Procédé de préparation de bromtétracycline La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une nouvelle substance antibiotique à large spectre utilisable en thérapeutique, la brom- tétracycline. Conformément au procédé de la présente inven tion, on obtient la bromtétracycline en soumettant un milieu nutritif aqueux contenant au moins 50 par ties d'ions bromure pour 1 million de parties du mi lieu et présentant une teneur en ions chlorure ne dé passant pas 50 parties pour 1 million de parties du milieu,
à une fermentation en aérobiose à l'aide d'une souche de Streptomyces aureofaciens produc trice de bromtétracycline..
La substance antibiotique ainsi obtenue est dif férente de celles connues jusqu'à présent et différente, en particulier, de l'antibiotique dénommé chlortétra- cycline produit jusqu'à présent au départ des mêmes microorganismes.
La substance antibiotique nouvellement décou verte a été dénommée bromtétracycline, car on a constaté que sa structure est identique à celle de la chlortétracycline, sauf que l'atome de chlore est rem placé par un atome de brome. . La bromtétracycline a donc la composition C,H2sN20sBr et la formule développée suivante
EMI0001.0017
La bromtétracycline, sous forme libre, est am photère et forme des sels tant avec des acides qu'avec des bases.
Ainsi, la bromtétracychne forme des sels d'addition avec des acides organiques et inorganiques et peut être obtenue sous forme de chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, borate, nitrate, phosphate, as- corbate, citrate, succinate, acétate, sulfamate et au tres sels d'addition avec des acides de nature simi- laire. La bromtétracycline forme également des sels monobasiques et bibasiques avec des bases,
notam ment avec celles des métaux alcalins ou alcalino- terreux, avec les bases d'ammonium et les bases ami nées. Comme exemples spécifiques, on peut citer les sels de calcium, baryum, strontium, magnésium, éthy- lène-diamine, triéthylamine, pipéridine, potassium et lithium. La bromtétracycline forme également des sels ou plus exactement des sels complexes avec des sels basiques d'acide borique, tels que le borate sodique.
Les sels des types décrits plus haut présentent de la valeur dans les procédés d'isolement et de purifi cation, car ils peuvent être transformés, par neutra lisation ou métathèse, en matière amphotère libre ou d'une forme en une autre. Ces sels possèdent éga lement des propriétés antiseptiques et thérapeutiques. La solubilité de la bromtétracycline dans l'eau varie avec le pH, cette solubilité étant plus grande lorsque le pH augmente et moindre à partir d'un pH d'envi ron 6. La forme qui est la moins soluble- dans l'eau à un pH intermédiaire est dite isoélectrique, ou ma tière amphotère ou libre.
Des essais<I>in vitro</I> ont révélé que les sels d'acides et de bases, de même que la matière isoélectrique ou libre, sont actifs vis-à-vis d'un grand nombre de bactéries, y compris des bacté ries Gram-positives et Gram-négatives.
Les sels d'acides de la bromtétracycline peuvent se préparer aisément en dissolvant l'antibiotique libre dans de l'eau ou dans un autre solvant approprié aci difié à l'aide d'un acide organique ou minéral. De même, les sels basiques peuvent être préparés aisé ment en ajoutant une base organique ou inorganique à une solution de l'antibiotique libre.
Le spectre d'absorption dans infrarouge de l'an tibiotique libre dissout dans une huile hydrocarbonée présente des bandes d'absorption caractéristiques au voisinage de 3460, 3320, 3050, 1645, 1610, 1575, 1525 et 830 cm-1. Le spectre infrarouge de ce com posé, bien que similaire à maints égards à celui de la chlortétracycline libre, notamment en ce qui con cerne les bandes d'absorption de part et d'autre de 950 cm-', révèle des différences ;
ainsi, ce spectre ne présente aucune bande triple d'absorption corres pondant à celle que présente la chlortétracycline au voisinage de 800 cm-', tandis que des différences se manifestent dans les rapports d'intensité d'absorption, comme on peut s'y attendre avec de faibles différen ces moléculaires.
