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La présente invention est relative à nidation de certains composés stéroïdes par des moyens microbiolo- giques Elle concerne, en particulier, 1 oxydation de. cer- tains composés stéroïdes 3-céto-4-non saturés à l'aide de certains microorganismes ou à l'aide d'enzymes oxydantes produites' par ces microorganismes conformément au procédé .décrit,de manière générale,, dans le brevet belge n 5@8.327 déposé le 21 mai 1955 -au nom de la demanderesse.
Comme décrit dans ce', brevet antérieur,, en soumettant un composé stéroïde 3-céto-4-non saturé à l'ac- tion d'une espèce du genre Mycobacterium, .on obtient un stéroïde 3-céto-l,4-non saturé. Il se produit également une certaine oxygénation nucléaire, principalement dans la posi tion 14, lorsque cette position est disponible. Le produit principal de l'oxydation est cependant le produit de déshy, drogénation. Il est ainsi possible par l'utilisation d'orge nismes du genre Mycobacterium de produire des composés ayans un groupe 3-céto et non saturés dans les positions 1 et 4.
Certains composés de ce type sont extrêmement précieux, 4 cause de leur activité biologique, en sorte qu'il importe grandement de disposer d'un procédé simple permettant une déshydrognénation en un seul stade opératoire dans les posi. tions 1,2 .
Le procédé spécifié ci-dessus est le'premier, dans lequel une déshydrogénation dans le noyau A d'un stéroïde a été produite par 1!emploi de microorganismes sans scission oxydante simultanée d'une chaîne latérale présente dans la position 17* Ce procédé est également le premier, dans lequal
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un organisme du genre Mycobactarium a été utilisé dans une réaction chimique commercialeet il semble aussi que ce soit la première fois que l'on ait trouvé un usage quelconque pour les microorganismes de la famille des Mycobacteriaceae.
Conformément à la présente invention, des stérofdes différents de ceux décrits spécifiquement dans le brevet précité sont utilisés comme matières de départ pour le pro- cédé décrit dans ce brevet , ces stéroïdes étant, en par- ticulier, l'hydrocortisone et la cortisone, ainsi que les
14-hydroxy-hydrocortisone et -cortisone. Par ce procédé, ces composés ont été convertis en delta 1-dehydrohydrocorti- sone, delta-1-dehydrocortisone, delta-1-14-OH-hydrocortisone et delta-l-14-OH-cortisone respectivement . Chacun de ces nouveaux produits est extrêmement actif comme hormone adré- nocorticale .
La preuve de cette activité est donnée par le fait que chacun de ces composés demie un test d'involution de thymus très positif, ainsi qu'un test de glycogène du foie très positif. Par ailleurs, ces delta-1-composés pré- sentent des avantages par rapport aux composés apparentés , en ce sens qu'ils sont exempts d'effets secondaires, lors de leur administration à des animaux, y compris les êtres humains. Les effets secondaires de formation d'oedème et d'androgénicité sont fortement réduits.
Comme le groupe hydroxyle en position 21 est le seul groupe alcool primaire dans les quatre composés sus- mentionnés, il peut aisément être éthérifié et estérifié par des méthodes courantes. Ainsi, les éthers méthylique, éthylique, benzylique et méthoxyméthylique ont été préparés de même qu'une variété d'esters tant d'acides monocarboxy- ' ligues que d'acides polycarboxyliques= y compris ceux à chaînes droites, ramifiées, saturées, non saturées et cycliques .
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Les esters en position 21 de ces alcools stéroides peuvent être prépares à partir des alcools libres par l'un quelconque des procédas d'estérification connus, qui n'impli- quent pas l'utilisation d'agents défavorablesà la stabili- té du stéroïde. Ainsi, le chlorure d'acide de l'acide préféré peut être utilisé, en particulier' en présence d'une base or- ganique, telle que pyridine, diméthylaniline et analogues.
Les nouveaux esters suivant la présente invention peuvent également être préparés à partir des alcools par traitement desdits stéroïdes avec au moins environ une proportion molé- culiaire d'un acide ou d'un agent d'acylation acide,'tel qu'un anhydride d'acide ou un ester d'acide d'un alcool à faible poids moléculaire. Dans ce dernier cas, l'estérifi- cation du groupe hydroxy en C21 a lieu par alcoolyse de l'es- ter à l'aide de l'alcool stéroïde en C21. Non seulement l'al- cool stéroïde libre en C21peut étre utilisé comme matière de départ pour ce procédé, mais on peut également faire usa- ge d'esters d'acides aliphatiques de faible poids moléculai- re de l'alcool stéroïde.; ainsi, on peut, par exemple, utili- ser l'acétate à cette fin.
Par traitement de ce composé avec, par exemple, un acide polycarboxylique ou un ester d'acide polycarboxylique et d'alcool à faible poids moléculaire, il se produit un échange donnant lieu à l'obtention de l'ester d'alcool stéroïde en C21 désiré d'un acide polycarboxylique.
L'alcool ou l'ester obtenu comme sous-produit .doivent être éliminés pour achever la réaction. '
Le procédé d'estérification peut être catalysé par des matières telles que des résines échangeuses d'ions ou par des proportions mineures d'acides ou d'alcalis forts, tels que HCl ou NaOH. Le catalyseur peut être organique ou inorganique; toutefois, des précautions doivent être prises parce que certains groupes sensibles sont présents dans la molécule, notamment le groupe hydroxyle de configuration ss
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occupant la position 11. L'emploi de quantités catalytiques d'une base ou d'un acide pour accélérer le processus d'esté- rification n'est évidemment pas nécessaire, lorsqu'un agent d'acylation, tel qu'un anhydride d'acide ou un halogénure d'acide est utilisé pour l'exécution du procédé.
Les agents de ce dernier groupe peuvent être utilisés en présence d'une base organique, telle que la pyridine, la diméthylaniline, la quinoléine, etc...
