<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention se rapporte à la séparation de certains composés antibiotiques et en particulier à leur séparation de solutions aqueuses diluées impures. ces composés très actifs contre divers microor- ganismes ont été appelés anti-bittiques du type tétracycline. Ils compren- nent l'oxytétracycline (Terramycyne) la chlortétracycline (Auréomycine) et la tétracycline (Tétracyne). Ces composés ont des structures très voi- sines et des propriétés biologiques semblables. Ils peuvent être désignés
EMI1.1
par la tormule Cg3 OE N (CH32 J< OH OE
Si X est un groupe hydroxyle et Y est de l'hydrogène le composé est l'oxy- tétracycline. Si X est de l'hydrogène et Y du chlore, le composé est la chlortétracycline. Si X et Y sont de l'hydrogène, le composé est la tétra- cycline.
La tétracycline peut être préparée par au moins deux procédés différents. Dans le premier ,on soumet la chlortétracycline à une réduc- tion catalytique pour éliminer le chlore et obtenir l'antibiotique. Dans le second procédé, la tétracycline est directement formée par culture de mi- croorganismes sélectionnés dans des conditions aérobies dans des milieux- nutritifs appropriés. L'oxytétracycline et la chlortétracycline se forment par fermentation. Il est souvent nécessaire de séparer les antibiotiques de solutions aqueuses diluées impures, particulièrement lorsqu'ils sont préparés par fermentation.
La dema@de de brevetaméricain n 165.588 décrit un procédé de pré- cipitation de l'antibiotique oxytétracyclique sous la forme de complexes avec des combinaisons de certains ions métalliques polyvalents. On a trouvé à présent que le même procédé peut; être appliqué aux antibiotiques chlor- tétracycline et tétracycline. En outre, des mélanges de 2 ou 3 de ces compo- sés antibiotiques peuvent être également précipitées suivants ce procédé
La séparation de ces antibiotiques s'obtient très facilement en précipitant le composé actif de solutions aqueuses diluées par des combi- naisons de certains ions métalliques polyvalents.
Ces antibiotiques forment des sels métalliques simples de solubilité limitée avec divers ions métal- liques bi- et trivalents. (cependant, lorsque plus d'un ion métallique poly- valent est présent dans une solution aqueuse d'un ou plusieurs antibiotiques du type tétracycline, il se forme des complexes métalliques contenant deux ou plusieurs métaux, dont la solubilité dans l'eau est particulièrement ré- duite. C'est ainsi qu'on peut séparer une forte proportion du composé actif de solutions contenant une très faible proportion de l'antibiotique.
Les métaux qui sont particulièrement efficaces pour la formation des complexes métalliques suivant la présente invention sont au moins deux métaux de la classe formée par le baryum, le strontium, le calcium, le magné- sium, le zinc, le béryllium, le cadmium et le mercure. Ces élements se trou- vent tous dans les groupe 2 du Tableau Périodique. La précipitation est ef- fectuée de la solution aqueuse le plus efficacement à un pH compris entre 7 environ et 10,5 environ. Les ions métalliques peuventêtre ajoutés à la solution sous la forme de sels solubles dans l'eau En général, les halogé- nures (chlorures, bromures) sont très utiles ainsi que les nitrates. Il est souvent préférable d'ajouter les sels à un pH acide puis d'augmenter le pH du mélange afin de précipiter l'antibiotique sous la forme d'un comple- xe solide.
Bien que la solutbilitééde ces complexes varie quelque peu
<Desc/Clms Page number 2>
suivant les ions métalliques choisis, cette solubilité est généralement très réduite dans l'eau, o.à.d. inférieure à 100 microgrammes par cm3.
Suivant le présente procédé, on traite une solution aqueuse diluée de l'antibiotique par les composés métalliques polyvalents solubles dans l'eau requis, par exemple par du chlorure de calcium et du chlorure de ba- ryum -dans une proportion au moins équivalente en-poids à l'antibiotique en solution. La solution est réglée à un pH dans la gamme précipitée, soit de 7 environ à 10,5 environ, avant ou de préférence après l'addition des composés métalliques. Le mélange de réaction est de préférence rémué ou agitée d'une autre manière pendant l'addition des composés métalliques et le réglage du pH pour que la réaction soit complète et pour éviter une trop grande acidité ou alcalinité dans une partie quelconque du mélange. A- près avoir agité pendant un peu de temps encore, on retire le précipité de la solution.