Le spectre antibiotique de la bromtétracycline est à maints égards similaire à celui de la chlortétracy- cline.
On a constaté que, pendant la fermentation, il est souhaitable de faire croître les microorganismes précités dans des conditions d'aérobiose immergée en agitant et en aérant convenablement les cultures, par exemple dans un flacon sur une machine à agi ter ou dans un fermentateur agité, équipé d'un dispo sitif permettant d'y introduire, de manière continue, un courant d'air. La température ne paraît pas être déterminante dans la gamme de température de 25 à. 350 C, bien qu'on préfère opérer à une tempéra ture comprise entre 30 et 350 C. Le pH initial du.
milieu est de préférence voisin de la neutralité, bien qu'une certaine quantité d'antibiotique soit égale ment produite dans des milieux présentant des va leurs de pH initiales aussi faibles que 5,0 ou aussi 'levées que 8,5. Un milieu de fermentation convenant pour la production de bromtétracycline contient une source de carbone, telle qu'un hydrate de carbone assimi lable, une source d'azote assimilable, des sels inorga niques, tels que des phosphates, des sels de magné sium, etc., et des sources des oligo-éléments habituels. Des tampons sont ordinairement inclus dans le mi lieu de fermentation.
On ajoute une source d'ions bromure de sorte qu'au moins 50 parties par million d'ions bromure soient présentes, la quantité maxi mum requise pour une opération satisfaisante ne dépassant pas approximativement 1500 parties par million. La teneur du milieu nutritif en ions chlo rure ne doit pas dépasser 50 parties par million. Elle est de préférence inférieure à 10 parties par million.
La source de carbone peut être soit un hydrate de carbone soluble, tel que le saccharose, soit un hydrate de carbone insoluble, tel qu'un amidon, com me l'amidon de maïs. On peut également utiliser de la dextrine. Alors que le saccharose, qui constitue un sucre soluble, est très satisfaisant, le lactose et le glucose, qui constituent deux autres sucres solubles, sont relativement médiocres.
La quantité de source de carbone peut varier dans de larges limites, soit de 0,5 à 10,0 % en poids environ, par rapport au poids total du milieu de fermentation.
Comme source d'azote assimilable, on peut uti liser des sels d'ammonium inorganiques. Parmi ces sels, on peut citer le sulfate d'ammonium, le phos phate d'ammonium, etc. Il est également possible d'utiliser des sources d'azote organiques telles que des aminoacides et diverses matières protéiniques naturelles.
Parmi les sels inorganiques qui se sont révélés avantageux, on peut citer les phosphates, qui peu vent être présents sous forme de phosphate d'am monium ou d'un phosphate métallique, notamment sous forme de phosphate de potassium, et le sulfate de magnésium ; il est souhaitable que le phosphate de potassium soit présent, s'il n'y a pas d'autre source de potassium.
L'addition de faibles quantités de métaux lourds est désirable, à moins que de tels métaux soient pré sents dans les autres ingrédients. Parmi ces éléments, qui peuvent être présents sous forme de traces, par exemple comme impuretés, ou être ajoutés, on peut citer le cuivre, le zinc, le manganèse, le fer et le chrome.
Parmi les agents tampons, on peut citer le carbo nate de calcium et les sels d'acides organiques, tels que citrates, acétates et lactates, qui sont utiles pour maintenir le pH dans les limites voulues. En outre, les acides organiques peuvent servir comme sources de carbone dans le métabolisme du microorganisme. L'emploi d'un agent de destruction des mousses est souhaitable dans les fermentateurs à grande capa cité, même si, au cours de la fermentation la forma tion de mousse ne constitue pas un problème particu lièrement difficile et est aisément limitée par utilisa tion d'un agent antirnousse habituel, tel que l'octadé- canol dans de l'huile de lard ou un autre agent des tructeur ou inhibiteur de mousse du commerce.
