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La présente invention concerne un procédé particulier de prépara- tion de déhydro-composés de la série des stéroïdes, présentant une double
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liaison en position 1,2 et ., 5,
Le procédé décrit dans la demande de brevet déposée en Belgique par la demanderesse le 20 août 1954 et ayant pour titre : "Procédé de prépa- ration de produits d'oxydation de la série des stéroïdes." concerne la dé- gradation par voie bio-chimique de la chaîne latérale de composés du prégna- ne en composés de l'androstane et, éventuellement, la scission de l'anneau D, avec introduction simultanée d'une double liaison en 1,2 et éventuelle- ment en 4,5.
De cette manière on peut, par exemple, transformer la proges-
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térone, comme d'ailleurs le A 5-33 -hyd.roxy'^20 -oo-prégène,.a 11-désoxycor- ticostérone ou le 3,20-dioxo-alloprégnane, en un stade opératoire, enAl,4- 3,17-dioxo-androstadiène ou en 1,2-déhydro-testolactone.
La présente invention est relative à un procédé qui permet d'in-
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troduire une double liaison en 1,2 et/ou en Q., 5 par voie biochimique, dans des stéroïdes, notamment dans ceux de la série du prégnane, sans dégradation de la chaîne latérale ni ouverture d'anneau, ledit procédé étant caractéri- sé par le fait qu'il consiste à soumettre des stéroïdes saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5, à l'action aérobie d'enzymes de Didymella lycoper- sici, de Calonectria décora, d'Alternaria passiflorae, d'Ophiobolus heteros- trophus ou d'Ophiobolus Miyabeanus.
Les stéroïdes utilisés comme substances de départ sont, par exem- ple, des dérivés du spirostane, de l'allospirostane, du furostane, de l'allo- furastane, du cholane, de l'allocholane, du prégnane, de l'alloprégnane, de l'androstane et du testane et ils présentent un groupe hydroxyle ou oxo, libre ou fonctionnellement modifié, de préférence en position 3.
Ils peuvent être saturés ou renfermer des doubles liaisons, par exemple en position 1 ou 4,
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ainsi qu'en position 5, 6, 7e 8, 9:lle 14 ou 16, ou renfermer encore des sub- stituants, par exemple des groupes hydroxyles, oxo ou carboxyliques, libres ou modifiés; de plus, des groupes époxy ou des atomes d'halogène, par exem- ple en position 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20 ou 21, ou des grou-
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pes méthyliques, par exemple en position 17a ou 17j3< Les substances de dé- part indiquons oi-dessus sont de :.-;.' importe quelle configuration stérique et peuvent aussi se présenter à l'état de raoémates.
Elles embrassent égale- ment les composés des séries dites noir- et/ou homo-, en particulier les 1- nor- et les D-homo-compcscs. Des substances de départ particulièrement im-
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portantes sont les comrC88S de la série du prêgnane renfermant en positions 3 et 20 des groupes hydro:
cyles ou oxo, libres ou fonctionnellement modifiés, par exemple la progestérone, la 11-dêhydro-pr.agestérone, les 11-., 12-, 14-e 15-, 16-, 17- ou 1.8-hydraxyprogestêrones9 lesd 5- ou /4-prégr-ène-3-ol-20- ones, les à 5-prëgnène-, 2U-d2ols la 11-désoxycorticostérone, la cortisone, l'hydrocortisone, la 11-opihydrooortisone, l'aldostérone, la 18-hydroxycorti- costérone, la 11-épi-18-hydroxycorticostérone, la 18-oxocorticostérone, la l7amhydroxy-al do,tcrone, la 18-hydroxyhydrocortisone, la 18-hydroxy- et la 18-oxo-cortisone, la 18-hydroxy et la 18-oxo-cortexone, la substance S de , Reichstein, la 18-hydroxy# et la 18-oxo-substance S (Reiahs.in, des com- posés correspondants non saturés en position 1 au lieu de l'être en position 4, la prégnane-3,20-dione, la prégnane-3-ol-20-one, l'alloprégnane-3,20-dio- ne, le prégnane et 1.
r alloprégnanew3 17,., 2Ci-tr.one-l7et, 21-dïol, le prégnane- et 1 alloprégnane-3,0-diane-ll(3,.1,21-triol, le prégnane- et l'alloprégna- ne-3,18,20-trione-llp,21-diol, le prégnane- et l'alloprégnane-3,20-dione-11(3, 18,21-triol, le prégnane- et l'alloprégnane-3,20-dione-18,21-diol, les 21- oxo-composes correspondants et/ou les 9a-fJ.uaro- et .-chloro.dêrivês, par exemple la 9<X-fluoro-oortisone, la 9'x-fluoro-hydrocortisone, la 9-luoro-al- dostérone et la 9a-fluoro.l8-hydroxycorticostêxone! de plus des composés de l'androstane saturés en position 1,2 et/ou en position .4>5> par exemple la
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A 4# ou la 5-audrostène="3,l"7-=d.îone, la testostérone, la h 5-androstène 30? l7 ona 1'adrénos'cérone, l'axidrostane-3el7-dîone, les acides étiani- ques, par exemple les acides 4 4- ou 5-étlëniques,
les acides allo- étianiques présentant des groupes hydroxyles ou oxo notamment en position 3, 11 et/ou 18, des dérivés fonctionnels des composés indiqués, c'est-à-dire des composés correspondants comportant des groupes hydroxyles ou oxo fonc- tionnellement modifiés.
Dans les substances de départ, le groupe hydroxyle fonctionnellement modifié est par exemple un groupe hydroxyle estérifié par un acide carboxylique aliphatique, aromatique ou hétérocyclique, par exem- ple par les acides acétique, propionique, benzoique ou furanne-carboxylique, ou un groupe hydroxyle éthérifié, par exemple le groupe tétrahydropyranny# loxy, le groupe benzyloxy ou le groupe triphénylméthoxy. Le groupe oxo fonctionnellement modifié est avantageusement un groupe oxo cétalisé, déri- vant notamment d'un alcool divalent, par exemple le groupe éthylènedioxy.
