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SUBSTANCE ANTIBIOTIQUE ET SON PROCEDE DE PREPARATION.
L'invention se rapporte à une substance antibiotique et à un procédé pour la préparer. Plus particulièrement, elle se rapporte à un an- tibiotique produit par un organisme isolé à partir d'un certain sol, et comprend des améliorations et découvertes corrélatives conduisant à la pro- duction d'un antibiotique d'efficacité particulière.
La croissance des bactéries et des moisissures dans des condi- tions prescrites bien définies, a produite au cours des années récentes des substances métaboliques qui se sont avérées être remarquablement effica- ces contre les organismes pathogènes. Sont comprises parmi ces substances la pénicilline, la streptomycine, l'auréomycine et la terramycineo
Un objet de la présente invention est de produire une substance antibiotique ayant une action bactéricide et/ou bactériostatique particuliè- re contraire aux organismes pathogènes, et plus spécialement.. vis-à-vis des organismes du type gram-positif et gram-positif acido-résistant.
Un autre objet de l'invention est d'apporter un procédé suivant lequel on peut préparer la substance antibiotique par la préparation d'un isolat à partir du sol, l'inoculation d'un milieu nutritif avec celui-ci.. la fermentation, et l'extraction de la substance antibiotique à partir du milieu fermenté.
D'autres objets de l'invention en partie seront évidents.. en partie ressortiront de l'exposé ci-aprèso
L'invention comprend donc plusieurs phases opératoires ; la re- lation d'une ou de plusieurs de ces phases opératoires avec chacune des au- tres, la composition possédant les caractéristiques et propriétés données en exemple dans ce qui est révélé ci-après en détails et la portée de l'in-
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vention seront indiquées dans les revendications.
Le micro-organisme qui produit la nouvelle substance antibioti- que a été isolée du sol d'un lopin de terre à Brooklyn., New-York et, pour des raisons d'identification, l'organisme a été désigné par Streptomyces crystallinus.
On peut isoler le micro-organisme à partir du sol en agitant ce dernier dans un milieu aqueux, en laissant décanter ensuite, et en mé- langeant le liquide surnageant avec une solution contenant des sels de mé- taux alcalins et alcalmo-terreux, en chauffant ensuite à une température inférieure à 100 C et en maintenant cette température pendant un certain laps de temps.
On effectue la préparation de la substance antibiotique en ino- culant un milieu nutritif avec le micro-organisme isolé du sol. Le milieu nutritif contient avantageusement des sels minéraux essentiels et des carbo- hydrates et matières azotées assimilables. On effectue ensuite de façon aérobie la fermentation du milieu, avec une valeur de pH d'environ 6,0 à environ 8,0, de préférence voisine de 7,5, la température étant de l'ordre de 28 C, et on permet à la fermentation de se poursuivre pendant une pério- de de plusieurs jours. De plus, la croissance et le mycélium aérien se pro- duisent à 24 ,32 et 37 C., comme cela a été déterminé sur des milieux pomme de terre-dextrose-agar.
Le milieu de fermentation, désigné fréquemment par bière, est filtré, éliminant ainsi le mycélium; on récupère la substance antibiotique du filtrat par une extraction, par exemple avec un solvant non miscible à l'eau comme le n-butanol, le butanol secondaire et l'acétate d'amyle.
Le nouvel antibiotique a été préparé à l'état amorphe et haute- ment purifié. La matière première pour la préparation d'une matière à très grande pureté est d'habitude un solide lyophilisé, préparé comme indiqué dans la suite. Cependant,. on peut utiliser trois filtrats combinés de buta- nol pour une purification supplémentaire, évitant ainsi la phase de lyophi- lisation. On a préparé le nouvel antibiotique dans un état de grande pure- té en soumettant ces préparations partiellement purifiées à une chromatogra- phie d'adsorption ou de partition.
On donne ci-après les résultats des ana- lyses élémentaires de quatre préparations du nouvel antibiotique
EMI2.1
<tb> C <SEP> H <SEP> N
<tb>
<tb> 1 <SEP> 53.90 <SEP> 6,30 <SEP> 3,06
<tb>
<tb> II <SEP> 53.49 <SEP> 6,64 <SEP> 2,79
<tb>
<tb> III <SEP> 53.93 <SEP> 6,Il <SEP> 3,02
<tb>
<tb> IV <SEP> 53,20 <SEP> 6,16 <SEP> 2,92
<tb>
<tb> Calcul <SEP> pour <SEP> 53,6 <SEP> 6,20 <SEP> 2,98
<tb>
C21H29NO11.
La préparation I a été préparée à partir d'un solide brut lyophilisé par l'emploi d'un chromatogramme de partition.
La préparation II est la même qu'en I sauf que la matière a été redissoute et reprécipitée à partir de deux systèmes solvants.
La préparation III est préparée à partir d'un solide lyophilisé par l'emploi d'un chromatogramme de partition légèrement différent de celui
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utilisé dans la préparation I.
La préparation IV est la même qu'en I sauf qu'elle a été repassée sur une colonne de charbon actif.
Le tableau I montre les coefficients de distribution pour le nouvel antibiotique dans divers systèmes aqueux à deux phases.
EMI3.1
<tb>
TABLEAU <SEP> I <SEP> - <SEP> Coefficient <SEP> de <SEP> distribution.