Il est à noter qu'une variété d'acides peuvent ê- tre utilisés pour la présent procédé, soit comme acides, soit comme esters avec des alcools à faible poids moléculaire,soit: encore sous forme d'anhydrides d'acides ou d'halogénures d'a- cides. Parmi ces réactifs, on peut citer des composés, tels que l'anhydride acétique, les halogénures des acides propa- noïque, butanoique, pentanoïque, hexanoique, heptanoïque, octanoique, nonanoique, décénoique, ortho-toluique, benzoïque
1-éthylcyclohexane carboxylique, cyclohexane carboxylique et
1-méthyl-cyclopropane carboxylique, anhydride maléique, anhydride glutarique, anhydride phtalique, chlorure de phta- loyle, acide maléique, acide citrique, acide tartrique, anhy. dride succinique, acide pyromellitique, etc...
Comme on l'a noté plus haut, ces stéroïdes possèdent dans leurs struc tures des groupes sensibles et il est à conseiller de prendre des précautions dans l'estérification de ces'composés. L'u- tilisation d'un anhydride d'acide ou' d'un halogénure d'acide dans une base organique est particulièrement favorable. Il est à noter que la réaction est sélective, en ce sens que seul le groupe alcool primaire en position C21 est estérifié et d'autres groupes, tels que le groupe ss-hydroxyle,ne sont pas estérifiés dans une mesure appréciable dans le présent procédé.
Lors de l'exécution du procédé, il est souhaitable d'utiliser un solvant, si une base organique telle que la
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pyridine n'est pas @@ilisée a cette fin. Des .solvants organi- ques inertes, tels que benzène, chloroforme, toluène, etc... peuvent être utilisés. L'application de chaleur favorise sou- vent l'a@élération de la réaction vers son achèvement; toute- fois, cette application doit se faire avec soin et si on uti- lise, par exemple, un chlorure d'acide comme agent d'estéri- ficatiou, il faut prendre des précautions.
Lorsqu'un ester d'acide carboxylique .d'alcool inférieur et un alcool stéroi- de sont utilisés comme réactifs ou lorsqu'un procédé de trans- estérification est utilisé pour la préparation des présents esters, le sous-produit, qui est volatil, peut être néparé du mélange réactionnel de façon à provoquer l'achèvement de la réaction. Ceci peut se faire en appliquant modérément de la chaleur et du vide au mélange réactionnel.
Par ces procédés, on obtient des esters en posi- tion 21 avec des acides monécarboxyliques contenant seulement de l'hydrogène, de l'oxygène et du carbone et ayant une te- neur en carbone de 1 à 10 atomes de carbone inclusivement, ainsi que des esters acides en. position 21 avec des acides polycarboxyliques contenant seulement de l'hydrogène, de l'oxygène et du carbone et ayant une teneur en carbone compris se entre 2 et 10 atomes de. carbone inclusivement.
Lorsque les composés en question sont estérifiés avec un acide polycarboxylique, tel qu'un acide dibasique, comme l'acide succinique, on obtient un ester acide, c'est-à- dire un ester ayant un ou plusieurs groupes carbbxyle libres.
Des sels de métaux alcalins et d'ammonimm de ces composés, tels que le sel sodique du succinate, ont l'avantage d'être solubles. dans l'eau, ces sels sont obtenus en traitant l'es- ter acide avec des quantités équivalentes d'une base ou de sels d'acides faibles, tels que le bicarbonate de sodium.
Chacun des composés suivant la présente invention
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peut être administré seul ou en combinaison avec des véhicu- ler pharmaceutiques acceptables. Les doses sont, en général, sensiblement du même ordre de grandeur qu'avec l'hydrocorti- sone, mais une gamme plus large de dosage existe. Dans cer- tains cas, l'activité de ces composés est telle qu'une dose plus faible suffira, mais l'absence d'effets secondaires per- met l'administration de doses plus fortes, lorsque celles-ci sont nécessaires. Le choix du véhicule ou excipient est dé- terminé par la voie choisie pour l'administration, par la solubilité du composé particulier et par les pratiques commer. ciales courantes.
Des excipients, tels que l'amidon et le lac. tose, peuvent être utilisés pour préparer des tablettes à administrer par la voie buccale. Des élixirs contenant des agents aromatisants et sucrants peuvent également être utili-' sés. Pour des injections intra-articulaires, on peut faire usage de compositions contenant suffisamment d'eau salée pour les rendre isotoniques. Lorsque des composés solubles dans l'eau, tels que du succinate sodique de delta-1-déhydrohy- drocortisone, sont administrés, des solutions aqueuses peu- vent être utilisées. La filtration à travers un filtre Seitz constitue un procédé convenable pour stériliser une telle so- lution. De petites quantités d'un agent préservatif, tel que le chlorobutanol, peuvent également être ajoutées pour main- tenir la stérilité.
Comme exemples spécifiques.de composés stéroïdes
3-céto-4-non saturés, qui peuvent être utilisés comme matiè- res de départ selon la présente invention, on peut citer les composés suivants :
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Composé F (hydrocortisone) Composé F 14 of-hydroxylé Composé E (cortisone) 11-épi-hydrocortisone Composé S 14 c( -hydroxylé 4e 6 androstadiendiozie Nortestéstérone .1, ,17 d, -.dïhydroxyproastérona 17 o(-hydroxyprogestérone '4f-dêhydro-composé S 11- c et oproge st érone l6-.déhydroproge at érone Composé F 9 4 -fluoré 9(ll)-déliydro-compOS6 S En général, ce procédé est .le plus généralement
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applicable aux composés 3-éto--stéroïdes ayant 18 à 21 atomes dans la structure carbonée.
Les produits de la réaction peuvent être détectés par comparaison soignée des chromatogrammes sur papier des produits formés par la réac- tion suivant l'invention avec des composés stéroïdes connus.
Ce procédé a été essayé sur une grande variété de composés
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et on a constaté qu'il donne des résultats sûrs. Des '"données relatives à ce procédé peuvent être trouvées dansla littéra ture chimique.
