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"Procédé et milieu nutritif pour la production de pénicilline"
La présente invention a pour objet un prbcédé pour la pro- duction de pénicilline et un-milieu nutritif pour la mise en oeuvre de ce procédé.
La méthode antérieure de culture en surface en milieu de glucose Czapek-Dox pour la production de pénicilline a été abandonnée et la méthode de.culture submergée en milieu liquide st maintenant universellement pratiquée. Elle consiste à déve- lopper une souche quelconque de pénicillium., productrice de péniw cilline, dans un milieu liquide consistant principalement en une liqueur de céréale macérée, de glucose et de lactose. Un autre milieu liquide utilisé dans l'industrie, quoique très rarement, consiste principalement en caséine ou peptone hydrolysée, en li- queur de froment macéré, avec du glucose comme sucre immédiatement assimilable et du lactose comme sucre assimilable lentement.
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Toutefois, l'utilisation d'un milieu consistant en 3 à 6 % de liqueur de céréale macérée avec du lactose a la faveur de nombre d'entreprises industrielles. Ce milieu est spécialement avanta- geux pour les entreprises industrielles, qui.sont situées dans des contrées où la liqueur de céréale macérée peut être obtenue à un prix peu élevé et où la qualité de la liqueur de céréale macérée convenable à la production de pénicilline peut être véri fiée à l'avance, car toutes les livraisons de liqueur de céréale macérée, même si elles sont fabriquées par la même entr@prise, n'ont pas la même production de pénicilline.
Etant donné que la liqueur de céréale macérée n'est pas produite dans de nombreux pays, la production industrielle de pénicilline en milieu de liqueur de céréale macérée n'st possi- ble pratiquement que par importation de liqueur de céréale macé- rée de l'étranger. Le milieu consistant en liqueur de (céréale macérée présente le désavantage de produire beaucoup de mousse et son pH tend à s'élever au-dessus de 8 au cours de la lermen- tation, ce qui nuit'alors à l'obtention d'un grand rendement en pénicilline.
Ceci étant dit, la présente invention a pour résultat de résoudre le problème du remplacement de l'emploi de liqueur de céréale macérée par celui d'une matière également efficace mais meilleur marché. Après un grand nombre d'expériences, on a trou- vé que l'on peut obtenir de grands rendements en pénicilline en culture submergée avec aération et agitation adéquates de toute souche de pénicillium productrice de pénicilline en utilisant. un milieu nutritif contenant du tourteau de moutarde ou du tour- teau de sésame ou du tourteau d'arachide, soit individuellement, soit en combinaison.
Il a en outre été découvert que le tourteau de moutarde ou le tourteau de sésame ou le tourteau d'arachide peut également être utilisé en combinaisons avec des matières contenant de l'amidon ou contenant de la protéine, corme certains
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autres types de tourteaux végétaux, tels que farine de graine de soja ou farine de graine de coton. Il a été observé que certains constituants du tourteau de moutarde, du tourteau de sésame ou du tourteau d'arachide, non seulement favorisent une grande production de pénicilline totale, mais également que la pénicilline obtenue consiste principalement en pénicilline "G", forme cristalline la plus largement utilisée de la pénicilline.
Par addition d'un précurseur, tel que l'acide phénylacétique ou un sel de ce dernier, ou de phénylacétamide, le pourcentage de pénicilline "G" obtenue dans le milieu à tourteau suivant l'in- vention, se tient entre 85 et 98 %. Ceci est de grande impor" tance du point de vue de la production économique de pénicilline "C." La production en pénicilline en milieu à tourteau suivant l'in- vention est en outre stimulée par l'addition de petites quantités den sels suivants, à savoir : de sodium ou de potassium, ou phosphate monosodique ou monopotassique, sulfate de magnésium et carbonate de calcium.