<tb>
<tb>
<tb>
Système <SEP> solvant <SEP> Coefficient <SEP> de
<tb> distribution
<tb>
<tb>
<tb> n-butanol <SEP> eau <SEP> 1
<tb>
EMI3.2
50 de n-butanol et 50% acétate d'éthyle-eau 1 20% If" fi 80% rr n Il p " 1/4 10% If" fi 90% " " fi - Il 1/9
EMI3.3
<tb> n-butanol <SEP> -- <SEP> tampon <SEP> aqueux <SEP> pH <SEP> 9 <SEP> 1,2
<tb>
EMI3.4
50% de n-butanol et 50% d'éther de pétrole-tampon 1/6 aqueux pH 90 méthy1-éthy1"-cétone -- tampon aqueux pH 9 1/5 10% de n-butanol et 90% de méthyl-éthyl-eétone--eau 1/2 25j " 7510" fi n tu -- If 1/2 5a{o Il If 5CY/o fi fi" - Il 1/3
Le nouvel antibiotique est très soluble dans l'eau (1 gramme ou plus par cm3) et facilement soluble dans le méthanol et l'éthanol (plus de 100 mgo par em3).
L'antibiotique est un peu moins soluble dans le bêta- méthoxyéthanol, le 1,4 dioxane et le n-butanol (plus de 40 mg. par em3) et aussi dans la formamide et la diméthylformamide (plus de 30 mg. par cm3)o L'antibiotique est médiocrement soluble dans l'acétone et la méthyl-éthyl- cétone (envion 4 mg. par cm3) et est encore un peu moins soluble dans la diéthyl-cétone et l'acétate d'éthyle saturé d'eau (1-1,5 mg par cm3)o L'an- tibiotique a une très faible solubilité dans l'acétate d'éthyle (0,4 mg. par cm3) et il est insoluble dans les solvants tels que le chloroforme,
EMI3.5
l'éther, le benzène,l'4ther de pétrole, etc.. L'antibiotique se dissout dans le pentanol chaud (plus de 30 mg. par cm3) mais il précipite lorsque la solution est refroidie à la température ordinaire.
Des chromatogrammes exécutés à 26 C ont donné les valeurs sui- vantes de Rf :
EMI3.6
<tb> système <SEP> solvant <SEP> valeurs <SEP> de <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 98% <SEP> d'acétate <SEP> d'éthyle <SEP> et <SEP> 2% <SEP> de <SEP> n-butanol <SEP> saturés <SEP> 0,12
<tb>
<tb>
<tb> avec <SEP> de <SEP> l'eau
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> n-butanol <SEP> saturé <SEP> avec <SEP> de <SEP> l'eau <SEP> 0,96
<tb>
EMI3.7
n-hexanol aaturé avec de la foirnamide 0,25
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On a constaté que le nouvel antibiotique est un composé relati- vement stable en solution aqueuse. Cette conclusion est vérifiée par le ta- bleau II.
TABLEAU II - Stabilité du nouvel antibiotique en solution aqueuse dans dif- férentes conditions de pH et de température.
EMI4.1
<tb> pH <SEP> temps <SEP> en <SEP> C <SEP> % <SEP> d'activité <SEP> restante <SEP> . <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 2 <SEP> 25 <SEP> 94
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 2 <SEP> 25 <SEP> > <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 2 <SEP> 25 <SEP> 89
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 4-1/2 <SEP> 25 <SEP> 93
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 4-1/2 <SEP> 25 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 4-1/2 <SEP> 25 <SEP> > <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 1 <SEP> 65 <SEP> 91
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 1 <SEP> 65 <SEP> 89
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 1 <SEP> 65 <SEP> 65
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 3 <SEP> 65 <SEP>
94
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 3 <SEP> 65 <SEP> 95
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 3 <SEP> 65 <SEP> 85
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 1 <SEP> 100 <SEP> 96
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 1 <SEP> 100 <SEP> 82
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 1 <SEP> 100 <SEP> 46
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> 76
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> 81
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> 48
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> HCl <SEP> 0,1n <SEP> 1 <SEP> 25 <SEP> 89
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> HCl <SEP> 0,1n <SEP> 4 <SEP> 25 <SEP> 94
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> HCl <SEP> 0,1n <SEP> 1 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> NaOH <SEP> 0,1n <SEP> 1 <SEP> 25 <SEP> 70
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> NaOH <SEP> 0,1n <SEP> 4 <SEP> 25 <SEP> 40
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> NaOH <SEP> 0,
1n <SEP> 1 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb>
Le spectre d'absorption infrarouge de l'antibiotique dans une huile minérale (Nijol) mull présente des maxima approximativement aux lon- gueurs d'onde suivantes 3400, 1725 1660, 1620, 1283, 1215, 1170, 1137, 1070, 1028, 964, 915, 850, 816 et 722 cm La portion caractéristique du spectre d'absorption infrarouge dans l'intervalle de 1350 à 650 cm-1 est représentée dans la figure 1 des dessins.
Le tableau III donne un aperçu des doses du nouvel antibiotique, par comparaison avec l'auréomycine et la terramycine, requises pour donner
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une prolongation significative et comparable des temps de survivanée des animaux traités, comparés à des animaux de contrôle non traités, lorsque les agents d'infection sont mortels. Les animaux essayés sont des poulets
EMI5.1
pour le test au Salmonella et des souris pour le test au VoTuberculosiso
EMI5.2
<tb> TABLEAU <SEP> III <SEP> - <SEP> Prolongation <SEP> de <SEP> survivance.
<tb>
EMI5.3
-----¯¯¯¯¯¯-¯¯-¯..¯..¯-------------------,----,.¯,.¯¯-
EMI5.4
<tb> nouvel <SEP> antibiotique <SEP> chlorhydrate <SEP> d'auréomycine.