Lors de l'exécution de la.présente invention diver ses espèces du genre Mycobacterium peuvent être utilisées pour assurer l'oxydation du hoyau stéroïde. Ces espèces sont. disponibles dans des collections de cultures publiques, telle, que l'Américain Type Culture Collection de Washington , D.C.
Parmi ces espèces, on peut citer les espèces connues, telles
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que Mycobacterium species 607. M,berolinense. Nï,I,actiçola M.thamnopheos. et l'espèce M.smegmatis ATCC 1pu. Sont parti- culièrement utilisables les organismes de l'espèce" u2, h dont une culture vivante a été déposée dans l'American Type Culture Collection de Washington, D.C., où le numéro ATCC 354 lui a été donné. Les diverses espèces de Mycobacterium varient considérablement par la vitesse et la facilité avec lesquelles la déshydrogénation est produite par les cellule des organismes eu par des produits formés pendant leur crois
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sauce.
On a constaté que certaines souches de !fil, phlei et
M.smegmatis sont particulièrement actives pour provoquer la réaction selon la présente invention. Les diverses mycobacté- ries varient quelque peu en ce qui concerne leurx exigences de milieux nutritifs. Par un minimum d'essais simples, il est cependant possible de déterminer la composition de milieux appropriés, ainsi que les conditions optima de service, tel- les que pH, degré d'aération, vitesse d'agitation, etc...
De manière similaire, les conditions optima pour la déshydro- génàtion d'un stéroïde particulier peuvent être trouvées.
Plusieurs procédés peuvent 8tre utilisés dans la déshydrogénation de composés stéroïdes suivant la présente invention. Dans le premier de ces procédés, des milieux nu- tritifs sont ensemencés à l'aide de cultures inclinées du
Mycobacterium choisi. Un tel milieu peut Consister, par ex - emple, en un mélange d'une base de bouillon nutritif bactério- logique standard avec un glycérol. Il a été constaté qu'un agent à activité superficielle neutre , tel qu'un dérivé polyoxyéthylénique d'un ester d'acide gras d'un alcool de sucre (par exemple, Tween 80), est utile lorsqu'il est ajou- té en proportion mineure au milieu. L'addition de l'amino a- cide asparagine est également utile. La culture des mycobacté- ries a été décrite avec beaucoup de détails dans de nombreu- ses publications.
Les solutions nutritives stériles ainsi en- semencées peuvent être amenées à croître dans des flacons à agiter pendant deux à trois jours, de maniàre à fournir un inoculum pour de plus grands récipients et, à leur tour, -les récipients plus grands, qui sont.aérés et agités, peuvent @tre utilisés pour l'inoculation de récipients de production grande échelle pour fermentation submergée. Le même milieu du type décrit plus haut peut être utilisé pour l'oxydation à grande échelle des stéroïdes suivant la présente invention.
Bien entendu, des modulions considérables pavent être
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apportées au milieu. En fanerai, ce milieu doit contenis un hydrate de carbone, une source d'azote organique;, des sels minéraux, et divers métaux en traces.
Comme on l'a signalé plus haut, plutôt que d'exécu- ter l'oxydation du composé stéroïde choisi en présence de tout le produit de fermentation, des cellules peuvent @tre séparées des cultures de croissance et cescultures peuvent être remises en suspension dans un Milieu qui a été désigné comme mélange de réaction enzymatique.
Un tel mélange de ré- action peut consister, par exemple, en une solution 0,01 molaire dans du fumurate de sodium ou un autre accepteur d'hydrogène et dans du sulfate de magnésium et 0,03 molaire dans du citrate de sodium. Il a. été constaté que la présence d'une certaine quantité de tri-phosphate d'adénosine, par exemple 0,125%, est également très utile. Des cellules lavées et centrifugées du Mycobacterium choisi peuvent être mises en suspension dans ce type de mélange réactionnel, qui est ajusté à un pH d'environ 6, par exemple avec de l'acide ci- trique.
Après addition du composé stéroïde, que l'on désire oxyder, le mélange peut être incubé à environ 37 C, et des échantillons peuvent être prélevés de temps en temps pour déterminer le point auquel la conversion maximum du stéroïde a eu lieu. En général, ceci se produit après envi- ron 1 à plusieurs jours. On a constaté que les cellules pro- venant d'environ 100 ce des cultures aérées et. agitées de mycobactéries peuvent être mises en suspension dans environ 20 cc d'un mélange réactionnel enzymatique, pour obtenir des résultats appropriés. Ces proportions peuvent subir des variations considérables. Le composé stéroïde peut être uti- lisé à raison d'environ 25 à environ 200 mgr par 100 ce du mélange réactionnel enzymatique.
Le composé sous forme solide estsimplement ajouté au milieu après ajustement du
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pH. Les flacons sont bouchés à l'aide de coton, de façon que leur contenu soit exposé à l'air pendant l'incubation. On . préfère utiliser un petit volume par rapport au volume du flacon, notamment 20 ce dans un flacon d'Erlenmeyer d'une capacité de 125 ce. Le mélange peut aussi être agité et aéré.
En général, au moins un accepteur d'hydrogène, un métal biva- lent en particulier le magnésium et un tampon sont nécessai- res dans le milieu.
Plutôt que de séparer les cellules de l'lycobacterium et -d'exécuter la réaction suivant l'invention dans un mélange réactionnel enzymatique, le composé stéroïde peut être ajou- té directement à une portion stérilisée de milieu nutritif, tel que décrit plus haut, et le milieu est alors ensemencé avec les mycobactéries choisies. Dans ce cas, on peut égale- ment utiliser sensiblement la même proportion du composé stéroïde choisi. Des échantillons du mélange aéré et agité peuvent être prélevés de temps en temps pour la détermination! de la conversion du composé stéroïde en produits oxydés.
Le mélange est maintenu à une température comprise entre
25 et 37 C ou plus élevée pendant la croissance des cellules et la conversion du stéroïde. En général, environ deux à sept jours environ sont nécessaires pour une production maximum des composés oxydés. En variante, la croissance des cellules peut être établie avant addition du stéroïde..
