BE537353A - - Google Patents

Description

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   On sait qu'on peut introduire des groupes hydroxyles dans des sté- roïdes, notamment en position 17a, à l'aide d'enzymes de surrénales, en particulier avec des homogénéisais ou par passage à travers ces organes ou des tranches de ces organes. Pour aussi intéressante que soit cette fonction des enzymes animales du point de vue théorique, elle ne peut don- ner satisfaction pour l'obtention, spécialement industrielle, de 17a-hydro- 
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 xystéroides. Avec des méthodes microbiologiques qui peuvent aussi être utilisées en grand, la réaction indiquée n'a pas pu être exécutée jusqu'à présent. 



   La présente invention est relative à un procédé permettant d'intro- duire de l'oxygène dans des stéroïdes, caractérisé par le fait que, sur des composés de la série du prégnane présentant en position 17 un atome   d'hy=   drogène, on fait agir des enzymes produites par des cultures aérobies de 
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 champignons de..

   19 ordre des Yo1'dliaIeB ou de l'ordre des Sphériales, puis on isole les stéroïdes hydroxylés en position 17, par exemple en position 
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 17axa Des substances de départ pour le nouveau procédé sont en général des composés de la série du prégnane ayant un atome d'hydrogène en position 17, parmi lesquels il y a lieu d'entendre les dérivés de n'importe quel genre de substitution et de n'importe quelle configuration, saturés et non-sa- 
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 turés, du 10,1,3-diméthyl-17-éthyl-cyclopentano.Qilaphn.rènex ainsi que de ses homologues supérieurs et inférieurs, par exemple les A-nor-, D-homo-, 19-nor-, 21-nor-, et 21-homo-composés correspondants. Des doubles liaisons se trouvent, par exemple, en position 1, 4, 5, 6, 7, 9, 14, 15 et/ ou 20.

   La configuration des substances de départ est, de préférence, celle du prégnane, du   5a-prégnane,   du 17a-prégnane ou de   raémates   correspondants tels qu'on les obtient par synthèse totale. Comme substituants, on envisa- ge en particulier des groupes hydroxyles, oxo ou carboxyliques libres ou   fonctionnellement   modifiés, tels des groupes ester, éther,   thio-ester,   thio- éther, thiol- et thion-ester, acétal, mercaptal, cétal, hydrazone, semi- carbazone et des groupes énoliques, par exemple en position 3, 7, 11, 12, 16, 18, 19, 20 et 21 Des substances de départ spéciales sont, entre autres, 
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 la cortexone, la 9,11- ou la 11,12-déhydro-cortexone, la 16a-hydroxy-carte- xone, la l8-oxo- et la 18-hydroy-cortexone, la corticostérone, la 11-épi- cortiotërone,

   la 11-déhydro-corticostérone, la 18-hydroxy-cortioostérone, le ' -3,11,20-tricéto-21-hydroxy-prégnadiéne, le -3,20-dicéto- 11p,21-dihydroxy-prégnadiêne, la progestérone, la 17oc-progestérone, la 11-   céto-progestérone,   la 11a ainsi que la   11-hydroxy-progestérone,   la 9,11 ou la   11,12-déhydro-progestérone,   la 19-oxo-progestérone, la 19-norprogesté- 
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 rone, la prégnénolone, la 21-hydrox,y=prêgnénolane, J'aldostérone ou leurs dérivés fonctionnels. 



   Les enzymes utilisées sont de provenance   microbiologique   et sont 
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 produites par des cultures #érobiê.s de champignons de#l' ordre des Moniliales et de l'ordre des Sphériales, en particulier par des représentants actifs des familles des Moniliacées, des Dématicaées et des Stilbacées, par exem- 
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 ple le Monilia, l'Oospora, le Trichothecium ou 1.' $elicotriohum, ou des familles des Phaeophragmiae, par exemple les Leptosphérîa. Pour l'introduc- tion d'oxygène, on incube en général directement les substances de départ avec des cultures immergées des champignons indiqués, croissant dans des conditions aérobies connues.