Selon le procédé conforme à l'invention, on fait réagir les sub- stances initiales indiquées sur des enzymes de Didymella lycopersici, Calo- nectria décora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus ou Ophio- bolus Miyabeanus. Pour leur obtention on peut utiliser les cultures de ces champignons dans les milieux connus en soi comme appropriés, par exemple ceux qui renferment des sucres tels le glucose ou le lactose, des peptones, de l'eau de gonflement du mais, des produits provenant du soya et analogues, ainsi que des sels minéraux, ou les solutions nutritives synthétiques. On travaille en particulier dans des conditions aérobies, par exemple dans une culture agitée ou dans une culture immergée avec agitation et amenée d'air.
Les champignons indiqués se distinguent d'autres microorganismes, par exem- ple des bactéries, par une bonne croissance dans des conditions de culture relativement simples. La réaction du procédé selon l'invention s'effectue dans la culture de champignons décrite ou à l'aide des enzymes qu'elle ren- ferme, le cas échéant enrichis ou séparés, ou plus simplement dans une sus- pension du mycélium séparé du champignon, dans une suspension du mycélium de champignon homogénéisé ou dans des filtrats desdites suspensions ou des ex- traits du mycélium, contenant de l'eau.
On peut isoler les produits du procédé suivant des méthodes con- nues. Leur séparation peut être effectuée par exemple par extraction du mélange réactionnel avec un solvant organique, par exemple avec du chloru- re de méthylène ou de l'acétate d'éthyle. Pour une purification plus pous- sée de l'extrait ainsi obtenu, les opérations qui conviennent particuliè- rement bien, sont entre autres la chromatographie, par exemple sur de l'oxyde d'aluminium ou sur du gel de silice, l'emploi de méthodes de répar- tition, par exemple le procédé à contre-courant, ou la séparation à l'aide de réactifs de Girard, tel l'hydrazide de l'acide triméthylammonium# ou de
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l'acide pyridinium-acétiquee A la suite de cette purification ou à sa pla- ce, on effectue, de préférence,
une recristallisation dans des solvants or- ganiques ou dans des solvants organiques aqueux.
Par introduction de la double liaison en 1,2 et/ou en 4,5, on parvient à de précieux médicaments de la série des stéroïdes, en particulier de la série du prégnane qui, comparés aux composés thérapeutiquement actifs saturés en position 1,2, se caractérisent par une efficacité accrue.
Parmi
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les produits du procédé, il y a lieu de citer en particulier le Lu ly4-3ellg 20-trioxo-17a,, 21-dihydroxy-prégnadiène, le 14-320d.ioolli'I7as21tri hydroxy-prégnadiène, le l'4 3I1f20=triogo-2lmhydroxy=prégn.adiène le 1,4¯3,20=dioxo-ll,2l-dihydroxy-prégnadiène, le l'4-320diogo-17a21-di- hydroxy-prégnadiène, Ie 14-3,20.-dioxo-21 hydrogy prégnadiéne' le ! 14- 3,l8,20-trioxo-ll,21-dihydroxy-prégnadiène, le 14-3111820-têtrao$o- 21-hydroxy-prégnadiène, le,6 l'4 320=.dioxo113,18-21-trïhydroxy prégnadiè- ne , le194¯3,18s20-trioxoG11317a21trihydraxy prégnadzènei le14-311
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18' 20tétraoxol7a' 21d.hydroxyvprégnadièney le± 1 4-3 20dioxo-113a l7ocy 18 21-tétrahydroxymprëgnadséney le,l4-3920-dioxo-.821-dihyâroxy-prégnadi:ne le A 1 4¯3Ji8,20-trioxo-21 liydroxy-prégnadiène, le 1,4-3,20-dioxo-17, 18'2ltrihyd:
oxy=prêgnadiène9 le a 1,4¯3,18,20-trioxo-17,21-dihydroxy-pré- gnadiène, les 21-oxo- ainsi que les 2idésoxy-composés correspondants, de plus des dérivés fonctionnels correspondants tels que les esters, les éthers, les dérivés halogènes, par exemple les composés 9<X-halogénés, notamment les composés fluorés et chlorés. Lorsque les produits du procédé ne présen- tent pas la configuration et les substituants de stéroïdes thérapeutiquement utilisables, ils peuvent servir de produits intermédiaires pour leur prépara- tion, par exemple pour la préparation des composés indiqués ci-dessus.
Les produits réactionnels obtenus conformément au procédé peuvent être transformés en leurs dérivés fonctionnels d'une manière en elle-même connue, par exemple en dérivés oxygénés, soufrés ou azotés, par exemple en esters, éthers, esters énoliques, éthers énoliques, cétals, thio-éthers, et thio-cétals, ainsi qu'en hydrazones, oximes et énamines. Dans ces com- posés, les groupes hydroxyles et/ou oxo peuvent être totalement ou partiel- lement modifiés du point de vue fonctionnel.
Dans les esters et dans les esters énoliques, les restes d'acide sont ceux d'acides organiques et inorganiques quelconques, par exemple ceux d'acides carboxyliques, thion-carboxyliques, thiol-carboxyliques ou sulfoni- ques aliphatiques, alicycliques, araliphatiques, aromatiques ou hétérocycli- ques, de préférence ceux des acides formique, acétique, chloracétique, tri-
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fluoracétique, propionique, butyriques, valériques, diéthylacétique, caproi- ques, oenanthiques, caprylique, palmitiques,crotonique, undécanique, undécy- lénique, oxalique, succinique, pimélique, maléïque, lactique, carbamiques,
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alcoxycarboxyliques, 3-cyclopentylpropioniqu.e hexahydrobenzoïque, benzoïque phénylacétique, cyclohexylacétique,
phénylpropioniques, triméthylgallique, phtalique, furanne-2-carboxylique, iso-nicotinique, méthane-sulfonique, to-
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luëne-sulfonique, sulfurique, des hydracides halogénés ou des acides phospho- riques.
