont obtenues dans le même ordre de pureté  et de rendement.  



  <I>Exemple 3</I>  <I>a) Fermentation</I>  Les mêmes conditions de fermentation que  celles décrites dans la section a) de l'exemple 1  sont employées à l'exception du fait que la     11-          désoxy-17a-hydroxy-corticostérone    (composé  S de Reichstein) est incorporée avec une teneur  de 0.50 g par litre à la place de la     progéstérone.       <I>b)</I>     Epuisement   <I>et séparation</I>  <I>des produits d'oxydation</I>    3100 ml du     filtrat    de culture obtenu en a)  (en se basant sur une fermentation de 1.75 g  du composé S) sont épuisés avec 5 portions de  1.5 litre de chloroforme et l'extrait au chloro  forme combiné est filtré et est évaporé.

   jusqu'à  siccité dans le vide, la température du liquide  qui distille n'excédant pas     40,1.    Le résidu     semi-          cristallisé    (pesant environ 1.00 g) est mis en  suspension dans 20 ml de chloroforme chaud, et  le précipité cristallisé (pesant environ 424 mg)  est séparé par filtration.

   Après recristallisation,  le produit obtenu     (44-prégnène-lla,17a,21-          triol-3,20-dione)    a les propriétés suivantes       aiguilles    prismatiques,     P.F.    environ 216-2190 ;  (a)24     -i--        117o    (c, 0.46 dans     Péthanol    absolu) ;       ,l        aie.    242 mu (a = 15,000) ; analyse : (cal  mar.  



  culé pour     C21H@o0s    : C, 69.50 et<I>H,</I> 8.34) ;  trouvé : C, 69.46 et H, 8.39.    <I>c) Isolement d'un autre produit d'oxydation</I>    La liqueur-mère au chloroforme combinée,  obtenue dans b), est évaporée jusqu'à siccité, et  le résidu est repris dans un petit volume d'acé  tone.

   En refroidissant dans un réfrigérateur, un  produit cristallisé est obtenu et deux cristallisa  tions avec le même solvant fournissent un pro  duit ayant les propriétés suivantes :     P.F.    envi  ron 248-2500 ;     (a)240        -i--    970 (c, 0.50 dans     l'étha-          nol    absolu) ;     2;#@X,    241 mu (e = 16,000) ; ana  lyse : (calculé pour     C21H3005   <I>; C,</I> 69.58 et H,  8.34) ; trouvé: C, 69.45 et H, 8.53. Le produit  est isomère avec la     44-prégnène-lla,17a-21-          triol-3,20-dione.     



  En traitant la     44-prégriène-11    a,17a,21-         triol-3,20-dione    obtenue à la section b) avec de  l'anhydride acétique et de la     pyridine,    on peut  obtenir un     monoacétate.    Par oxydation à l'aide  d'acide chromique dans de l'acide acétique, on  peut obtenir     l'adrénostérone.     



  <I>Exemple 4</I>    <I>a) Fermentation</I>    Les mêmes conditions de fermentation que  celles décrites dans la section a) de l'exemple  1 sont utilisées à l'exception du fait que l'acé  tate de     -11-désoxy-17a-hydroxy-corticostérone     est incorporé avec une teneur de 0.50 g par li  tre à la place de     progéstérone.       <I>b)</I>     Epuisement   <I>du produit d'oxydation</I>    Le filtrat de culture obtenu en a) par fer  mentation de 1.9 g d'acétate de     11-désoxy-17a-          hydroxy-corticostérone    est épuisé avec du chlo  roforme et le chloroforme est éliminé de l'ex  trait comme décrit dans la section b) de l'exem  ple 3.

   Le résidu, pesant environ 420 mg lorsqu'il  est traité ultérieurement comme décrit dans cette  section b), fournit environ 156 mg de cristaux.  Après deux     recristallisations    avec l'acétone, le  produit     (44-prégnène-l1a,17a,21-triol-3,20-          dione)    fond à     215-218 .    Du mycélium séché de  cette fermentation, l'acétate de     11-désoxy-17a-          hydroxy-corticostérone    non oxydé peut être ré  cupéré par épuisement avec     l'hexane    pour éli  miner la matière lipoïde, puis avec de l'acétone,  l'élimination de l'acétone dans le vide laissant  un résidu cristallisé pesant environ 1,

  35 g et la  recristallisation du résidu avec de l'acétone four  nissant environ 930 mg du composé pur fon  dant à     234-238o.       <I>Exemple S</I>    <I>a) Fermentation</I>    Les mêmes conditions de fermentation que  celles décrites dans la section a) de l'exemple  1 sont utilisées, à l'exception du fait que la     11-          désoxy-corticostérone    est incorporée à une te  neur de 0,25 g par litre à la place de     progésté-          rone.     