<tb>
<tb>
Nombre <SEP> quantité <SEP> de <SEP> nombre <SEP> quantité <SEP> de <SEP> chadoses <SEP> chaque <SEP> dose <SEP> doses <SEP> que <SEP> dose <SEP> en <SEP> mg/kg
<tb> en <SEP> mg/kg <SEP> du <SEP> du <SEP> poids <SEP> du <SEP> corps
<tb> poids <SEP> du <SEP> corps
<tb>
EMI5.5
Salmonella , 15 l 65
EMI5.6
<tb> gallinarum
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mycobacterium
<tb> tuberculosis <SEP> 15 <SEP> 200 <SEP> 15 <SEP> > <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> chlorhydrate <SEP> de
<tb>
EMI5.7
terram.vcine 0
EMI5.8
<tb> Nombre <SEP> quantité <SEP> de <SEP> chaque
<tb> doses <SEP> dose <SEP> en <SEP> mg/kg <SEP> du
<tb> poids <SEP> du <SEP> corps.
<tb>
<tb>
Salmonella
<tb> gallinarum <SEP> 4 <SEP> 65
<tb>
EMI5.9
Nycobacterium tuberculosis 15 > 100 ---------------------.------------------------------------------------- Toxicitéo
L'antibiotique a été administré en solution aqueuse. Les animaùx ont été observés pendant deux semaines ; toutefois tous les décès se produisirent dans l'intervalle d'une heure. Les décès sont rapportés en nombre de souris mortes/nombre de souris traitéeso
EMI5.10
Intraveineuse - dose en m,(k
EMI5.11
<tb> 1000 <SEP> 1100 <SEP> 1180 <SEP> 1250
<tb>
<tb> 1/20 <SEP> 4/10 <SEP> 8/10 <SEP> 9/10
<tb>
EMI5.12
5 -lllo mg/kg; limites 19/20 1067 - 1154 mg/kg.
Intrapéritonéale -
La plupart des décès se produisirent dans les 24 heures mais certains ont été recules jusqu'à 10 jours. Tous les animaux ont été observés pendant deux semaines.
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EMI6.1
<tb> dose <SEP> en <SEP> mg/kg
<tb>
<tb> 1000 <SEP> 1250 <SEP> 1500 <SEP> 2000 <SEP> 2500 <SEP> 3000
<tb> 0/20 <SEP> 0/20 <SEP> 4/20 <SEP> 0/10 <SEP> 1/10 <SEP> 2/10
<tb>
La LD50 intrapéritonéale n'a pas été déterminée à cause de sa faible toxicité aiguë.
Plus particulièrement., on peut effectuer l'isolement de l'orga- nisme du sol de la manière suivante
On secoue parfaitement 10 g du sol dans 10 cm3 d'eau stérile et on laisse décanter à part pendant environ 10 à 20 minutes. On retire 10 gouttes du liquide surnageant et on les mélange à 10cm3 d'une solution, contenant les chlorures de sodium= potassium et calcium et qui a la compo- sition suivante chlorure de sodium, 3 g.; chlorure de potassium, 2 g.; chlorure de calcium, 2 g.; d'eau distillée, 1000 cm3. On enlève 5 gouttes de la suspension saline surnageante et oh les transfère dans un flacon de 25cm3. On chauffe le restant de la suspension pendant environ 15 minutes vers 53 C. On place 5 gouttes de chaque suspension saline, chauffée et non chauffée, dans des flacons de 125 cm3.
On ajoute suffisamment d'agar à chaque flacon pour faire une plaque, chacune de la première dilution. Bien agiter et verser dans des boîtes de Petri (dilution 1). Ajouter suffi- samment d'agar aux mêmes flacons pour faire deux plaques pour chaque fla- con (dilution 2, deux plaques pour chaque flacon). Ajouter une nouvelle quantité d'agar aux mêmes flacons, mélanger et verser dans des boîtes de Petri (dilution 3, une plaque de chacun). Les plaques sont mises de côté à une température d'environ 28 C, pendant environ 4 jours à environ 8 jours.
Les organismes sont recueillis et étendus sur des milieux pomme de terre- agar stériles et de nouveau recueillis après 7 à 8 jours. L'agar peut avoir la composition suivante :dextrose, 10 g.: asparagine, 0,5 g.; phosphate monopotassique 3,5g; phosphate dipotassique, 0,5 g.; extrait de boeuf, 20 g.; agar, 30g.; eau distillée, 1000 cm3 ; valeur du pH étant voisine de 6,2.
L'organisme qui a été isolé du sol de Brooklyn, et qui est dé- signé maintenant par Streptomyces cyrstallinus, peut être caractérisé comme suit :
Sur gélatine : pellicule sur le côté du tube de verre, Mycé- lium brun-foncé. Spores blanc terne. Du brun-foncé à un quart de la hau- teur à partir du haut, se déprimant au centre. Légère liquéfaction de la gélatine.
Sur bouillon de dextrose :pas d'anneau ou de pellicule. Crois- sance couleur de tan au fond du tube. Liquide rouge-'brun,
Sur Czapek-Dox : bonne croissance. Les spores sont blancs.
Pas de pigment diffusible.
Sur tournesol-lait : pH 6,5. Anneau attaché autour du verre.
Mycélium brun. Spores blancs. Sédiment couleur du tan au fond du tube.
Liquide brun opaque.
Sur pomme de terre-agar : Mycélium brun foncé. Spores blancs.
Pigment diffusible brun moyen.
Sur tampon de pomme de terre : Mycélium brun foncé. Spores gris avec pigment diffusible brun clair.
Sur tampon de carotte : croissance très clairsemée. Spores gris, pas de diffusion.
Hyphes minces, ténues, brunes, de 1 - 1,5 de diamètre, rami- fication monopode, spores portées dans des hyphes sporulées, diamètre des spores de 1 , pas de spirales.