Un.troisième procédé,-qui convient également très bien pour l'oxydation des composés stéroïdes choisis, impli,. que l'utilisation d'enzymes oxydantes produites par les mycobactéries. Ces enzymes peuvent être préparées par pluseura procédés à partir des cellules des organismes choisis. Ces matières peuvent être libérées des cellules par plusieurs procédés différents. Parmi ces procédés, on peut citer celui consistant à broyer, en particulier, avec des matières abra.
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si va -'; belles que du verre en poudre ou du sable, qui sert à briser les parois des cellules et à libérer les matières es- sentielles* Un second procédé est l'autolyse. Les cellules peuvent être séparées du milieu, dans lequel elles croissent.
Ces cellules sont alors lavées et mises en suspension dans de l'eau. L'eau peut être couverte d'une mince couche de toluène de manière à empêcher la contamination. Le mélange est laissé au repos à une température d'environ 20 à environ
50 C. Les cellules se désintègrent en un ou plusieurs jours et'le résidu des cellules peut être séparé par filtration, par exemple sur un filtre Seitz ou sur un filtre bactérien de verre fritté. Un troisième procédé pour préparer des pro- duits d'élaboration exempts.de cellules des mycobactéries, destinés à être utilisés pour les réactions suivant la pré- sente invention, consiste à faire subir à la matière cellu- laire des congélations et décongélations rapides répétées.
Une autre méthode consiste à utiliser l'énergie ultrasonique pour briser les cellules. Un autre procédé' consiste à faire usage dans le même but d'un solvant miscible à l'eau et, en particulier, d'acétone . Lorsqu'elles sont placées dans un tel 'solvant, les cellules sont'brisées et un extrait des en- zymès désirées est obtenu.
Des enzymes de mycobactéries peu- vent être utilisées pour l'oxydation des composés stéroïdes- 3-céto-4-non saturés dans des milieux similaires à ceux utili- sés avec les cellules ayant subi unecroissance, c'est-à-di- re dans des milieux contenant un accepteur d'hydrogène tel que fumarate, un tampon et, dans certains cas, un métal bi- valent, tel que du magnésium, ainsi qu'une proportion mineu- re de triphosphate d'adéhosine. Les enzymes oxydantes exemp- tes de cellules de mycobactéries peuvent être utilisées dans les milieux décrits plus haut à une température d'environ 20 à 40 C. En général, l'oxydation des composés stéroïdes dési-
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rés est produite en une période allant de quelquesheures à plusieurs jours.
La durée et la température optima, de même que les autres conditions peuvent être déterminées par un minimum d'expérimentation. Des descriptions détaillées de milieux appropriés tant pour l'utilisation de cellules iso- lées remises en suspension que pour l'utilisation de produits d'élaboration exempts de cellules sont données dans les ou- vrages "Manometric Technique in Tissue Metabolism" par
W.W. Umbreit et autres, Burgess Publishing Company, Minnea- polis (1949) et "Respiratory Enzymes" par H. Lardy, Burgess
Publishing Company, Minneapolis (1949).
Le procédé le plus commode pour suivre la. progres- sion de la réaction d'oxydation est la chromatographie sur papier. D'autres procédés peuvent également être utilisés à cette fin, comme on l'a signalé plus haut. Dans le procédé de chromatographie sur papier, du papier filtre imprégné d'a- lumine est préparé en trempant de grandes feuilles de papier (des feuilles de papier filtre Whatman n 54 de 27 pouces x
22 1/2 pouces conviennent spécialement) dans une solution de sulfate d'aluminium (13 grammes /100 ce). Le papier est égoutté, exposé à une atmosphère d'ammoniac pendant 15 heures et les feuilles sont lavées, de manière continue, pendant
6 heures à l'aide d'eau de robinet.
Les feuilles sont alors égouttées, repassées à une température modérée de manière à présenter une surface plane et laissées à température ambi- ante pendant 24 heures avant leur utilisation. Divers systè- mes solvants sont utilisés pour le développement des chroma- togrammes sur papier. Ces systèmes ont été désignés comme suit :
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<tb> Système <SEP> I <SEP> Hexane
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Système <SEP> II <SEP> Hexane-éther <SEP> (19 <SEP> volumes <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> valu
<tb>
<tb>
<tb> me)
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<tb> Système <SEP> III <SEP> Hoxane-cther <SEP> (16 <SEP> volumes <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> volume)
<tb>
<tb> Système <SEP> IV <SEP> Ether.
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Des quantités correspondant à 5 microlitres de so- lutions contenant les stéroïdes sont placées sur le papier le long d'une ligne distante de trois centimètres d'un bord du papier et les tâches sont espacées de deux centimètres.
Le bord de chaque papier est réuni au bord opposé, de maniè- re à former des cylindres et chaque papier est placé dans un flacon en verre de dimensions appropriées. On expose les pa- piers aux vapeurs du système solvant pendant une heure à 4-8 C. Les flacons sont alors recouverts de couvercles trans- parents en matière plastique, qui sont scellés avec de la graisse de silicone sous un vide élevé, après qu'on ait pla- cé suffisamment de solvant dans le fond du flacon. Le solvant est entraîné dans le papier par capillarité et, passant, par les tâches où les stéroïdes ont été déposés, les divers com- posants de ces produits sont entraînés dans le papier à un degré plus ou moins grand selon la structure du composé in- dividuel.
Le développement des feuilles est exécuté dans une pièce froide à environ 4-8 C jusqu'à ce que le front de sol- vant atteigne un point situé à environ 8 centimètres du bord supérieur de la feuille de papier. Ceci prend généralement environ 4 à 5 heures. Les cylindres de papier sont alors en- levés et séchés à température ambiante.