Dans les composés obtenus, on peut, si on le désire, transformer en groupes libres les groupes hydroxyles ou oxo fonctionnellement modifiés.
De cette manière, on peut aussi mettre partiellement en liberté les groupes fonctionnellement modifiés, en particulier dans des dérivés polysubstitués.
Cela a lieu, par exemple, par une hydrolyse effectuée par voie chimique ou enzymatique, par exemple en utilisant des agents acides ou basiques, en pro- cédant à une alcoolysé ou à une acétalisation. A partir des dérivés seule- ment partiellement modifiés que l'on obtient de cette manière ou aussi di- rectement, par exemple à partir des dérivés estérifiés ou éthérifiés, on peut préparer des dérivés polysubstitués par modification fonctionnelle sub- séquente, par exemple par estérification ou éthérification, en particulier aussi des esters ou des éthers mixtes ou des esters-éthers.
Les produits du présent procédé peuvent être utilisés comme médi- caments ou comme produits intermédiaires pour la préparation de produits précieux.
La présente invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les produits définis ci-dessus.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non li- mitatifs qui suivent. Dans ces exemples, les températures sont indiquées en degrés centigrades.
Exemple l.
Dans un récipient agitateur, on stérilise 4 litres de moût de biè-
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re à 70% (pH 5,1) et ensemence avec 150 cm3 d'une culture d'agitation, âgée de 2 jours, de Calonectria decora dans du moût de bière à 70%. On agite le récipient pendant 24 heures à 27 ; la culture se développe bien. On ajou- te alors dans des conditions stériles une solution de 1 g de cortexone dans 25 cm3 d'acétone et continue d'agiter à 27 . Au bout de deux jours, on sé- pare le mycelium et le lave bien à l'eau et à l'acétate d'éthyle. Après avoir réuni les filtrats, on les extrait jusqu'à épuisement avec au total 4 litres d'acétate d'éthyle, lave les extraits à l'eau, les sèche et les évapore sous vide.
L'extrait brut ainsi obtenu (1,1 g) est chromatographié sur une colonne de 30 g de gel de silice suivant la méthode par passage, en éluant avec du chloroforme et avec des mélanges de chloroforme et d'acé- tone d'une teneur croissante en acétone. On examine les diverses fractions (chacune de 100 cm3) en les soumettant à une chromatographie sur papier.
Les fractions éluées avec du chloroforme ne renferment que des impuretés, tandis que, dans les fractions obtenues avec un mélange de chloroforme et d'acétone (9:1) se trouve une nouvelle substance qui, au chromatogramme sur papier (système propylèneglycol-toluène) migre un peu moins loin que la cortexone. Les fractions obtenues avec une teneur en acétone plus grande ne renferment que peu de matière hautement polaire. On réunit les fractions renfermant la nouvelle substance indiquée et les évapore sous vide. Par recristallisation du résidu dans des mélanges d'acétone et d'éther de pétro- le, on obtient avec un rendement presque quantitatif et à l'état pur la 1-dé hydro-cortexone qui fond à 185 - 192 .
Ce composé réduit rapidement et fortement une solution alcaline d'argento-diammine, L'analyse concorde avec la formule brute C21H2803 (calculé : C 76,79, H 8,59%, trouvé : C 76,67, H 8,84 %). Le spectre ultra-violet du composé libre montre une for- te bande avec un maximum à 244 m (¼ = 14,200), le spectre ultra-violet de la dinitro-phénylhydrazone présente une bande avec un maximum à 388 m ( ¼= 39,000). Les bandes correspondantes de la cortexone se situent respec- tivement à 240 m (¼ = 16,200) et à 378 m (¼= 39,000).
Exemple 2.
Si l'on utilise de la même manière, à la place de la culture de Calonectria décora décrite à l'exemple 1, des cultures d'Alternaria passi- florae, d'Ophiobolus heterostrophus ou d'Ophiobolus Miyabeanus pour la dés- hydrogénation de la cortexone, on obtient alors, après le traitement décrit à l'exemple 1, la 1-déhydro-cortexone avec un rendement élevé.
Exemple 3.
On cultive, comme décrit dans l'exemple 1, dans un récipient agi- tateur, 4 litres d'une culture de Calonectria decora et ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g de cortisone dans 25 cm3 de métha- nol. On secoue ensuite le récipient à 27 . Au bout de quatre jours, on sé- pare le mycelium et extrait le filtrat de culture jusqu'à épuisement avec au total 3 litres d'acétate d'éthyle. Les extraits réunis sont lavés à l'eau, séchés et évaporés sous vide. Le résidu brut ainsi obtenu est chro# matographié, comme décrit à l'exemple 1, sur 30 g de gel de silice, suivant la méthode par passage. Les fractions éluées avec des mélanges de chloro- forme et d'acétone (6:4) sont constituées essentiellement par une substance qui est un peu plus polaire que la matière de départ.
On réunit ces frac- tions et les évapore sous vide. On recristallise la 1-déhydro-cortisone dans des mélanges d'acétone et d'éther. Elle fond à 231 - 234 ' Cette sub- stance réduit rapidement et fortement une solution alcaline d'argento-diam- mine et montre dans le spectre ultra-violet une forte absorption à 240 m (¼ = 15,800). Par acétylation avec un mélange de pyridine et d'anhydride acétique, on obtient le 21-acétate correspondant qui fond à 224-230 C.
D'une manière analogue, on peut préparer par exemple l'oenanthate ou l'un-,
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décylénate.
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Exem 1 s A 4 litres d'une culture bien développée de Calonectria décora, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g d hydrocorti- sone dans 25 cm3 de méthanol. Après avoir agité pendant 4 jours à 27 , on extrait et chromatographie comme décrit à l'exemple 1. Les fractions éluées avec des mélanges de chloroforme et d'acétone (1:1) renferment une substance qui est un peu plus polaire que 1 hydrocortisone. On réunit ces fractions et les évapore. On recristallise la 1-déhydro-hydrocortisone dans le métha-
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nol ou dans des mélanges d'acétone et d'éther. Elle fond à 238 # 2410. El- le réduit rapidement et fortement une solution alcaline d'argento-diammine
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et montre dans le spectre ultraviolet une forte absorption à 244 ml.4-(Î 15,100
Exemple 5.