  <I>b) Isolement de</I>     l'épicorticostérone     3.58     litres    de filtrat de culture obtenu en a)  (en se basant sur la fermentation de 1 g de dés-           oxy-corticostérone)    sont épuisés avec 4 por  tions de 2 litres de chloroforme, et les extraits  au chloroforme sont refroidis et concentrés,  fournissant environ 1.01 g d'un produit solide  amorphe.

   Ce produit solide est dissous dans 5  ml de chloroforme et 20 ml de benzène et la  solution est     chromatographiée    sur une colonne  de 30 g de gel de silice.     L'élution    se produit  comme suit  
EMI0005.0004     
  
    <I>Eluat <SEP> Volume <SEP> Solides</I>
<tb>  <I>(ml) <SEP> <U>(</U>mg)</I>
<tb>  Chloroforme-benzène <SEP> (1:4) <SEP> . <SEP> 300 <SEP> Traces
<tb>  Chloroforme-benzène <SEP> (1:1) <SEP> . <SEP> 500 <SEP> Traces
<tb>  Chloroforme <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> Traces
<tb>  Acétone-chloroforme <SEP> (1:9) <SEP> . <SEP> 340 <SEP> Traces
<tb>  Acétone-chloroforme <SEP> (1:4) <SEP> . <SEP> 850 <SEP> 670.2
<tb>  Acétone-chloroforme <SEP> (1:

  1) <SEP> . <SEP> 525 <SEP> <B>103.2</B>
<tb>  Acétone <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 250 <SEP> 19.5       Les produits solides ayant subi une     élution     avec le mélange acétone-chloroforme (1 : 4)  cristallisent aisément sous forme de barreaux à  partir de mélanges acétone-éther, ou sous forme  de prismes à partir d'acétate d'éthyle, ayant  les propriétés suivantes : P. F.     153-154o    ;       (02D)        -f-    1680 (c, 0.7) ; analyse : (calculé pour       C.1IH;;004    : C, 72.80 et<I>H,</I> 80.73) ; trouvé       C-,    72.90 et H, 8.76.

   Le produit est la     44-pré-          gnène-lla,21-diol-3,20-dione.    Tel quel, il est  susceptible d'être transformé en l'acétate de       déhydrocorticostérone    par traitement avec de  l'anhydride acétique en présente de     pyridine.       <I>Exemple 6</I>    <I>a) Fermentation</I>    Les mêmes conditions de fermentation que  celles décrites dans la section a) de l'exemple  1 sont utilisées, à l'exception du fait que la     17a-          hydroxy-progéstérone    est incorporée avec une  teneur de 0.25 g par litre à la place de la     pro-          géstérone.       <I>b)

  </I>     Epuisement   <I>et isolement</I>  <I>de produits d'oxydation</I>    Le filtrat de culture obtenu en a) (en se ba  sant sur la fermentation de 1 g de     17a-hydroxy-          progéstérone)    est épuisé avec du chloroforme    comme décrit dans la section b) de l'exemple 3.  Le résidu,     pesant    environ 514 mg, est dissous  dans du chloroforme et la solution est     chroma-          tographiée    sur 15 g de silice.

   Le     chromato-          gramme    subit une     élution    avec 1300 ml d'un       mélange        de    5     %        d'acétone        dans        du        chloroforme     et les solvants sont évaporés, laissant environ  245 mg de cristaux incolores, qui sont     recristal-          lisés    avec un mélange acétate-     d'éthyle-hexane.     Le produit, qui est isomère avec la     lla,

  17a-          dihydroxy-progéstérone    décrite ci-après et est  supposé être la     17a-méthyl-D-hoMo-44-andro-          stÙne-11        a,17a-diol-3,20-dione    (composé X), a  les propriétés suivantes : P. F. 261 - 2620 ;  (a) D     -f-        4,60    (c, 0.74) ; analyse : calculé pour       C21Hgp04   <I>:</I> C, 72.80 et<I>H,</I> 8.73) ; trouvé : C,  72.92 et H, 8.84.  