   Ces cultures sont avantageusement remuées, c'est-à-dire secouées ou agitées, et elles renferment du carbone assimila- ble, en particulier des hydrates de carbone, ainsi le cas échéant qae des substances de croissance, par exemple de l'eau de fonflement du mais ou du moût de bière, et des sels inorganiques. On peut ainsi utiliser des solutions nutritives naturelles, synthétiques   ou semi-synthétiques.   Un procédé prati- quement simple est décrit dans ce qui suit sans que l'invention se trouve pour autant limitée par les indications fournies : On cultive les organis- 

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 mes dans des appareils et dans des conditions analogues à ceux qui sont connus pour les cultures immergéesdans la fabrication des antibiotiques. 



  Lorsque les cultures sont bien développées,on ajoute les substances de départ indiquées, à l'état de fine dispersion ou de solution, par exemple dans le méthanol, l'acétone ou   l'éthylèneglycol,   et poursuit l'incubation. 



  Finalement, on sépare le mycélium, extrait le filtrat et/ou la masse de mycélium et isole   lesproduits   réactionnels de l'extrait, d'une manière en elle-même connue, par exemple par répartition entre solvants ou mélan- ges de solvants non miscibles 1 un avec l'autre, par adsorption, chroma- tographie, cristallisation, transformation en dérivés fonctionnels tels que les composés de Girard ou par d'autres procédés appropriés. Ces mêmes réactions peuvent toutefois aussi être exécutées en séparant d'abord les enzymés actives des cultures aérobies correspondantes de champignons de 1' ordre des   Moniliales,   puis en les utilisant à l'exclusion des cultures en croissanceo 
Les produits du présent procédé peuvent être utilisés comme médicaments ou comme produits intermédiaires pour leur préparation.

   D'un grand intérêt pratique sont, par exemple, la cortisone, l'hydrocortisone, la   1,2-déhydro-cortisoné,   la 1,2-déhydro-hydrocortisone, la substance S de   Reichstein,   la 17a-hydroxy-aldostérone ainsi que les dérivés polyoxy- génés se formant par exemple à partir de la progestérone, de la prégné-   nolone,   et de la   11-céto-progBstérone.   



   L'invention concerne également,à titre de produits industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé ci-dessus défini. 



   L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limi- tatifs qui suiventDans ces exemples, il y a entre chaque partie en poids et chaque partie en volume le même rapport que celui existant entre le gram- me et le centimètre cube. Les températures sont indiquées en degrés centi- grades 
Exemple   1.   



   On ensemence 2000 parties en volume d'une solution nutritive stérilisée de Czapek-Dox avec une culture de   Trichothécium   roseum et agite pendant 5 jours à 27  A la culture bien développée, on ajoute alors, dans des conditions stériles, une solution de 0,5 parties' en poids de cortexone dans 15 parties en volume d'acétone et continue d'agiter à 27 oAu bout de 4 jours, on essore, lave le résidu à l'eau à plusieurs reprises et ex- trait le filtrat de,culture à trois reprises avec chaque fois 1200 parties en volume d'acétate   d'éthyle.   On lave les solutions d'acétate d'éthyle avec de l'acide chlorhydrique normal, à l'eau, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et à nouveau à l'eau, les sèche et les évapore sous vide à 40-45  On chromatographie le résidu, 0,62 partie en poids,

   sur 10 parties en poids de gel de silice, en éluant d'abord avec du chlo- roforme seul, puis avec des mélanges de chloroforme et d'acétone d'une teneur croissante en acétone. A l'aide de chloroforme et d'un mélange de chloroforme et d'acétone 95.5 on élue   des¯impuretés   renfermant un peu de cortexone. Les premières fractions chloroformiques à 10% d'acétone fournissent par évaporation un résidu qui donne avec de l'acide sulfurique concentré la coloration rouge carmin caractéristique pour la substance S 17a-hydroxy-cortexone En recristallisant ce résidu dans des mélanges    d'acétone et d'éther, on obtient la substance S pure, fondant à 202 - 213 , d'un pouvoir rotatoire spécifique @ + 132  (dans l'éthanol).