Le milieu nutritif contient de préférence un sucre d'assimilation lente, tel que le lactose. -
Les avantages du milieu à tourteau suivant l'invention sont les suivants: (1) dans ce milieu, il suffit de à .4 % de tourteau, tandis que dans les milieux habituels la quantité de liqueur de céréale macérée nécessaire s'élève à 6 %; (2) le pH du milieu au cours de la fermentation se règle automatiquement; il ne dépasse pas 7,8;
(3) il se forme très peu de mousse et par conséquent il n'est nécessaire d'employer qu'une très petite quantité d'agent anti-inoussant; (4) le prix du tourteau de moutarde, du tourteau de sésame cu du tourteau d'arachide, est bien moindre que celui de La liqueur de céréale macérée; (5) la production de pénicilline en milieu contenment Ce tourteau atteint 1500 unit/;-: par cm3 du mmilieu ..,,il .
52 à 96 heures de fermentation ;
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(6) on obtient des produits contenant un fort pourcentage de pénicilline "G", même sans précurseur tel que l'acide phénylacétique ou un sel de celui-ci ou la phénylacétamide, bien qu'avec l'addition d'un tel précurseur, la quantité de pénicilline "G" produite soit encore augmentée.
Suivant l'invention, un procédé pour la production de péni- cilline consiste à cultiver une souche productrice de pénicilline, telle que de Penicillium Notatum ou de Penicillium Chrysogenum, à l'état submergé en contact avec un milieu nutritif aqueux, et il est caractérisé en ce que ce milieu contient du tourteau de moutarde ou du tourteau de sésame ou du tourteau d'arachide, soit individuellement, soit en toute combinaison, maintenu à un pH ' compris entre 6,0 et 7,8 au cours de la fermentation,
L'invention a également pour objet un milieu nutritif conte- nant du tourteau de moutarde, ou du tourteau de sésarne, ou du tourteau d'arachide, soit individuellement, soit en combinaisons.
L'invention a également pour objet la pénicilline.lorsqu'elle est produite par le procédé décrit ci-dessus.
Le milieu nutritif peut contenir, en plus des tourteaux ci- dessus, des matières contenant de l'amidon ou contenant de la protéine, telles que d'autres types de tourteaux, par exemple de la farine de graine de soja ou de la farine de graine de coton, soit individuellement, soit en combinaisons.
Il faut noter que lesdits tourteaux doivent être incorporés en quantité de 2 à 4 % en poids du milieu nutritif total. Si l'on veut obtenir une production satisfaisante,il faut poursuivre la fermentation pendant une période de temps de 52 à 96 heures, suivant la nature des tourteaux particuliers employés. Il a été trouvé que le développement de la pénicilline est fortement facilité si le pH est maintenu dans la gamme de 7 à 7,6. Pour fournir l'oxygène on peut faire passer à travers le milieu, main- tenu en agitation mécanique, par exemple par des pales rotatives à l'intérieur de la cuve de fermentation, de l'air filtré dépourvu
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de bactéries, en quantité suffisante et sous des pressions de 0,7 à 1,1 kg/cm2.
On peut employer pratiquement tout type de cuve en acier inoxydable ou en acier doux, comportantdes disposi- tifs d'aération et d'agitation. Les degrés d'aération et d'agi- tation peuvent varier largement.
Dans la mise en oeuvre de l'invention, le milieu nutritif aqueux doit être stérilisé avant d'être inoculé par une souche de pénicillium productrice de pénicilline.
Ce qui suit illustre les combinaisons possibles de tourteaux employés, dans le milieu nutritif aqueux objet de l'invention : (1) Tourteau de moutarde, ou (2) Tourteau de sésame, ou (3) Tourteau d'arachide, ou (4) Tourteau de moutarde et tourteau de sésame, ou (5) Tourteau de moutarde et tourteau d'arachide, ou (6) Tourteau de sésame et tourteau d'arachide, ou (7) Tourteau de moutarde et farine de graine de soja, ou (8) Tourteau de moutarde et farine de graine de coton, ou (9) Tourteau de sésame et farine de graine de soja, ou (10) Tourteau de sésame et farine de graine de coton, ou (11) Tourteau d'arachide et farine de graine de soja, ou (12) Tourteau d'arachide et farine de graine de coton.
