BE539498A - - Google Patents

Description

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  *Procédé pour introduire de l'oxygène dans des stéroïdes." 
On sait qu'on peut introduire des groupes hydroxyles dans des stéroïdes,   notâmment   en position 21, à l'aide d'enzymes      de surrénales, en particulier avec des homogénéisais ou par passage à travers ces organes Ou des tranches de ces organes. 



  Pour aussi intéressante que soit cette fonction des enzymes animales du point de vue théorique, elle ne peut donner satis- faction pour l'obtention, spécialement Industrielle, de 
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 l-hydroxr-stéroi'dea. La ract-jon indiquée n'a pas pu être exécutée jusqu'à prêtent par des méthodes mlcrob101ogiquea qui peuvent aussi être utilisées en grand. 

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   La présente invention est relative   à   un procédé permettant d'introduire de l'oxygène dans des stéroïdes, caractérise par le fait que, sur des composés de la série du prégnane, non substitués en position 21, on fait agir des enzymes produites par des cultures aérobies de champignons de l'ordre   Ophiobolus   ou de l'ordre   Solérotina,   puis qu'on isole les stéroïdes hydroxylés en position 21.

   Des substances de départ pour le nouveau procédé sont en général des composés de la série du prégnane, non substitués en position 21, parmi lesquels il y a lieu d'entendre les dérivés de n'importe quel genre de substitution et de n'importe quelle configuration, saturés et non saturés, du 10,13-diméthyl-17-éthyl-cyclopentano- polyhydrophénanthrène, ainsi que de ses homologues supérieurs et inférieurs, par exemple les A-nor-, D-homo- et 19-nor- composée correspondants. Des doubles liaisons se trouvent, par exemple, en position 1, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15 et/ou 16. 



  La configuration des substances de départ est, de préférence, celle du prégnane, du 5a-prégnane, du   17a-prégnane   ou de racémates correspondants, tels qu'on les obtient par synthèse totale. Comme substituants, on envisage en particulier des groupes hydroxyles, oxo ou carboxyliques, libres ou fonctionnel- lement modifiés, tels des groupes ester, éther, thio-ester, thio-éther, thiol- et   thlon-ester,   acétal, mercaptal, cétal, hydrazone, semi-carbazone et des groupes énoliques, par exemple en position 2, 3, 6,   7.   11, 12, 16, 17, 18, 19 et 20, de plus 

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 des atomes d'halogène, en particulier de chlore ou de fluoré, par exemple en position 9 et 17.

   Des substances de départ spécifiques sont, entre autres, la progestérone, la 17a- 
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 progestérone, la 16a-hydrocy-progestérone, la 17a-hydroxy- progestérone, la 11-céto-progestérone, la lla- ainsi que la 110-hydroxy-progei3t6rone là 9,11- ou la 11,12-déhydro- progestérone, la 19-oxo-progestérone, la 11-céto-17a-hydroxy- progestérone, la lia- ainsi que la llp-hydroxy-17a-hydroxy- progestérone, la 9-ohloro- ou la 9-fluoro-llp,17a-dihydroxy- progestérone, la 11fl,18-dlhydroxy-progestérone, la 11fl,17,18- trihydroxy-progestërone, la 11-hydroxy-18-oxo-progestérone, la 9-chloro- ou la 9-fluoro-110-hydroxy-18-oxo-progestérone, la 11,18-dioxo-progestérone, la 19-nor-progestérone, la      
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 a3nor-1.-hydroxy-18-o:o-pragestérone, la prégnénolone ou leurs dérivés fonctionnels. 



   Les enzymes utilisées sont de provenance   microbiolo-   gique et sont produites par   des   cultures aérobies de champignons de l'ordre Ophiobolus ou de l'ordre   Sclérotinia,   en particulier par des souches actives de l'Ophiobolus herpotrichus ou du 
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 Solérotinla tüetloola. Pour l'introduction d'oxygène, on in- cube en général directement les substances de départ avec des cultures immergées des champignons Indiqués, croissant dans des conditions aérobies connues.