  Une nouvelle     élution    du chromatogramme       avec        550        ml        d'acétone    à     10        %        dans        du        chloro-          forme    et une évaporation des solvants fournis  sent environ 150 mg d'un produit cristallisé.

    Lors de la     recristallisation    avec un mélange acé  tate d'éthyle-éther, le produit est obtenu sous  forme de plaques incolores ayant les proprié  tés suivantes :     P.F.    219-221  ; (a)22     -I-        87     (c,  0.57) ; et analyse : (calculé pour     CIIH@?o04     C, 72.80 et H, 8.73) ; trouvé : C, 73.11 et  H,     8.70.-    Le produit est la 11     a,17a-dihydroxy-          progéstérone.    Par oxydation, elle peut former  la     44-prégnène-17a-ol-3,11,20-trione    connue.  



  Quant au composé     X,-    il donne par oxyda  tion avec de l'anhydride chromique dans de  l'acide acétique glacial, une 11 -cétone sous  forme de plaques incolores, qui a les proprié  tés suivantes :     P.F-        238-242o    ;     (a)D        -I-    121   (c, 0.48) ; analyse : (calculé pour     C21H2804     C, 73.23 et H, 8.19) ; trouvé: C, 73.33 et  H, 8.34.

      <I>Exemple 7</I>  0    <I>a) Fermentation</I>    Les mêmes conditions de fermentation que  celles décrites dans la section a) de l'exemple  1 sont utilisées, à l'exception du fait que     l'asper-          ffi   <B>CI</B>       llus    type     A.T.C.C.    11,267 est employé à la  place de l'aspergillus     niger    et que la     17a-hy-          droxy-progéstérone    est incorporée, avec une te-      heur de 0,25 g par litre, à la place de la     pro-          géstérone.     



  <I>b)</I>     Epuisement   <I>de produits d'oxydation</I>  Le     filtrat    de culture obtenu en a) (en se ba  sant sur la fermentation de 875 mg de     17a-          hydroxy-progéstérone)    est épuisé avec du chlo  roforme comme décrit dans la section b) de  l'exemple 1 et le chloroforme est éliminé, lais  sant un résidu d'environ 536 mg.

   Le résidu est  dissous dans le chloroforme et la solution est       chromatographiée    sur 15 g de silice.     L'élution     avec 300 ml de chloroforme élimine environ  35 mg de sous-produits non identifiés ; une       nouvelle        élution        avec        200        ml        de    5     %        d'acétone     dans du chloroforme élimine environ 20 mg du  composé     D-homo    décrit dans l'exemple 6 ;

   et  une     élution    avec 150.0 ml de 10 % d'acétone  dans du chloroforme élimine environ 410 mg  du produit d'oxydation principal     (11a,17a-di-          hydroxy-progéstérone),    fondant à     215-219     et  ayant (a) 24     -i--   <B>870</B> (c, 0.52)-    <I>Exemple 8</I>    Utilisant le procédé décrit dans les sections  a) et b) de l'exemple 3, mais avec l'aspergillus  type     A.T.C.C.    11,267 comme organisme de  fermentation à la place de l'aspergillus     niger,     on obtient 582 mg de cristaux insolubles dans  le chloroforme et ayant les propriétés suivan  tes:

       P.F.   <B>216--2190;</B> (a)     23        -I-   <B>1170</B> (c, 1.00 dans  l'éthanol absolu) ; analyse : (calculé pour       C,11,3005   <I>:</I> C, 69.58 et<I>H,</I> 8.34) ; trouvé : C,  69.88 et H, 8.09. Le produit, après     recristalli-          sation    dans l'acétone montre dans l'infrarouge  un spectre identique à celui de la     44-prégnène-          11a,17a,21-triol-3,20-dione    authentique.