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Les cultures de S. Crystallinus forment de façon caractéristi- que des rosettes de cristaux à proximité du substrat de mycélium sur les milieux suivants :Agar de Bennett, agar d'Emerson, agar de dextrose Waksman, agar dextrose-nitrate, agar-extrait de levure., agar-asparagine, agar-dex- strose- pomme'de terre et gélatine. Toutefois., ces cultures ne forment pas ces cristaux sur l'agar Czapek Dox ou l'agar-amidon. Sur agar synthétique (agar Czapek Dox), les conidiophores sont parfois en buissons. c'est-à-dire avec des conidiophores centraux courts desquels partent un certain nombre de longues branches, la structure entière ayant 115 ou plus en hauteur.
Il y a aussi des conidiophores qui sont extrêmement longs avec branches por- tées isolement et sur des côtés opposés, la longueur totale étant aussi grande que 660 . Les conidies sont cylindriques et ont une longueur de 1 à 1,8 .
Il est bien entendu que, pour la production de l'antibiotique, on n'est pas limité à ce ou ces organismes particuliers obtenus à partir de cet échantillon particulier de sol, ou aux organismes répondant entière- ment à la description ci-dessus, celle-ci étant donnée simplement à titre explicatif. En particulier, la présente invention comprend l'emploi d'orga- nisme qui sont des espèces mutantes produites à partir de l'organisme de'*--; érit à l'aide d'agents de mutation tels que les rayons X, les rayons ultra- violets, etc..
La substance antibiotique est produite par culture de l'organis- me par inoculation d'un milieu nutritif qui contient des sels minéraux es- sentiels et des matières carbohydratées et azotées assimilables, et par fer- mentation aérobie. Le milieu nutritif peut contenir comme source de carbo- ne par exemple de l'amidon, de la dextrine, du maltose, du dextrose, du xy- lose, du galactose, et du glycerol et, comme source d'azote, par exemple des amino-acides, de la caséine ou des hydrolysats de caséine, de la farine de fève de soja, des peptones comme la peptone de soja, de la peptone brute, de la "Neopeptone", de la "Tryptone", de la liqueur d'extraction du mais., des extraits de viande, et des produits solubles de distillerie, des sub- stances minérales comme le sodium, le potassium, le calcium et le magnésium, pouvant être sous la forme de chlorures,
sulfates, phosphates, etc.. On peut faire appel aux éléments dits traceurs comme le bore, le polybdène et le chrome. Ceux-ci sont requis en quantités si minimes qu'ils peuvent être entièrement fournis sous forme d'impuretés dans les constituants utiliséso La fermentation peut se faire avantageusement dans des flacons Erlenmeyer de capacité désirée, et les flacons sont secouas, pour effectuer l'aération, sur une machine à secouer., pendant une durée appropriée, la solution étant à une valeur de pH allant d'envion 6,5 à environ 8,0, de préférence à un pH voisin de 7,5.
On peut produire l'aération en forçant 1/4-1 volume (d'habitude environ 1/2 volume) d'air stérile par volume de milieu par minute à travers le mélange en fermentation. On peut produire une agitation supplémentaire au moyen d'un agitateur ou turbine mécanique. Il peut être requis d'ajouter un agent anti-mousse comme 1% d'octadécanol dans de l'oléfine de lard. Tout le processus opératoire est exécuté suivant des techniques stériles.
Pour préparer des inocula , on transfère des petits morceaux d'agar de tubes d'essai d'agar par la technique stérile standard à des lots de 100 cm3 de milieu stérile dans des flacons Erlenmeyer de 500 cm3. Ces flacons sont soumis à l'incubation sur des appareils mécaniques à secousses, à une température voisiné de 28 C, pendant environ 2 jours. De 100 à 200 cm3 de cet inoculum primaire sont utilisés pour inoculer approximativement 4 li- tresde milieu stérile dans une bouteille de verre de 9 litres, qui est mise à incuber pendant 20 à 60 heures, d'habitude 30 heures, à une température d'environ 24 à environ 35 C, de préférence d'environ 28 C.
Ensuite 6 à 12 litres, de préférence 8 litres, de l'inoculum en bouteille sont utilisés
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pour inoculer 1000 à 2000 litres de milieu stérile dans des feimentateurs.
Les fermentations sur une grande échelle sont exécutées de préférence à une température d'environ 24 à environ 35 C, de préférence de 26 à 28 C, et pendant environ 40 à environ 80 heures, particulièrement pendant environ 60 à environ 65 heures.
Comme milieu nutritif, ce qui suit a donné satisfaction en pro- duisant une bonne croissance et un bon rendement en antibiotique, et aussi parce que les ingrédients sont relativement peu coûteux et facilement obte- nables M-1 Cerelose 1 g.
Sucrose 0,5 g.
Hydrolysat de caséine 0,5 g.
Carbonate de calcium 0,5 g.
Chlorure de sodium 0,25 g.
Levure entière séchée désalifiée 0,12 g.
Eau de distribution pour faire 100 cm3.
L'intervalle de pH est de 6,8 environ à 7,1 environ avant sté- rilisation sous une pression de 1,05 kg./cm2 de vapeur pendant 30-45 minutes, et il est de 7,0 à 7,3 après stérilisation,
Comme autres milieux de fermentation ou de nutrition, on peut utiliser les compositions suivantes. Il est entendu que la différence en- tre les pourcentages indiqués et 100 est complétée par de l'eau.
