Procédé de préparation de 3-céto-stéroïdes du groupe du prégnane L'invention a pour objet un procédé de prépara tion de 3-céto-stéroïdes du groupe du prégnane, comportant deux doubles liaisons en positions 1(2) et 4(5) et substitués par une fonction oxygénée dans au moins l'une des positions 11, 17a et 21 ;
parmi ces composés, dont certains sont utiles en théra peutique, figurent notamment la 1-déhydrocortisone (1,4-prégnadiène-17a,21-diol-3,11,20-trione), le 1- déhydrocortisol (1,4-prégnadiène-11(3,17(x,21-triol- 3,20-dione) , leurs 9a-halo-dérivés et leurs esters, ainsi que d'autres composés, pouvant être ultérieu rement convertis en les composés susmentionnés, et éventuellement eux-mêmes doués d'activité thérapeu tique.
Le procédé de l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet un dérivé du prégnane comportant au moins une double liaison en position 4(5), une fonction cétone en position 3 et une fonction oxy génée au moins dans l'une des positions 11, 17a et 21, à l'action d'enzymes d'une culture d'un micro organisme déshydrogénant, aptes à former une dou ble liaison entre les atomes de carbone 1 et 2, sans dégradation du squelette carboné du prégnane.
Les principaux produits finals dudit procédé sont représentés en annexe par les formules I (1-déhydro- cortisone et ses 21-esters), II (1-déhydrocortisol et ses 21-esters), III (9a-halogéno-1-déhydrocortisones et leurs 21-esters) et IV (9a-halogéno-1-déhydrocor- tisols et leurs 21-esters), toutes ces formules étant combinées dans la formule composite V, par la formule VI qui représente le 11-épi-1-déhydrocortisol et ses 21-esters,
c'est-à-dire la 1,4-prégnadiène-11 , 17a,21-triol-3,20-dione et ses 21-esters, ces derniers composés pouvant être ultérieurement transformés en 1-déhydrocortisone (I).
Les composés non saturés de départ peuvent avoir, en plus de la double liaison 4(5), une double liaison 9(11) et une double liaison 16(17).
Les enzymes de cultures de microorganismes dés- hydrogénants utilisés dans le procédé ont la pro priété spécifique d'introduire une double liaison entre les carbones 1 et 2 sans dégradation simultanée du squelette carboné du prégnane, comme par exemple la scission de la chaise latérale au carbone 17 ou l'ouverture du noyau D. Ils sont capables aussi, dans certaines conditions, d'hydrolyser un ou des groupes esters, d'habitude en position 21.
Ces enzymes sont extrêmement efficaces pour introduire une insaturation A1 dans les composés ayant une double liaison attachée aux carbones 4,5.
Les microorganismes déshydrogénants opèrent le mieux sur des substrats (c'est-à-dire le composé stéroïde à modifier) qui contiennent un groupe hydroxyle qui est relativement stable vis-à-vis de l'organisme, c'est-à-dire qui n'est pas rapidement oxydé en oxygène cétonique, ou un ester d'un tel groupe hydroxyle qui est hydrolysé par la culture du microorganisme. Ainsi, des composés tels que la progestérone, laquelle ne comporte pas de fonction oxygénée en positions 11, 17a et 21, ne sont pas utilisables comme composés de départ.
On peut estérifier après coup certains des compo sés finals des formules I à V. Ces esters se sont avérés être d'activité plus durable, et ainsi il faut une administration et particulièrement une injection moins fréquente.
Un groupe 9a-halogéno peut exister dans un composé de départ 11-céto ou 11(3-hydroxy, ou on peut l'introduire par divers procédés chimiques dans des composés finals dans lesquels un groupe hy droxyle 11a ou 11(3 est présent, obtenant dans chaque cas un composé 9a-halogéno-110-hydroxy, qui peut être oxydé en composé 9a-halogéno-11- cétonique.
Par des essais cliniques, on a trouvé que les composés 1-déhydrocortisone, 1-déhydrocortisol et leurs 21-esters ont une action physiologique extra ordinairement améliorée par rapport aux composés correspondants une seule fois non saturés (cortisone, hydrocortisone et leurs 21-esters respectivement). Ainsi, ils présentent plusieurs fois le pouvoir des hormones correspondantes connues, telles que corti sone et hydrocortisone, dans le traitement de l'ar thrite rhumatoïde.
En outre, les réactions secondaires indésirables des hormones connues se manifestent seulement à un degré moindre dans l'emploi des nouveaux composés ; l'intensité de ces réactions se condaires est encore réduite davantage par le fait que l'on peut employer des doses beaucoup plus basses des nouveaux composés par comparaison aux composés connus correspondants une seule fois non saturés. Tant les doses initiales que les doses d'en tretien dans le traitement de l'arthrite rhumatoïde peuvent être fortement réduites par l'emploi des nou veaux composés, comparativement aux doses requises avec la cortisone et l'hydrocortisone.
Même avec les doses réduites, les composés nouveaux ne nécessitent pas l'emploi simultané de codéine ou autre analgé sique pour soulager la douleur, alors que ces anal gésiques s'employaient fréquemment conjointement avec la cortisone et le composé F de Kendall (hydro cortisone).
On administre de préférence les diènes thérapeu- tiquement actifs, résultant du procédé de la présente invention, par voie buccale sous la forme de ta blettes contenant une dose journalière complète, par exemple 50 mg ou un sous-multiple de cette dose, c'est-à-dire 25 ou 20 mg, ou même 10 mg, en mé lange avec un support pharmaceutique solide conte nant un ou plusieurs des composants usuels tels que amidon, sucre, gommes, argiles, etc.
Cependant, on peut également les administrer par injection intra veineuse et intramusculaire, en solution ou en sus pension dans un véhicule liquide non toxique ap proprié ; ou bien on peut les administrer à l'état solide par implantation sous-cutanée, ou sous la forme de suppositoires dissous ou en suspension dans un véhicule gras ou cireux fondant approximative ment à la température du corps. Ces composés, de même que-leurs dérivés 9a-halogénés, peuvent éga lement être administrés localement sous la forme d'un onguent ou crème, en solution dans une base d'onguent ou de crème de composition connue.
On va maintenant expliquer de manière détaillée le nouveau procédé d'introduction d'une double liai- son Al à l'aide d'une culture d'un microorganisme déshydrogénant.
On peut réaliser cette réaction de manière effi cace et peu coûteuse en mettant incuber ou fermenter le stéroïde de départ dans un milieu de culture con tenant un microorganisme déshydrogénant qui ne dégrade pas ou ne scinde pas en même temps le squelette carboné du prégnane. Des microorganismes appropriés de ce genre appartiennent à la famille des Corynebactriaceae, parmi laquelle l'espèce Co- rynebacterium simplex (American Type Culture Col lection 6946) et Corynebacterium hoagii (A. T. C. C.
7005) ont donné des résultats très satisfaisants. Le premier de ceux-ci est une bactérie du sol, tandis que le second se rencontre dans la gorge de l'homme (dans laquelle aparemment il ne produit pas un état pathologique) et parfois comme un contaminant de cultures exposées à l'atmosphère, bien que son habi tat réel ou original ne soit pas connu.
Les composés de départ peuvent avoir des grou pes hydroxyle, céto, halogène et ester dans diverses positions du noyau ou de la chaine latérale ; ainsi, les groupes hydroxyles peuvent exister en une ou plusieurs des positions 11, 17, 20 et 21 ; les groupes cétoniques peuvent occuper, entre la position 3, l'une ou l'autre des positions 11 et 20, tandis que l'halo gène, par exemple du fluor ou du brome, peut être attaché au carbone 9 ou en d'autres points du noyau ou de la chaine latérale. La présence d'un groupe hydroxyle libre semble promouvoir la transformation chimique.
Des groupes esters très divers, et de pré férence les esters d'acides employés habituellement dans la synthèse de stéroïdes et dans la préparation des hormones stéroïdes à usages thérapeutique, par ticulièrement d'acides alcanoïques inférieurs tels que l'acétate, peuvent être situés en une ou plusieurs des positions 11, 17, 20 et 21.
