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La présente invention se rapporte à un procédé pour la préparation d'esters polysulfuriques de la chitosane par sulfation de la chitosane.
Le procédé usuel de sulfation de la chitosane par l'acide chlorosulfonique (ou chlorhydrine sulfurique) en présence de pyridine donne des
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résultats très peu saifaisants.A1nsi,lorsqu'on introduit la chitosane dans un mélange chaud de pyridine et d'acide chlorosulfonique (3:1 parties en volume),pn n'obtient qu'un faible rendement en ester polysulfurique de chi- tosane.Même lorsqu'on chauffe longuement la chitosane au sein de pyridine pour la faire gonfler et qu'on la traite ensuite par le mélange pyridine-
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acide chlorosulfonique, les résultats ne sont guère meilleurs.Ce procédé présente les désavantages de nécessiter beaucoup de temps, d'être compliqué et de ne pas se porter à une mise en oeuvre sur une grande échelle.
On a trouvé qu'ils est facile d'effectuer la sulfation de la chito- sane, si on la met en solution avant la sulfation en la dissolvant sous for- me de ses sels dans de la formamide.
Le procédé pour'.la préparation d'esters polysulfuriques de la chi- tosne, suivant la présente" invention,consiste à transformer la chitosane en un sel,à dissoudre ce sel dans de la formamide et à faire agir sur,cette solution de l'acide chlorosulfonique ou un mélange de pyridine et d'acide chlorosulfonique.
La réaction entre les sels de'la chitosane en solution avec 1'
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acide chlorosulfonique, selon la présente invention,est homogène et se laisse facilement contr8ler de sorte que l'on peut obtenir, de manire re- productible,tous les degrés de sulfation voulus.
Les esters polysulfuriques de chitosane obtenus selon la présente invention sont des substances qui exercent une action inhibitrice sur la coagulation du sang et présentent une activité analogue à celle de l'hépa- rine.Ces esters peuvent, par conséquent, être utilisés à des fins thérapeuti-
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ques dans tous les cas où l'on désire obtenir l'effet anticoagulant de l'hc:- parine.Les fractions à poids IrÍblédù1a.irê bas 'de - ' e4te>s 1pol;rsu:tfuriques' , de''chiiosane o15tenùs tpeuvent - Ê!,tre utilisées pour éclà'.xo3x, du plasma ; lîpéràique , .' : 1 -' .
Il convient de mettre en oeuvre le procédé selon la présente in- vention de la manière décrite ci-après,
On désaoétyle de la qhitine (cf.Dissertation par Bruno Camerino,
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zuriah,1945,h- 36);par exemple un'produit commercial, de préférence exempt de carbonate,par fusion alcaline selon les indications de LOEWY (Biochem.
Zeitschrift 23 47 i1910j ).On dissout la ohitosane, obtenue, après éli- mination de l'alcali,dans un acide inorganique ou organique, de préférence un acide monobasique tel que les acides chlorhydrique,bromhydrique, perchlo- rique, nitrique, formique ,acétique ,etc., et,on précipite le sel de chitosane par addition d'agents précipitants miscibles à l'eau tels que, par exemple, l'acétone, le méthanol,etc.Ensuite on dissout le sel de chito-
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sane dans de la fô r6ami.de, ''onca3 oute â; la solution tout en la refroidis- sant clé l'acide chlorosulfoïliqus ét on agite longuement le méi1.Ie mé- .lange *.é,t3tnelayeutid.a.b#r dé.
Tâ: aanièfe âécri-bë. ci-après,Les po- duits -ainsi obtenus se caractérisent par le fait qu'ils contiennent encore des groupements amirio libres, ce qui est démontré,par les résultats des
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dosages d'azote selon Van Slyke.Le nombre de groupements amino est parti- culièrement élévé lorsqu'on utilise des'sels de chitosane avec des acides forts, par exemple le,chlorhydrate on le perchlorate.
Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé suivant la pré- sente invention,on peut ajouter la solution du sel de chitosane dans la formamide à un mélange chaud de pyridine et d'acide chlorosulfonique et
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procéder à la sulfation à une température quelconque comprise entre 20 et
100 C. Le produits obtenus selon ce mode opératoire contiennent, en général un nombre inférieur de groupements amino libres.
On a constaté que la sulfation du sel de chitosane dans la for- mamide est accompagnée d'une formylation d'une partie des groupements amino libres, de sorte qu'on obtient des produits qui contiennent, suivant les conditions de réaction, un nombre plus ou moins élevé de groupements amino formylés.Les produits contenant de nombreux groupements amino libres présentent, relativement, peu de groupes formyliques et vice versa.Ainsi, .'on peut influencer la teneur en groupes formyliques par lés mesures indi- quées, par exemple par sulfation de sels de la chitosane avec des acides forts, en présence ou absence de pyridine, ou par sulfation de sels de la chitosane avec des acides faibles, en présence ou absence de pyridine.Oh obtient une teneur basse en groupes formyliques (environ 1,5% de groupes formyliquesg)
par exemple en sulfatant le. chlorhydrate de chitosane en 1' absence de pyridine, tandis qu'on obtient une teneur élevée en groupes formyliques (environ 9% de groupes formyliques) en sulfatant le formiate de chitosane en présence de pyridine.
Le présent procédé permet donc d'ajuster à volonté la teneur des produits finals en groupements amino libres, en utilisant des sels de la chitosane avec des acides forts et en variant la quantité de la pyridine.
La teneur des produits finals en soufre est une fonction de la quantité d'acide chlorosulfonique utilisée ainsi que de la température et du temps de sulfation.On peut faire varier à volonté la teneur en.,soufre entre des limites assez éloignées.
Suivant les propriétés physiques que devca présenter le produit final, on peut procéder à une dégradation partielle des molécules de chi- tosane ,soit avant ou après la sulfation.mais en tout cas après la salifi- cation de la chitosane.Cette dégradation peut être effectuée,par exemple* par un traitement avec du peroxyde d'hydrogène ou par hydrolyse avec des acides ou des alcalis.A la suite de cette dégradation, on obtient des produits finals dont le degré de polymérisation est inférieur à celui des produits de départ.
L'activité anticoagulante des produits obtenus par le présente pro- cédé est une fonction de la teneur en soufre et du degré de polymérisation des produits.Lorsqu'il est prévu d'utiliser les esters polysulfuriques de chitosane comme anticoagulants, il convient, par conséquence, de choisir une teneur en soufre élevée, par exemple d'environ 12 à 16%, et un degré de polymérisation élevé.On a fait la découverte surprenante que, parmi les esters polysulfuriques de la chitosane, ceux qui présentent un degré de polymérisation réduit et qui ne possèdent aucune ou qu'une faible activité anticoagulante;exercent une action clarifiante remarquable sur le plasma lipémique et peuvent, par conséquent, être utilisés comme médicaments contre l'artérioclérose.
Ainsi, le présente procédé permet d'obtenir des homolo- gues polymères qui différent quant à leur activité biologique,à partir d'un seul et même squelette polymère, en modifiant la longueur de chaîne des molécules polymères.
Une dégradation partielle peut être obtenue, en particulier, en traitant le sel de chitosane ou les esters polysulfuriques de la chitosane par du peroxyde d'hydrogène .On peut obtenir différents degrés de dégradation en'faisant varier la quantité de peroxyde,la température et le temps de - réaction et le temps de réaction ou en combinant judicieusement 'des facteurs.
On peut également effectuer la dégradation par voie hydrolytique, soit avec des acides ou des alcalis, de manière connue.Pour'influencer la longueur de chaîne, on dispose encore de la méthode consistant à faire varier la
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température de sulfation, le degré de dégradation étan d'autant plus élevé que la température de sulfation est plus élevée.Le degré de la dégradation des esters polysulfuriques est caractérisé viscosimétriquement par l'indice de viscosité ("intrinsic viscosity"); n, qui est défini par l'équation suivante :
n, = lim nspec c c oùnspec = nl-n. /n. = nrel - 1, et n = viscosité de la solution
L = viscosité du solvant c concentration en g/100 cm3
La valeur limite n est déterminée graphiquement, à partir de différentes concentrations, par exemple en portant nspec/c en ordonnée et c en abscisse.Les mesures de viscosité sont exécutées à l'aide d'un viscosimètre Ostwald à 25 C.