Dans une fiole conique d'une capacité de 500 cm3, on stérilise 150 cm3 de moût de bière à 70% et ensemence avec du Calonectria décora. On agite deux jours à 27 et ajoute à la culture alors bien développée, dans des conditions stériles, une solution de 30 mg d'aldostérone dans 1,5 cm3 d'acétone. On continue de secouer à 27 et au bout de 38 heures sépare le mycélium par filtration. On extrait le filtrat de culture jusqu'à épuise- ment à l'acétate d'éthyle, lave les extraits à l'eau, les sèche,et les évapo- re. Comme décrit à l'exemple 1, on chromatographie le résidu sur 1 g de
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gel de silice, en examinant les diverses fractions (chacune de 20 cm3), par chromatographie sur papier.
Dans les fractions éluées avec des mélanges de chloroforme et d'acétone (1:1) se trouve une substance qui est un peu plus polaire que l'aldostérone et qui réduit une solution alcaline d'argento-diam- mine. On la cristallise dans des mélanges d'acétone et d'éther et obtient la 1-déhydro-aldostérone. Dans le spectre ultra-violet elle montre une for- te absorption à 244 m
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Ee:;1J:1l e 0 1
On utilise 14 fioles coniques d'une capacité de 200 cm3 chacune et stérilise dans chacune d'elle 50 cm3 de moût de bière à 70%, qu'on ensemen- ce avec du Calonectria décora. Après avoir agité deux jours à 27 , les cul- tures se sont bien développées.
Dans des conditions stériles, on ajoute à chacune des 14 cultures l'un des 14 composés suivant (10 mg de chacun en so- lution dans 0,5 cm3 de méthanol) g la cortexone, la cortisone, l'hydrocor-
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tisone, la 17a=hydroxy-cortexone, la corticostérone,, la 11-épi-corticostér- ne, la 11épihydrocortisoneg l'aldostérone, la l'ahdroxraldostërone9 la progestérone, la prégnénolone, la 21-hydroxy-prégnénolone, la 5 an= drrsténe3ohl7one et I'androstène 3jl7-dione.
On continue d'agiter deux jours à 27 et extrait alors les cultures à l'acétate d'éthyle. L'exa- men chromatographique sur papier des divers extraits montre que toutes les
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substances de départ ont été transformées en l=-déhydro¯composés correspon-, dants possédant, par rapport aux substances de départ, une polarité légè- . rement accrue et se différenciant par leurs spectres de façon caractérisai- que des substances de départ indiquées.
Exemple 7.
Si l'on utilise pour déshydrogéner les substances indiquées à l'exemple 6, à la place des cultures de Calonectria decora décrites dans cet exemple, des cultures d'Alternaria passiflorae, d'Ophiobolus heteros- trophus ou d'Ophiobolus Miyabeanus, l'examen chromatographique sur papier des extraits montre alors que les produits formés sont les mêmes que ceux décrits à l'exemple 6.
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Exemple 8.
A 4 litres d'une culture bien développée de Calonectria décora,
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on ajoute dans des conditions stériles une solution de 1 g de 311,20-tri- céto# 17a,21-dihydroxy-alloprégnane dans 25 cm3 de méthanol. On agite 3 jours à 27 et sépare alors le mycelium. On exécute, de la même manière que celle décrite dans l'exemple 1, l'extraction des filtrats de culture et la chromatographie de l'extrait brut. Les fractions éluées avec des mé- langes de chloroforme et d'acétone (1:1) renferment la 1-déhydrocortisone que l'on obtient à l'état cristallin au moyen de mélanges d'acétone et d'é- ther. Elle fond à 230 - 233 et possède les propriétés décrites à l'exemple 3.
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Si, à la place de la solution de 3,11,20-tricéto-17tx,21-dihydroxy- alloprégnane, on ajoute une solution de 3ll,20-tricéto-17a,21-dihydroxy- prégnane, dans 25 cm3 de méthanol, aune culture analogue de Calonectria de- cora et traite de la manière décr±téy on obtient alors également la 1-dêhy- dro-cortisone avec un bon rendement.
Exemple 9.
Dans des conditions stériles, on ajoute, à 4 litres d'une culture
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de Calonectria décora, une solution de 1 g de 3,20-dicéto-llp,17a,21-trihy- droxy-alloprégnane dans 25 cm3 de méthanol, puis agite le mélange pendant 4 jours à 27 . On sépare alors le mycélium et effectue l'extraction du fil- trat de culture et la séparation chromatographique de l'extrait, comme on l'a décrit à l'exemple 1. A partir des fractions éluées avec des mélanges de chloroforme et d'acétone (1:1), on obtient, avec un bon rendement et à
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l'état cristallisé, la 1-déhydro-hydro-cort2sone qui fond à 239-242 et pos- sède les propriétés décrites à l'exemple 4.
Exemple 10.
A 4 litres d'une culture de Calonectria décora, on ajoute une so- lution de 1 g d'androstane-3,17-dione dans 25 cm3 d'acétone, dans des con- ditions stériles. Après avoir agité 36 heures à 27 , on sépare le mycelium et extrait le filtrat de culture jusqu'à épuisement avec du chlorure de mé- thylène. On lave l'extrait à deux reprises, chaque fois avec de l'acide chlorhydrique décinormal et avec une solution à 1% de bicarbonate de sodium, puis trois fois à l'eau, le sèche et l'évapore sous vide. On crhomatographie le résidu (1,2 g) sur 30 g d'oxyde d'aluminium suivant la méthode par passa- ge, en éluant avec des mélanges d'éther de pétrole et de benzène, avec du benzène, avec des mélanges de benzène et d'éther, et avec de l'éther.