Cette opération peut être exécutée par filtrage ou centrifuga- tion du mélange ou par d'autres procédés connus. Il est souvent désirable d'ajouter un auxiliaire de filtration comme la terre d'infusoires avant de filtrer, Le produit obtenu peut être séché et est utile dans certaines ap- plications, par exemple si les ions métalliques polyvalents utilisés sont relativement peu toxiques (p.ex. le chlorure de calcium) la préparation peut être utilisée directement comme médicament administré par voie bucale.
Le produit peut être également utilisé pour stimuler la croissance des vé- gétaux ou des animaux.
Il faut noter qu'au moment ou l'on rend basiques des bouillons de fermentation d'antibiotiques du type tétracycline, une certaine quantité ,le l'antibiotique peut précipiter. Ceci est principalement dû à la présence dans le milieu de fermentation utilisé de certains ions métalliques polyva- lents,particulièrement de calcium et de magnésium, La proportion de l'anti- biotique précipité dépend de la quantité relative de ces métaux polyvalents présents dans les milieux de fermentation d et de la nature de ces métaux.
Certaines matières brutes utilisées comme ingrédients dans les milieux de -fermentation contiennent certaines proportions de métaux tels que le cal- cium et le magnésium. Toutefois ces ions métalliques polyvalents ne sont généralement pas présents en proportion suffisante pour assurer la précipi- tation d'une partie importante de l'antibiotique lorsque sa solution est rendue alcaline. Un but de l'invention est de procurer un procédé permet- tant de précipiter unepartie importante de l'antibiotique de ces solutions aqueuses impures diluées par addition à dessein de quantités suffisantes de deux ou plusieurs ions métalliques polyvalents et par réglage du pH.
Bien que des proportions équimoléculaires des deux ions métalli- ques polyvalents différents puisent être utilisées dans le présent procédé cette proportion de métaux n'est pas nécessairement la proportion optimum au point de vue de la précipitation maximum du produit. On peut déterminer assez facilement la meilleure combinaison de métaux et la meilleure propor- tion entre ces métaux pour une solution aqueuse impure particulière d'oxy- tétracycline, tétracycline et chlortétracycline.
Cette combinaison et cet- te proportion varient évidemment suivant la nature des impuretés présentes dans la solution et divers autres facteurs. certaines parties de la solution aqueuse peuvent être traitées par un volume mesuré de solutions standard de différents composés métalliques polyvalents afin de déterminer une combi- naison précipitante appropriée pour cette solution d'antibiotique particu- lière. Comme indiqué plus haut, certains métaux bivalents sont particulière- ment utiles dans le procédé de l'invention. Ces métaux appartiennent au groupe 2 du Tableau Périodique.
Les complexes métalliques sont utiles comme bactéricides industriels, agents stimulant la croissance des plantes et, lorsqu'on utilise des métaux peu toxiques, comme 'médicaments et stimulants de la croissance des animaux.
<Desc/Clms Page number 3>
Pour régénérer un sel simple d'antibiotique du type tétracycline ou un antibiotique amphotère du type tétracycline à partir du produit soli- de obtenu suivant la présente invention, il convient souvent de dissoudre ce produit solide dans un-acide. Si l'on utilise un acide qui forme un composé insoluble dans l'eau avec les métaux polyvalents présents dans le complexe solide de tétracycline, les ions métalliques sont alors séparés de la solution acide de l'antibiotique sous la forme de leurs sels insolù- bles. C'est ainsi que lorsqu'on traite le complexe baryum-calcium d'un des antibiotiques du type tétracycline par de l'acide sulfurique dilué, l'an- tibiotique se dissout en laissant un -résidu solide de sulfate de calcium et de sulfate de baryum. Cette partie salide peut être éliminée par exemple par filtration.
Il est souvent désirable d'utiliser un second traitement acide de la matière solide pour dissoudre tout l'antibiotique. La solution aqueuse acide combinée de l'antibiotique peut être alors réglée à un pH de
6 à 9 environ et de préférence voisin de 7 pour précipiter l'antibiotique amphotère. Des concentrations très élevées de l'antibiotique-sont obtenues en prenant soin de maintenir au minimum le volume d'acide. L'antibiotique précipitée rpeut encore contenir de petites quantités st de sels métalliques.