Le caractère spécifique de l'ester n'est pas déterminant dans le présent pro cédé, et on peut employer d'autres esters, tant d'acides organiques que d'acides minéraux, par exemple des cyclopentyl- et cyclohexyl-acétates, pro- pionates et butyrates, de même que des phosphates, polyphosphates et sulfates ; ce qui est uniquement nécessaire, c'est que ces esters ne soient pas toxiques envers le microorganisme.
Si on le désire, des pro duits finals hydroxylés peuvent être convertis en leurs esters correspondants par des procédés connus, par exemple en leurs esters alcanoïques inférieurs et plus particulièrement leurs esters acétiques. Le groupe hydroxyle en position 11 peut être l'épinière a ou (3. Le groupe ester, particulièrement en position 21, peut être dérivé d'un acide qui agit de manière à prolonger la durée de l'activité des composés théra peutiques.
Par l'emploi d'un microorganisme déshydrogénant conformément à l'invention, on peut convertir par exemple la 4-prégnène-17a,21-diol-3,11,20-trione (cortisone, composé E de Kendall) en 1,4-prégna- diène-17a,21-diol-3,11,20-trione (1-déhydrocorti- sone), la 4-prégnène-11(3,17a,21-triol-3,20-dione (hydrocortisone ou cortisol, composé F de Kendall) en 1,4-prégnadiène-11(3,17a,21-triol-3,20-dione (1- déhydrocortisol), le 4-prégnène-17a,21-diol-3,
20- dione (composé S de Reichstein) en 1,4-prégnadiène- 17(3,21-diol-3,20-dione, la 4-prégnène-11(3,21-diol- 3,20-dione (corticostérone) en 1,4-prégnadiène-11p, 21-diol-3,20-dione, la 4-prégnène-21-ol-3,20-dione (désoxycorticostérone) en 1,4-prégnadiène-21-ol- 3,20-dione, la 4-prégnène-21-ol-3,11,20-trione (com posé A de Kendall) en 1,4-prégnadiène-21-ol-3,11,
20-trione, la 9a-fluoro-4-prégnène-11(3,17a,21-triol- 3,20-dione (fluoro-composé F) en 9a-fluoro-1,4-pré- gnadiène-11 [3,17a,21-triol-3,20-dione.
Le procédé est applicable également au traite ment des épimères lla-hydroxy des composés de départ 110-hydroxy mentionnés plus haut, par exem ple la 4-prégnène-11(x,17 ,21-triol-3,20-dione et ses mono- et polyesters, par exemple les 21-acétate et 17a,21-diacétate, ces composés de départ fournissant de la 1,4-prégnadiène-lla,17a,21-triol-3,20-dione ou un ester de ce composé.
Les 11-épimères du 1,4- diène du composé F (1-déhydrocortisol) et ses esters peuvent être convertis en le 1,4-diène de cortisone et ses esters par oxydation du groupe 11 a-hydroxyle de manière connue, par exemple avec la quantité théorique d'acide chromique, avec ou sans pyridine ou acide acétique, à la température ordinaire ou en dessous de celle-ci (5 à 151, C), de préférence après estérification de l'hydroxyle 21 si celui-ci est libre.
Les composés de départ 11 a-hydroxylés sont pré parés de manière relativement aisée avec un rende ment élevé, chose bien connue dans ce domaine, et ils constituent par conséquent des composés de dé part avantageux pour la préparation de la 1-déhydro- cortisone et du 1-déhydrocortisol.
Le procédé de l'invention est applicable également aux 9a-fluoro-, chloro- et bromo-stéroïdes et fournira les produits de réaction substitués correspondants. Les diverses transformations peuvent être représen tées par les équations (1) et (2) sur la feuille 2 en annexe, qui montrent la formation des produits finals désirés, pouvant être convertis en ces produits. Dans l'équation (1), X est<U>H.,</U> = O ou
EMI0003.0051
(a ou (3), Y est - CO - CH.LOH et Z' est OH ou H.
Dans l'équation (2), W est H, F, Cl ou Br, X est H,>, = O ou
EMI0003.0055
Y est -CO - CH.>OH, -CO - CH2OOCR' ou -CHOH - CH,OH, Z est OH ou H et R' est un radical alcoyle inférieur.
Le composé de départ peut comporter plus d'une double liaison. Ainsi, les 4,6-prégnadiènes peuvent être déshydrogénés de la manière décrite plus haut pour produire des 1,4,6-prégnatriènes, ces derniers pouvant être ensuite aisément réduits de manière connue en 1,4-prégnadiènes. A titre d'exemple, le 21-acétate de 4,6-prégnadiène-17a,21-diol-3,11,20- trione peut être converti en 1,4,6-prégnatriène-17a, 21-diol-3,11,
20-trione ou son 21-ester. Les composés correspondants 11 a- ou 11(3-hydroxy seront de même convertis en 1,4,6-triènes. On peut réduire les triènes par des procédés connus en 1-déhydrocortisone ou 1-déhydrocortisol ou composés analogues. Le com posé de départ peut avoir également une double liaison en position 16(17) ou en position 9(11).
En vue d'obtenir la croissance souhaitée du microorganisme de déshydrogénation, par exemple le Corynebacterium simplex et C. hoagii, on peut pro céder comme suit On prépare un milieu nutritif approprié contenant un glucide, de l'azote organique, des coenzymes et des sels minéraux.- Il est possible d'omettre l'emploi de glucide sans arrêter complètement la croissance de l'organisme. Après culture du microorganisme dans le milieu nutritif, on peut récolter la masse cel lulaire en essorant le bouillon nutritif, en décantant le liquide surnageant et en mettant en suspension la masse cellulaire dans une solution saline à 0,85 %, stérile. Un volume approprié de la suspension de cellules est alors ensemencé dans un milieu nutritif.
Le milieu nutritif employé peut être un extrait de levure, un hydrolysat de caséine, une liqueur de macération de maïs, un extrait aqueux de farine de soya, un hydrolysat de lactalbumine, des extraits solubles de poissons, etc.
Les extraits solubles de poissons peuvent s'ob tenir dans le commerce sous la forme d'un extrait de hareng, de menhad'en, et de mélanges divers de ceux-ci, qui ont été soumis à une hydrolyse enzy matique. On peut ajouter cette matière directement au bouillon de culture pour fournir la matière nutri tive. Lorsqu'on dispose d'extraits solubles de poissons (teneur en solides de 50 %) et que ceux-ci n'ont pas été soumis à une hydrolyse enzymatique, on doit diluer de tels extraits avec de l'eau et les traiter à la vapeur pendant environ 10 minutes à 900 C, puis les filtrer.
Le traitement de déshydrogénation peut être ef fectué comme suit Le composé stéroïde sous la forme solide ou en solution ou suspension dans de l'éthanol, de l'acétone ou autre solvant quelconque miscible à l'eau qui est non toxique envers l'organisme, est ajouté au microorganisme cultivé dans le milieu de culture dans des conditions stériles. On agite alors cette culture, on l'aère, ou bien on l'aère et l'agite simul tanément, en vue d'accélérer la croissance du micro organisme et la conversion biochimique du stéroïde. On peut ajouter le stéroïde au milieu de culture et l'inoculer alors avec le microorganisme, ou bien on peut ajouter au stéroïde le microorganisme cultivé en milieu de culture.
Dans certains cas, suivant les conditions du milieu de réaction, il peut être sou haitable d'obtenir une croissance optimum du micro organisme avant addition du stéroïde. On peut encore utiliser pour la mise en ouvre du procédé des pré parations d'enzymes obtenues de manière connue à partir de cultures des microorganismes. Des sels minéraux sont souhaitables pour main tenir le pH dans le milieu de réaction entre 6,8 et 7,2. Cependant, on peut omettre l'emploi de sels miné raux pour tamponner le mélange de réaction. L'omis sion de sels minéraux cause l'élévation du pH depuis une valeur initiale de 6,8 jusqu'à environ 7,7-8. Ceci permet toutefois encore la formation des pro duits stéroïdes finals recherchés.