   Ces cultures sont avantageusement      remuées, c'est-à-dire secouées ou agitées, et elles renferment du carbone assimilable, en particulier des hydrates de carbone, 

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 ainsi   quelle   cas échéant, des substances de croissance,   par   exemple de l'eau de gonflement du maïs ou du moût de bière, et des sels inorganiques. On peut donc utiliser des solutions nutritives naturelles, synthétiques ou aemi-synthétiques. Un procédé pratiquement simple est décrit dans ce qui suit sans que l'invention se trouve pour autant limitée par les indica- tions fournies : On cultive les organismes dans des appareils et dans des conditions analogues à ceux qui sont connus pour les cultures immergées, dans la fabrication des antibiotiques. 



   Lorsque les cultures sont bien développées, on ajoute les   substances de   départ indiquées, à l'état de fine dispersion ou de solution, par exemple dans le méthanol, l'acétone ou l'éthylèneglycol, et poursuit l'incubation. Finalement, on sépare le mycélium, extrait le filtrat et/ou la masse de mycélium et   Isole   les produits réactionnels de l'extrait, d'une manière en elle-même connue, par exemple par répartition entre solvants ou mélanges de solvants non miscibles l'un avec l'autre, par adsorption, chromatographie, cristallisation, transformation en dérivés fonctionnels tels que les composés de Girard ou par   d'autres.procédés   appropriés.

   Ces mêmes réactions peuvent toutefois aussi être exécutées en séparant d'abord les enzymes actives des cultures aérobies correspondante de champignons de l'ordre des Sphériales, puis en les utilisant, à l'exclusion des cultures en croissance. 



   Les produits du présent procédé peuvent être utilisés 

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   comme   médicaments ou comme produits,   Intermédiaires   pour leur préparation.   D'un   grand intérêt pratique, sont, par exemple, la cortisone,   1'hydrocortisone,   la   1-déhydro-cortisone,   la 
1-déhydro-hydrocortisone, la substance S de Reichstein, l'aldostérone, ainsi que les dérivés polyoxygénés   3e     formant   par exemple à partir de la progestérone, de la   'prégnénolone        , et de la 11-céto-progestérone. 



   L'invention concerne également, à titre de produits      
Industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du   procéda ci-dessus   défini.      



   L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Les températures sont inoiquées en degrés centigrades. 

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   Dans un récipient pourvu d'un agitateur, on stéril   @   4 litres de   moût   de bière à 70% (pH 5,6) et les ensemence avec une culture d'Ophiobolus   herpotrichus.   Après avoir agité pendant 3 jours à 26 , on ajoute, dans des conditions stérile,   à   la culture bien développée, une solution de   1,0 g   de .progestérone dans 25 cm3 d'acétone, et continue d'agiter à la même température. Au bout de 4 jours, on sépare le mycélium. 



  On extrait le filtrat de culture à trois reprises avec chaque fois 1 litre d'acétate d'éthyle et lave les extraits avec de l'acide chlorhydrique normal, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et à l'eau. Après avoir séché la solution d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium, on l'évapore sous vide à 400. On chromatographie le résidu (1,2 g) sur 15 g de gel de silice en éluant d'abord avec du chlorure de méthylène, puis avec du chloroforme, et finalement avec des mélanges de chloroforme et d'acétone d'une teneur croissante en acétone. 



  Cn évapore les diverses fractions (de 100 cm3 chacune) et les soumet à un examen par chromatographie sur papier. Les fractions éluées au chlorure de méthylène et les premières fractions        éluées   au chloroforme ne renferment, à c8té d'impuretés, que de la matière.de départ, tandis que dans les dernières obtenus fractions   chloroformiquesainsi   que dans les éluats/avec les mélanges de chloroforme et d'acétone (95 : 5 et 90 : 10) se trouve présente de la cortexone (11-désoxycorticostérone). 

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   On réunit ces fractions et les évapor.. Le résidu   (0,81   g) constitué essentiellement par de la cortexone est recristallité dans de l'éther, ce qui donne des cristaux en plaques, in- colores, fondant à 140 - 142 . Ces cristaux possèdent un pouvoir rotatoire spécifique   de 4   1750 et ne provoquent pas, en mêlant avec de la cortexone d'une autre provenance, d'abaissement du ,point de fusion. De même leurs spectres dans l'infra-rouge   et   dans l'ultra-violet sont identiques avec ceux de la cortexone. 



   Exemple 2. 