Le procédé peut alors être répété pour les éliminer. Si l'antibiotique am- photère est précipitée à un pH d'environ 5, il reste moins d'impuretés métal- liques que dans lecas du pH plus élevés. L'antibiotique purinlé ainsi obte- nu peut être utilisé en thérapeutique animale ou humaine ou pour stimuler la croissance des plantes ou des animaux. On peut aussi le purifer davanta- ge pour obtenir la forme cristallisée. On y arrive par exemple en dissolvant le produit purifié dans du méthanol contenant de l'acide chlorhydrique et en ajoutant ensuite une nouvelle quantité d'acide chlorhydrique pour déter- miner la précipitation du chlorhydrate cristallisé.
Dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on a trouvé que la quantité d'ions métalliques nécessaires pour précipiter l'antibiotique varie quelque peu suivantle traitement préalable du bouillon de fermenta- tion. On utilise généralement des acides pour clarifier le bouillon pendant la filtration du mycélium. On a trouvé que si l'on utilise de l'acide sul- furique à cette fin, des quantités appréciables d'ions métalliques formant des sulfates insolubles dans l'eau doivent être utilisés pour éliminer l'ex- ces d'acide sulfurique avant que les métaux commencent à précipiter l'anti- biotique. L'acide chlorhydrique est particulièrement utile pour acidifder le bouillon de fermentation avant la filtration du mycélium.
Comme la plu- part des métaux précités forment des chlorhydrates relativement solubles dans l'eau, aucun excès d'ions métalliques n'est nécessaires.
Une des combinaisons .préférées d'ions métalliques pour la précipi- tation des antibiotiques du type tétracycline est celle d'un sel de baryum soluble dans l'eau avec un sel de magnésium soluble dans l'eau. L'emploi d'une proportion du sel de magnésium pour deux proportions du sel de baryum convient très bien pour précipiter l'antibiotique. Le rapport entre les ions métalliques et l'antibiotique n'est pas fixe mais dépend de la propor- tion des ions métalliques utilisés et de la teneur en ions métalliques de la solution initiale d'antibiotique, du pH auquel s'effectue la précipita- tion, et d'autres facteurs.
Il faut noter que les complexes sont préparés par précipitation avec deux ions métalliques spécifiques par exemple le baryum et le magnésium et, en plus de ces métaux, avec certains autres métaux polyvalents initialement présents dans le bouillon de fermentation. On a trouvé que le précipité obtenu en traitantla solution aqueuse pure d'un des antibiotiques (oxytétracycline) par un mélange de sels solubles de baryum et de magnésium dans la quantité minimum requise pour obtenir une précipita- tion appréciable de l'antibiotique contient les ingrédients dans le rapport suivant : 4 oxytétracycline, 2 magnésium et 1 baryum lorsque le pH de la
<Desc/Clms Page number 4>
précipitation est environ 9,0. Ceci ne s'applique qu'à des solutions pures et particulièrement dans ces conditions exactes.
Lorsqu'on utilise des so- lutions impures ou d'autres concentrations, la précipitation maximum de que exige un autre rapport entre les métaux et une proportion différente et une modification d'autres facteurs.
On remarquera que les composés complexes des antibiotiques du type tétracycline de l'invention ne sontpas transformés en produits ne contenant que deux ions métalliques polyvalents, et par exemple trois ions métalliques polyvalents ou un plus grand nombre d'ions peuvent intervenir dans la for- mation de ces précipités. En outre, les composés métalliques complexes des antibiotiques du type tétracycline peuvent varier dans leur composition --en mettant en contact le précipité solide avec une solution d'ions métalliques polyvalents autres que ceux qui interviennent dans la précipitation.
C'est ainsi qu'un, précipitée obtenu à partir d'oxytétracycline avec du calcium et du magnésium peut être modifié et contenir une quantité considérable de baryum si l'on traite ce précipité par une solution d'un sel de baryum so- luble. Dans la série des complexes de l'oxytétracycline, le composé baryum- magnésium semble le moins soluble. Le sel baryum-zinc a une solubilité du même ordre et le sel calcium-magnésium est un peu plus soluble. L'addition de plus de deux sels solubles dans l'eau des ions métalliques polyvalents désirés peut amener la précipitation d'une proportion appréciable du com- plexe de l'antibiotique avec les deux métaux qui forment le complexe le moins soluble; toutefois, une partie des autres métaux en présence précipi- te généralement avec l'antibiotique mais en proportion moindre.
Dans certains cas, on rencontre des mélanges de deux ou plusieurs antibiotiques, par exemple la culture de certains microorganismes donne des mélanges de chlortétracycline et de tétracycline . Ces mélanges peuvent être précipités par le procédé décrit ci-dessus. Il peut se faire que les antibiotiques ne soient pas précipités exactement dans la proportion qu'ils présentent dans la solution, parce que les solubilités relatives des comple- xes des différents antibiotiques ne sont pas les mêmes. Les précipités mixtes peuvent être transformés en antibiotiques amphotères mixtes ou en sels mixtes d'antibiotiques. Les mélanges peuvent être utilisés dans les applications décrites ci-dessus pour les antibiotiques individuels, ou sé- parés.