Les microorganismes de l'espèce Streptomyces aureofaciens se divisent en deux catégories générales l'une comprenant les souches qui présentent une af finité particulière pour les ions chlorure et l'autre comprenant les souches qui ne présentent pas d'affi nité particulière pour les ions chlorure.
Les souches de la première catégorie tendent à utiliser tout ion chlorure présent dans le milieu nu tritif pour produire de la chlortétracycline. En l'ab sence d'ions chlorure, ces souches tendent à utiliser les ions bromure, à condition que le milieu nutritif en contienne, pour produire de la bromtétracycline. Une certaine quantité de tétracycline est invariable ment produite, même en présence d'un excès d'ions chlorure. La formation de l'un ou l'autre des anti biotiques est fonction des conditions prévalant dans le milieu nutritif.
Une souche de la première caté gorie, par exemple la souche S-77, cultivée dans un milieu renfermant des ions chlorure mais ne conte nant pas d'ions bromure, produira de la chlortétra- cycline et une faible quantité de tétracycline.
Dans un milieu exempt d'ions chlorure mais renfermant des ions bromure, il se formera de la bromtétracycline et de la tétracycline, la dernière en quantité notable ment plus élevée que dans un milieu de fermentation contenant des ions chlorure. L'ordre d'affinité de ces organismes est telle que la chlortétracycline est produite de préférence, la tétracycline et la brom- tétracycline prenant la seconde et la troisième place, respectivement.
En présence de quantités limitées d'ions chlorure et d'un excès d'ions bromure, les microorganismes de cette catégorie utiliseront d'abord les ions chlorure et commenceront ensuite à produire la bromtétracycline. La tétracycline sera également synthétisée. En présence d'un excès d'ions chlorure et d'ions bromure, les organismes ne produiront au cune quantité notable de bromtétracycline. Toute fois, les ions bromure exercent un effet inhibiteur sur les ions chlorure, de sorte que le rapport de la tétra cycline à la chlortétracycline est modifié en faveur de la tétracycline.
Les souches de la seconde catégorie se compor tent de manière très différente. Elles n'utilisent pas les ions bromure et, par conséquent, ne produisent pas de bromtétracycline, quelles que soient les con ditions de culture, en présence ou en l'absence d'ions chlorure. La tétracycline est synthétisée en quantités modérées et si des ions chlorure sont présents, un peu de chlortétracycline sera également produit. Ces microorganismes ne peuvent donc pas être utilisés dans le présent procédé.
Pour obtenir de la brom- tétracycline, il faut donc utiliser une souche d'orga nismes de la première espèce, possédant une affinité particulière pour les ions chlorure, et éliminer les ions chlorure ou du moins en limiter la quantité comme indiqué tout au début du présent exposé.
Il existe plusieurs manières de limiter la teneur en ions chlorure du milieu de fermentation. Une de ces manières consiste à séquestrer les ions chlorure dans un complexe inactif où le chlore n'est pas io nisé. Des résultats satisfaisants ont été obtenus par utilisation d'eau distillée et par utilisation dans le milieu de constituants ne contenant pas d'ions chlo rure. Des milieux synthétiques, dont des exemples sont donnés plus loin, peuvent être utilisés dans ce but.
De nombreuses matières naturelles, souvent uti lisées dans les milieux de fermentation, contiennent des ions chlorure. Leur emploi est néanmoins possi ble, à condition qu'elles soient préalablement désio- nisées, par traitement avec des échangeurs d'ions ou d'autres agents convenables pour en éliminer les ions chlorure.