M-2 Peptone de soja 0,5%
Extrait de levure 0,2%
Chlorure de sodium 0,25% Maltose 1,0%
Cerelose 0,5%
Carbonate de calcium 0,5% M-3 Hydrolysat de caséine 0,5%
Chlorure de sodium 0,5%
Dextrose 1,0%
Extrait de boeuf 0,05% M-4 Liqueur d'extraction de mais 1,25%
Lait écrémé en poudre 0,25% Maltose 1,0%
Phosphate ammonique monobasi- que (MH4)2HPO4 0,2%
Phosphate potassique monobasi- que KHPO 0,15%
Phosphate potassique dibasi- que KH2PO4 0,05%
Sulfate de magnésium MgSO4#7H2O 0,025%
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M-5 Amidon de mais 1 g.
Peptone. de soja 1,5 g.
Chlorure de sodium 0,2 g.
EMI9.1
(NH4)zHPO4 0,2 g.
KHPO, 0,15 go
EMI9.2
K2HPO4 0, 05 go gSV,o I11,V 0,025 go pH de 5,12 avant stérilisation.
On a' observé qu'après avoir mis fermenter le milieu M-2 pendant 4 jours,le pH de la solution est de 7,4 à 7,5 et qu'il contient 60 unités par cm3. Les unités mentionnées ici et par la suite sont des unités de dilution én tube. Après cela, on filtre le milieu et on fait des tests bactériologiques'sur la bière ou filtrat en ce qui concerne les inhibitions, on extrait en vue d'obtenir l'antibiotique sous une forme relativement pu- re.
Il y a lieu de mentionner que le S. crystallinus produit appa- remment d'autres antibiotiques en plus de l'antibiotique de la présente in- vention, et que le milieu employéde même que d'autres conditions de la fermentation, exercent un effet sur les proportions relatives des différents antibiotiques produits. On a constaté que le So hemolvticus C-203 est spé- cialement sensible à l'antibiotique de la présente invention au point que cet organisme peut être employé pour l'essai de la matière..
Le Besubtilis, d'autre part, est beaucoup moins sensible à l'antibiotique, La relation inverse de sensibilité a toutefois été trouvée pour d'autres antibiotiques
EMI9.3
produits par le Se Orystallinus, et une partie particulière du processus de purification décrit ici est destinée à la séparation de l'antibiotique désiré des autres.
Les résultats suivants montrent que le milieu peut altérer sen- siblement les proportions relatives des différents antibiotiques produits par le S. crystallinus:
Milieu
Peptone de soja 1,5 go
Amidon de mais 1,0 g.
EMI9.4
(NH4)2HP04 0 2 go KH2PO4 0,15 g.
EMI9.5
K2HP04 0, 05 g. gSO, o 1i1z0 0,025 go
NaCl 0,2 g.
Solution d'éléments traceurs (WiscoA-Z) 0,1 o
Eau distillée pour faire 100 cm3.
En utilisant le milieu ci-dessus et en faisant l'incubation dans de petits récipients sur des appareils rotatifs à secousses à 28 C, on a constaté que le pH initial de fermentation est critique dans la pro- duction de l'antibiotique désiré qui est actif contre l'organisme G-203 pré-
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férentiellement aux autres qui sont actifs contre 1e B. subtilis et vice- vérsa.' Des résultats d'essais typiques de bières de fermentation sont les suivants
EMI10.1
<tb> pH <SEP> initial <SEP> lectures <SEP> de <SEP> zone.
<tb>
<tb>
B. <SEP> subtilis <SEP> C-203.
<tb>
<tb>
5 <SEP> 0 <SEP> 8,4
<tb>
<tb> 6 <SEP> 0 <SEP> 6,0
<tb>
<tb> 7 <SEP> 4,9 <SEP> 3,6
<tb>
<tb> 8 <SEP> 4,0 <SEP> 4,8
<tb>
Les lectures de zone indiquées plus haut sont faites en déter- minant la largeur de la zone entre l'arête de la gouttière dans l'agar (la solution d'antibiotique étant dans la gouttière) et l'arête de la zone.
Des essais ont montré que la liqueur de fermentation à partir du milieu 9-2 inhibe un certain nombre d'organismes. les résultats obtenus étant les suivants :
EMI10.2
7 T.DoU./ma1 15 leDeU,,em3 Bicrococcus pyogenes var.aureus 209 - (1) + (2)
EMI10.3
<tb> rr <SEP> " <SEP> Il <SEP> " <SEP> C <SEP> ¯ <SEP> +
<tb>
EMI10.4
it il n il y + + fi Il Il Il H + +
EMI10.5
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> C <SEP> 203 <SEP> ¯ <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> W. <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> P. <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> R.
<SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pneumococcus <SEP> III- <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> M <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> (Enterococcus) <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C-203 <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb> (Haemolyticus)
<SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> Coli <SEP> B- <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 41 <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> B
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> Norwich <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> Vulgaris <SEP> OX19 <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> B <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
EMI10.6
Micrococm1,s L + +
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb> (Suite) <SEP> 7 <SEP> T.D.U/cm3 <SEP> 15 <SEP> T.D.U./cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cobacterium <SEP> smegmatis <SEP> 607 <SEP> + <SEP> (1)
<SEP> + <SEP> (2)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacyllus <SEP> cereus <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> + <SEP> +
<tb>
En plus de ce qui précède, l'antibiotique inhibe aussi, in vi- tro, le Mycobacterium tuberculosis BCG à la dilution de 1-640 et le Mycobac- terium tuberculosis H 37 rv (souche résistante à la streptomycine) à la di- lution de 1-160.
L'extraction de l'antibiotique peut se faire de la manière sui- vante
Procédé A.