Comme on l'a mentionné plus haut, un antibiotique du type tétracy- cline ou une solution acide d'antibiotique du type tétracycline peut être régénérée à partir des précipités obtenus suivant le procédé de l'invention par traitement par des acides ou d'une autre manière. On a indiqué également que de petites quantités de métaux peuvent subsister dans ce processus et rester avec d l'antibiotique. Comme ces métaux modifient la couleur du produit et ont d'autres effets indésirables leur élimination peut être re- cherchée. Le traitement de solutions acides de l'antibiotique régénéré du type tétracycline par un ferrocyanure soluble facilite l'élimination de la petite quantité de métaux polyvalents subsistant encore dans le produit.
Le précipité peut être filtré ou éliminé d'une autre manière et le filtrat limpide peut être traité par un alcali soluble afin de précipiter l'antibio- tique amorphe du type tétracycline, très pur et de couleur claire. Ceci -facilite l'obtention d'un rendement élevé d'antibiotique cristallisé.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans la limiter.
EXEMPLE 1. -
On prépare un bouillon de fermentation d'oxytétracycline de la manière suivante :
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> 500 <SEP> g
<tb>
<tb> Cérélose <SEP> 500 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Matières <SEP> solubles <SEP> de <SEP> distillerie
<tb>
<tb>
<tb> (extrait <SEP> soluble <SEP> dans <SEP> l'eau <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> bouillie <SEP> épuisée <SEP> ayant <SEP> servi <SEP> à <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> fermentation <SEP> de <SEP> l'alcool) <SEP> 25 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 250 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 50 <SEP> litres
<tb>
Le pH du mélange est réglé à 7,0 par addition d'hydroxyde de sodium, puis on ajoute 50 g de carbonate de calcium? Ce bouillon est sté- rilisé à 121 C,
refroidi et inoculé de Streptomyces rimosus et cultivé pen- dant 4 jours à 28 C en agitant sans arrêt. Le bouillon cultivé est amené au pH 2,5 en y ajoutant del'acide sulfurique dilué puis filtré pour obtenir un bouillon clarifié. Dans ce bouillon clarifié contenant 44e9 millions de mcg de l'antibiotique, on dissout, en agitant 120 g de chlorure de baryum dihydraté et 48 g de chlorure de magnésium héxahydraté. On règle ensuite la solution ainsi obtenue au pH 9,0 par une solution d'hydroxyde de sodium.
Après 10 minutes de repos, le précipité qui se forme est filtré avec une petite quantité d'un auxiliaire de filtration approprié (terre d'infusoires).
Le bouillon épuisé et les eaux de lavage contiennent au total 1,92 millions mog d'oxytétracycline.
On traite encore le précipité en le mettant en suspension dans deux litres d'eau et en l'amenant au pH 1,2 par de l'acide sulfurique. La solution contenant 36,8 millions de mog d'oxytétracycline est séparée de la matière insoluble par filtration . En réglant le pH de la solution à 7,0 par de l'hydroxyde de sodium, l'oxytétracycline précipite. On la sépare par filtration et on établit qu'elle contient environ 34 millions de come de l'antibiotique. Gette matière est beaucoup plus pure que l'oxytétracycli- ne contenue dans le bouillon de fermentation , mais contient encore de peti- tes quantités de métaux comme le calcium et le magnésium. Le filtre%'séparé du précipité contient 2,3 millions de mcg d'oxytétracycline.
EXEMPLE 2. -
Un bouillon d'oxytétracycline préparé comme ci-dessus et contenant environ 20 millions de mcg de l'antibiotique , mais clarifié à l'acide - chlorhydrique au pH 2,5 est amené au pH 9,0 par de l'hydroxyde de sodium.
On y ajoute 50 g d'un chlorure de baryum dihydraté et 20 g de chlorure de magnésium hexahydraté dissous dans 200 cm3. d'eau chaude. On agite le mé- lange pendant une demi-heure, on ajoute 80 g de Super-cel-(terre d'infusoi- res) et on filtre la partie solide. Le filtrat contient 0,8 million de mcg d'antibiotique. Le gateau de filtration est lavé avec un Titre d'eau et l'eau de lavage contient 0,5 million de mog d'oxytétracycline.