   Pour   l'acétylation on laisse reposer 15 heures à 20 , 0,02 partie en poids de la substance pure avec 0,2 partie en volume de pyridine et 0,4 partie en vo- 

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 lume d'anhydride acétiqueo On ajoute de l'eau au mélange, évapore sous vi- de et recristallise le résidu dans de l'acétone, on obtient l'acétate de la substance S, fondant à 239 -   241  o   
Les autres éluats chloroformiques à 10% d'acétone fournissent, par évaporation, un composé un peu plus fortement polaire qui, avec de l'a- cide sulfurique concentré, donne d'abord une coloration rougeâtre, puis jau- ne-brun avèc fluorescence verteo Cette substance cristallise dans l'acé- tone en prismes clairs qui, par chauffage, s'agglutinent à partir de 130  et fondent à 202 -   212    en mélange avec la substance S,

   ce produit provoque un fort abaissement du point de fusiono Ces cristaux séchés à 135 , sous un vide poussé, fournissent à l'analyse des valeurs qui concordent bien avec   la formule brute C21H30O4 Etant donné que cette substance est absorbante en ultra-violet e qu'elle réduit une solution alcoolique d'argent-diammi-   ne, il s'agit ici d'une nouvelle hydroxy-cortexone qui est différente de la substance So 
A la place de la solution nutritive de Czapek-Dox utilisée dans l'exemple ci-dessus, on peut également utiliser du moût de bière dilué à l'eau ou non dilué, ou d'autres milieux nutritifs qui, pour 2000 parties en volume d'eau, renferment chaque fois les adjuvants suivants :

   
Solution   A :   20 parties en poids de glucoce, 8 parties en poids de phos- phage secondaire d'ammonium, 10 parties en poids de chlorure de sodium, 4 parties en poids de phosphate secondaire de potassium, 2 parties en poids de sulfate de magnésium cristallisé, 0,8 partie en poids de chlorure de calciium 0,04 partie en poids de sulfate de fer   (il)   cristallisé, 0,02 partie en poids de sulfate de manganèse (II) cristallisé. 



  Solution B : 40 parties en volume d'eau de gonflement du mais (Cornsteep liquor), 20 parties en poids de glucoce brut, 4 parties en poids de phos- phate secondaire de potassium. 



  'Solution C 20 parties en poids de peptone, 200 parties en poids de glu- cose, 4 parties en poids de phosphate primaire d'ammonium, 4 parties en poids de nitrate de potassium, 1 partie en poids de sulfate de magnésium cristallisé, 0,2 partie en poids de chlorure de calcium. 



    Solution D :   20 parties en poids de peptone, 7 parties en poids d'extrait de viande, 80 parties en poids de glucose, 15 parties en poids de chlorure de sodium. 



   Exemple 2 
On ensemence avec du Trichothecium roseum 50 parties en volume d'une solution nutritive stérilisée de Czapek-Dox et l'incube 5 jours à 27  en secouanto A la culture bien   développée,on   ajoute dans des conditions stériles une solution de 0,01 partie en poids de   11-déhydro-corticostérone   11-céto-cortexone dans 0,5 partie en volume d'acétone et continue   d'agi-   ter à 27  Au bout de trois jours, on essore et extrait comme décrit dans l'exemple 1 Le résidu d'extraction renferme, d'après un examen chromato graphique sur papier, à côté de peu de matière de départ, essentiellement de la cortisone   (11-céto-17a-hydroxycortexone)   que l'on peut isoler et pu- rifier selon des méthodes en elles-mêmes connues.

   On obtient une transfor- mation analogue après avoir incubé la 11-déthdro-corticostérone pendant 6 jours. 