Les esters polysulfuriques de chitosane obtenus par le présent procédé sont des corps polydispersés. Par conséquent, il convient, en par- ticulier dans les cas où l'on a intercalé une opération de dégradation, de procéder à un fractionnement des produits obtenus,soit avant ou après la sulfation, mais en tout cas après la dégradation, et de choisir les fractions qui, après leur transformation, présenteront les propriétés voulues.
Dans ce but, on peut fractionner soit la chitosane sous forme de ses sels soit les esters polysulfuriques de la chitosane, de préférence sous forme de leurs sels alcalins.On peut procéder de la manière suivante : On dissout le pro- duit pollydispersé dans de l'eau et on ajoute à la solution un précipitant miscible à l'eau tel que le méthanol, l'éthanol, d'écétone, etc., en quan- tités de plus en plus élevées, les fractions individuelles étant ainsi pré- cipitées dans l'ordre des poids moléculaires décroissants.On sépare les fractions individuelles les unes des autres.Pour précipiter les fractions à poids moléculaire élevé, on ajoute donc une petite quantité de précipi- tant,
tandis que la précipitation des fractions à poids moléculaire bas nécessite une quantité plus grande de précipitant.Pour obtenir des esters polysulfuriques de chitosane anticoagulants à poids moléculaire élevé, on éliminera du mélange polydispersé les fractions à poids moléculaire bas, tandis que pour obtenir des esters polysulfuriques à poids moléculaires bas,utilisables dans la thérapeutique de l'artériosclérose, on éliminera les fractions à poids moléculaire élevé,
Pour élaborer le mélange d'esters polysulfuriques de chitosane obtenu, il convient de procéder de la manière suivante:
On sépare les frac- tions polymères du produit de sulfation à l'aide de méthanol ou d'un autre précipitant convehalbe, par exemple d'éthanol, d'acétone, etc., éventuellement en ajoutant de l'acétate de sodium pour faciliter la précipitation.Le pré- cipité est lavé avec le précipitant et ensuite dissout dans une petite quantité d'eau.On ajuste le PH de la solution à 9 avec un alcali.A cette solution du sel alcalin brut, on ajoute de nouveau du méthanol,et éventuel- lement de l'acétate de sodium, pour précipiter ledit sel alcalin.On redis- sout le produit précipité dans de l'eau,on ajoute de la glace à la solu- tion et on transforme le produit dissous en son sel de narcotine ou d'un
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autre alcaloïde, en ajoutant à la solution, en l'agitant,
une solution con- centrée de narcotine ou de l'alcaloïde correspondant.On isole dle sel obtenu, par centrifugation ou filtration,on le lave soigneusement à l'eau et on-le retransforme en sel alcalin en l'ajoutant à une solution de carbonate,soit à la température, ambiante soit à une température quelque peu élevée.L'alca- loïde précipité est séparé par filtration et soigneusement lavé .Le filtrat est neutralisé à l'aide d'acide acétique,concentré, si nécessaire, et ensui- te traité par du méthanol ou un autre précipitant.On peut, éventuellement,:' répéter cette précipitation pour purifier et fractionner les esters poly- sulfuriques de chitosane.
Pour des buts thérapeutiques,les esters polysulfuriques de chi- tosàne obtenus par le procédé suivant la présente invention, lesquels sont caractérisés par une toxicité très faible,sont utilisés, de préférence, sous forme de leurs sels alcalins.
Exemple;1
Pour préparer la, formiate de chitosane,on dissout la chitosane dans de l'acide formique étendu et on ajoute de l'acétone à la solution visqueuse pour obtenir un précipité.Le précipité est essoré,séché et broyé.
Le produit obtenu est facilement soluble dans l'eau n = 1,04.