La température optimum pour la croissance du microorganisme est de 37 C, mais les températures peuvent varier entre 25 et 370 C, et même entre 20o et 40o C. La durée de réaction peut varier depuis un temps aussi petit que 3 heures jusqu'à un temps aussi grand que 48 heures. La durée qui sera employée dépendra du stéroïde à transformer. On peut employer tout solvant miscible à l'eau qui est non toxique pour l'organisme, en vue de dissoudre ou de mettre en suspension le stéroïde.
On préfère l'emploi d'éthanol ou d'acétone en quantités telles que la concentration finale de ces solvants dans le mélange de réaction ne dépasse pas 7 % environ, et ces solvants peuvent exister seulement à l'état de traces ; par suite de l'évaporation, la concentration finale du solvant or ganique peut même être pratiquement nulle.
Après l'achèvement du processus de déshydro- génation, qui peut être accompagné d'une hydrolyse partielle ou totale lorsqu'on utilise des mono- ou polyesters, on peut récupérer les produits de réaction à partir du mélange par extraction avec un solvant approprié insoluble dans l'eau, par filtration, par adsorbtion sur un adsorbant approprié ou par tous autres procédés quelconques utilisés communément dans ce domaine. Pour l'extraction, les hydrocarbures inférieurs chlorés, les cétones et les alcools sont utiles.
Ces composés comprennent le chloroforme, le chlorure de méthylène, le trichloréthane, le di- chlorure d'éthylène, le butanol, la diéthylcétone et autres composés. On préfère employer l'extraction comme procédé d'isolation des stéroïdes déshydro génés. Après extraction, on peut isoler ces produits par concentration des extraits jusqu'à un faible vo lume ou jusqu'à siccité.
On peut alors purifier les résidus par de simples recristallisations dans un sol vant ou mélange solvant convenable, par exemple l'acétone, le chlorure de méthylène, l'éthanol, l'acé- tone-hexane, le chlorure de méthylène-hexane, etc., ce qui fournit le diène souhaité avec un excellent rendement et dans un état de pureté très élevé.
Un autre exemple de microorganisme déshydro génant utilisable est le Bacillus sphaericus (American Type Culture Collection 7055). Les stéroïdes 1,4- diéniques résultants sont très stables dans une culture de ce microorganisme, et il n'est pas nécessaire de prendre des précautions spéciales en vue de prévenir la destruction du produit final recherché. La durée d'incubation peut être aussi élevée que 96 heures et les rendements sont très élevés, fréquemment pres que quantitatifs.
Tout comme avec les autres microorganismes dés- hydrogénants cités plus haut, on peut employer à la place d'une culture en croissance de<I>B.</I> sphaericus les enzymes séparées de cette culture.
Le mode de culture du<I>B.</I> sphaericus et le procédé d'inoculation du milieu nutritif, la nature du milieu nutritif, la manière de mettre en contact le substrat stéroïde avec la culture en croissance du micro organisme peuvent être les mêmes qu'avec les espèces Corynebacterium, sauf que, comme déjà indiqué, la période d'incubation peut être plus longue, étant en général d'environ 24 à 96 heures. Dans tous les cas, la culture contenant le stéroïde est soumise à une agitation et à une aération.
En plus des milieux nutritifs révélés plus haut, on peut aussi employer de la Protopeptone (mar que de fabrique d'un produit nutritif à base de pep tones). La croissance du microorganisme est de pré férence amorcée à un pH d'environ 6,6 à 7,2 ; la température optimum pour la croissance du<I>B.</I> sphae- ricus est d'environ 28o C, mais la température peut varier entre 190 C et 320 C.
On récupère de préférence les produits de la réaction biochimique par extraction avec les solvants et suivant le procédé décrit précédemment, mais on peut utiliser tout autre procédé approprié connu des chimistes.
Evidemment, à la place des microorganismes dés- hydrogénants décrits plus haut, on peut employer les mutants qui ont une activité déshydrogénante simi laire sans exercer une action destructrice sur le squelette carboné du prégnane.
On va maintenant décrire des synthèses plus compliquées, comportant, outre le procédé selon l'in vention, des opérations complémentaires portant, soit sur la préparation des matières de départ, soit sur les produits finals du procédé. <I>A. Préparation de</I> 1-déhydrocortisone <I>et de</I> 1-déhydrocortisol <I>à partir de</I> 17a-hydroxy-progestérone On peut faire suivre ou précéder la déshydro- génation du noyau A, au moyen des microorganismes déshydrogénants décrits plus haut, par d'autres conversions microbiologiques, qui sont largement connues individuellement,
et par une phase opératoire d'oxydation chimique (lorsqu'il est question de pro duire de la 1-déhydrocortisone), pour convertir la 17a-hydroxy-progestérone (4-prégnène-17(x-ol-3,20- dione) en les dérivés Al-déhydro beaucoup plus pré cieux de cortisone et hydrocortisone, ces opérations étant susceptibles d'être employées dans des sé quences différentes, sauf que la phase opératoire d'oxydation chimique est consécutive au processus biologique qui introduit un groupe hydroxyle en position 11.
Ces processus microbiologiques supplé mentaires sont en principe de deux types ; ce sont les suivants (1) introduction d'un groupe hydroxyle 11a ou 11(3 par l'action d'un microorganisme 11- hydroxylant du type Rhizopus nigricans et Curvularia luuata, et (2) introduction d'un groupe 21-hydroxyle par l'action d'un microorganisme appartenant au genre Ophfobolus.
Si on envisage la production de 1-déhydrocorti- sone, alors, en un point quelconque après l'introduc tion du groupe 11-hydroxyle, le composé intermédiaire est oxydé, par exemple avec de l'acide chromique dans de la pyridine, de préférence à la température ordinaire ou au-dessous de celle-ci, pour convertir le 11-hydroxyle en oxygène cétonique. Au cas tou tefois où le 11-hydroxyle a la configuration (3; et qu'on désire obtenir le 1-déhydro-dérivé d'hydro cortisone, on omet la phase opératoire d'oxydation. <I>B.
Conversion de la</I> désoxycorticostérone <I>et de ses esters en</I> 1-déhydrocortisone <I>et</I> 1-déhydrocortisol Les produits finals préférés, à savoir la 1-dés- hydrocortisone et le 1-déhydrocortisol, de même que leurs esters, peuvent s'obtenir également à partir de désoxycorticostérone (4-prégnène-21-ol-3,20-dione) et de ses esters, par une combinaison du procédé selon l'invention avec la phase opératoire supplé mentaire d'introduction du 17a-hydroxyle au moyen d'un microorganisme 17a-hydroxylant,
par exemple un choisi dans le genre Trichothecium, le processus comprenant également la phase opératoire supplé mentaire d'oxydation d'un 11a- ou d'un 11(3-hy- droxyle, introduit au cours du processus, lorsque la 1-déhydrocortisone est le produit final souhaité.
On peut exécuter les diverses phases opératoires dans une séquence quelconque, sauf que la phase opératoire d'oxydation chimique vient à la suite du processus microbiologique qui introduit le 11-hy- droxyle.
Les transformations microbiologiques supplé mentaires sont des deux types suivants (1) introduction d'un groupe 11a- ou 11(3-hy- droxyle par l'action d'un organisme du type Rhizopus nigricans ou Curvularla lunata <I>;</I> et (2) introduction d'un groupe 17a-hydroxyle par l'action d'une culture d'un microorganisme hydroxylant choisi dans le genre Trichothe- cium.
Si l'on doit produire la 1-déhydrocortisone ou ses esters, alors en un point quelconque après l'introduc tion du groupe 11-hydroxyle, on oxyde le composé intermédiaire, de préférence sous la forme de son 21-ester, par exemple avec du trioxyde de chrome à des températures basses, pour convertir le 11-hy- droxyle en oxygène cétonique. Au cas, toutefois, où le 11-hydroxyle a la configuration (3, et que l'on désire obtenir le A'-dérivé d'hydrocortisone, on omet la phase opératoire d'oxydation.