      <I>Exemple 9</I>    Dans les mêmes conditions que celles de  l'exemple 8, mais faisant fermenter la     11-dés-          oxy-17a-hydroxy-corticostérone    avec une te  neur de 1 g     par    litre, on obtient, en partant de  1 g, un rendement de 467 mg de     d4-prégnène-          11        a,17a,21-triol-3,20-dione.       <I>Exemple 10</I>    Dans les mêmes conditions que celles de  l'exemple 8, en utilisant l'acétate de 11-désoxy-         17a-hydroxy-corticostérone,    on obtient un ren  dement d'environ 204 mg de     44-prégnène-11    a,       17a,21-triol-3,20-dione.     



  <I>Exemple 11</I>  Dans les mêmes conditions que celles de  l'exemple 10, mais en doublant la durée de fer  mentation, on obtient un rendement d'environ  220 mg de     44-prégnène-lla,17a,21-triol-3,20-          dione.       <I>Exemple 12</I>    Dans les mêmes conditions que celles dé  crites dans l'exemple 3, mais incorporant le  stéroïde avec une teneur de 0.25 g par litre et  en utilisant le microorganisme aspergillus       amstelodami    à la place de l'aspergillus     niger,

       environ 383 mg d'un produit     stéroïdal    sont ob  tenus à partir de 0.5 g de     11-désoxy-17a-hy-          droxy-corticostérone.    Ce produit est repris dans  10 ml de chloroforme et le précipité cristallisé  (pesant environ 1-64 mg) est récupéré par fil  tration et est recristallisé dans l'acétone. Le pro  duit fond à 217-220 et son spectre à l'infra  rouge est identique à celui de la     d4-prégnène-          11        a,17a,21-triol-3,20-dione    authentique.  



  La     liqueur-mère    au chloroforme est évapo  rée jusqu'à siccité, est reprise dans un peu d'acé  tone et est refroidie, et les cristaux qui en ré  sultent (pesant environ 33 mg) sont     recristalli-          sés    dans l'acétone. Le produit fond à 248.5   <B>2500</B> et son spectre d'infrarouge est identique à  celui du produit décrit dans la section c) de  l'exemple 3.

      <I>Exemple 13</I>    Dans les mêmes conditions que celles de  l'exemple 3, mais en utilisant l'aspergillus     nidu-          lans    à la place de l'aspergillus     niger,    environ  732 mg d'un produit     stéroïdal    sont récupérés à  partir de 1.0 g de     11-désoxy-17a-hydroxy-          corticostérone.    A partir de ce produit     stéroïdal,     on obtient environ 571 mg de     44-prégnène-          11a,17a,21-triol-3,20-dione    qui, après     recristal-          lisation    dans l'acétone,

   fond à     216-219Q    et mon  tre le spectre d'infrarouge correct.  



  D'autres milieux que ceux décrits dans les      exemples qui précèdent peuvent être     utilisés     pour les buts envisagés dans l'invention, la  seule exigence résidant bien entendu dans le  fait que ces milieux doivent être aptes à suppor  ter le développement ou la prolifération de l'as  pergillus particulier en la présence d'oxygène.  Tout acide critique obtenu comme sous-pro  duit (comme dans le cas de l'utilisation de su  cre ou de mélasses, par exemple comme par  tie ou comme tout de la source de carbone et  d'énergie), ou tous autres produits précieux ob  tenus (par exemple des amylases ou des     pro-          téinases)    peuvent être récupérés suivant les  procédés conventionnels pour la récupération  de ces produits en partant de cultures d'asper  gillus.

   La présence d'oxygène     (stérile)    pendant  la fermentation peut être assurée suivant le pro  cédé conventionnel pour les fermentations en la  présence d'oxygène, c'est-à-dire en exposant une  large surface du milieu à l'air ou en immergeant  une culture aérée. La durée d'incubation peut  déterminer le rendement en dérivé     hydroxylé     avec certains stéroïdes et l'incubation est arrê  tée bien entendu lorsque l'agent contient la te  neur la plus élevée du produit désiré, ce qui est  aisé à déterminer pour chaque sorte de condi  tions.  