La titulaire a mis au point un milieu synthétique qui est sensiblement exempt d'ions chlorure et qui donne des rendements supérieurs, tout en étant facile à préparer, de coût modique et de composition cons tante. Ce milieu contient, en général, du saccharose comme hydrate de carbone, du sulfate d'ammonium comme source d'azote, du phosphate de potassium comme sel inorganique, du sulfate de magnésium, du carbonate de calcium, du citrate de sodium et de l'acide acétique comme agents tampons, ainsi que du sulfate de cuivre, du sulfate de zinc et du sul fate de manganèse en petites quantités, comme sour ces d'oligo - éléments.
Des qualités sensiblement exemptes de chlorure de ces matières sont choisies et de l'eau distillée est utilisée, de façon que le mi lieu de fermentation ne contienne pas plus de 1 par tie par million d'ions chlorure. On ajoute alors une source d'ions bromure en quantité voulue.
Un inoculum pour la fermentation peut être pré paré à partir d'une culture obtenue sur des milieux de culture à plan incliné, inoculés au moyen de Streptomyces aureofaciens. Un milieu approprié pour les cultures à plan incliné est l'agar de Waksman de composition suivante Glucose . _ . . . . . . . . . . . . 10 g/1 Peptone .......... 5 g/1 KIH2P04 <B>....... ......</B> 1 g/1 MgS04 .71-120 <B>-----</B> . . . . . 0,5 g/1 Agar . . . . . . . . . . . . . .
20 g/1 La culture peut être transférée dans des flacons à agiter qui peuvent être utilisés comme fermenta- teurs de laboratoire ou pour la production d'inoculum pour fermentation à plus grande échelle.
Selon les dimensions du fermentateur, on peut utiliser de 0,5 à 1,5 volume d'air libre par volume de milieu liquide. La formation de mousse dans le milieu peut. être limitée par l'addition stérile d'un agent antimousse, tel que de l'huile de lard conte nant 2 % d'octadécanol.
<I>Récupération et purification</I> Comme indiqué, le produit de fermentation ren ferme en plus de la bromtétracycline une quantité inférieure de tétracycline. Pour certaines applications, il n'est pas nécessaire d'isoler la bromtétracycline à partir du milieu de fermentation. Ainsi, la matière fermentée peut être ajoutée directement à des aliments pour animaux, en sorte qu'on- obtient un produit convenant particu lièrement pour stimuler la croissance et/ou combat tre des maladies des animaux.
Lorsqu'on ne désire pas se servir des myceha et insolubles, le milieu de fermentation peut être filtré avec ou sans acidifica- tion et la liqueur claire put être ajoutée à l'eau de breuvage ou à des aliments pour animaux. Si on le désire, la liqueur contenant la bromtétracycline et la tétracycline peut être concentrée sous pression ré duite ou séchée par pulvérisation et l'antibiotique peut être utilisé sous forme brute pour stimuler la croissance ou traiter des maladies chez l'homme, les animaux et la volaille.
Lorsqu'on désire isoler la bromtétracycline et éventuellement la tétracycline sous forme pure, elles peuvent être récupérées du milieu de fermentation par un certain nombre de procédés comportant une ou plusieurs opératiôns, exécutées dans des ordres variés, d'adsorption, d'élution, d'extraction par sol vant avec ou sans agents auxiliaires, de cristallisation, de précipitation sous forme de sels insolubles, tels que les sels de calcium, baryum, strontium ou magnésium à des pH supérieurs à environ 6,5,
ou sous forme de sels insolubles avec des sulfates ou des acides sul- foniques du type agent mouillant ou colorant azoïque. On peut aussi faire passer la bromtétracycline et la tétracycline en solution dans un solvant organique, en utilisant, comme agents solubilisants des sulfates ou des sulfonates du type agent mouillant ou colo rant azoïque.
La bromtétracycline et la tétracycline peuvent, en outre, être séparées à partir du milieu ou moût de fermentation brut, par acidification à un pH de 3 environ ou moins, la bromtétracychne et la tétracycline passant ou restant en solution et les matières solides insolubles pouvant alors être sé parées et éliminées. La bromtétracycline et la tétra cycline peuvent être précipitées sous forme de sels de métaux alcalino-terreux dans des solutions aqueu ses à un pH supérieur à environ 6,5.