Le groupe 17a-hydroxyle est introduit par un organisme hydroxylant choisi dans le genre Tricho- thecium, et de préférence le<I>T.</I> roseum, de la ma- nière et avec l'appareillage décrits par Meystre et coll., Helvetica Chim. Acta,<I>37</I> 1548 (1954).
<I>C. Conversion de la</I> 16-déhydroprogestérone <I>en</I> 1-déhydrocortisone <I>et</I> 1-déhydrocortisol Il est également possible de convertir la 16-d hydroprogestérone et ses esters, relativement peu coûteux, en 1-déhydrocortisol et 1-déhydrocortisone et leurs esters, tels que leurs esters alcanoïques infé rieurs, par un nombre relativement petit d'opérations chimiques et biochimiques supplémentaires au cours desquelles on obtient des composés intermédiaires nouveaux.
Ces opérations sont (a) introduction du groupe 17a-hydroxyle, qui peut se faire par passage par le 16,17- époxyde, et par le composé 16-iodo-17a- hydroxylé ; on enlève ensuite l'atome d'iode par réduction ;
(b) introduction d'un groupe 21-hydroxyle par l'action d'un microorganisme appartenant au genre Ophiobolus, par exemple O. herbo- trichus <I>;</I> (c) introduction d'un groupe 11a- ou 11(3-hy- droxyle par l'action d'un microorganisme ap proprié, comme décrit plus haut.
L'exécution du procédé selon l'invention doit, dans ce cas, suivre l'addition d'un groupe hydroxyle en une ou plusieurs des positions 11, 17a et 21, sans quoi les rendements seraient médiocres.
Au cas où le composé de départ possède un groupe ester en position 21, ce groupe ester sera hydrolysé, l'hydrolyse du groupe ester C21 étant gé néralement favorisée par un pH de 6,8 à 7,1 et une température d'environ 26 à 29 C.
Lorsque le produit final doit être de la 1-dé- hydrocortisone, on préfère introduire un groupe 11a- hydroxyle plutôt qu'un groupe 11 (3-hydroxyle, étant donné que le groupe lla-hydroxyle peut en général être introduit plus facilement et peut alors par la suite être oxydé en un groupe 11-cétonique. Au cas où on introduit un 11(3-hydroxyle dans la molécule du stéroïde, on peut conserver ce groupe à l'état inchangé dans le produit final pour donner le Ol- déhydro-dérivé d'hydrocortisone,
qui est de même très actif.
Les composés obtenus à la suite des opérations décrites ci-dessus, comprenant le procédé selon l'in vention, ont les structures indiquées dans les for mules VII à IX (feuille 1). Dans ces formules, X est H2, O, ou
EMI0005.0094
(a ou (3), tandis que R repré sente H, OH ou 0-acyle, l'une au moins des posi tions 11 et 21 comportant une fonction oxygénée.
Dans chaque cas, le reste acyle en position 21 est celui d'un acide carboxylique organique, mais de préférence d'un acide alcanoïque inférieur tel que les acides formique, acétique, propionique, butyrique, valérique ou caproïque, ou d'autres acides tels que des acides alcanoïques substitués et aromatiques comme les acides cyclohexyl-acétique, cyclopentyl- propionique et benzoïque.
Les exemples qui suivent illustrent des modes de réalisation du procédé selon l'invention. <I>Exemple 1</I> <I>Conversion du composé E de</I> Kehdall <I>en</I> 1,4-pré,nadiène-17a,21-diol-3,11,20-trione A partir d'une solution de 30 g d'extrait de le vure dans 3,0 litres d'eau de conduite contenant 13,2 g de phosphate acide monopotassique et 26,4 g de phosphate acide disodique (pH de la solution 6,9), on prélève 27 portions de 100 em3 chacune, on les place dans des fioles Erlenmeyer de 300<I>ce</I> et on les stérilise en autoclave pendant 15 minutes avec une pression de vapeur d'eau de 6,795 kg (1200 C).
Après -autoclavage et refroidissement du bouillon, on place 1 cm3 d'une suspension de Coryne- bacterium simplex (A. T. C. C. 6946) dans chaque fiole. On fait incuber en agitant les fioles sur une table à agitation faisant 220 tours par minute, à 28o C pendant 24 heures.
On prend 27 fioles Erlenmeyer et on y introduit 150 mg de composé E de Kendall (cortisone). On stérilise alors les fioles et leur contenu pendant 15 minutes à une pression de vapeur d'eau de 6,795 kg (120 C). A chaque fiole, on ajoute alors 5,0 c<I>e</I> d'éthanol. On transfère ensuite aseptique- ment la culture bactérienne de 24 heures dans les fioles stérilisées et on agite les suspensions résultantes sur une table à agitation faisant 220 tours par mi nute, à 28o C pendant 48 heures. Le pH final est de 7,2.
On réunit le contenu de toutes les fioles et on l'extrait avec un total de 9,0 litres de chloroforme en trois portions égales. On concentre alors les ex traits combinés en un résidu que l'on fait cristalliser à partir d'acétone-hexane. On obtient 1,1 g de 1,4- prégnadiène-17a,21-diol-3,11,20-trione, P. F. 210 215o C (déc.).
Plusieurs recristallisations supplémentaires élè vent le P. F. à 230-232 C (déc.) ; [a] D = + 175,3 (d'ioxane) ; ., s = 15.400 iméthanol). Analyse
EMI0006.0035
Calculé <SEP> pour <SEP> Cz1H.,;0;;
<tb> C <SEP> 70,37 <SEP> H <SEP> 7,31
<tb> Trouvé
<tb> C <SEP> 70,38 <SEP> H <SEP> 7,67 Le composé obtenu peut être acétylé comme suit A une solution de 0,5 g de 1,4-prégnadiène-17a, 21- diol - 3,11,20 - trione dans 5<I>ce</I> de pyridine anhydre, on ajoute 3 cm3 d'anhydride acétique. On laisse reposer le mélange réactionnel pendant une nuit à la température ordinaire, puis on le dilue avec de la glace et de l'eau.
On filtre le précipité résultant et on le recristallise à partir d'acétone-hexane. On obtient 0,35 g de 21-acétate de 1,4-prégnadiène- 17a,21-diol-3,11,20-trione ; P. F. 227-228 C (déc.). Après plusieurs recristallisations à partir d'acétone- hexane, il fond à 233-236 C (déc.).
<I>Exemple 2</I> Conversion <I>du composé F de Kendall</I> <I>en</I> 1,4-pr-égnadiène-11p,17a,21-triol-3,20-dione Comme décrit dans l'exemple 1, on traite 150 mg de composé F de Kendall (cortisol) dans chacune des 27 fioles Erlenmeyer. Le pH à la fin de la période d'agitation est de 7,0.
On réunit le contenu de toutes les fioles et on l'extrait comme décrit à l'exemple 1. On concentre alors les extraits réunis en un résidu qui pèse 3,75 g. Le P. F. du résidu est 227-232 C. A partir de 2,75 g de cette matière brute, en triturant avec 50 cm2 d'acétone et en refroidissant, on récupère par filtration 1,35 g de 1,4-prégnadiène-11(3,17a,21- triol-3,20-dione ; P. F. 237-2390 C (déc.). On peut récupérer une quantité supplémentaire de produit à partir de la liqueur-mère. La recristallisation à partir d'acétone élève le P. F. à 239-241 C (d'éc.).
[a] D5 = + 1070 (dioxane) ; a@3 = 14.600 (méthanol). Analyse : -
EMI0006.0066
Calculé <SEP> pour <SEP> C_>1H-,s0.;
<tb> C <SEP> 69,97 <SEP> H <SEP> 7,83
<tb> Trouvé
<tb> C <SEP> 70,24 <SEP> H <SEP> 8,13 Le composé obtenu peut être acétylé comme suit A une solution de 0,85 g de 1,4-prégnadiène- 11(3,17a,21-triol-3,20-dione dans 5<I>ce</I> de pyridine, on ajoute 3 cm3 d'anhydride acétique. On laisse reposer le mélange de réaction à la température ordinaire pendant une nuit, puis on le dilue avec de l'eau glacée.