   Exemple 3 
A une culture de Trichothécium roseum préparée comme dans l'exem- ple 2, on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de corticostérone dans 0,5   partie.,   en volume d'acétone et incube trois jours à 27 , puis traite d' 

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 une manière analogue aux indications données dans l'exemple 2 L'examen de l'extrait effectué par chromatographie sur papier montre que la substan- 
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 ce de départ est transformée en majeure partie en substance M (17a-hydroxy- corticostérone)0 Si, à la place de corticostérone, on incube'd'une manière analogue aux indications ci-dessus, de la progestérone, de la 11-céto-progestérone ou de la   prégnénolone,   en isolant le produit réactionnel,

   on obtient éga- lement en majeure partie des composés hautement polaireso 
Exemple 4   A une culture de Trichothecium roseum préparée comme dans l'exemple 2, on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de,6,' -3,11,20-   
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 tricéto-21hydroxy-prégnadiéne dans 0,5 partie en volume d'acétone et in- cube trois jours à 27  Pour isoler le produit réactionnel, on opère d'une manière analogue à celle décrite à l'exemple 2 L'examen de l'extrait par chromatographie sur papier montre que la substance de départ a été trans- 
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 formée en majeure partie en4À ' -3,11,20-tricêto-17a-21-dihyâroxy-prégna- diène (1-àéhyàro-cortisone)o Si à la place de ' 3,11,20-tricéto-21-hydroxy prgradiène, on incube d'une manière analogue aux indications ci-dessus 1 -3,20-dicé- to-llp,21-dîhydro-préfrZdiène, en isolant le produit réactionnel,

   on obtient essentiellement du la ' -3,20-dicéto-11a,17c21-trihydroxy-prégnadiène (1-déhydro-hydrocortisone)4 Si dans l'exemple ci-dessus, on utilise à la place de la culture de Trichothecium roseumi une culture de Leptosphaed. a1mculans, l'extrait du filtrat de culture renferme alors également 1e 11 ' '174,11,2o-tricéto-17cx 21-dih;Tdrox prêgnadiène (1-déhydro-coxtisone) ou le -320,d3.céto-11i17ar 2-trihydroxy-prégnadiène (1-déhydro-hydro:eortisone)a Les produits initiaux peuvent être obtenus de la manière suivante: 1' °-3,11, 20-trïcéto-21-b=ydroxy-prégnadiène :

   On ensemence 2000 parties en volume de moût de bière stérilisé avec une, culture de Calonectria   decora,,     ¯puis   secoue à 27 Au bout de trois jours on ajoute, dans des conditions stériles,à la culture bien développée, 0,5 partie 
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 en. poids de 11=f'éhydro=corticostérone (composé .) dans 15 parties en volume d'acétone; on secoue ensuite le mélange encore pendant 3 jours à la même températureoOn filtre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on l'a indiqué à l'exemple 1 Le résidu de l'extraction est chromatographié sur une colonne de 15 parties en poids de gel de silice, en éluant tout d'abord avec du chloroforme puis avec des mélanges de chloroforme et d'acétone d'une teneur croissante en acétone. Chaque fraction (50 parties en volume) est examinée par chromatographie sur papier.

   Au moyen de chloroforme et d'un mélange de chloroforme et d'acétone (95: 5) on élue quelques impuretés et un peu de produit initial.Les fractions obtenues avec le mélange de chloro- forme et d'acétone (90:10) contiennent cependant surtout une substance 
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 que se déplace un peu plus lentement qy94 le produitrihitial sur le chromato- gramme sur papier Ce produit est le/ ' -3,11,20-tricé%o-21-hyàroxy-pré- gnadièneo On le recristallise dans un mélange d'acétone et d'éther; il fond alors à 200 - 215  suivant la rapidité du chauffage- Dans l'ultra-violet, ce composé donne une bande d'absorption avec un maximum à 244 mu et son 
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 spectre d'absorption dans 1 infra-rouge.présente des bandes à 5,99Z., 6,1°., et 6,23p, caractéristiques pour une '°-3-cétoneo 1'4 3,20-dicéto-11,21-dZhyd.roxy-prégnadiëne :