En vue d'une dégradation partielle, on dissout, en qhauffant dans un bain de vapeur,100 g du formiate de chitosane obtenu dans 1 litre d' eau'bn ajoute 25 cc. de perhydrol à 30% à la solution et on chauffe le mé- lange à 7000,, en l'agitant, dahscmm thermostat.Au bout 'de 2 heures le perhy- drol est entièrement consommé .Le mélange réactionnel est ensuite concentré à 450 ce.dans le vide,éventuellement après filtration.A la solution concen- trée on ajoute, 3 litres d'acétone pour obtenir un précipité.Après élimina- tion de l'acétone aqueux par décantation, on verse 500 ce. d'acétone fraî- che sur le précipité, on l'essore et on le sèche pour le durcir.Rendement
90 g; n = 0,190.
Pour la sulfation, on dissout 90 g de ce formiate de chitosane partiellement dégradé, n agitant, dans 900 cc. de formamide'chauffée à 50 C.
Ensuite, on refoidit la solution, avec de l'eau glacée et on y ajoute len- tement, goutte à goutte, à environ 1000, 180 cc. d'acide chlorosulfonique
Pour mener à bout'la réaction, on agite le mélange réactionnel pendant la nuit, à la température ambiante.Ensuite, on essore le mélange à travers de la cellulose filtrante et on ajoute u filtrat, en lagitant, 3 litres de méthanol contenant 120 g d'acétate de sodium en solution pour provoquer - une précipitation.On isole le précipité et on le dissout dans une petite quantité d'eau.On ajuste le pH de la solution à 9 par addition d'alcali concentré et on représipite à l'aide de méthanol,:
On dissout le!sel sodique brut dans environ 1,5 litres d'eau et on ajoute à la solution 500 g de glace.Ensuite, on ajoute à ce mélange, en l'agitant,une solution de 280 g de chlorhydrate de narcotine dans 1 litre d'eau,pour précipiter le sel de narcotine de l'ester polysulfurique de chitosane.Ce sel est isolé par fil- tration et lavé avec environ 1,5 litres d'eau froide.On met en suspension le sel de narcotine dans environ 1,5 litres d'eau,on ajoute 60 g de carbo- nate de sodium solide à la suspension et on agite le mélange pendant la nuit.On essore la narcotine précipitée et on la lave avec environ 1 litre d'eau.Ensuite, on ajuste le PH du filtrat à 5 par addition d'acide acétique glacial, on le concentre à 450 cc.
sous pression réduite et on ajoute à la solution concentrée 3 litres de méthanol contenant, ensolution, 30 g d'acéta- te de sodium,pour provoquer'une précipitation.On repète une fois encore cette suite d'opérations.Par séchage du précipité sous pression réduite on obtient 110 g d'une poudre blanche présentant une teneur en soufre de 15,1% et un indice de viscosité n de 0,072 (dans une solution 0,5 N de NaCl).
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Teneur totale en azote: 3,39%; teneur en azote selon Van Slyke (groupements amino libres): 1,20%; teneur en groupements formyliques ; 3,2% .Ce produit ne possède qu'une faible activité anticoangulante; en revanche, il exerce une action clarifiante prononcée sur le plasma lipémique.
Exemple 2.
On mélange 90 g du formiate de chitosane obtenu selon l'exemple
1 avec de la formamide pour obtenir une pâte.On dissout cette pâte à 50 C en ajoutant 900 cc. de formamide, tout en agitant.Après élimination de gru- meaux non-dissous par filtration,on procède à la sulfation,selon les indi- cations données dans l'exemple 1, avec 180 cc. d'acide chlorosulfonique.Le mélange de sulfation est élaboré de la manière décrite dans l'exemple 1.
L'ester polysulfurique de chitosane obtenu présente une teneur en soufre de 12,6 % et un indice de viscosité n de 0,3415 (dans une solution 0,5 N de
NaCl).Teneur totale en azote :3,05% teneur en azote selon Van Slijke groupements amino libres): 0,5%; teneur en groupes formyliques: 6,0%.
Ce produit présente, in vivo, une bonne activité anticoagulante et peut être utilisé comme anticoagulant.