Un autre système a été utilisé pour la comparaison deo divers produits stéroïdes. Il s'agit du système dénommé "Système V". Il consiste en benzène saturé d'eau. Avec ce stystème, on fait, toutefois, usage de feuilles de papier- filtre Whatman n 54 non traité, plutôt que des feuilles imprégnées d'alumine. Des cylindres sont préparés à l'aide de feuilles de 8" x 18 " du papier en question. Avant de chromatographier les produits, l'atmosphère des flacons est
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saturée d'eau au moyen de vapeur. Le benzène sature a@eau est versé dans le fond des flacons et le'couvercle de ceux-ci . est scellé. Le développement est admis à s'opérer à températu. re ambiante jusqu'à ce que le front de solvant soit arrivé au voisinage du bord supérieur du paper, ce qui prend trois à quatre heures.
Le papier est alors retiré des flacons et séché à température ambiante. Les procédés de chromatographie sur papier de Zaffaroni et de Bush, décrits dans la littératu- re, peuvent également être utilisés dans le cas actuel.
Divers procédés.peuvent être utilisés pour détecter les divers stéroïdes sur les chromatogrammes. Le premier de ces procédés n'implique aucune réaction chimique avec les stéroïdes séparés et peut être utilisé avant l'application de l'un ou l'autre des autres procédés. Dans ce premier pro- cédé, les feuilles sont examinées avec un dispositif d'ex- ploration fluorescent, tel que décrit par Haines et autres,
Fédération Proceedins, Volume 9, p.180 (1950). Les stéroïde, ayant une structure cétonique Ó, ss-non saturée et certains stéroïdes diéniques apparaissent sous forme de taches foncée. lorsqu'on les voit à travers l'écran phosphorescent. Ces ta- ches peuvent être entourées d'une ligne au crayon sur les différentes feuilles,, de manière à établir leur position.
Des échantillons standard connus des stéroïdes peuvent être exa- minés côte à côte avec la matière préparée conformément à l'invention. De cette manière, il est possiblede distinguer les stéroïdes oxydés nouvellement produits. Un second procédé pour localiser les composés stéroïdes sur les feuilles de papier consiste à traiter celles-ci avec une atmosphère de chlore pendant 20 minutes, puis à arroser ou pulvériser les feuilles avec une solution de 380 grammes de trichlorure d'antimoine dans¯¯ 100 ce d'anhydride acétique. La solution est préparée journellement, de manière à être fraîche.
Les
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feuilles arrosée, sont chauffées à 90-100 C jusqu'à être sèch et sont immédiatement examinées eu .chambre noire avec une lampe solaire, en utilisant un filtre Corning n 9863. 'Les taches formées sur le papier- peuvent être indiquées -au crayon et la' position relative par rapport à-des échantillons connus des divers stéroïdes peut être alors -établie.
Un autre procédé pour localiser certains des pro- duits stéroïdes consiste à faire usage du réactif décrit par
Burton et' autres, J. Biol. Chem. Volume. lise, p. 763 (1951).,, qui implique la pulvérisation du papier avec une solution de chlorure de triphényltétrazolium dans de l'hydroxyde de potassium alcoolique. Les stéroïdes ayant une chaîne latérale 21-hydroxy-20-cétonique apparaissent sous forme de taches rouges après séchage du papier. Les taches sont immédiatement soulignées au crayon, étant donné que le contraste avec le fond disparaît rapidement.
En réalisant des chromatogrammes sur papier avec un groupe de composés stéroïdes oxydés connue il a été possible de distinguer le produits formés par le procédé suivant l'invention et de démontrer l'oxydation qui a lieu pendant la réaction. Les divers systèmes solvants ont été utilisés pour établir avec certitude la nature des matiez res qui ont été formées. Lors de l'exécution du travail de chromatographie sur papier, une valeur connue comme Rf a été utilisée pour identifier la position des divers composés stéroides sur les chromatogrammes au papier.
La valeur Rf pouf un composé donné avec un système solvant spécifique est le rapport de la distance parcourue par le composé à partir de l'endroit où il a été appliqué sur la feuille de papier à la distance parcourue par le front du solvant dans des conditions exactement identiques. La valeur Rf variera évidemment avec différents types de composés, avec les différents systèmes solvants, selon les variations de tempén
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ture et selon les variations dans la nature du papier utili- sé. Toutefois, dans les mêmes conditions, le même composé donnera la même valeur Rf, ce 'qui permet d'identifier le compc sé particulier. Une table- standard de valeurs Rf peut être préparée en vue de son utilisation avec un système solvant déterminé donné dans une série spécifique de conditions.
Ces valeurs ont été indiquées dans une publication de Gilbert M. Shull et autres (Archives of Biochemistry and Biophysics) vol. 37, p. 186 (1952).
Les produits du nouveau procédé suivant l'invention peuvent être isolés de la solution aqueuse par extraction à l'aide de divers solvants'organiquesnon misciblesà l'eau.
Des hydrocarbures halogénés inférieurs, tels que le chloro- forme, conviennent particulièrement comme tels solvants. A- près extraction, le solvant peut être séparé par distilla- tion et le produit solide est alors isolé. La matière obtenue ¯ peut encore être purifiée par recristallisation dans des sol- vants organiques ou par chromatographie, par exemple sur des colonnes d'alumine ou sur d'autres matières absorbantes soli- des appropriées. L'utilisation d'une colonne gel de silice- éthanol avec un mélange de 98% à 2% en volume de chlorure de méthylène et d'éthanol (95%) comme agent de développement s'est révélée particulièrement avantageuse.
Des procédés pour la séparation de produits de cette nature ont été décrite antérieurement dans la littérature. Pour certains usages, les produits ne doivent pas être séparés, mais le 'mélange brut peut être utilisé comme tel. Dans certains cas, il s'est révélé avantageux d'acyler les produits bruts et de travail- ler avec les esters résultant qM sont quelque peu plus sta- bles.