Les fractions éluées avec le mélange d'éther de pétrole et de benzène et avec le
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benzène, renferment la V ls°-androstad.ièns-3,17-dione coxiue qui cristal- lise, dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole en paillettes rhombi-
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ques fondant à 145-146 ; [a]D = + 110 (chloroforme).
Exemple 11.
- f 22 A une solution de 40 mg de 1-déhydro-cortexone (rqq2 = + 120 dans le chloroforme) dans 2 cm3 de pyridine, on ajoute 2 cm3 d'anhydride acétique et laisse reposer à la température ambiante. Au bout de 16 heures, on évapore la solution sous vide à 30 et reprend le résidu dans un mélange de chloroforme et d'éther (1:4). On lave la solution à trois reprises, @ chaque fois avec de l'acide chlorhydrique décinormal, avec une solution à 2% de bicarbonate de sodium et à l'eau, la sèche et l'évaporé sous vide.
En recristallisant le résidu obtenu dans un mélange d'acétone et d'éther
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de pétrole, on obtient à l'état pur le 21-acétate de la 1-déhydro-cQrtexonei, qui fond à 203 - 205aaD = + 1340 (.dans le chloroforme).
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Exemple 12.
A 4 litres d'une culture de Calonectria decora obtenue comme dé- crit à l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution
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de 1 g de ll-=déhydro-corticostérone dans 25 cm3 d'acétone. On agite pen- dant 3 jours à 27 et sépare alors le mycelium par filtration. L'extraction du filtrat de culture et la chromatographie de l'extrait brut sur du gel de silice sont exécutées comme décrit à l'exemple 1.
Les fractions obtenues
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au moyen de chloroforme et d'un mélange de chloroforme et d'acétone (955) renferment des impuretés et un peu de la substance de départ, tandis que les fractions obtenues avec un mélange de chloroforme et d'acétone (90sl0), sont essentiellement constituées par une substance qui, dans le chromato- gramme sur papier, migre un peu plus lentement que la matière de départ.
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Cette substance est le 19°31120-tricéto-21-hydroxyprégnadiène que l'on cristallise dans un mélange d'acétone et d'éther. Les cristaux se décompo- sent entre 200 et 220 , plus ou moins rapidement suivant la rapidité avec laquelle on les chauffe. Ce produit présente en ultra-violet, une absorption
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de 240 mjet montre dans l'infra-rouge, à 59 99 /-d- ' 6,14}-l- et 6,22JA- les ban- des caractéristiques du groupement A 1,4-3-cétonique. Par acétylation de ce produit au moyen de pyridine et d'anhydride acétique, on obtient le 21-acé- tate correspondant, fondant à 188-191 . On peut préparer d'une manière ana- logue l'oenanthate ou l'undécylénate.
Exemple 13.
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Lu..° litres d'une culture de Calonectria decora obtenue comme dé- crit à l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g de corticostérone dans 25 cm3 d'acétone. On agite 4 jours à 27 , puis sépare le mycélium par filtration. L'extraction du filtrat de culture et la chromatographie de l'extrait brut sur du gel de silice sont exécutées comme décrit à l'exemple 1. Les fractions éluées au moyen de chloroforme
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et d'un mélange de chloroforme et d'acétone (95s5) renferment des impuretés et de la matière de départ. Avec des mélanges de chloroforme et d'acétone
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(90sl0) et (80µ20)s on élue essentiellement une substance qui, dans le chro- matogramme sur papier, migre un peu plus lentement que la matière de départ.
Il s'agit de la 1-débydro-cortiGostérone que l'on recristallise dans l'acé- tone. Elle fond à 216=220 en se décomposant, #D = + 1580 (dans l'alcool).
Dans l'ultra-violet, cette substance présente une absorption à 244 mJi-( é 15300) et elle montre dans l'infra-rouge des bandes à 2,76, 2,86, bzz 5,99, 6,14, 6,22,7,44,8,73, 9,22, 9,38/, et 9,63-.
Le 21-acétate préparé à 20 à l'aide d'un mélange de pyridine et d'anhydride acétique, fond à 159-16"!0; cxl D = + 1510 (dans le dioxanne); absorption dans le spectre ultra-violet À m 243 mfL(t::; 14800)-
Exemple 14.
A 4 litres d'une culture de Calonectria décora obtenue comme dé- crit à l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de
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1 g de 17'X'=hydroxy'-cortexone (substance S de Reichstein) dans 25 om3 de méthanol. On secoue 3 jours à 27 et sépare alors le mycélium par filtra- tion. L'extraction du filtrat de culture et la chromatographie de l'extrait brut sur gel de silice s'effectuent comme décrit à l'exemple 1. Les frac- tions obtenues au moyen de chloroforme et d'un mélange de chloroforme et d'acétone (97,5;2,5) renferment des impuretés, tandis qu'avec un mélange de chloroforme et d'acétone (95:5) on élue un peu de la matière de départ.
Les fractions obtenues avec un mélange de chloroforme et d'acétone (90sl0) sont constituées par un mélange renfermant, à côté d'un peu de matière de départ et de produits d'une polarité plus élevée, essentiellement de la 1-
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déhydro 17a-hydroxy-cortexone. On obtient cette dernière à l'état pur par
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cristallisation dans l'acétone; elle fond à 227-233 en se décomposant;
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hX1D = + 76 (éthanol); spectre d'absorption dans l'ultra-violet 1 max 244 21 /*-((± = 16200). Dans 1'infra-rouge, on observe des bandes, notamment à 2,761'Lg 2,85/c, 5,84-, 6,00-, 6el5,p4 6,23, 9,01, 9,20, 9,55. et 10,04. Le 21-acétate préparé à l'aide d'un mélange de pyridine et d'anhydride acétique fond à 216-222 , JD = + 86Q (dioxanne); spectre d'ab- sorption ultra-violet : y max 244 m fi- (l = 15400).
Exemple 15.