   Dans une fiole conique d'une contenance de 500 cm3, on stérilise 150 cm3   d'une   solution nutritive renfermant par litre 50 g de glucose brut, 20 cm3 d'eau de gonflement du   maïs   (cornsteep-liquor) et 10 g de tartrate d'ammonium, et par ailleurs de l'eau du robinet, puis ensemence avec une culture   d'Ophiobolus   herpotrichus. Après avoir agité 2 jours à 26 , la culture s'est bien développée, et l'on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 30 mg de   11-céto-proges-          trone   dans 1,5 cm3 d'acétone, puis on agite encore 3 jours à la même température. On sépare alors le mycélium.

   On extrait le filtrat de culture à trois reprises avec chaque fois 50 cm3      d'acétate d'éthyle et traite les extraits comme décrit dans l'exemple 1. On soumet le résidu   (40   mg) à un examen   ahromato-   graphique sur papier. Il est constitué essentiellement par de la 11-déhydro-corticostérone (composé A de Kendall). Après 

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 purification par chromatographie, on peut l'obtenir sous forme   cristalline-   
Exemple 3. 



   Si à une culture d'agitation   d'Ophlobolus   herpo-   trichus,   telle qu'elle a été décrite dans l'exemple 2, on ajoute, à la place de la 11-céto-progestérone, une solution de 30 mg de   17a-hydroxy-progestérone   dans 1,5   cm   d'acétone, on obtient alors, après incubation et extraction analogues, un produit réactionnel brut formé essentiellement de   17a-hydroxy-   cortexone (substance S de Reichstein). Après purification par chromatographie, on peut l'obtenir sous forme cristalline. 



   ¯Exemple 4. 



   A 4 litres d'une culture d'agitation   d'Ophiobolus   herpotrichus qui a été obtenue comme décrit dans l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g de   1-déhydro-progestérone   dans 25   cm   d'acétone. On agite trois jours a 27  et sépare alors le mycélium. On extrait le filtrat de culture à plusieurs reprises avec au total 3 litres d'acétate d'éthyle. On lave.les extraits avec de l'acide chlorhydrique   décinormal,   avec une solution normale de bicarbonate de sodium et à l'eau.

   Après l'avoir séchée sur du sulfate de sodium, on ' évapore sous vide la solution d'acétate d'éthyle et   chromatogra-   phie le résidu ainsi obtenu (1,1 g) sur 30 g de gel de silice, en éluant avec du chloroforme et avec des mélanges de chloro- forme et d'acétone d'une,teneur croissante an acétone. On 

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 évapore- les divergea fr<.lon8 (zîc looc2a3 chacune) et leu soumet à un examen par cimot;v;aLnr. nply3e sur papier. Dansa les fractions chloroformiqueu, on trouve, six coté d'impuretés, un peu de la matière de départ, tandis que les fractions éludes avec les mélanges de chloroforme et d'acétone   (95:5)   (710 mg) 
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 sont essentiellement constituées par de la 1-déhydro-cortexonc. 



  On   cristallise   cette dernière dans un mélange d'acétone et   d'éther   de pétrole. Elle fond à   185 -   192  et présente un 
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 pouvoir rotatoire spécifique ta]22 + 120o (dans le chlore- forme). 



   Exemple 5. 



   Si dans l'exemple ci-dessus, on ajoute à la culture, au lieu de la solution de   1-déhydro-progestérone,   une solution 
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 de 1 g de 1-déliydro-11-céto-17a-hydroxy-,progestérone dans 25 cm3 d'acétone et que   l'on   traite de la manière décrite et chromatographie,, les fractions obtenues avec un mélange de chloroforme et d'acétone   (1:1)   sont alors essentiellement formées de   1-déhydro-cortisone   que l'on cristallise dans des mélanges d'acétone et   d'éther.   Elle fond à 231 - 233 . 



     --Exemple   6. 



   Si dans l'exemple 4, on ajoute à la culture, au lieu      
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 de la solution de 1-déhydro-proge8térone, une solution de 1 g de 1-ddhydro-11;17a-dihydroxy-progestérone dans 25 em3 de méthanol et que   1 on   traite et   chromatographie.de   la manière décrite, les fractions obtenues à l'aide d'un mélange de 

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 chlorcforme et d'acétone   (1;1)   sont alors essentiellement formées de 1-déhydro-hydrocortisons. On la   cristallisa   dans des mélanges   d'acétone   et   d'éther.   Elle fond à 239 - 242 . 