On sépare du mélange le précipité résul tant par filtration et on le recristallise à partir d'acé- tone-hexane. On récupère 0,45 g de 21-acétate de 1,4-prégnadiène-11[3,17a,21-triol-3,20-dione ; P. F. 235-239o C. Par recristallisation, le P. F. s'élève à 237-239 C.
[a) D5 = + 116 (dioxane) ; = 15.000 (méthanol). Analyse
EMI0006.0081
Calculé <SEP> pour <SEP> C,.,H.;"O,;
<tb> C <SEP> 68,63 <SEP> H- <SEP> 7,51
<tb> Trouvé
<tb> C <SEP> 68,62 <SEP> H <SEP> 7,78 <I>Exemple 3:
</I> <I>Conversion du composé S de Reichstein</I> <I>en</I> 1,4-prégnadiène-17a,21-diol-3,20-diotte On stérilise comme précédemment 100 em2 d'un bouillon de culture concentré contenant 1 % d'ex- trait de levure, 9,0 cm3 de solution 0,2 molaire de KH.,PQ1 et 9,0 cm @ de solution 0,2 molaire de Na.3HPOI et on inocule avec suspension à 1,
0 % de Corynebacterium simplex (A. T. C. C. 6946) prove nant d'une culture en bouillon de 24 heures. On met incuber la culture ensemencée pendant 20 heures à 28#3 C, comme décrit à l'exemple 1. Après incubation, on transfère aseptiquement la culture en bouillon dans une seconde fiole Erlenmeyer stérile de 300 cm3, contenant 150,0 mg de composé S de Reich stein stérile (4-prégnène-17a,21-diol-3,20-dione) dans 5,0 cm3 d'éthanol ou d'acétone. Le pH du milieu de réaction est de 7,0.
La culture bactérienne conte nant le stéroïde et le solvant est mise à incuber et agitée pendant une durée de 48 heures à 280 C. Le pH final du mélange de réaction est 7,2r7,4. On extrait ensuite à fond la culture avec du chloro forme. On réunit les extraits et on les concentre à siccité sur bain de vapeur. L'extrait brut pèse 196,0 mg.
On triture l'extrait brut total avec du méthanol et on obtient 80 mg de solide cristallin ; P. F. 246 250o C. Après deux recristallisations à partir d'acé tone, le P. F. est de 246-249 C (déc.) ; [ajh' = -f-760 (CHC13) ; = 15.500 (C..H"OH).
EMI0007.0020
Calculé <SEP> pour <SEP> C.1H,s04
<tb> C <SEP> 73,22 <SEP> H <SEP> 8,19
<tb> Trouvé
<tb> C <SEP> 73,56 <SEP> H <SEP> 8,40 L'analyse spectrale infrarouge et l'analyse chimique établissent que le produit est de la 1,4-prégnadiène- 17a,21-diol-3,20-dione.
Le composé obtenu peut être acétylé comme suit A une solution de 0,25 g de 1,4-prégnadiène- 17a,21-diol-3,20-dione dans 2 cm-' de pyridine, on ajoute 1 cm3 d'anhydride acétique. On laisse reposer le mélange réactionnel à la température ordinaire pendant une nuit, puis on le dilue avec de -la glace et de l'eau. On filtre le précipité résultant et on le recristallise à partir de chlorure de méthylène-hexane, obtenant 0,20 g de 21-acétate de 1,4-prégnadiène- 17a,21-diol-3,20-dione ; P. F. 226,5-228 C.
En ce qui concerne l'acétylation des diènes dé crits dans les exemples 1, 2 et 3, il est évident qu'il est possible de préparer de même d'autres esters des composés diéniques, par exemple par réaction avec l'anhydride de l'acide ou avec son chlorure de manière connue.
Par exemple les formiates, pro- pionates, butyrates et valérates, de même que les esters d'autres acides non toxiques tels que les ben- zoates, et aussi les esters neutres et acides d'acides polybasiques tels que les acides succinique, maléique, malique, citrique, tartrique, phtalique et hexahydro- phtalique peuvent être ainsi obtenus. Dans le cas des esters acides, on peut former des sels métalliques de la manière courante par réaction avec l'hydroxyde, le carbonate ou bicarbonate du métal, par exemple des métaux alcalins et alcalino-terreux.
Au lieu de former les 1,4-diènes de cortisone et d'hydrocortisone et d'estérifier ensuite les produits, on peut soumettre les esters correspondants de cortisone et d'hydrocortisone au procédé de la présente invention et faire en sorte qu'ils fournissent les diènes des esters.
Ainsi, dans l'exemple 1, on peut remplacer le com posé E par son 21-ester ou par son 17a,21-diester, tandis que dans l'exemple 2, on peut remplacer le composé F par son 21-acétate, 17a,2,1-diacétate ou 11 (1,17a,21-triacétate ou par les lla-hydroxy-épi- mères correspondants, pour avoir les 11-épimères du diène du composé F et ses 21-esters et 17a,21-di- esters. Dans tous les cas, les polyesters peuvent être des esters mixtes.
Par exemple, par un traitement comme décrit pour la transformation du composé F en diène cor respondant (exemple 2), on peut convertir le 21-acé- tate du composé F en le 1,4-diène ou son 21-acétate, et isoler le produit par extraction au chloroforme et cristallisation à partir d'acétone. A partir de 1,0 g de 21-acétate de composé F, on obtient 0,22 g de 1-déhydrocortisol (IIa), P. F. 239-241C (déc.).
Lorsqu'on désire éviter la désacétylation, on uti lise les mêmes conditions que ci-dessus, sauf que la température pour le traitement du stéroïde de départ est élevée à 36 C. On isole le produit de manière habituelle. A partir de 1,0 g de 21-acétate de com posé F, on obtient de cette façon 0,13 g de 21-acé- tate de 1-déhydrocortisol (IIb), P. F. 237-239 C (déc.).
De même, en suivant le mode opératoire de l'exemple 1, on convertit 1,0 g de 21-acétate de cortisone en 1-déhydrocortisone, dont on isole 0,17 g, P. F. 230-232o C. Si on élève la température jusqu'à 360 C, à partir de .1,0 g de 21-acétate de cortisone, on obtient 0,11 g de 21-acétate de 1-déhydrocorti- sone, P.
F. 230-2333 C (déc.). <I>Exemple 4:</I> <I>Conversion du composé F de Kendall</I> <I>en</I> 1-déhydrocortisol A partir d'une solution de 1g d'extrait de levure dans 1,0 litre d'eau de conduite contenant 4,4 g de phosphate acide monopotassique et 8,8 g de phos phate acide disodique (pH de la solution: 6,9), on prélève 10 portions de 100 cm-3 chacune que l'on place dans des fioles Erlenmeyer de 300 ce.
Après autoclavage comme décrit à l'exemple 1 et refroidis sement du bouillon, on place dans chaque fiole 1 cm3 d'une suspension de Corynebacterium hoagii (Arne- rican Type Culture Collection 7005). On agite alors les fioles sur une table à agitation faisant 220 tours par minute, à 280 C pendant 16 1/2 heures.
Dans chacune des 10 fioles Erlenmeyer, on ajoute aseptiquement 50 mg de composé F de Ken dall (cortisol) en solution dans 1 cm3 de méthanol à 90 %. On replace les fioles sur l'appareil à agiter et on met incuber pendant 7 heures. Le pH à la fin de la période d'agitation est de 6,82. On réunit le contenu de tous les flacons et on l'extrait avec un total de 3 litres de chloroforme en trois portions égales. On concentre les extraits com binés en un résidu de 425 mg. La cristallisation du résidu à partir d'acétone fournit 248 mg de 1,4- prégnadiène-11(3,17a,21-triol-3,20-dione.