On peut extraire la substance antibiotique de la liqueur de fer- mentation en prélevant 4 litres de cette dernière., en ajustant la valeur du pH entre environ 6,9 et environ 7,9, de préférence environ 7,5, en ex- trayant à trois reprises, chaque fois avec un litre d'un solvant non misci- ble à l'eau qui peut être du n-butanol, du butanol secondaire, de l'acétone, de l'acétate d'amyle ou de l'alcool amylique. Le solvant, par exemple du butanol, est séparé et porté à une valeur de pH d'environ 1,7 à environ 3,3, de préférence environ 2,2 à environ 2,5, avec un acide minéral dilué tel que l'acide sulfurique à 10%.
En vue de séparer l'eau, on ajoute environ 1500 cm3 de n-penta- ne à la solution de butanol, suite à quoi on élimine à peu près 300 cm3 d'une solution aqueuse brun clair au moyen d'un entonnoir séparateur. Au lieu de n-pentane, on peut utiliser du chloroforme, du tétrachlorure de carbone ou de l'hexane.
On lave ensuite le butanol avec 200 cm3 d'eau distillée, on se- coue dans un entonnoir séparateur, et on récupère la solution aqueuse. On concentre ensuite la solution à la température ordinaire sous un ventilateur.
Après réduction au dixième., on ajoute un volume et demi d'acétone, on sépa- re par filtration le précipité résultant, on évapore l'acétone ; les 100 cm3 résultant de la solution légèrement brune montrent à l'essai 200 unités par cm3.
Un autre procédé consiste à acidifier la liqueur de fermentation à une valeur de pH d'environ 1,7 à environ 3,3, de préférence environ 2,2, avec un acide minéral comme l'acide sulfurique et à extraire à trois repri- ses avec 1000 cm3 de n-butanol pour chaque extraction. Il se forme un pré- cipité brun foncé dans le butanol, on l'élimine par essorage et on neutrali- se la solution de butanol limpide et brun foncé avec un alcali convenable, par exemple de l'ammoniaque et des carbonates, bicarbonates et hydroxydes de sodium et de potassium.
On ajoute 1500 cm3 de n-pentane et on récupère 300 cm3 d'une so- lution brun foncé. On lave ensuite le butanol avec 200 cm3 d'eau distillée.
On réunit les deux portions, on évapore à la température ordinaire sous un ventilateur, et on concentre cinq fois. On reprend alors le concentré avec cinq fois son volume d'acétone. Il se forme un précipité abondant brun fon- cé que l'on aépare par filtration ; les 100 cm3 résultants de liqueur brune donnent à l'essai 200 unités par cm3.
Procédé B (1) - inactivité (2) + inhibition
<Desc/Clms Page number 12>
Les antibiotiques du B.subtilis sont adsorbés par un silicate magnésien hydraté synthétique de formule approximative MgO.2.5 SiO2.H2O.
L'antibiotique de l'invention, qui est actif contre l'organisme C-203, n'est pas aussi adsorbé par le "Magnesol". La purification de l'antibiotique im- plique par conséquent, au pH de la récolte, d'agiter le bouillon de fermen- tation ou bière avec 0,5% de "Magnesol" et de filtrer alors la suspension en utilisant un agent auxiliaire de filtration et un filtre-presse. L'ac- tivité est ensuite adsorbée à partir du filtrat de "Nagnesol" sur du char- bon actif (tel du "Norit"). d'où l'antibiotique peut être élue avec du n-butanol saturé d'eau. Bien que le n-butanol saturé d'eau soit l'éluant préféré.. d'autres éluants satisfaisants sont par exemple la méthyl-éthyl- cétone saturée d'eau, l'eau saturée de méthyl-éthyl-cétone, et l'eau satu- rée d'acétate d'éthyle.
Le méthanol et l'acétone peuvent être employés.
Pour une bonne récupération, il faut plus d'une élution au butanol. Les éluats de butanol sont réunis, et on concentre la solution de butanol résul- tante sous vide avec addition constante d'eau jusqu'à obtention d'un con- centré aqueux exempt de solvant. On peut alors lyophiliser ce concentré pour avoir des solides secs bruts.
On peut purifier encore davantage le produit brut par chromato- graphie d'adsorption ou de partition. Le charbon actif et l'alumine se sont avérés efficaces pour la chromatographie d'adsorption, mais les colon- nes d'adsorption ne se sont pas montrées aussi satisfaisantes que les co- lonnes de partition.
On a utilisé avec succès des colonnes de partition avec des charges inertes comme la "Dicalite" et la "Celite", et des systèmes solvants à deux phases comme le butanol-eau et la méthyl-éthyl-cétone-eau. Ces co- lonnes ont produit l'antibiotique le plus pur.
Plus particulièrement.. on ajoute à 3300 litres de bière brute, 16,5 kg. de "agnesol" et on agite mécaniquement la suspension pendant 1/2 heure. On ajoute 66 kg. de "Hyflow Supercel" et on filtre le mélange à tra- vers un filtre-presse, obtenant 3000 litres de filtrat.
On ajuste le filtrat de "Magnesol" à un pH de 7-7,5, et on ajou- te 12 kg. de charbon actif ("Norit A"). On agite la suspension pendant 30 minutes, on ajoute 12 kg. de "Hyflow Supercel", puis on filtre le mélange.
On écarte le filtrat inactif. On lave le gâteau de filtration, avec 120 litres d'eau.. et on écarte la partie inactive. On lave ensuite le gâteau avec 120 litres de méthanol, et on écarte le méthanol de lavage.
On met ensuite en suspension le gâteau lavé dans 60 litres de n-butanol saturé d'eau, on agite mécaniquement la suspension pendant 30 minutes puis on filtre. On répètre l'élution deux fois, on combine les 3 éluats, ce qui donne 115 litres de solution de butanol contenant l'antibio- tique.