  Dans les exemples indiqués précédemment,  le stéroïde est incorporé dans l'agent de fermen  tation avant l'ensemencement avec l'aspergillus;  et, dans un cas de ce genre, le stéroïde est dis  sous de préférence dans du chloroforme pour  faciliter la manipulation (par exemple 1 ml de  chloroforme pour 100 ml du milieu), le chloro  forme étant éliminé du milieu pendant la stéri  lisation (c'est-à-dire avant l'ensemencement).  Cependant, le stéroïde peut être ajouté après l'en  semencement et même après que s'est produite une  prolifération sensible de l'aspergillus.

   Donc, le  stéroïde peut être transformé en un dérivé     hy-          droxylé    en amenant en contact commun le sté  roïde et l'air dans une suspension aqueuse de  cellules non proliférantes de l'aspergillus ou en  amenant en contact commun le stéroïde, l'air  et des enzymes de l'aspergillus dans un agent  aqueux exempt de cellules.

   Ainsi une culture  de trois jours d'aspergillus     niger    proliféré sur  le même milieu que celui utilisé dans l'exemple    I, mais sans la     progéstérone,    est soumise à une  centrifugation, est à nouveau mise en suspen  sion dans l'eau distillée, est soumise à une nou  velle centrifugation, est encore mise en suspen  sion dans l'eau 'distillée : la suspension est pla  cée dans un flacon ; la     progéstérone    (par exem  ple) est ajoutée ; le flacon est agité à 250 pen  dant 24 heures ;

   la suspension est     filtrée,    et la       11a-hydroxy-progéstérone    formée est récupérée  par épuisement au chloroforme du- filtrat et par  un nouveau traitement tel que celui décrit dans  les sections b) et suivantes de l'exemple I.  D'autres expédients qui sont conventionnels  dans la fermentation peuvent être     utilisés    pour  la mise en     oeuvre    pratique de l'invention.

   C'est  ainsi que l'aspergillus peut être développé sur  un milieu le mieux adapté à sa prolifération, le       mycelium    peut être séparé du liquide de culture  après une prolifération sensible, et le     mycelium     peut être remis en suspension dans un nouveau  milieu contenant le stéroïde à oxyder (par exem  ple le milieu décrit dans l'exemple I).

   Égale  ment le     mycelium    d'aspergillus peut être utilisé  d'une manière répétée, c'est-à-dire que le liquide  de culture contenant le dérivé     hydroxylé    du  stéroïde peut être séparé du     mycelium,    le pre  mier étant traité pour récupérer ledit dérivé  alors que le dernier est remis en suspension dans  une nouvelle quantité du milieu contenant le  stéroïde à oxyder. Les dérivés     hydroxylés    des  stéroïdes obtenus dans la mise en     oeuvre        prati=     que de l'invention sont des intermédiaires pour  la préparation d'hormones corticales et/ou d'au  tres produits utiles.

   C'est ainsi que la     11a-hy-          droxy-progéstérone    est convertible en la     11-          céto-progéstérone    connue comme décrit précé  demment, aussi bien qu'en l'acétate de     cortisone     par exemple.

   A titre d'illustration, la     lla-hy-          droxy-progéstérone    peut être réduite par voie  catalytique avec du palladium dans de l'acétate  d'éthyle pour former     l'alloprégnane-1la-ol-          3,20-dione    ; cette dernière peut être réduite avec  de l'hydrure de lithium et d'aluminium en     l'al-          loprégnane-3,11a,20-triol    ;

   ce dernier peut être  traité avec un agent     acylant    (par exemple un  agent     d'acétylation)    dans des conditions modé  rées pour obtenir le dérivé     3-acyle    (par exem  ple le     3-acétate        d'alloprégnane-3,11        a-20-triol         ce dernier peut être oxydé avec de l'acide     chro-          mique    pour former la     3-acétoxy-alloprégnane-          11,20-dione    ;

   et cette dernière peut être conver  tie, par des procédés décrits dans la technique  (par exemple par     Rosenkrank,        Pataki    et     Dje-          rassi,'        J.A.C.S.   <I>73,</I> 4055, 1951) en l'acétate de  cortisone.