<I>Exemple 5:</I> <I>Conversion du composé de Kendall</I> <I>en</I> 1-déhydrocortisol A partir d'une solution de 0,5 g de Basamin Busch (marque de fabrique d'un extrait hydro soluble de levure autolysée) dans 1 litre d'eau de conduite, on prélève 10 portions de 100 ce cha cune, on les place dans des fioles Erlenmeyer de 300 ce.
Après autoclavage comme décrit à l'exem ple 1 et refroidissement du bouillon, on introduit dans chaque fiole 1 ce d'une suspension de Coryne- bacterium simplex. On agite alors les fioles sur une table à agitation faisant 220 tours par minute, à 280 C pendant 24 heures.
Dans chacune des 10 fioles Erlenmeyer, on ajoute aseptiquement 50 mg de composé F de Ken dall en solution dans 0,8 ce de méthanol absolu. On replace les fioles sur l'appareil à agiter et on les met incuber pendant de nouveau 4 à 7 heures. Le pH à la fin de la période d'agitation est de 7,2-7,6.
On combine le contenu de toutes les fioles et on extrait l'ensemble avec un total de 3 litres de chloro forme en 3 portions égales. On concentre les extraits combinés en un résidu de 490 mg. La cristallisation du résidu à partir d'acétone fournit 403 mg de 1,4- prégnadiène-11(3,17a,21-triol-3,20-dione ; P. F. 238 240,1 C (déc.) ; [a] = -1050 (dioxane) D ; Ee4s = 14.500 (méthanol).
En employant le composé E à la place du com posé F dans cet exemple et en augmentant la durée de conversion de 6 à 12 heures, on obtient de la déhydrocortisone brute avec un rendement de 85 %.
Cet exemple montre que le rendement est aug menté par une réduction de la concentration du com posé de départ.
<I>Exemple 6:</I> <I>Conversion du composé E en</I> 1-déhydrocortisone On met incuber le Bacillus sphaericus (A. T. C. C. 7055) sur un agar nutritif composé d'extrait Bacto- beef (marque de fabrique d'un extrait d'infusion aqueuse de viande), 3 g ; Bacto-peptone (marque de fabrique d'un produit à base de peptones), 5 g chlorure de sodium, 8 g ; agar, 15 g ; eau de conduite, 1 litre, pendant 24 heures à 280 C.
A 100 ce d'un bouillon nutritif stérile (composé d'extrait Bacto-beef , 3 g; Bacto-peptone , 5 g; et complété à 1 litre avec de l'eau de conduite) dans une fiole de 300 ce, on ajoute une cuillerée de la culture incubée et on met incuber le milieu de culture de nouveau pendant 24 heures à 28o C sur une machine à secouer dans des conditions d'aéro biose. On utilise le bouillon de culture ainsi obtenu comme inoculum à 1 %.
Dans chacune des 10 fioles contenant 100<I>ce</I> de bouillon nutritif stérile, on ajoute 1 em3 d'ino- culum. On agite les fioles sur un appareil à agitation rotatif faisant 240 tours/minute, dans des conditions d'aérobiose pendant 8 heures à 281, C. Après cette période de croissance, on ajoute aseptiquement à chaque fiole une solution de 25 mg de cortisone dans 0,5<I>ce</I> de méthanol ; on agite de nouveau et on met incuber pendant 24 heures en plus. Le pH final est voisin de 7,8.
On combine le contenu des fioles, on extrait au chloroforme et on traite de la manière habituelle, obtenant de la 1-déhydrocorti- sone. <I>Exemple 7:</I> <I>Conversion du composé F en 1-</I> déhydrocortisol On prépare un milieu de croissance à partir de 30 g d'extraits solubles de poissons (traités aux enzymes), 4,49 g de KH.,PO4 et 8,83 g de Na.HP04 - 7 HO, le tout étant dilué à 1 litre avec de l'eau de conduite. Le pH de ce milieu est voisin de 6,8. Dans chacune de 10 fioles de 300 ce, on place 100 ce du milieu de croissance et on traite les fioles et leur contenu en autoclave pendant 15 minutes sous une pression de vapeur d'eau de 6,795 kg.
A chaque fiole refroidie, on ajoute alors 1 ce de l'inoculum décrit dans l'exemple 6 et on laisse la croissance se poursuivre pendant 12 heures. A chaque fiole, on ajoute ensuite aseptiquement 25 mg d'hydrocortisone et on continue l'incubation en aérobiose pendant 24 heures supplémentaires. On traite alors le mélange de fermentation comme décrit précédemment pour la récupération du 1-déhydro- cortisol.
On peut modifier les modes opératoires des exem ples 6 et 7 en employant comme milieu nutritif un extrait de levure à 1 % dans de l'eau de conduite. <I>Exemple 8:</I> <I>Conversion du</I> 21-acétate <I>de</I> 4,6-prégnadiène-17a,21-diol-3,11,20-trione <I>en</I> 1,4,6-prégnatriène-17a,21-diol-3,11,20-trione 0,85 g de 2.1-acétate de 4,6-prégnadiène-17a,21- diol-3,11,20-trione (connu également comme acétate de 6-déhydrocortisone), obtenu de la manière décrite dans J.
Biol. Chem. 197, 261 (1952), est converti en 1,4,6-prégnatriène-17a,21-diol-3,11,20-trione de la manière décrite plus haut par action des enzymes d'une culture de Corynebacterium simplex, avec un rendement voisin de 18 %.
Ce nouveau triène pré sente des propriétés d'hormones adrénocorticales, mais il peut être hydrogéné partiellement en 1,4-diène correspondant (1-déhydrocortisone) par réduction dans des conditions relativement douces, par exem ple au moyen de zinc, d'acide acétique et d'acide ascorbique, de la manière décrite dans la publication citée.
On peut préparer, comme on vient de la décrire, d'autres 1,4,6-prégnatriènes à partir de composés de départ 4,6-diénique, et on peut de même hydrogéner partiellement ces prégnatriènes pour avoir les 1,4- prégnadiènes correspondants.
Le substituant en po sition 11 peut être un a- ou (3-hydroxyle ou il peut faire entièrement défaut ; le groupe en position 21 peut être un méthyle au lieu d'un hydroxyméthyle ou acyloxyméthyle. Ainsi, on peut convertir la 4,6- prégnadiène-11(3,17a,21-triol-3,20-dione par l'action des cultures révélées précédemment en 1,4,6-prégna- triène-11(3,17a,21-triol-3,20-dione, tandis que l'on peut convertir la 4,6-prégnadiène-17a,21-diol-3,20- dione en 1,4,6-prégnatriène-17a,21-diol-3,20-dione. Dans chaque cas,
on peut employer le 21-ester, le quel peut ou non être hydrolysé dans le processus. Par hydrogénation partielle comme décrit plus haut, on obtiendra les 1,4-prégnadiènes correspondants. <I>Exemple 9:</I> <I>Conversion</I> <I>de la</I> 4-prégnène-lla,17a,21-triol-3,20-dione <I>en</I> 1,4-prégnadiène-lla,17a,21-triol-3,20-dione On exécute la réaction exactement comme décrit pour la transformation du composé F en diène cor respondant et on isole le produit par extraction au chloroforme et cristallisation à partir d'acétone- hexane. Partant de 1,
0 g de 1.1-épi-composé F, on isole 0,25 g de 1,4-prégnadiène-11a,17a,21-triol- 3,20-dione à l'état de solide cristallin fondant à 245 246 C (déc.).
L'acétylation du diène du 11-épi-composé F (1,0 g) peut se faire par dissolution dans 15 cm3 de pyridine anhydre, suivie de l'addition de 0,3 g d'anhydride acétique. On laisse le mélange de réaction reposer à la température ordinaire pendant une nuit, puis on le verse dans un mélange de glace et d'eau.