    Exemple 7.¯    
Dans une fiole conique, on stérilise 50 cm3 de moût de bière à 70% et ensemence avec une culture de Sclerotinia fruction   Apres   avoir agité pendant 4 jours à 27 , on ajoute à la culture bien développée, dans des conditions stériles, une solution de 10 mg de progestérone dans 0,5 cm3 d'acétone. On cgite encore 4 jours à la même température et sépare alors le mycélium. On extrait jusqu'à épuisement le filtrat de culture avec de l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait à l'eau, le sèche et l'évapore sous vide. Un examen   chromatographique   sur papier de l'extrait brut ainsi obtenu montre qu'il est essentiellement formé de cortexone (11-désoxy-corticostérone). 



   Exemple 8. 



   Si dans l'exemple ci-dessus, on ajoute à la culture agitée de   Solerotinia   fructicola, au lieu de la solution de progestérone, une solution de 10 mg de   1-déhydro-11-céto-17a-   hydroxy-progestérone   dans,0,5   cm3 d'acétone et qu'on incube et traite de la même   manière, l'extrait   brut est alors formé essentiellement de 1-déhydro-cortisone. 



   Exemple 9. 



   Dars une fiole conique d'une contenance de 500 cm3, on stérilise 120 cm3 de moût de bière et ensemence avec 

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 de   l'Ophiobolus     herpotrichus.   Après avoir agité pendant 4 jours à 26 , on ajoute à la culture bien développée, dans des conditions stériles, une solution de 30 mg de 
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 (18 ---.11)-lactone du d,lOw3,20-diadto-11-hydroxyprégnène-18-oïque dans 1,5 cm3 d'acétone, et agite encore 3 jours à 26 . On extrait alors, comme décrit dans les exemples précédents, avec de l'acétate d'éthyle.

   Pour séparer les produits de cet extrait brut on le soumet àune chromato- 
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 graphie sur papier (système propy1èneg1yco1-to1uène); on sépare ainsi une substance qui, par rapport à la substance de départ, est d'une polarité plus élevée et réduit rapidement et fortement une solution alcaline d'argento-diammine. On la cristallise dans un mélange d'acétone et d'éther; c'est la 
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 (18 ## ll)-lactone du d,l--3,20-dicéto-11,21-dihydroxy- prégnène-18-oïque, La (18 ##> 110)-lactone du d,i-à'-3,zo-àioéto- llp-hydroxy-prégnene-18-oïque peut être préparée par exemple suivant les Indications données dans la demande de brevet déposée par Monsieur Tadéus   REICHSTEIN   le 14 Janvier 1955 et ayant pour titre : "Procédé de préparation de stéroïdes oxygénés".

Claims (1)

1. Revendications.

   I.) Un procédé permettant d'introduire de l'oxygène dans des stéroïdes, caractérisé par le fait que, sur des composés de la série du prégnanc, non substitués en position 21, on fait agir des enzymes produites par des cultures aérobies . de champignons de l'ordre Ophiobolus ou de l'ordre Sclérotinia, puis qu'on isole les stéroïdes hydroxylés en position 21.

   Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants .

   1.) Sur des composés de la série du prégnane, non substitués en position 21, on fait agir des cultures immergées EMI12.1 de champignons du genre Ophloboluè herpotrichus, croissant dans des conditions aérobies.

   2. ) Sur des composés de la série du prégnane, non substitués en position 21, on fait agir des cultures immergées de champignons du genre Sclerotinia fructicola, croissant dans des conditions aérobies.

   3.) Comme composés du prégnane, on utilise de la progestérone.

   4. ) Comme composé du prégnane, on utilise de la 11-céto- progestérone.

   5.) Comme composé du prégnane, on utilise la 17a-hydroxy- progestérone.

   6. ) Comme substances de départ, on utilise des composés EMI12.2 à 1,4¯ prégnadléniques,- <Desc/Clms Page number 13> 7. ) Comme substance de départ, on utilise la 1-déhydro- progestérone.

   8. ) Comme substance de départ, on utilise la 1-déhydro- EMI13.1 11-éto-l7ahydroxy-progestérone.

   9.) Comme substance de départ, on utilise la 1-déhydro- llp,17a-dihydroxy-progestérpne.

   Remarque: Ajouté un mot.