On concentre sous vide cette solution de butanol jusqu'à 6 à 7 litres contenant un précipité. On enlève la solution et le précipité de la colonne et on lave la colonne avec 7 litres d'acétone. On combine les mé- langes de butanol et d'acétone,et on agite le mélange combiné pendant 10 minutes, puis on filtre. On lave les insolubles avec de l'acétone.. et on combine le liquide de lavage et le filtrat. On écarte les insolubles lavés.
On concentre sous vide la solution limpide de butanol-acétone, avec addition constante d'eau, pour avoir une solution aqueuse exempte de solvant d'environ 3 litres. On lave cette solution aqueuse avec un volume égal d'acétate d'éthyle, et on écarte l'acétate d'éthyle inactif de lavage.
On élimine le solvant de la solution aqueuse lavée, laquelle contient envi- ron 240 g. d'antibiotique dans 2,68 litres. On lyophilise cette solution et on obtient environ 295 g. de solides secs.
<Desc/Clms Page number 13>
Purification de l'antibiotique par chromatographie de partition.
Méthode I.
On lave de la "Dicalite" avec de l'eau, du méthanol et de l'a- cétone et on la sèche ensuite dans un four chauffé. On prépare une phase solvant composée de 85% d'acétate d'éthyle et de 15% de n-butanol. On sa- ture la phase solvant avec de l'eau, et on utilise 1,7 litre de la phase solvant saturée d'eau pour humecter 1,7 kg. de "Dicalite" lavée et séchée.
On empile ensuite la Dicalite humectée dans un tube de verre de 7,5 cm de diamètre intérieur, pour obtenir une colonne de 1,5 m.
80 g. de l'antibiotique lyophylisé prépare, comme décrit plus haut sont dissous dans 100 cm3 d'eau qui a été saturée avec le solvant.
A cette solution on ajoute 100 g. de Dicalite sèche et on mélange bien. On empile alors ce mélange au sommet de la colonne ; onintroduit la phase sol- vant au sommet, et on la fait passer avec un débit de l'ordre de 10 cm3 par minute. Le volume retenu est d'environ 3100 cm3, et on effectue des percolations successives comme suit
EMI13.1
<tb> N <SEP> du <SEP> percolat <SEP> Volume <SEP> en <SEP> cm3 <SEP> Activité <SEP> totale <SEP> en <SEP> g.d'antibiotique
<tb>
<tb>
<tb> standard. <SEP> vis-à-vis <SEP> du <SEP> S. <SEP> hemolyticus
<tb>
<tb>
<tb> C-203.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
1 <SEP> 3100 <SEP> 0,85
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 3020 <SEP> 0,665
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 3430 <SEP> 0,405
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 3100 <SEP> 5,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> 3100 <SEP> 19,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> 2980 <SEP> 21,7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 2110 <SEP> 15,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7A <SEP> 1000 <SEP> 5,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> 3100 <SEP> 4,65
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 5550 <SEP> 0.695 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Total <SEP> 30490 <SEP> 75.265
<tb>
On réunit les n s 5, 6, 7 et 7A et on concentre la solution ré- sultante en une solution sèche de butanol de 600 cm3. On décolore cette solution avec 12 g. de charbon décolorant (par exemple du "Darco G-60"), et on filtre la suspension tant qu'elle est chaude.
On ajoute deux volu- mes d'éther de pétrole, on sépare par filtration les solides précipités et on les sèche. Le rendement est de 18,9 g. Cette matière est la prépara- tion I à laquelle il est fait allusion précédemment.
Méthode II.
On prépare un système solvant à deux phases en mélangeant une partie d'acétate d'éthyle, 5 parties d'eau et 9 parties de n-butanol dans un entonnoir séparateur, on agite bien, on sépare les deux couches, une phase aqueuse et une phase solvant. On empile 200 g. de Celite humectée avec la phase aqueuse dans un tube de verre de 3,75 cm. de diamètre intérieur pour avoir une colonnade 75 cm. de longo On dissout 5 g. d'antibiotique lyophilisé brut dans 15 cm3 d'eau, et on mélange intimement cette solution avec 30 g. de Celite. On empile le mélange résultant au sommet de la colon- ne, On développe ensuite la colonne en faisant passer à travers la phase solvant. Le volume retenu est de 400 cm3, et les fractions de percolation
<Desc/Clms Page number 14>
sont chacune de 50 cm3.
Les fractions 25-40 incluses sont combinées, con- verties en une solution aqueuse exempte de solvant, et lyophilisées. Cet- te matière est la préparation III mentionnée précédemment.
Le tableau IV représente le spectre anti-microbien du nouvel antibiotique, qui a été obtenu au moyen de la filtration "Magnesol", de l'ad- sorption au charbon actif ("Norit") et de l'élution décrites plus haut.
Le groupe d'antibiotiques du B. Subtilis ont donc été séparés et les valeurs par conséquent représentent les activités de l'antibiotique unique de l'in- vention :
Tableau IV - Spectre antimicrobien du nouvel antibiotique.
EMI14.1
<tb>
Organisme <SEP> d'essai <SEP> mg <SEP> d'échantillon <SEP> zones <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> iequis <SEP> pour <SEP> l'inhi- <SEP> boîte <SEP> d'agar <SEP> avec
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> bition <SEP> complète <SEP> dans <SEP> une <SEP> solution <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> l'essai <SEP> en <SEP> bouillon, <SEP> l'échantillon <SEP> à
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,5 <SEP> mg/cm3.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 62,5 <SEP> légère
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> pullorum <SEP> 16, <SEP> 4,4c
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 250 <SEP> 2,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 2500 <SEP> 0,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> (#8) <SEP> 16 <SEP> 9,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> (#28) <SEP> 3,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Alcaligenes <SEP> sp.