A 4 litres d'une culture de Calonectria décora obtenue comme dé- crit à l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g de progestérone dans 25 cm3 d'acétone. On secoue 24 heures à 27 et sépare alors le mycélium par filtration. On effectue l'extraction du
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filtrat de culture comme décrit à 1.,exemple 1. On chromatographie l'extrait brut sur une colonne de 30 g d'oxyde d'aluminium exempt d'alcali, en sou- mettant les diverses fractions (de chacune 100 cm3) à un examen par chroma- tographie sur papier. Les fractions obtenues avec un mélange d'éther de pétrole et de benzène renferment de la matière de départ, tandis qu'avec du
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benzène on élue principalement de la 1-déhydro-pxogestérone.
On cristalli- se cette dernière dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole; elle fond
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à 151-152 ; al D3 - + 120 (éthanol); spectre d'absorption ultra-violet À max 245 m e D ( 16150). Dans le spectre infra-rouge, on observe des bandes notamment à 5,$6 f.t., 5,99 t' , 6,14, 6,23 , 7,23, 7,38 f'-, 8,33 r- 856214,1 10 55 fe. et 12,24.f"-.
Exemple 16.
Dans un récipient agitateur, on met 1 litre d'une solution nutritive renfermant 15 g de peptone, 10 cm3 d'eau de gonflement du maïs (Corn-
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steep-liquor, 0,1 g de glucose brut et quant au reste de l'eau du robinet, amène à un pH de 6,8 et stérilise. On ensemence alors avec une culture de Calonectria decora. On secoue 48 heures à 27 et ajoute alors à la culture bien développée, dans des conditions stériles, une solution de 250 mg de cortisone dans 8 cm3 de méthanol. On continue d'agiter à 27 , sépare le mycélium par filtration au bout de 3 jours et extrait le filtrat de culture' au moyen d'acétate d'éthyle comme décrit à l'exemple 1.
L'examen'de l'ex- trait brut, effectué par chromatographie sur papier, montre qu'à part une faible quantité de fraction d'une polarité plus élevée, il n'y a que de la 1-déhydro-cortisone et plus de matière de départ. Par cristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther et dans le méthanol, on obtient la 1-déhydr'o- cortisone à l'état pur.
Exemple 17.
Dans 1 litre d'eau du robinet, on dissout 2 g de nitrate de so- dium, 1 g d'orthophosphate primaire de potassium, 0,5 g de sulfate de ma- gnesium heptahydrate 0,5 g de chlorure de potassium et 1 g d'extrait de le- vure Difoo, amène à un pH de 5 en ajoutant une solution d'hydroxyde de so-' dium et stérilise. On ensemence la solution nutritive obtenue avec 50 cm3 d'une culture d'agitation de Didymella lypopersici agée de 4 jours et la se-
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coue 48 heures à 27e ce qui fait que la culture se développe bien. On ajou te alors, dans des conditions stériles, une solution de 250 mg de cortexone dans 10 cm3 d'acétone. On agite encore deux jours à 27 , sépare alors le mycélium par essorage, le lave à l'eau et à l'acétate d'éthyle et extrait les filtrats réunis à l'acétate d'éthyle.
On lave à l'eau les solutions dans l'acétate d'éthyle, les sèche et les évapore sous vide; un examen chromatographique sur papier dans le système Bush B3 (mélange de benzine et de
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ligroïne: benzène : méthanol : eau (6,67 : 3,33 : 8,0 : 2,O)j montre que le résidu cristallin obtenu est constitué par de la 1-déhydro-cortexone presque
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j;iu.J:'8. POJ12 la purifier on la fait passer en solution chloroformique à travers une couche de gel de silice. Le filtrat chloroformique renferme au pli (i'Uc10 :1't:116 très liquide. On réunit les autres filtrats obtenus au moyc''i do chloroforme avec addition de 1 à 3% de butanol tertiaire, et les ;hr.1por'e..
Le résidu fournit, par recristallisation dans un mélange d'acéto- .e et d'éther isopropylique, 220 mg de 1-déhydrocortexone fondant à 189-195 en se décomposant, E7..:9mple 18.
A un litre d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue comme à l'exemple 17, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 250 mg de cortisone dans 10 cm3 de méthanol et secoue 72 heures à 27 , après quoi on traite le liquide de culture comme indiqué à l'exemple 17. Un examen chromatographique sur papier dans le système propylène-gly- col-toluène montre que le résidu des extraits obtenus à l'acétate d'éthyle
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ne renferma pratiquement que de la 1-d6hydro-cortisone comme fraction stéroldique. On filtre le résidu, en solution chloroformique, à travers du gel de silice. Les filtrats chloroformiques fournissent un peu d'une huile très liquide.
Avec un mélange de chloroforme et d'acétone (6:4), on obtient un résidu cristallin qui fournit, après recristallisation dans un mélange d'a- cétone et d'éther, 225 mg de 1-déhydro-cortisone pure, fondant à 231-234 .
Exemple 19.
A un litre d'une culture bien développée de Didymella lycopersioi préparée comme à l'exemple 17, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 250 mg d'hydrocortisone dans 10 cm3 de méthanol., Après avoir agité pendant 10 jours à 27 ,on traite la culture comme indiqué à l'exemple 17. Un chromatogramme sur papier (système propylèneglyool-toluène) montre que le résidu des solutions dans l'acétate d'éthyle est constitué par de la
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1-dêhydrc-hydrocortisone presque pure. Pour éliminer les substances accom- pagnatrices, on reprend le résidu dans le chloroforme et filtre la solution à travers du gel de silice. On jette les éluats ohloroformiques qui renfer- ment une petite quantité d'une huile très liquide.
On réunit les éluats ob- tenus avec un mélange de chloroforme et d'acétone (isl) et les évapore.On recristallise le résidu dans le méthanol ou dans un mélange d'acétone et
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d'éther, et obtient ainsi 210 mg de 1-dêhydro-hydrocortisone pure, fondant à 238=241 .
Exemple 20.