On sépare par filtration le précipité résultant et on le recristallise à l'état de solide cristallin (21-acétate) à partir d'acétone-hexane. <I>Exemple 10:</I> 1,4-prégnadiène-9a-f luoro-21-ol-3,11,2 0-trione Dans une fiole Erlenmeyer de 300 em3, on ajoute 100 ce d'extrait de levure à 0,1 % contenant 9,
0 cm2 de solution 0,2 molaire de phosphate acide monopotassique et 9,0 cm3 de solution 0,2 molaire de phosphate acide disodique. On stérilise la fiole et son contenu en autoclave pendant 15 minutes à 120e C et on ajoute au milieu stérile 1 cm3 d'une suspension à 1 % de Corynebacterium simplex. On met incuber le flacon et son contenu à 280 C pen dant 24 heures.
Dans une seconde fiole Erlenmeyer de 300 cm-9, on ajoute 2 cm3 d'éthanol et 25 mg de 9a-fluoro- 11-déhydrocorticostérone. La culture âgée de 24 heu res est transférée aseptiquement dans la fiole conte- nant le stéroïde et on soumet le mélange à l'incu bation à 280 C et on l'agite pendant 10 heures. A la fin de cette durée, on extrait soigneusement le mé lange de réaction avec du chloroforme et on con centre les extraits chloroformiques en un résidu.
On fait cristalliser celui-ci à partir d'acétone-hexane, obtenant 4 mg de 9a-fluoro-1,4-prégnadiène-21-ol- 3,11,20-trione.
On peut préparer le 2.1-acétate de ce composé en faisant réagir 0,3 g d'anhydride acétique avec une solution de 1 g du 21-o1 dans 20 cm3 de pyridine anhydre à la température ordinaire pendant une nuit, après quoi on dilue avec de l'eau et de la glace.
De même, par le mode opératoire de l'exem ple 10, on obtient de la 9a-fluoro-1,4-prégnadiène- 11(3,21-diol-3,20-dione avec un rendement de 5 mg à partir de 25 mg de 9a-fluoro-corticostérone. On peut préparer le 21-acétate par le procédé d'acéty- lation habituel.
En employant une suspension à 1 % de Coryne- bacterium hoagii au lieu du C. simplex de l'exem ple 10, les autres conditions restant les mêmes, on convertit 25 mg de 9a-chloro-corticostérone en 9a- chloro-1,4-prégnadiène-11(3,21-diol-3,20-dione avec un rendement de 7 mg.
On peut convertir ce produit en 21-propionate par réaction avec de l'anhydride propionique. Avec la même culture (C. hoagii), on convertit le 21-acétate de 9a-bromo-corticostérone en 9a-bromo-1,4-prégnadiène-11(3,21-diol-3,20-dione.
Suivant le procédé de l'exemple 10, mais en uti lisant une période d'incubation de 48 heures à une température de 28() à 301, C, on convertit le 9a-fluoro- dérivé du composé F en 9a-fluoro-1-déhydrocortisol. Avec le même procédé, on convertit les 9a-fluoro, 9a-chloro et 9a-bromo-dérivés du composé E (cor tisone) respectivement en 9a-fluoro,
9a-chloro et 9a- bromo-dérivés de 1-déhydrocortisone. Les 9a-chloro et 9a-bromo-dérivés du composé F sont de la même manière convertis respectivement en 9a-chloro et 9a-bromo-dérivés de 1-déhydrocortisol.
On peut convertir les 17-désoxy-composés en 17a-hydroxy-composés correspondants (9a-halogéno- dérivés de 1-déhydrocortisol et 1-déhydrocortisone) par l'action d'une culture de Trichothecium roseum, comme décrit ci-dessus.
<I>Exemple<B>Il</B></I> 1,4-prégnadiène-17a,21-diol-3,20-dione On ajoute 1 cm3 d'un bouillon de culture, pré paré comme inoculum (1 0/0) suivant l'exemple 6, à chacune de 10 fioles contenant 100 cms de bouil lon nutritif stérile comme décrit dans cet exemple. On agite les fioles sur un appareil rotatif à - secouer pendant 8 heures, à 28ù C et à raison de 240 courses par minute.
Après cette période de croissance, on ajoute aseptiquement à chaque fiole une solution de 25 mg de composé S de Reichstein dans 0,5 cm3 de méthanol, puis on l'agite et la soumet à une incuba tion pendant 24 heures supplémentaires. Le pH final est de<B>7,8.</B> On réunit alors le contenu des fioles et on l'ex trait trois fois avec 2. litres de chloroforme par ex traction. On évapore à siccité les extraits chloro- formiques combinés, ce qui donne 310 mg de produit brut. On purifie le stéroïde brut par chromatographie sur le système chromatographique décrit par G. M.
Shull, extraits des publications du 126e congrès de l'American Chemical Society du 12 au 17 décembre 1954, page 9a, publication<B>NI,</B> 24. L'examen chroma- tographique montre une conversion quantitative de la matière de départ en diène lorsqu'on utilise un échantillon authentique du S-diène comme moyen de contrôle.
Ou bien, on recristallise le produit brut à partir d'acétone, ce qui donne 225 mg de 1,4-prégnadiène- 17a,21-diol-3,20-dione, P. F. 246-248# C.
<I>Exemple 12</I> 1-déhydrocortisol A partir d'une solution d'extrait de levure à 1 % dans de l'eau de conduite, on prélève 10 portions de 100 ce chacune, on les place dans des fioles de 300 ce et on les stérilise par autoclavage de 15 minutes sous une pression de vapeur d'eau de 6,795 kg.
Après autoclavage et refroidissement du bouillon, on place dans chaque fiole 1 cm3 d'une culture agitée de Bacillus sphaericus, cultivé en bouil lon de culture comme décrit dans l'exemple 11. On agite alors les fioles sur une table à agiter pendant 12 heures à 28e C, à raison de 240 courses par mi nute.
Dans chaque fiole, on ajoute aseptiquement une solution de 25 mg de composé F dans 0,5 ce de méthanol et on agite et met incuber les fioles et leur contenu pendant 8 heures supplémentaires.
Par combinaison du contenu de toutes les fioles et extraction avec du chloroforme comme décrit dans l'exemple 11, on obtient 304 mg de diène brut. On effectue la purification par recristallisation à par tir d'acétone avec emploi de charbon décolorant, et ainsi on obtient 230 mg de 1,4-prégnadiène-11p,17a, 21-triol-3,20-dione, fondant à 240-241 C.
En utilisant un total de 250 mg de 21-acétate de composé F au lieu du composé F proprement dit, on obtient 220 mg de 21-acétate de 1,4-prégnadiène- 11(3,17a,21-triol-3,20-dione, fondant à 237-239o C après recristallisation à partir d'acétone-hexane. <I>Exemple 13:
</I> 1-déhydrocortisone On prépare un milieu de croissance à partir de 30 g d'extraits solubles de poissons (traités aux enzymes), 4,49 g de KH2P04 et 8,83 g de Na.,HPO4. 7H20, que l'on dilue à 1 litre avec de l'eau de conduite (le pH de ce milieu est voisin de 6,8). Dans chacune de 10 fioles de 300 ce, on introduit 100 cm3 du milieu de croissance et on traite en autoclave les fioles et leur contenu pendant 15 minutes sous une pression de vapeur d'eau de 6,795 kg.
On inocule chaque fiole avec 1 cm' de culture de Bacillus sphaericus incubée comme dans l'exemple 12 et on laisse croifre pendant 12 heures. A chaque fiole, on ajoute ensuite aseptiquement une solution de 50 mg de composé E dans 1<I>ce</I> de méthanol, puis on continue l'agitation et l'incubation pendant 24 heures supplémentaires.
On combine le contenu des fioles et on l'extrait avec du chloroforme comme décrit dans l'exemple 11, obtenant 630 mg de diène brut du composé E. On purifie par recristallisation à partir d'acétone en pré sence de charbon décolorant, obtenant ainsi 420 mg de 1-déhydrocortisone, fondant à 233-235 C.