Le gateau est tritu é 3 fois avec 600 cm3 d'eau en réglant chaque fois le pHà1,5 par de l'acide sulfurique et en filtrant la matière solide.
Les filtrats réunis contiennent 12.000 mog/om3 d'antibiotique. On y ajou- te graduellement une solution d'hydroxyde de sodium jusqu'à ce que le pH at- teigne 7,0 . L'oxytétracycline brute précipite et est filtrée et lavée avec 200 cm 3 d'egu. Le filtrat et les eaux de lavage contiennent environ 2,3 mil- lions de mcg d'antibiotique. Le gateau est séché.jusqu'au lendemain sous vide à 50 C. Il pèse 25,0 g et contient à l'essai 650 mog/mg.
EXEMPLE 3.-
On prépare de la même manière un bouillon semblage à celui de l'ex- emple 1, mais dans lequel les matières solubles de distillerie sont rempla- cées par un poids égal d'un produit de digestion enzymatique de caséine et
<Desc/Clms Page number 6>
on le clarifie par de l'acide chlorhydrique au pH 2,5. Le bouillon clarifié est réglé par de l'hydroxyde de sodium au pH 9,0 puis extrait plusieurs fois 'par des portions de 10 % en volume de butanol normal. L'antibiotique est extrait au moins partiellement sous forme de sels avec des métaux com- me le calcium et le magnésium. Il est également possible d'extraire des composés métalliques complexes de l'oxytétracycline aved d'autres combinai- sons métalliques comme le baryum-magnésium et le baryum-zinc.
L'extrait par le butanol. est extrait à son tour par la moitié de son volume d'acide c chlorhydrique N dans l'eau. Ce concentré aqueux contient 4. 600 mcg/cm3 de l'antibiotique. On régle 40 cm3 de cette solution au pH 9,5 par de l'hy- droxyde de sodium dilué et le précipité qui se forme est centrifuge,,- et séparé du liquide limpide qui surnage. Ce liquide résiduel contient envi- ron 500 mog/om3 d'oxytérracycline ce qui indique qu'environ 90% de l'an- tibiotique ont été précipitée. Le-, précipité est lavé à l'eau et séché. Il contient à l'essai environ 675 mog/mg. Un échantillon contient environ 35% de cendres (sulfatées) formées de quantités approximativement égales de cal- cium et de magnésium.
Comme on l'a indiqué plus haut, le calcium et le ma- gnésium sont extraits de bouillon d'oxytétracycline dans le butanol sous la forme de sels métalliques complexes, dans ce cas principalement sous la forme du composé complexe calcium-magnésium.
EXEMPLE 4.-
On prépare un bouillon de fermentation de tétracycline par culture dans un milieu nutritif dans des conditions aérobies submergées d'un strep- tomyces produisant une proportion importante de tétracycline. Lorsque la fermentation est achevée, on acidifie le bouillon au pH 2,5 par de l'acide chlorhydrique eton filtre. On traite 1 litre du bouillon filtré par 42,4 cm3 d'une solution préparée en dissolvant'342 g de chlorure de baryum dihy- draté et 45,6 g de chlorure de magnésium hexahydraté dans 950 g d'eau.
On agite le mélange et on le règle au pH 8,5 par une solution diluée d'hy- droxyde de sodium. On continue à agiter pendant une demi-heure environ et on élimine ensuite le précipité par filtration avec une petite quantité d'un auxiliare de filtration (@ d'infusoires) L'essai du filtrat indique l'élimi- nation d'environ 90% de l'activité de l' antibiotique . Le gateau de filtra- tion humide est mis en suspension dans un volume minimum d'eau et amené au pH 1,5 par addition d'acide sulfurique à 50%. On agite le mélange quelques minutes puis on filtre. Le gâtea de filtration humide est à nouveau mis en suspension dans un volume minimum d'eau, amené au pH 1,5 par de l'acide sulfurique à 50% et refiltré. Les deux filtrats sont combinés et amenés au pH 7,0.
La tétracycline amphotère purifiée se sépare de la solution sous la forme d'une matière solide finement divisée de couleur claire. Cette matière est filtrée avec une petite quantité d'auxiliaire de filtration et on établit qu'elle possède une grande activité biologique. Des cristaux sont obtenus en dissolvant l'antibiotique amphetère dans une solution concentrée de chlorure de calcium en filtrant et en ajoutant de l'acide chlorhydrique concentré. Le chlorhydrate cristallisé de tétracycline se sépare alors.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.