Divers stéroides 3-céto-4-non saturés sont utilisa- bles comme matières de départ pour les réactions suivant l'in-
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vent ion. Parmi ces stéroides, on peut citer des composes bien connus tels que la testostérone-, la progestérone et le composé S de Reichstein. Les produits oxydés sont utilisable:. comme intermédiaires dans la synthèse d'autres composés uti- les.
Ainsi, les produits déshydrogénés, qui présentent une non-saturation dans la position 1,2, ainsi que le groupe
3-céto et la non-saturation en 4,5 originellement présente susceptibles ('dans la matière de départ, sont spécialement/'de subir la réaction d'aromatisation d'Inhoffen. Ceci donne lieu à la production d'un groupe de dérivés d'estrone. Dans le cas du produit de déshydrogénation du composé S, une scission de chaîne latérale avec production d'un groupe 17-céto peut ai- sément être obtenue par des moyens courants, par exemple par oxydation à l'aide d'acide chromique, et, lorsque le produit de cette réaction est aromatisé par la réaction d'Inhoffen, par exemple par chauffage à température élevée dans un sol- vant hydrocarboné,
le composé estronique très précieux est produit. L'introduction de fonctions oxygène dans les noyaux des stéroïdes qui ont été oxygénés a communiqué à ces molé- cules de nouveaux centres d'activité chimique et a fortement accru leur propension à subir d'autres réactions chimiques.
Des changements très souhaitables de solubilité sont égale- ment obtenus par l'introduction de groupes hydroxyle. En . plus de leur utilité mentionnée plus haut, nombre de composés produits par cette réaction sont extrêmement précieux à cause de leur grande activité biologique.
Ainsi, par traitement d'hydrocortisone avec des mycobactéries par le procédé selon' la présente invention il se forme de la prednisolone, qui présente une grande utilité et se caractérise par des avanta- ges importants vis-à-vis de l'hydrocortisone dans le traite- ment de l'arthrite rhumatoïde. Lorsqu'on traite de la corti- sone à l'aide de mycobactéries, on obtient le composé dénom-
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EMI18.1
mé "produisions, qui s'avère aussi.'l!: andamemt utile de l'ar- thrite rhumatoïde.
On a également .ooits.:Uaté'rque d'autres 3-céta -A 114--stéroïdes possèdenfune grande activit:'...QOOllIle (hormones adrénocorticales et sont utilisables pour lwn8nccype de thérapeutique que l'hydrocortizone. De nombreux stéroides naturels, de même que des stéroïdes aisément préparés à par- tir de stéroïdes naturels ont une structure 3-céto- 4, mais aucun cbmposé 3-céto- 1,4 n'est aisément disponible comme matière première.
Pour cette raison, le procédé sui- vant l'invention, grâce auquel il est possible de transformer
EMI18.2
un composé 3-cétô-/ ' ayant 18 à 21 atomes de carbone dans la structure carbonée en un composé 3-céta- 1,4- et ce en un seul stade par un procédé commercial à grande échelle -, présente une valeur considérable.
Les exemples suivants sont donnés à titre d'illus-
EMI18.3
tration et ne doivent être considérésmme limitant la por- tée de l'invention, étant donné que cette dernière peut fai- re l'objet de formes d'exécution apparamment très différen- tes, sans que l'on s'écarte de son esprit et de sa portée.
EXEMPLE I.-
Une culture de Mycobacterium smegmatis ATCC 12.051 sur un milieu d'agar solide a été inoculée dans une solution nutritive stérile ayant la composition suivante :
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<tb> Bouillon <SEP> nutritif <SEP> standard <SEP> solide <SEP> 8 <SEP> gril.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glycérol <SEP> 20 <SEP> cc/l.
<tb>
EMI18.5
Tween 80 0'2'cc/Z.
'Asparagine . 5 gr/le ,
EMI18.6
<tb> 5 <SEP> gr/l.
<tb>
EMI18.7
UU ¯# ae ce milieu inoculé a été placé dails deux flacons à agiter de Fernbach. Après 3 jours, oe5 gr d'hydro, cortisone a été ajoutée à chaque flacon. La. réaction a été poursuivie pendant 4 jours. Au bout de cette période, les contenus des flacons ont été combinés et extraits à trois re- '
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prises, chaque fois avec un volume équivalent de chloroforme.
Les extraits chloroformiques combines ont été concentrésjus- qu'à un volume d'environ 50 ce. Une petite quantité de char- bon activé (Nuchar) a été ajoutée et le mélange a été chauffé modérément et agité pendant quelques minutes. Le charbon a été séparé par filtration et le filtrat a été placé dans une colonne de chromatographie gel de silice-éthanol. La colonne a été développée, en utilisant un mélange de 97% en volume de chlorure d'éthylène et 3,j d'éthanol. On a recueilli des fractions de 50 cc. Les 37 premières fractions ne contenaient pas de stéroïdes. Dans les fractions 38 à 66, on a récupéré de l'hydrocortisone n'ayant pas réagi.
Les fractions 67 à 82 contenaient de l'hydrocortisone et de la delta-l-dé hydrohy- drocortisone. Les fractions 83 à 115 contenaient de la del- ta-1-déhydrohydrocortisone. Les fractions 116 à 269 ne con- tenaient pas de stéroïdes. Les fractions 270 à 332 conte- naient de la /\ -prégnène-11/3 , 17 Ó ,20 ss ,21-tétrol-3-one.
Les fractions 83 à 115 combinées ont été évaporées jusqu'à siccité au bain de vapeur. Le résidu a été dissous dans de l'acétate d'éthyle et traité avec une petite quantité de charbon activé. Le charbon a été séparé par filtration et le filtrat a été concentré jusqu'à un petit volume et réfrigéré. Les cristaux formés après réfrigération ont été redissous dans une quantité minimum d'acétone. Un volume équivalent d'hexane a ensuite été ajouté, après.,quoi.on a ajou té du cyclohexane jusqu'à trouble naissant. Par refroidisse- ment supplémentaire, il s'est formé des cristausx blancs.