En opérant de façon analogue, on convertit la corticostérone en 1,4-prégnadiène-11(3,21-diol-3,20- dione. En utilisant le milieu de réaction et l'orga nisme décrits dans l'exemple 11, on transforme la 9a-fluoro-4-prégnène-110,17a,21-triol-3,20-dione en 1,4-prégnadiène correspondant que l'on obtient sous la forme d'un solide cristallin.
On peut de même convertir la désoxycorticosté- rone en 1,4-prégnadiène-21-ol-3,20-dione avec la culture décrite dans l'exemple 11.
Les exemples suivants illustrent diverses combi naisons de la réaction du procédé selon l'invention avec d'autres réactions microbiologiques. <I>Exemple 14:</I> 1,4-prégnadiène-17a-ol-3,20-dione En employant le mode opératoire décrit dans l'exemple 3, on déshydrogénise 150,0 mg de 4-pré- gnène-17a-ol-3,20-dione stérile (17a-oxy-progesté- rone) dans 5,0<I>ce</I> d'éthanol. L'extrait brut pèse 178 mg.
On fait cristalliser le produit brut à partir d'acétone-hexane, ce qui donne des cristaux purs de 1,4-prégnadiène-17a-ol-3,20-dione.
Ce produit peut conduire aux dérivés suivants <I>A.</I> 1,4-prégnadiène-11 a,17a-diol-3,20-dione On effectue cette conversion à l'aide d'une cul ture de Rhizopus nigricans de la manière décrite en détails dans J. Am. Chem. Soc., 74, 5933 (1952). A 6 litres d'un bouillon de culture de 24 heures de Rhizopus nigricans, on ajoute 1,0 g du diène dans 200 ce d'éthanol.
Après 48 heures, on extrait la culture avec du chlorure de méthylène, on évapore le solvant et on recristallise le résidu cristallin brut à partir d'acétone-hexane.
<I>B.</I> 1,4-prégnadiène-17a-ol-3,11,20-trione On ajoute lentement une solution de 3,0 g de diol, obtenu selon A, dans 30<I>ce</I> de pyridine à 1,5 g d'acide chromique dans 15 ce de pyridine (Poos et coll., J. Am. Chem. Soc.,<I>75,</I> 422 (1953)) et on agite le mélange résultant pendant une nuit à la température ordinaire. Au mélange de réaction, on ajoute alors 4,5 g de sulfite de sodium dans 45<I>cm:,</I> d'eau et on poursuit l'agitation pendant 2 heures. On verse le mélange de réaction dans 600 cm3 d'eau et on extrait la solution résultante avec du chlorure de méthylène.
On lave les extraits jusqu'à neutra lité avec de l'acide sulfurique dilué, du carbonate de sodium aqueux et de l'eau, et on sèche sur sul fate de magnésium. La concentration de la solution séchée et la cristallisation du résidu à partir d'acé- tone-hexane donnent de la 1,4-prégnadiène-17a-ol- 3,11,20-trione cristalline.
<I>C.</I> 1-déhydrocortisone On stérilise 4 litres d'extrait de levure à 1 % dans une fiole agitée et on inocule avec une souche de Ophiobolus herbotrichus. On soumet la culture à l'incubation pendant 3 jours en agitant à 27 C.
Ensuite, on ajoute aseptiquement à la fiole secouée 1,0 g de trione, obtenue selon B, dans 25 cm3 d'acé tone (stérile) et on poursuit l'agitation de nouveau pendant 3 jours à<B>270</B> C. On sépare le mycélium du milieu de réaction et on extrait à fond le mycélium et le filtrat aqueux avec 3 portions de chloroforme. On combine les extraits, on les lave à l'eau, puis on les sèche et les concentre.
On chromatographie la solution concentrée sur du Floricil (30 g) et on lave la colonne avec du chlorure de méthylène l'élution avec 0,5 % et 1,0 % de méthanol dans du chlorure de méthylène enlève la 1-déhydrocortisone qui est recristallisée à partir d'acétone-hexane. <I>Exemple 15:
</I> 1,4-prégnadiène-21-ol-3,20-dione On fait fermenter 150,0 mg de 4-prégnène-21- ol-3,20-dione stérile dans 5,0<I>ce</I> d'éthanol, dans le même milieu, avec le même microorganisme et de la même manière que dans l'exemple 14, obtenant un extrait brut pesant 137 mg. On fait cristalliser le produit brut à partir d'acétone-hexane, obtenant de la 1,4-prégnadiène-21-ol-3,20-dione cristalline.
<I>Exemple 16:</I> Le composé de départ peut être préparé comme suit On fait réagir à la température ordinaire, pen dant environ 15 heures, 1 g de 16-déhydroproges- térone, en solution dans 25 ce de chloroforme, avec la quantité équivalente d'acide perbenzoïque en solu tion dans du chloroforme. On ajoute alors de l'eau au mélange de réaction, on lave la couche organique avec une solution de sulfite de sodium, ensuite avec une solution de bicarbonate de sodium, de l'eau, puis on sèche sur du sulfite de sodium.
On évapore le chloroforme et on fait cristalliser le résidu à partir d'un mélange d'acétone et d'hexane, ce qui donne la 16,17-époxy-4-prégnène-3,20-dione.
On mélange une suspension de 1 g du 16,17- époxyde dans 10 ce d'acide acétique glacial avec une solution de 1,1 g d'acide iodhydrique aqueux à 47 %, 10 ce d'acide acétique et 4,1 g d'anhydride acétique. On maintient la température à environ 15-20 C pendant toute l'addition, puis encore pen dant 1/_ heure.
On verse ensuite le mélange dans 5 volumes d'eau, on filtre le précipité, on le lave à l'eau et on le sèche. Le produit brut, la 16-iodo-4- prégnène-17a-ol-3,20-dione, est dissous dans 100 ce d'éthanol et 1 ce d'acide acétique, puis on le fait bouillir sous reflux pendant environ 6 heures avec 2,5 g de catalyseur au nickel de Raney. On enlève ensuite le catalyseur par filtration, on concentre le filtrat et, par addition d'eau, on obtient un précipité de 4-prégnène-17a-ol-3,20-dione (17a-hydroxy-pro- gestérone).
On stérilise 4 litres d'un extrait de levure à 1 % dans une fiole agitée et on inocule avec une souche d'Ophiobolus herbotrichus. On met incuber la culture pendant 3 jours, avec agitation à 270 C ; on ajoute ensuite aseptiquement à la fiole agitée 1,0 g de 17a- hydroxy-progestérone dans 25 ce d'acétone (stérile), puis on continue à agiter pendant 3 jours supplé mentaires à 270 C.
On sépare le mycélium du mé lange de réaction et on extrait à fond le mycélium et le filtrat aqueux avec 3 portions de chloroforme. On combine les extraits, on les lave à l'eau, les sèche, les concentre et les chromatographie sur Flo- risil .
La matière obtenue à l'élution, par exemple avec 0,5 % à 1,5 % de méthanol dans du chlorure de méthylène, est cristallisée à partir d'acétone- hexane pour donner de la 4-prégnène-17a-21-diol- 3,20-dione.
On ajoute une solution de 1,0 g du composé ainsi obtenu dans 150 cm3 d'éthanol à 1 litre d'une culture de 24 heures de Rhizopus nigricans. Après une pé riode de transformation de 48 heures, on extrait le mélange avec du chlorure de méthylène et on éva pore l'extrait organique à siccité. On cristallise le produit brut à partir d'acétone-hexane pour avoir la 4-prégnène-11a,17a,21-triol-3,20-dione.
Le procédé selon l'invention s'exécute comme suit On soumet le composé de départ ainsi préparé à l'action d'une culture d'un microorganisme dés hydrogénant tel que le Corynebacterium simplex. Après incubation d'environ 48 heures à 28,1 C, on obtient la 1,4-prégnadiène-11a,17a,21-triol-3,20- dione.
On peut oxyder supplémentairement ce composé comme décrit plus haut en 1-déhydrocortisone.