A 120 cm3 d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue de la manière indiquée à l'exemple 17, on ajoute, dans des condi-
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tions stériles, une solution de 30 mg de 391120.tricétol7txq21Clihydroxy alloprégnane dans 2 cm3 de méthanol. On agite 10 jours à 27 et traite la culture comme indiqué à l'exemple 1. Un examen chromatographique sur pa-
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pier, dans le système propylèneglyooltaluène9 du résidu des extraits obtenus au moyen d'acétate d'éthyle, montre que ledit résidu renferme, à côté de matière de départ inchangée, de la 1-d6hyclra-cortisone qu'on peut obtenir sous forme pure par chromatographie sur du gel de silice et par cristalli- sation subséquente dans un mélange d'acétone et d'éther.
Exemple 21.
D'une manière analogue, on obtient, à partir de progestérone,
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deÀ8 lallorégnène39 20-d.oneg de prégnane-3i 20m-dïone' de corticostérone, de lldéhydrooorticostéroney de l7cxhydroxy cortexone' de testostérone, de 1 l - ou de Z4 -androstène-3,17-dione, les .ls4diênes correspondants.
Exemple 22.
A 2 litres d'une culture-bien-développée de Didymella-lycopersici
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obtenue comme il est indiqué à l'exemple 17, on ajoute, dans des conditions
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stériles, une solution de 500 mg de A °-31120-trioxo-17a-méthyl-21-acé- toxy-=prégnène dans 15 cm3 d'acétone. On agite pendant 3 jours à 27 , puis traite alors comme décrit à l'exemple 1. Un examen chromatographique'sur papier montre que le résidu d'extraction (585 mg) n'est constitué pratique-
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ment que par du 14-31120-trioxo-ï7a-mêthyl-21-hydrox prégnadiène. En recristallisant ce dernier dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, on l'obtient sous la forme d'aiguilles qui fondent à 183-1860 en se décom-
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posant légèrement. COEID = *# 120 (alcool), absorption en ultra-violet; loi max 240 m- ( 14600).
Le spectre infra-rouge montre à 59 98,%z 3 6 13 y et 6,2l}k les bandes caractéristiques pour les Ll1,4-3-cétones. Le 21-acé- tate préparé au moyen d'anhydride acétique et de pyridine fond à 198-201 ; [Ó]24D = + 1350 (chloroforme); spectre d'absorption dans l'ultra-violet
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max 240 m/i(± 14800).
Exemple 23.
A 4 litres d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue comme on l'a indiqué à l'exemple 17,on ajoute, dans des conditions
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stériles, une solution de 1 g de I7 éthinyl-testostérone dans 25 cm3 d'acé- tone. On agite 8 jours durant à 27 , puis traite la culture suivant les in- dications données à l'exemple 17. L'examen chromatographique sur papier du résidu d'extraction montre que ledit résidu n'est pratiquement constitué
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que par de la 1-déhydro# 17oc-éthinyl-testostérone On obtient ce produit à l'état pur par recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther. Il fond à 228-233 et possède un pouvoir rotatoire spécifique [Ó]D = -17 ( chl orof orme ) .
Exemple 24,
A 2 litres d'une culture bien développée de Didymella lycopersi# ci obtenue comme il est indiqué à l'exemple 17, on ajoute, dans des condi- tions stériles, une solution de 180 mg de 21-acétate de 6-déhydro-cortexone dans 10 cm3 d'acétone et agite pendant 3 jours à 27 . On traite la culture de la manière décrite à l'exemple 17. Un examen chromatographique sur papier montre que le résidu d'extraction (190 mg) est pratiquement exclusivement constitué par la 1,6-bis-déhydro-cortexone libre que l'on cristallise dans un mélange d'acétone et d'éther. Dans le spectre infra- rouge, on observe, .
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à 5 98 f 6913 ft et 6e22 Jc- les bandes caractéristiques pour les 46 le4-3- cétones.
Ce composé fond à 166-168 , [Ó]D = + 112 (acétone), Le 21-acéta- te de ce composé préparé au moyen d'anhydride acétique et de pyridine fond à 158-162 [Ó]25D = + 123 (éthanol). Spectre d'absorption dans l'ultra-
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violet max 223 mfc ( = 11600), 256 mf' (±. = 9900) et 300 myc (<f= 12800),
Exemple 25.
A 4 litres d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue de la manière indiquée à l'exemple 17, on ajoute, dans des condi- tions stériles, une solution de 1 g de 11-déhydro-progestérone dans 20 cm3 d'acétone, On agite 8 jours à 27 et traite alors de la manière décrite à l'exemple 17. En procédant à un examen chromatographique sur papier, on ne peut déceler dans le résidu d'extraction, que de la 1,11-bisdéhydro-proges- térone. On l'obtient sous forme cristalline au moyen d'un mélange d'acétone et d'éther de pétrole; elle fond à 166-168 ; dans le spectre infra-rouge, on
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observe des bandes à 5,98/<, 6,17<- et 6,22/k. ? ; a7 24 = 112 (acétone); spectre d'absorption dans l'ultra-violet, A max 245 mf,a. ( = 17750).
Exemple 26.
A 2 litres d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue suivant les indications de l'exemple 17, on ajoute, dans des condi-
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tions stériles, une solution de 500 mg de 17a-méthyl-testostérone dans 15 cm3 d'acétone. On agite pendant 3 jours à 27 , puis traite la culture sui- vant les indications de l'exemple 1. On dissout le résidu d'extraction dans
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un peu d'acétone. Par addition d'éther, on obtient la 1dêhydro-l'tx-mêthyl- testostérone sous la forme de cristaux compacts. Ils fondent à 163-164 .
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L-7 D 0 (chloroforme). Spectre d'absorption dans l'ultra-violet Xmax 245 myL ( :: 15600).
Exemple 27.