Ce précipité peut être extrait au moyen d'eau acidifiée ou au moyen de solvants organiques, tels que des alcools, alcoxy- alcanols ou cétones. L'extraction peut se faire en milieu acide, neutre ou basique. Similairement, une solution aqueuse contenant de la bromtétracycline et de la tétracycline peut être extraite par des solvants organiques non miscibles à la couche aqueuse, tels que des alcools inférieurs, des alcoxyalcanols, des es ters et des cétones non miscibles à la couche aqueuse.
Parmi les solvants connus tels que le butanol, le chloroforme et l'acétate d'éthyle, on préfère le bu- tanol pour l'extraction de la bromtétracycline et de la tétracycline. Certains alcools, tels que l'isopropa- nol, qui sont miscibles à l'eau, mais ne sont pas mis cibles à une solution saline, sont également utiles. L'addition d'une substance soluble dans l'eau et in soluble dans la couche organique, par exemple d'am- moniaque, d'amines, d'halogénures de métaux alca lins et de sulfates, facilite l'opération d'extraction.
La bromtétracycline et la tétracycline peuvent être précipitées dans des solutions aqueuses par addi tion de substances hydrosolubles, par exemple d'am moniaque, d'amines, d'halogénures de métaux al calins et de sulfates.
Si le moût de fermentation contient de la chlor- tétracycline, celle-ci est récupérée avec la brom- tétracycline et la tétracycline dans les procédés dé crits ci-dessus. La titulaire a également mis au point un nouveau procédé de récupération hautement efficace tant au point de vue de la récupération d'un produit exempt d'impuretés inactives qu'au point de vue de la récu pération d'un produit exempt d'autres substances antibiotiques formées en même temps dans le milieu. Ce procédé de récupération permet d'obtenir un pro duit cristallin de haute pureté aux deux points de vue en question.
Ce procédé implique essentiellement l'utilisation de sels d'ammonium quaternaire, qui pré cipitent sélectivement la tétracycline et la bromtétra- cycline dans le milieu de fermentation, à un pH alca lin (pH 8 à 11) sous forme de sels d'ammonium quaternaire de bromtétracycline et de tétracycline. Après filtration, un tel sel est empâté avec une faible quantité d'eau et une quantité relativement impor tante de chloroforme, en sorte que les sels d'ammo nium quaternaire de bromtétracycline et de tétracy cline sont dissous dans la phase chloroformique de la pâte.
Les phases aqueuse et chloroformique sont alors, de préférence, séparées de manière à éliminer les impuretés dissoutes dans l'eau. La bromtétracy- cline et la tétracycline sont alors extraites à l'aide d'une solution aqueuse acide à un pH d'environ 1 à 2,5, ce qui donne lieu à la formation des sels d'acide de bromtétracycline et de tétracycline, qui passent en solution dans la phase aqueuse, dans laquelle ces sels précipitent sous forme de produits cristallins, par augmentation du pH de 3 à 7, la précipitation com mençant à pH 3.
Les sels d'ammonium quaternaire, qui sont parti culièrement utiles dans ce procédé de récupération, sont les chlorures d'alcoyl-triméthylammonium et les chlorures de dialcoyl-diméthylammonium, dans les quels le groupe alcoyle contient 8 à 18 (inclusive ment) atomes de carbone. E,xemple <I>1</I> On prépare un hydrolysat de caséine par hydro lyse de 5 g de caséine avec 0,85 cm-3 d'acide sulfu rique dans 100 cm2 d'eau, en agitant à 50o C pen dant 60 minutes et en chauffant à 120,1 C pendant 120 minutes dans un autoclave.