Afin que l'invention puisse être complètement comprise, elle sera décrite maintenant en référence aux exemples suivants. Il doit être compris que les exemples détaillés, qui suivent, ne doi- vent pas être considérés restrictivement et que des variantes de ceux-ci sont dans la portée de l'invention.
EMI5.1
- ilxTI-IDL-11, 1.
Un milieu nutritif de fermentation, de composition suivante, était préparé :
Tourteau de moutarde........ à 4 %
Nitrate de sodium........... 0,3 %
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Phosphate monopotassique... 0,05 %
Sulfate de magnésium....... 0,0125 %
Lactose.................... 3,0 %
Acide phénylacétique....... 0,2%
Carbonate de calcium....... 0,5%
Eau en quantité pour faire 100 cm3 la litres du milieu ci-dessus étaient stérilisés à une pression de 1,05 kg/cm2 pendant 30 minutes.
Le milieu était inoculé avec 0,5 à 1 litre de pousse végétale de Penicillium Notatun ou de Pénicillium Chrysogenum et la fermentation était poursuivie à une température de 23 C à 27 C pour une durée de 65 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conser- vait un pH compris entre 7 et 7,6, avec aération et agitation continues. Après fermentation complète un échantillon de filtrat de la culture se révélait contenir 1400 unités Oxford par cm3.
EXEMPLES
Un milieu nutritif de fermentation était préparé, avec la même composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesdits 2 à 4 % du tourteau de moutarde étaient remplacés par 2 à 4 % de tourteau de sésame, et que les 0,2 % diacide phénylacétique étaient remplacés par 0,2 % de phénylacétamide. La stérilisation et l'ino- culation étaient effectuées suivant la. méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température de 23 C à 27 C pour une durée de 68 heures, à l'état submergé.
Au cours de la fermentation le milieu conservait un pH compris entre 7,1 et 7,6, avec aération et agitation continues. Après fermentation complète, un échantillon de filtrat de la culture se révélait contenir 1450 unités Oxford par cm3.
EXEMPLE 3.
Un milieu nutritif de fermentation était préparé avec
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la maire composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesdits
2 à 4 % de tourteau de moutarde étaient remplacés par. 2 à 4 % de tourteau d'arachide. La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées suivant la méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température de 23 C à 27 C pour une durée de 63 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conservait un pli compris entre
7,1 et 7,5 , avec aération et agitation continues. Après fer- mentation complète, un échantillon de filtrat de la culture se révélait contenir 1395 unités Oxford par cm3.
EXEMPLE 4.
Un milieu nutritif de fermentation était préparé avec la même composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesdits
2 à 4 % du tourteau de moutarde étaient remplacés par 2 à 4 % d'un mélange de tourteau de moutarde et de tourteau de sésame.
La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées suivant la méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température- de 23 C à 27 C' pour une durée de 72 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conservait un pH 'compris entre 7 et 7,6 avec aération et agitation continues. Après fermentation complète, un échantillon de filtrat de la culture se révélait contenir 1425 unités Oxford par cm3.
EXEMPLE 5.
Un milieu nutritif de fermentation était'préparé avec la même composition que. celui de l'exemple 1, excepté que lesdits 2 à 4% du tourteau.de moutarde étaient remplacés par à 4 % d'un mélange de tourteau de moutarde et de tourteau d'arachide.
La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées suivant la méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température de 23 C
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à 27 C pour une durée de 73 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conservait un pH compris entre 7,2 et 7,6, avec aération et agitation continues. Après fermentation colleté, un échantillon du filtrat de la culture se révélait contenir 1410 unités Oxford par cm3.
EXEMPLE 6.