Ceux-ci' ont été identifiés comme étant constitués par de la del ta-l-déhydrohydrocortisone, qui peut également être dési- @gnée comme prednisolone@ 1,4-prégnadiène-11ss, 17Ó, 21-triol- 3,20-dione. Les cristaux avaient un point de fusion de 196 - 198 C, une rotation spécifique de [Ó ]25D +108,2 dans
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éthanol et \ } HZSU4 260, 2S0, 310, 358 mlu .
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El#ÙlPLE TT. ¯
On a procédé comme dans l'exemple I, si ce n'est que de la cortisone a été utilisée à la place d'hydrocorti-
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sone..Le produit, à savoir la. L1 l -déhydrooortisone, arli peut également être désigné comme prednisone ou 1,4¯prégnadièna- 17 4 ,21-dlol-3,u,20., . été isolé d'une manière Di- milaire.
EXEMPLE III.-
Dans un récipient en verre Pyrex d'une capa.cité de
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4 litres équipé de manière à permettre une fermentati.on aérée en immersion, on a introduit 2 litres du milieu de Turfitt.
Le milieu aqueux a été stérilisé et ensuite inoculé avec
EMI20.5
100 ce d'une culture de aCS2b&S.Ui..ag 92CC 12.051, développée dans un flacon à agiter sur un bouillon nutritif, Après 3 jours, 0,25 gr d'hydrocortisone a été ajouté. Le mé- lange a été agitë ou aéré avec de l'air stérile. 4 jours
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après ltaddition du stéroïde, J l'entièreté du mélange a été extraite avec approximativement 2 litres de chloroforme. La chromatographie aévélé la présence de G1¯déhy.drocortisone dans le produit.
EXEMPLE IV...
On a procédé comme dans l'exemple III, si ce n'est
EMI20.7
qu'on a uti1:i.sé de la cOltis0l1e. au'lieu dthydroco!'tisone- D'une manière identique, 011 fi. préparé de la 1--'déh y drocorti- sone.
EMI20.8
EXEJliIPLE y.
Dans un récipient en verre Pyrex d'u.ne capacité de 4 litres équipé de manière à permettre une f'ermel1ta.tiol1 aérée en immersion, on a introduit 2 litres de milieu de Turfitt.
Le milieu aqueux a été stérilisé et ensuite inoculé avec 100
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cc d'uns culture-de -2#"L'egm ATCG'12 o déH Ve10ppé dans un flacon d agiter sur du bouillon nutritif.
-21-
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fcroi? *##>-'# "" #### .L4<:<"!!y"'y composé F ;> ( j.ub Lu mëlaa.c . "#;-: Ofiitrt *ft aéré avec d L'aii- #>-'- Quatre jours a,.r. L'.ddit..ou t u ...-roMo, to-u. 1" u'I.... a extrait avec environ 2 lltreo de ohloroJW,. i.'ex- tra:fe chlorofonuique été t1'8.1i:é aVQC du charbon ud filtre réduit s un petit volume par poration et .>!Uo<- sur lUI) colonne cbroinatoffraphique gel de silicc#ah&i.ol. L'A colonne a été élude avec des mf.lanre8 de chlorure- d'.îthyit- ne et .12:"tllallol ',!5/: eu -oM.i.noant avec de- "-.Jc ccr.- tenêhrt environ 2,.. en volume -.-.hal et ou fi.:.,-.-...u.-.-î,ti ra.
EMI21.2
duellemeub le pourcentage '.b t-' 'flc3ilt?:., compose '¯..ï;lu:!:7!lf; l p ^y'2"f! YlcY.lR2fl.:f; '...L..f ; y :=i ; ......-.,.-u8.... -..)",')","'.L'¯,u.:: été ré0uné't"é de cotte faon.
Les constantes physiaus de co 3 9t?1f'::fu composé Dont leo .suivantes : : '.1'. ;;7-;2':J;>(;, .... 7 jf + lU3,)'" (dicxa), ##|2x 4 2Ô4) ' 4'5 m
EMI21.3
Le.. pointes d'absorption les plus saillantes dans, l'infra-
EMI21.4
rou:e (1: dans boules de :;T3." 5t: présentent à éyj''3 5,7&, 6 03 et y,o5 microns. C? compose possède une grande activité comme hormone Ci: ÉiIUCUl'f.l.f:élLE.
EîÇJI'jLïi Yin Un a opère rcvrnr:lr' dans 1. t (J:.'3mple V, sauf que l'on a utilisa cornue stéroïde de .(.c...L t..,F,,-it'.2"0: cortisone. Le compost- L 1) h - prégtiadione-14 4 ,1't d 21-triol-3, 11,20- triona a été récupéré par une j;-éth:;de ;.:?.111:1. r.F"',.i.'C'. Go compose possède une grande activité bi.'.:.1."r;ioue comifte hormone adreno- -
EMI21.5
cortical!')-
EMI21.6
hll-. IV) J'; \f 1...', <, Du !i:z((.b<1Gt"1'.i :'1,1 fJm('i,W:;:tlê: n été 'tr'<:1.tU:i.ff:'r'\ ï,'.'G.iI;I: culture inclinée s >r (-';"e:f.fr;,, r.±nePS'J sept Plaçons ''f3x'.llE),ti't. ';..'.;1' tenant chacun 1000 CI; (:\ la;...;.;:1 suivant ;
<Desc/Clms Page number 22>
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<tb> Extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> (Difco) <SEP> 5,0 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
Dextrose <SEP> hydratée <SEP> 30,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> NaNO <SEP> 2,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 1,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KC1 <SEP> 0,5
<tb>
EMI22.2
MgSO4<7H2O 0,5 FeS0.7H2Q 0,5
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<tb> pH <SEP> 6,7 <SEP> de
<tb>
<tb> H20 <SEP> de <SEP> ville <SEP> q. <SEP> s. <SEP> ad <SEP> 1000cc.