   A 2000 parties en volume d'une culture de Calonectria décora, obtenue comme il a été indiqué ci-dessus, on ajoute, dans des conditions stériles, 0,5 

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 partie en poids de corticostérone dans 15 parties en volume d'acétone. On effectue ensuite le développement de la culture, l'extraction et la chro- matographie sur gel de silice comme on l'a indiqué ci-dessus. Les fractions éluées avec du chloroforme et un mélange de chloroforme et d'acétone   (90:10)   contiennent des impuretés et un peu de produit initial le produit principal qui est contenu dans les fractions obtenues avec des mélanges de chlorofor-   me et d'acétone (90:10) et (80:20) se déplace plus lentement que le produit initial sur le chromatogramme sur papier.

   Ce produit est le -3,20-dicé-   to-11ss,21-dihydroxy-prégnadiène qui, recristallisé dans de l'acétone, fond à 216 - 220  (avec décomposition); son pouvoir rotatoire spécifique est de + 158  (éthanol); son spectre d'absorptions dans l'ultraviolet présen- te un maximum à 244 m  8 15300) et son spectre d'absorption dans 1'.infra- rouge, des bandes à   2,76p,     2,86p,5,84p     5,99p    ,6,14p,     6,22p,   7,44    8,73p,   
9,22  9,38  et 9,63  
Exemple 5 
On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70%, stéri- lisé, avec une culture de Leptophaeria maculans et secoue pendant 4 jours à 27  A la culture bien développée, on ajoute une solution de 0,01 par- tie en poids de cortexone dans 0,5 partie en volume d'acétone,

   dans des conditions stériles, puis secoue le mélange à   27 .   Au bout de trois jours, on filtre le mycélium puis extrait le filtrat comme on l'a indiqué à l'exem- ple 1 Le résidu d'extraction contient, comme l'essai de chromatographie sur papier le montre,à   c,ôté   d'un peu de produit initial, surtout de la   17a-hydroxy-cortexone   (substance. S de   Reichstein),   que l'on isole et cris- tallise comme on l'a indiqué à l'exemple 1. 



   Exemple 60 
On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70% stéri- lisé, avec du Cucurbitaria laburni et secoue 5 jours à 27 o A la culture bien développée, on ajoute une solution de 0,01 partie en pbids de cortexo- ne dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles, puis on secoue encore à 27 o Au bout de trois jours, on filtre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on l'a   indiqué   à l'exemple 1. Le résidu de l'extraction   contient;) comme   l'essai de chromatographie sur papier le montre, à côté d'un peu de   produit initiale   surtout de la   17a-hydroxy-cortexone   ( substance S de   Reichstein),   que l'on isole et cristallise comme on l'a in- diqué à l'exemple 1,      
1 Exemple 7. 



   On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70%, stérili- sé, avec de la Acrospeira levis et secoue 3 jours à 27  A la culture bien développée, on ajoute une solution de 0,01 partie de cortexone dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles, puis on secoue le mélange à 27 o Au bout de trois jours le mycélium est filtré et le fil- trat est extrait comme on l'a indiqué à l'exemple 1.

   Le résidu de l'extrac- tion contient, ce que montre   l'essai.de   chromatographie sur papier, à côté d'un peu de produit initial, surtout de la   17a-hydroxy-cortexone   (substance S de Reichstein), qu'on isole et cristallise comme on l'a indiqué à l'exem- ple 1 
Exemple.