Un milieu nutritif de fermentation était préparé avec la même composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesides 2 à 4 % du tourteau de moutarde étaient remplacés par 2 à 4 % d'un mélange de tourteau de sésame et de tourteau d'arachide. La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées suivant la méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température de 23 C à 27 C pour une période de 64 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conservait ¯un pH compris entre 7,2 et 7,6, avec aération et agitation continues. Après fermentation complète, 'un échantillon du filtrat de la culture se révélait contenir 1430 unités Oxford par cm3.
EXEMPLE 7.
Un milieu nutritif de fermentation était préparé avec la même composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesdits à 4 % de tourteau de moutarde étaient remplacés par 2 à 4 % d'un mélange de tourteau de moutarde et de farine de graine de soja. La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées sui- vant la méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température de 23 C à 27 C pour une durée de 76 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conservait un pH compris entre 7,3 et 7,6, avec aération et agitation continuas. Après fermentation complète, un écnantillon du filtrat de la culture se révélait
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contenir 1390 unités Oxford par cm3.
EXEMPLE 8.
Un milieu nutritif de fermentation était préparé avec la même composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesdits 2 à 4 % de tourteau de moutarde étaient remplacés par 2 à 4 % d'un mélange de tourteau de moutarde et de farine de graine de coton.
La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées suivant la méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une.température de 23 C à 27 C pour une durée de 72 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conservait un pH compris entre 7 et 7,6, avec aération et agitation continues. Après fermentation complète, un échantillon du filtrat de la culture se révélait contenir 1420 unités Oxford par cm3.
@ EXEMPLE 9 .
Un milieu nutritif de fermentation était préparé avec la même composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesdits 2 à 4 % du tourteau de moutarde étaient remplacés par 2 à 4 % d'un mélange de tourteau de sésame et de farine de graine de soja.
La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées suivant la méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température de 23 C à 27 C pour une durée de 69 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conservait un pH compris entre 7,1 et 7,6, avec aération et agitation continues. Après fermentation complète, un échantillon du filtrat de la culture se révélait contenir 1425 unités Oxford par cm3.
EXEMPLE 10.
Un milieu nutritif de fermentation était préparé avec la
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même composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesdits 2 à 4 % du tourteau de moutarde étaient remplacés par 2 à 4 % d'un mélange de tourteau de sésame et de farine de graine de coton.
La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées suivant la méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température de 23 C à 27 C pour une durée de 70 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conservait un pH compris entre 7,2 et 7,6, avec aération et agitation continues. Après fermentation complète, un échantillon du filtrat de la culture se révélait contenir 1395 unités Oxford par cm3.
EXEMPLE 11.. '
Un milieu nutritif de fermentation était préparé avec la même composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesdits 2 à 4 % du tourteau de moutarde étaient remplacés par 2 à 4 % d'un mélange de tourteau d'arachide et de farine de graine de soja.
La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées suivant la méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température de 23 C à 27 C pour une durée de 76 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation, le milieu conservait un pH compris entre 7,1 et 7,5, avec aération et agitation continues. Après fermentation complète, un échantillon du filtrat de la culture se révélait contenir 1390 unités Oxford par cm3.
EXEMPLE 12.
Un milieu nutritif de fermentation était préparé avec la même composition que celui de l'exemple 1, excepté que lesdits 2 à 4 % du tourteau de moutarde étaient remplacés par 2 à 4 % d'un mélange de tourteau d'arachide et de farine se graine de coton. La stérilisation et l'inoculation étaient effectuées
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suivant la Méthode de l'exemple 1.
La fermentation était poursuivie à une température de 23 C à 27 C, pour une durée de 75 heures, à l'état submergé. Au cours de la fermentation le milieu conservait un pE compris entre 7, et 7,5, avec aération et agitation continues. Après fermentation complète, un échantillon du filtrat de la culture se révélait contenir 1440 unités Oxford par cm3.