On neutralise la caséine hydrolysée à pH 6,0 à l'aide d'ammoniaque, environ 2,5 cm8 de celui-ci étant requis. On prépare un milieu de base contenant, par litre, l'hydrolysat de caséine obtenu à partir de 5 g de caséine, et les ingrédients suivants lactate de magnésium . . 3,5 g carbonate de calcium . . 2,5 g NaH2P04 ' H20 . . . . . . 2,2 g saccharose . . . . . . . . . . 15;
0 g FeS04. 7H20 . . . . . . . . 40,0 mg CUS04 ' 5H20<B>......</B> 32,0 mg MnS04 - 4H20<B>......</B> 20,0 mg ZnSQt - 7140 <B>......</B> 20,0 mg acétate de cobalt<B>....</B> 5,0 mg C1 ................ < 5 parties par million de parties du milieu A ce milieu, on ajoute les quantités de bromure de potassium indiquées dans le tableau suivant. On obtient les activités indiquées dans le même tableau.
EMI0005.0011
Bromure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> Unités <SEP> d'activité
<tb> g/litre <SEP> antibiotique
<tb> 0,1 <SEP> 415
<tb> 0,2 <SEP> 450
<tb> 0,4 <SEP> 430 Les unités indiquées se rapportent à l'activité antibiotique sur Straphylococcus aureus correspon dant à l'activité de 1 microgramme de chlortétracy- cline par cm3. La fermentation est effectuée à 270 C pendant 72 heures avec agitation et aération. Le mi croorganisme utilisé pour la fermentation est le Strep tomyces aureofaciens B. C. 41.
Le rendement de la fermentation en antibiotiques se compose de '/a de tétracycline, '/9 de bromtétracycline et z/9 de chlor- tétracycline. <I>Exemple 2</I> On effectue une fermentation sous des conditions identiques à celles définies dans l'exemple 1, sauf que la durée de la fermentation est réduite à 48 heures.
On obtient les résultats suivants
EMI0005.0025
Bromure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> Unités <SEP> d'activité
<tb> g/litre <SEP> antibiotique
<tb> 0,1 <SEP> 330
<tb> 0,2 <SEP> 305
<tb> 0,4 <SEP> 290 Le rendement de la fermentation en antibiotiques se compose de 2 parties de tétracycline pour 1 par tie de bromtétracycline et d'une faible quantité de chlortétracycline. <I>Exemple 3</I> On prépare un milieu contenant moins de 50 parties d'ions halogénure par million de parties et ayant la composition suivante, exprimée en mgr/litre Saccharose .......... 30.000 D,L-alanine ..........
450 L-arginine <B>....</B> .<B>.......</B> 570 D,L-méthionine ...... 200 Acide L-glutamique <B>....</B> 260 L-histidine .......... 200 D,L-bêta-asparagine <B>....</B> 200 (NH4)2SO4 . . . . . . . . . . . .<B>2.000</B> Lactate de magnésium . . 5.000 NH4H2P04 . . . . . . . . . . 2.000 Lactate de potassium . . 2.000 Mg'-'l(P04)2 <B>....</B> .<B>.....</B> 1.000 Carbonate de calcium .. 5.000 FeS04. 7H20 . .
.<B>.....</B> 60 ZnS04-7H20 ........ 33 MnS04-H20 ........ 19 CUS04 ' 5H20 . . . . . . . . 5 Co(CH3C02)2 - 6H20 . . 5 La solution est portée au volume requis au moyen d'eau distillée sur de l'hydroxyde de sodium. Tous les constituants, à l'exception du carbonate de calcium, sont dissous, puis le pn est ajusté à 6,2-6,3 à l'aide d'une solution ammoniacale 3N (approxi mativement 3cc par litre) et le carbonate de calcium est ajouté. Le milieu ne donne pas de précipité avec l'acide nitrique et le nitrate d'argent.