   80 
On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70% stéri- lisé, avec du Lophotrichus hartinii et secoue trois jours à 27  A la cul- ture bien doveloppéem on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de cortexone, dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles, 

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 puis on continue de remuer le mélange à 27   Au   bout de deux jours, on fil- tre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on   !la   indiqué à l'exem ple 1 Comme la chromatographie sur papier le montre, le résidu de l'ex- traction contient, à côté d'un peu de produit initial, surtout de la 17a-hy- droxy=cortexone (substance S de   Reichstein),

     que l'on isole et cristallise comme on l'a indiqué à   l'exemple   1 
Exemple 9  
On ensemence 50 parties en volume de   moùt   de bière à 70% stérili- sé, avec du Melanospora parasitica et secoue trois jours à 27  A la cultu- re bien développée, on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de cor- texone, dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles, et secoue le mélange à 27 oAu bout de deux jours, on filtre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on l'a indiqué à l'exemple 1 Le résidu de l'extraction   contient,   comme le montre la chrbmatographie sur papier, à côté d'un peu de produit initial, surtout de la 17a-hydroxy-cortexone (substance S de Reichstein) qu'on isole et cristallise comme on l'a indi- qué à   l'exemple   1 
Exemple 10. 



   On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70% stéri- lisé, avec du   Thielavia   terricola, puis on secoue trois jours à 27 o A la culture bien développée, on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de cortexone dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles, puis on continue de secouer le mélange à 27 Au bout de trois jours, on filtre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on l'a indi- qué à l'exemple 1 Comme le montre la chromatographie sur papier, le résidu de l'extraction contient, à côté d'un peu de produit initial, surtout de la 17a-hydroxy-cortexone (substance S de Reichstein), que l'on isole et cris- tallise comme cn l'a indiqué à l'exemple 1   REVENDICATIONS.   



  1 Un procédé permettant d'introduire de l'oxygène dans des stéroïdes, caractérisé par le fait que, sur des composés de la série du prégnane qui renferment en position 17 un atome d'hydrogène, on fait agir des enzymes pro- duites par des cultures aérobies de champignons de l'ordre des Moniliales et on isole les stéroïdes des   hydroxylés   en position 17 
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants : 
1) On isole les stéroïdes formés,   hydroxylés   en position 17 
2 Sur des composés de la série du prégnane qui présentent en position 17 un atome d'hydrogène, on fait agir des cultures immergées, croissant dans des conditions aérobies, de champignonsde l'ordre des Mo-   niliales.   



   3 Sur des composés de la série du prégnane qui présente en po- sition 17 un atome d'hydrogène, on fait agir des enzymes séparées de cultu- res aérobies de champignons de l'ordre des   Mouillâtes.   

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims (1)

1. 4 Sur des composés de la série du prégnane qui présente en position 17 un atome d'hydrogène, on fait agir des cultures immergées, croissant dans des conditions aérobies,de champignons de la famille des Moniliacées 5 Sur des composés de la série du prégnane qui présentent en po- sition 17 un atome d'hydrogène, on fait agir des cultures immergées, crois- <Desc/Clms Page number 7> sant dans des conditions aérobies, de champignons de la famille du Tricho- thecium.

   6 Comme composé du prégnane, on utilise de la progestérone.

   7.) Comme composé du prégnane, on utilise de la 11-céto-progesté- roneo 80) Comme composé du prégnane, on utilise de la prégnénolone.

   9.) Comme composé du prégnane, on utilise de la cortexone.

   10.) Comme composé du prégnane, on utilise de la corticostérône.

   11 Comme composé du prégnane, on utilise de la 11-déhydro-cor- ticostéroneo EMI7.1 12a) Comme composé du prégnane, on utilise du ± 1,4¯3,11,20-tricé- to-21-hydroxy-prégnadzène.

   130) Comme composé du prégnane, on utilise duà l4-320-dicéto- 11,21-dihydroxy-prégnadiène.

   11 A titre de produits industriels nouveaux : 140) Les nouveaux composés obtenus par la mise en oeuvre du procé- dé défini sous I.) et la) à 13.) .

   15 Les composés obtenus par la mise en oeuvre des procédés décrits dans les exemples.

   16 Les nouveaux composé décrits dans les exemples.