Dans 1 litre d'eau du robinet, on dissout 2 g de nitrate de so-
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dium, 1 g d8 orthophosphate primaire de potassium, 0,5 g de sulfate de ma- gnésium-heptahydrate, 0 5 g de chlorure de potassium, 50 g de glucose et 1 g d'extrait de levure Difco, amène le pH à 5 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium et stérilise. On ensemence la solution obtenue avec 50 cm3 d'une culture d'agitation de Didymella lycopersici âgée de 4 jours et l'agite 48 heures à 27 ; la culture se développe bien. A 120 cm3 de cet- te culture de Didymella lycopersici, on ajoute, dans des conditions stériles,
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une solution de 30 mg de 9'X#fluoro-hydrooortisone dans 2 cm3 de méthanol.
On agite 5 jours à 27 , sépare alors le mycelium par essorage, le lave à l'eau et à l'acétate d'éthyle et extrait à l'acétate d'éthyle les filtrats réunis. On lave à l'eau les solutions dans l'acétate d'éthyle, les sèche et les évapore sous vide. Un examen chromatographique sur papier montre
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qu.3 le résidu d'extraction renferme de la 1-déhydro-ga-fluoro-hydrocortiso- ne que l'on sépare de la matière de départ inchangée à l'aide d'un chromatogramme de préparation sur papier (système propylèneglycol-toluène). Recristallisé dans de l'acétone, le produit obtenu est sous forme de cristaux fondant à 263-266 (en se décomposant); [Ó]23D240 = + 108 (éthanol); spectre
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d'absorption dans l ult avv.alet9 max 240 m ( m 15800).
On sèche ce produit sous -Lui vide poussé et l'acétyle à la température ambiante, de ma- nière usuelle, à l'aide de 4 cm3 d'un mélange d.e pyridine et d'anhydride acé-
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tique (181). Le 21-acétate de la I-dêrdrQ-9a-fluoro-hydrocortisone que l'on obtient ainsi est rscristallisé dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, il fond à 244 '246 (avec décomposition), /K/ 23 =+ 108 (dioxan- ne); spectre d'absorption dans 1 ultra-vioJ.et max 240 m&(± = 16250).
Exemple 28.
Dans 1 litre d'eau du robinet, on dissout 2 g de nitrate de sodium, 1 g d'orthophosphate primaire de potassium, 0,5 g de sulfate de magnésium heptahydrate, 0,5 g de chlorure de potassium, 50 g de glucose et 1 g d'ex- , trait de levure Difco, amène le tout à un pH de 5 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium, puis stérilise. On ensemence la solution nutritive obtenue avec 50 cm3 d'une culture d'agitation de Didymella lycopersici âgée de 4 jours et l'agite à 27 pendant 48 heures, ce qui fait que la culture se développe bien. A 120 cm3 de cette culture de Didymella lycopersici,.on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 30 mg de 21-acétate
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de lliépox 1;'a,hydrax-cortexone dans 2 cm3 de méthanol.
On agite pen- dant 5 jours à 27 , sépare ensuite le mycélium par essorage, le lave à l'eau et à l'acétate d'éthyle, puis extrait les filtrats réunis à l'acétate d'é- ' thyle. On lave à l'eau les solutions dans l'acétate d'éthyle, les sèche et les évapore sous vide. Un examen chromatographique sur papier montre que
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le résidu d'extraction renferme de la l-déhydro-9'll j3-=époxy-17ct-hydroxy- cortexone qu'on sépare de la matière de départ inchangée à l'aide d'un chromatogramme de préparation sur papier (système propylèneglycol-toluène).
On sèche le produit brut sous un vide poussé et l'acétyle, à la température ambiante, de manière usuelle à l'aide de 4 cm3 d'un mélange de pyridine et d'anhydride acétique (1:1).
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On dissout dans 5 cm de dioxanne le 21-acétate de l-déhydro-9,ll- époxy=17#=hydroxy-cortexone (30 mg) obtenu, ajoute 1,25 em3 d'acide fluorhy- drique 2,5 fois normal dans le chloroforme et laisse reposer une heure à la température ambiante. On ajoute alors de l'eau et extrait avec un mélan- ge de chloroforme et d'éther (1:1). Après lavage à l'eau, séchage et évapo-
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ration du solvant sous vide, on obtient le 21-acétate de 1-déhydro-9a-fluo- ro-hydrocortisone, qui fond à 235-237 :
REVENDICATIONS.
1.- Un procédé de préparation de déhydro-composés de la série des stéroïdes, caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre des composés stéroidiques saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5, à l'action aé- robie d'enzymes de Didymella lycopersici, de Colonectria décora, d'Alterna- ria passiflorae, d'Ophiobolus heterostrophus ou d'Ophiobolus Miyabeanus, puis à transformer le cas échéant en leurs dérivés fonctionnels les produits réactionnels obtenue.
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants
1) On utilise comme substances de départ des composés stéroidi- ques saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5 et présentant en posi- tion 3 un groupe hydroxyle ou oxo libre ou fonctionnellement modifié.
2) On utilise comme substances de départ des composés du prégna- ne, saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5.
3) On utilise la cortisone comme substance de départ.
4) On utilise l'hydrocortisone comme substance de départ.
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5) On utilise la 11#épi-hydrocortisone comme substance de départ.
6) On utilise la corticostérone comme substance de départ.
7) On utilise la 11-désoxy-corticostérone comme substance de départ.
8) On utilise le 5-3i-hydro 20-o$o-prégnène comme substance de départ.
9) On utilise l'aldostérone comme substance de départ.
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10) On utilise la l8-hydroocy-corticostérone comme substance de dé- part.
11) On utilise la 18-hydroy-I1-d.éhd.ro-corticostérone comme sub- stance de départ.
12) On utilise la 18-hydroxy-cortexone comme substance de départ.
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13) On utilise la 18-oxo-cortexone comme substance de départ.
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14) On utilise la progestérone comme substance de départ.
15) On utilise comme substance de départ ceux des composés indi- qués sous 3) à 7) et 9) à 14) qui possèdent la double liaison en 1,2 au lieu d'en 4,5.
16) On utilise comme substance de départ des alloprégnane-3,20- diones.
17) On utilise comme substance de départ le prêgnange-ou l'allo-
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prégnange-3 , 11 , 20-trione-17<x> 21-diol .
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.