Sa teneur en ions chlorure s'avère inférieure à 0,17 mgr/litre. Des fractions de 100 cc du milieu de base sont placées dans les flacons d'Erlenmeyer d'une capacité de 500 cc, que l'on bouche avec des tampons de coton et que l'on traite à l'autoclave pendant 15 mi nutes à 1200 C. 10 cc d'eau distillée stérile sont ajou tés à chaque tube d'une série de tubes à culture in clinée sur gélose, contenant du Streptomyces aureo-. faciens sous forme sporulée. Les spores sont douce ment détachées à l'aide d'un fil métallique stérile et -les suspensions de spores sont réunies l'une à l'autre.
Les flacons sont chacun inoculés à l'aide de 5 cc de cette suspension et agités pendant 24 heures à 27() C, en sorte qu'on obtient un inoculum. 6,3 litres du milieu et 35 cc d'huile minérale sont placés dans un fermentateur équipé d'un agitateur et d'un aérateur et le tout est stérilisé.
Le contenu de 7 flacons d'inoculum vieux de 24 heures et 50 cc d'une solution aqueuse stérile contenant 0,97 g de bromure de potassium sont introduits, dans des con ditions stériles, -dans le fermentateur. La fermentation est conduite à 27,40 C, en faisant tourner l'agitateur à 350 tours par minute et en faisant passer de l'air à un débit de 7 litres par minute. L'air est d'abord conduit à travers un laveur à acide nitrique et à ni trate d'argent, puis à travers un laveur à eau et en- suite à travers un filtre de stérilisation.
Au besoin, on ajoute un inhibiteur de mousse constitué, par exemple, par une polysiloxane <B>(e</B> Général Electric Silicone SS24 ).
Pendant la croissance du milieu, le pli diminue lentement et la fermentation est poursuivie jusqu'à ce que le pH cesse de diminuer et commence à aug menter. Ceci prend environ 51 heures et on obtient finalement une solution dont le pg est de 5,90. Le moût final titre 412 unités d'antibiotique.
Le moût de fermentation contient de la bromtétra- cycline ainsi que de la tétracycline. Pour séparer la bromtétracycline, le moût de fermentation est acidi fié à un pH de 1,5, en agitant et en employant de l'acide chlorhydrique concentré. Le moût est alors agité avec 95 g d'un adjuvant de filtration et le mé lange est filtré.
Le gâteau de filtration est empâté avec 1400 cc d'eau distillée à 500 C. La pâte obtenue est filtrée et le filtrat est ajouté au filtrat du moût. Dans les fil- trats, on retrouve 94,4 % de l'activité du moût. Le pH du filtrat est ajusté à 2,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium à 50 % (32 cc)
et le mélange est concentré sous vide à une température comprise entre 25 et 30 OC, jusqu'à un volume final de 2070 cc. 83;6 % de l'activité du moût se retrouvent dans le mélange final. Le pH est ajusté à 1,5 à l'aide d'acide chlor hydrique concentré et 331 g de chlorure de sodium sont ajoutés.
La solution est extraite à deux repri ses avec des portions de 311 cc de n-butanol et en suite à trois reprises avec des portions de 207 cc de n-butanol. Les extraits sont combinés, leur pli est ajusté à 2,5 au moyen d'hydroxyde de sodium à 50 % et le mélange est distillé sous vide,
dans une atmosphère d'azote, en opérant des additions d'eau, jusqu'à ce que tout le n-butanol ait distillé azéotro- piquement. Le pli est ajusté à 1,5 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré, 5 g d'un adjuvant de fil tration sont ajoutés et le mélange est filtré sur un entonnoir à verre fritté.
Un volume aqueux final de 1100 cc contenant 70,5 % de l'activité du moût ori- ginal est obtenu.
A ce filtrat, on ajoute 41,5 g de chlorure de ba ryum dihydraté dissous dans 119 cc d'eau distillée. Le mélange est agité pendant une demi-heure puis le pH est ajusté à 8,5 au moyen d'hydroxyde de sodium, après quoi le mélange est centrifugé. Le gâteau ré sultant est lavé à l'aide de 40 cc d'eau distillée.