Exemple 3.
On met en suspension 50 g de chitosane dans environ 1200 cc.d'eau et on ajoute à la suspension ,en l'agitant, environ 30 ce.d'acide chlorhy- drique concentré.On obtient ainsi une solution à viscosité élevée.Par ad- dition d'environ 3 litres d'acétone à la solution,on précipite du chlorhy- drate de chitosane que l'on isole par filtration, lave à l'acétone et sèche..
On dissout 10 g de ce chlorhydrate de'chitosane dans 60 cc. de formamide en chauffant à 70 C.On ajoute la solution obtenue à un mélange fon- du de 90 cc.de pyridine et 30 cc d'acide chlorosulfonique , à 70 C.La température du mélange s'élève à 85 C.Il se produit un dégagement de gaz à la suite d'une décomposition de la formamide.Le mélange réactionnel est ensuite agité pendant 2 heures à 90 C.Le mélange de sulfation est élaboré de la manière décrite dans l'exemple 1.Le produit obtenu présente les propriétés suivantes : Teneur en soufre: 14,8 %, n = 0,270 (dans une solu- tion 0,5 N de NaCl);teneur totale en azote :4,26%; teneur en azote selon Van Slyke: 0,16; teneur en groupes formyliques :6,0%.
Exemple 4.'
On dissout 5 g d'ester polysulfurique de chitosane (n = 0,315, en.solution de NaCl 0,5 N) obtenu.selon l'exemple 2 'dans 7,5 cc. d'eau.
On chauffe la solution à 70 C dans un thermostat et on y ajoute 1,75 cc. d'acide chlorhydrique concentré.Au bout de 330 minutes la solution de l' ester partiellement dégradé est neutralisée par de la soude caustique;con- centrée et additionnée de méthanol pour précipiter le produit de dégrada- tion.L'indice de viscosité n du produit obtenu est tombé à 0,135 (en solu- tion 0,5 N de NaCl).
Exemple 5.
On dissout 2 g de l'ester polysulfurique de chitosane ( n = 0,315) obtenu selon l'exemple 2 dans 20 cc. d'eau.On ajoute 0,3 ce.de peroxyde d'hydrogène à 30% à la solution et on la chauffe environ 1 heure à 90 C.Au bout de ce temps la réaction est terminée et le peroxyde est consommé.Après une filtration éventuellement nécessaire, on concentre la solution à 10 ce.sous pression réduite et on ajoute du méthanol au concen- trat pour précipiter un produit présentant un indice de viscosité n de 0,150 (en solution 0,5 N de NaCl).
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Exemple 6
On dissout 5 g de chlorhydrate de chitosane dans 75 ce. de formamide dans un bain de -vapeur.On refroidit ensuite la solution à 5 -10 C avec de l'eau glacée.Ensuite, on ajoute lentement, goutte à goutte, 15 ce.d'acide chlorosulfonique et on agite le mélange pendant 24 heures à la température ambiante.Le mélange de sulfation est élaboré de la manière décrite dans l' exemple 1.Le produit obtenu présente les propriétés suivantes: n = 0,245; teneur en soufre :16,24 %, teneur totàle en azote: 3,58%; teneur en azote selon Van Slyke: 2,90%.
Exemple 7
On introduit 340 g de formiate de chitosane non dégradé dans 5,8 litres de formamide. Le mélange est agité pendant 24 heures à la tempéra- ture ambiante et ensuite encore 5 heures à 6000.La solution obtenue,à vis- cosité élevée, est ensuite ajoutée à un mélange fondu de 680 ce.d'acide chlorosulfonique et de 2040 ce. de pyridine.Le mélange de sulfation est chauffé pendant 4 heures à 900C.En élaborant le mélange de réaction de la manière décrite dans l'exemple 1, on obtient un ester polysulfurique de chitosane présentant une teneur en soufre de 12,7%. [#]= 0,48 (en solution 0,5 N-de NaCl); teneur totale en axote: 4,34%,teneur en azote selon Van Slyke: 0,07%; teneur en groupes formyliques:8,7%.