<SEP> 62,5 <SEP> 1,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 16 <SEP> 8,1c
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> 2500 <SEP> légère
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hoirnodendrqm <SEP> cladosporoides <SEP> 0,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 250 <SEP> 3,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mycobacterium <SEP> ranae <SEP> 2,4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mycobacterium <SEP> #607 <SEP> 1,7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> hemolyticus <SEP> C-203 <SEP> 2 <SEP> 11,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Staph.
<SEP> albus <SEP> 31 <SEP> 4,4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 625 <SEP> légère
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 1,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agrobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> 9,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Flavobacterium <SEP> scraveolus <SEP> 16 <SEP> 4,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> gallinarum <SEP> 125 <SEP> 3,5c
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 31 <SEP> 4,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> c <SEP> = <SEP> zone <SEP> nuageuse.
<tb>
Dans les tests sur souris et cobayes avec le Mycobacterium tu- berculosis H 37 rv, on a observé une activité tuberculostatique certaine.
En outre, la substance antibiotique a été expérimentée contre le Streptococcus Haemolyticus G-203 avec 35 souris infectées par cet orga- nisme ; la dose était de 10 - 3. On a gardé 10 souris comme contrôle. On a administré par voie intrapéritonéale 200 unités à 5 souris, 100 unités à 5 souris, 50 unités à 5 souris, 25 unités à 5 souris et 12,5 unités à 5 sou- riso Les animaux de contrôle avaient tous péri en moins de 18 heures.
Après que les souris étaient infectées, on leur donnait immédiatement après l'infection une demi-dose. On appliquait le prochain traitement la matinée suivante et l'après-midi.. ceci pendant 5 jours, puis on suspendait le trai- tement. Après 44 Jours, les souris ayant reçu 200 et 100 unités journaliè- res étaient toutes vivantes. Parmi celles ayant reçu 50 unités journalières, 4 étaient vivantes et une mourut en moins de 18 heures. Parmi celles ayant reçu 25 unités par jour, 3 étaient vivantes, 1 morte en moins de 42 heures
<Desc/Clms Page number 15>
et 1 après 148 heures. Parmi celles ayant reçu 121/2 unités par jour, 3 moururent en moins de 18 heures, mais 2 survécurent. Par conséquent, la dose efficace minima parait être de 50 unités par jour.
Dans une seconde expérience, on a obtenu les résultats suivants Des 5 sujets de contrôle,
4 périrent en moins de 18 heures et le sème après 48 heures. Les autres
5 souris reçurent 100 unités après l'infection et pendant les 3 jours qui suivirent 100 unités deux fois par jour. Ces 5 souris furent sacrifiées après 33 jours. Les organes ne montraient pas de lésions
La substance antibiotique dans le bouillon de fermentation, an- térieur à son extraction, n'est pas stable à la température ordinaire dans l'intervalle de pH allant d'environ 4,0 à environ 8,2; toutefois, elle est stable lorsqu'on la conserve pendant une semaine dans un réfligérateur à une température d'au moins -5 C. De plus, à une valeur de pH d'environ 2 à env. 3, l'antibiotique est au moins partiellement stable à la température ordinaire.
En outre., la substance antibiotique purifiée est stable à la température ordinaire (20 C) à un pH d'env. 2,2 à env. 7,5 et elle est très stable lorsqu'on la maintient à une température d'env. 4 C, et aussi quand elle est à l'état congelé.
Etant donné que certains changements dans l'exécution du procé- dé ci-dessus et certaines modifications dans la composition qui fait partie de l'invention peuvent être apportés sans s'écarter du but poursuivi, il va de soi que toute la matière contenue dans la description ci-dessus ou représentée dans le dessin d'accompagnement doit être considérée comme don- née à titre explicatif et non pas dans un sens limité. Il est également entendue que les revendications qui suivent sont destinées à couvrir toutes les caractéristiques génériques et spécifiques de l'invention décrite pré- sentement et toutes les données dans le cadre de l'invention que l'on pour- rait considérer comme tombant dans lesdites caractéristiques.
REVENDICATIONS.
-------------
1. Procédé de préparation d'une substance antibiotique, carac- térisé en ce qu'on inocule un milieu nutritif aqueux contenant des sels mi- néraux essentiels et des substances carbohydratées et azotées assimilables avec le micro-organisme Streptomyces crystallinus, en ce qu'on effectue une fermentation aérobie à une valeur de pH d'environ 6,5 à environ 8,0 à une température d'environ 24 à environ 35 C pendant une durée d'environ 40 à environ 80 heures, et en ce qu'on récupère la substance antibiotique à par- tir du milieu fermenté.
2. Procédé de préparation d'une substance antibiotique, carac- térisé en ce qu'on inocule un milieu nutritif aqueux contenant des sels mi- néraux essentiels et des substances carbohydratées et azotées assimilables avec le micro-organisme Streptomyces crystallinus, en ce qu'on effectue une fermentation aérobie à une valeur de pH d'environ 6,5 à environ 8,0 à une température d'environ 26 à environ 28 C pendant une durée d'environ 60 à environ 65 heures, et en ce qu'on récupère la substance antibiotique à par- tir du milieu fermenté.
3. Procédé de préparation d'une substance antibiotique, caracté- risé en ce qu'on inocule un milieu nutritif aqueux contenant des sels miné- raux essentiels et des substances carbohydratées et azotées assimilables, avec le micro-organisme Streptomyces crystallinus, en ce qu'on effectue une fermentation aérobie à une valeur de pH voisine de 7,5 à une température d'environ 26 à environ 28 C pendant environ 60 à environ 65 heures, et en ce qu'on récupère la substance antibiotique à partir du milieu fermenté.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.