Le gâteau lavé est empâté avec 249 cc d'eau distillée, le pli est ajusté à 2,5 au moyen d'acide sulfurique à 50 % et le mélange est agité vigoureusement pendant une heure. Après cela, le pH est ajusté à 1,5 à l'aide d'acide sulfurique à 50 0/0, agité à nouveau pendant une demi-heure, puis centrifugé.
Le précipité obtenu est lavé par centrifugation, avec deux fractions de 15 cc d'acide sulfurique N/10, la première fois en malaxant. Les liquides séparés dont le volume global atteint 260 cc, contiennent 62 % de l'activité du moût de départ.
Le mode opératoire décrit ci-dessus est répété et les deux liquides séparés sont combinés. Le pH du mélange est ajusté à 3,5 à l'aide d'hydroxyde de so dium à 10 0/0, après quoi le mélange est agité pendant 10 minutes et centrifugé. Le précipité obtenu est lavé avec 10 cc d'eau et l'eau de lavage est ajoutée au liquide surnageant.
Le pH des solutions combi nées est ajusté à 4,95 au moyen d'hydroxyde de so- dium à 10 %, et le précipité est recueilli et lavé. Le précipité est congelé et l'eau restante est chassée par sublimation.
On obtient 2,65 g d'un produit à 490 unités de produits actifs et contenant 5,43,% de brome.
Un appareil de répartition à contre-courant de Craig contenant 30 tubes est chargé au moyen d'un solvant constitué par des volumes égaux d'eau dis tillée et de n-butanol saturés l'un avec l'autre, le pH étant ajusté à 2,5 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. 1,55 g du produit congelé et séché sont empâtés avec 160 cc de la phase aqueuse, le pH est réajusté à 2,5, 160 cc de la phase n-butanolique sont ajoutés et le pH est à nouveau ajusté à 2,5 en agitant.
Le mélange est filtré, on laisse les phases se séparer et 50 cc de chaque phase sont introduits dans chacun des trois premiers tubes de l'appareil de Craig. Les tubes restants sont chargés à l'aide de 50 cc de phase aqueuse saturée de n-butanol et la répartition est poursuivie jusqu'à ce que la phase supérieure initia lement dans le tube 2 soit équilibrée dans le tube 29. La répartition est effectuée jusqu'à ce que 18 phases supérieures soient extraites du tube 29. De cette ma nière, toute la matière active est amenée dans le tube 29.
Un examen spectrophotométrique montre qu'il y a deux crêtes, la première se concentrant autour du tube 12 avec un maximum optique à 355 - 365 milli- microns et la seconde se concentrant autour du tube 21 avec un maximum optique à 370 - 375 millimi- crons. Les solutions des tubes 18 à 29 contenant la matière présentant la seconde crête sont combinées et distillées sous vide, en atmosphère d'azote, avec addi tion d'eau à un pH de 2,5, jusqu'à obtention d'une solution aqueuse finale exempte de n-butanol de 50 cc. Le pH est ajusté à 1,5 à l'aide d'acide chlor hydrique, on ajoute un adjuvant de filtration et on filtre le mélange.
Le pH de la solution est alors ajusté lentement, en agitant, à 5,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium à 10,%. Le mélange est agité avec des per- les de verre et laissé au repos pendant une nuit à 40 C.
La solution est centrifugée et le liquide surna geant est congelé et séché en sorte qu'on obtient 200 mg de produit sec. 152 mg de ce produit sont dissous dans 1,4 cc de 2-éthoxy-éthanol sec et la so lution est filtrée, 0,14 cc d'eau sont ajoutés et le mé lange est placé dans un agitateur. La matière cris tallise et les cristaux sont filtrés, lavés et séchés. La première récolte donne 49 mg de bromtétracycline.