   Une telle conversion peut, par exem  ple, être effectuée en traitant la     3-acétoxy-allo=          prégnane-11,20-dione    avec de l'anhydride acé  tique et de l'acide     p-toluène-sulfonique    pour ob  tenir l'acétate de     11,20-diénol    de la     3-acétoxy-          alloprégnane-11,20-dione    et, sans isolement,  être traitée avec un excès d'acide     perbenzoïque     dans du chloroforme, suivi. d'une saponification  avec une solution d'hydroxyde de     sodium-2N     pour obtenir     l'alloprégnane-3,17a-diol-11,20-          dione    ;

   cette dernière est bromée dans du chlo  roforme pour obtenir la     21-bromo-alloprégna-          ne-3,17a-diol-11,20-dione    ; cette dernière est  traitée avec de l'iodure de sodium dans de  l'acétone, puis avec de l'acétate de potassium,  pour fournir le     21-acétate        d'alIoprégnane-3,17a,          21-triol-11,20-dione    (composé D de Reich  stein) ; cet acétate est oxydé avec la     N-bromo-          acétamide    pour fournir le     21-acétate        d'allopré-          gnane-3,11,20-trione-17a,21-diol    ;

   cet acétate  est bromé et, sans isolement est traité avec de  l'iodure de sodium pour obtenir le     21-acétate     de     d4-2-iodo-prégnène-17a,21-diol-3,11,20-          trione    ; et cet acétate est traité à son tour avec  de la poudre de zinc dans du     dioxane    et de  l'éthanol pour fournir l'acétate de cortisone. La       44-prégnène-lla,17a,21-triol-3,20-dione    est  convertible en     l'adrénostérone    connue, aussi  bien qu'en l'acétate de cortisone par exemple,  La     44-prégnène-lla,21-diol-3,20-dione    est  convertible en l'acétate de     déhydrocorticosté-          rone    connu.

   La 11     a,17a-dihydroxyprogéstérone     est convertible en la     44-prégnène-17a-ol-3,11,          20-trione    connue.

Claims

REVENDICATION: Procédé pour convertir un stéroïde non substitué en position 11 en un dérivé lla-hy- droxy de ce stéroïde, caractérisé en ce que l'on soumet ce stéroïde, en présence d'oxygène, à l'action d'enzymes d'une espèce oxydante d'as pergillus. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, dans le quel on traite un 3,20-dicéto-prégnène non substitué en 11, de façon à former un dérivé 11 a-hydroxy de celui-ci. 2. Procédé selon la revendication, dans le quel on traite un 3-oxy-20-céto-prégnène non substitué en 11, de façon à former un dérivé 11 a-hydroxy de celui-ci. 3.

Procédé selon la revendication, dans le quel l'espèce oxydante d'aspergillus est l'asper gillus niger, Wisc. <I>72-2.</I> 4. Procédé selon la revendication, dans le quel l'espèce oxydante d'aspergillus est l'asper gillus amstelodami. 5. Procédé selon la revendication, dans le quel l'espèce oxydante d'aspergillus est l'asper gillus nidulans. 6. Procédé selon la revendication, dans le quel l'espèce oxydante d'aspergillus est l'asper gillus sp. A.T.C.C. 11,267. 7.

Procédé selon la revendication, dans le quel on traite la progéstérone de façon à ob tenir la 11 a-hydroxy-progéstérone et la 6,11 a- dihydroxy-progéstérone. 8. Procédé selon la revendication, dans le quel on traite la 17a-hydroxy-11-désoxy-corti- costérone ou un ester de celle-ci de façon à ob tenir la 44-prégnène-11a,17a,21-triol-3,20- dione. 9.

Procédé selon la revendication, dans le quel on traite la 11-désoxy-corticostérone de fa çon à obtenir la 44-prégnène-lla,21-diol-3,20- dione. 10. Procédé selon la revendication, dans le quel on traite la 17a-hydroxy-progéstérone de façon à obtenir la 1<B>l</B>a, 17a-dihydroxy-progésté- rone. 11. Procédé selon la revendication, dans le quel on cultive une espèce oxydante d'aspergil lus en présence d'oxygène dans un milieu de fermentation contenant du carbone assimilable et le stéroïde à traiter. 12.

Procédé selon la sous-revendication 8, dans lequel, pour séparer la 44-prégnène-11a, 17a,21-triol-3,20-dione du produit brut de l'oxydation microbiologique de la 17a-hydroxy- 11-désoxy-corticostérone; on met en suspension ledit produit d'oxydation dans un solvant hydro carbure chloré, et recueille la matière insolu ble dans ledit solvant.