<tb>
Après cinq jours d'agitation à 28 , 250 mgr de 14Ó -hydroxy-composé S ont été introduits dans chaque flacon. Après trois jours supplémentaires, les fermentations ont été arrêtées et le bouillon a été extrait avec du chlorofor- me. Les extraits combinés ont été chromatographiés sur du gel de silice, en sorte qu'on a obtenu 33 mg d'un produit
EMI22.4
cristallin blanc, P.F..2Z7¯21$Q? L d ¯7 + 132 {CHC. ) lax composé été 3 ideii, À H2S l. 289, 315, 468, 520, mu . Le composé a été iden.. tifié comme étant de la 6 ' -prégnadiè1,1e-1l. o(, 17 d , 21- triol-3,20-dione.
EXEMPLE VIII.- \!ne série d'essais a été effectiée en opérant de la manière décrite dans les exemples donnés plus haut et en uti- lisant les espèces suivantes de Mycobacteria -(toutes ces espèces existant dans des collections de cultures publiques).
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<tb>
M. <SEP> phlei <SEP> M. <SEP> thamnopheos
<tb>
<tb> M. <SEP> ranae <SEP> M. <SEP> lacticola
<tb>
<tb>
<tb> M. <SEP> butyricum <SEP> M. <SEP> friedmanni
<tb>
<tb>
<tb> M. <SEP> berolinense <SEP> M. <SEP> tuberculosia
<tb>
Les stéroïdes suivants ont été utilisés :
<Desc/Clms Page number 23>
9 o(-fluoro-composé F
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4,6-androstadièendione 11/ , 17 z( -hydroxyprog,--gt6rone à 14-dehydro-composé S 19-nortestostérone 16-déhydroprogestérone
EMI23.2
11-. batoproge st êrone a 9 ( 11 j-dehydr. o-6ompoaé S 140(, l'," o(.:
époxido .- Composé 3 14 o(, 15 c(-époxido - Composé F
Dans chaque cas, les produits ont été récupérés du mélange réactionnel par extraction et ont été 'soumis à une identification par chromatographie sur papier. On a constaté qu'il s'était produit dans chaque cas une déshydrogénation en position 1.
EXEMPLE IX. -
On a traité de la delta-1-déhydrohydrocortisone avec un équivalent moléculaire d'un anhydride acétiquejdans de la pyridine à température ambiante. Après 18 heures, le mélange a été versé dans de l'eau froide' et extrait à deux reprises. avec du chloroforme. Les extraits chloroformiques ont été combinés et. lavé successivement avec de l'acide salfurique 1 N, avec une solution aqueuse saturée de bicarbo. nate de sodium et avec de l'eau. La solution chloroformique a ensuite été filtrée sur un filtre'de terre d diatomées et évaporée jusqu'à siccité. Le résidu a été trituré avec de l'éther et la matière résiduelle non dissoute a été séchée.
Le produit séché a été identifié comme étant le 21-acétate de delta-l-déhydrocortisone. De façon identique) le 21-acétate
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de delta-1-dehydrocortisone et des composés 14-hydroxylës correspondants" a" été préparé.
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EXEMPLE X. - hydro 0,5 gramme de delta l-déhydrocortisone a été ajou- "té à 1 gr d'acide formique anhydre dans 15 ce de benzène et le mélange a été agité pendant deux heures à température am- biante. Il a ensuite été refroidi et versé dans de l'eau froi- de. La couche benzénique a été séparée, séchée sur sulfate . de magnésium anhydre et évaporée jusqu'à siccité. Le résidu a été purifié par recristallisation et srest révélé être du
21-formiate de delta 1-déhydrohydrocortisone . D'une manière similaire, le 21-formiate de delta-1-déhydrocortisone et des composés 14-hydroxylés correspondants a été préparé.
EXEMPLE XI.-
On a ajouté 7 millimoles de chlorure de propionyle à une solution de 5 millimoles de delta 1-dehydrohydrocorti- sone dissoute dans 5 ce de pyridine. Lsolution a été agitée et refroidie dans de la glace jusqu'à fin de dégagement de chaleur. Le mélange a alors été laissé au repos jusqu'au len- demain à température ambiante. Il a été ensuite versé dans
50 ce d'acide sulfurique 3 N glacé. Le mélange a été extrait à deux reprises avec des portions de 50 ce de chloroforme. Le. extraits chloroformiques combinés ont été lavés avec de l'a- cide sulfurique 1 N, avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium-et avec de, l'eau. La solution .chlore- ,formique a ensuite été filtrée sur un filtre de terre à dia- tomées et évaporée jusqu'à siccité.
Lè résidu a été trituré avec de l'éther et la matière résiduelle non dissoute a été séchée. Le produit séché a été identifié comme étant du 21- propionate de delta 1-déhydrohydrocortisone.
Par des réactions similaires, en utilisant le chlo- rure d'acide ou l'anhydride de l'acide, on a préparé des es- ters de deltadérohydrocortisone et d'une grande varié-. té d'acides organiques carboxylés. Parmi ces esters, on peut
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citer, par exemple, ceux des acides butyrique, valérique, caproique, heptoique, caprylique, nonylique et caprique. Ce* acides comportaient à la fois des chaînes carbonées droites et ramifiées. Ces acides peuvent également être non saturés.
Dans tous les cas, la réaction était analogue à celle'décri- te plus haut. Par oe procédé, on a préparé aisément les es- ters de delta 1-déhydrohydrocortisone et d'acides monocarboxy. liques contenant seulement de l'hydrogène, de l'oxygène et du carbone, la teneur en carbone étant comprise entre 2 et
10 'atomes inclusivement. Des résultats 'identiques ont été obtenus en utilisant de la delta 1-déhydrocortispne et les composés 14-hydroxylés correspondants.
EXEMPLE XII.-
6,6 millimoles de chlorure d'ortho-toluyle ont été ajoutéesjà une solution de 5,5 minimales de delta 1-déhydro- hydrocortisone dissoute dans 5 ce de pyridine.La solution a été agitée et refroidie dans de la glace jusqu'à fin de dé- gagement de chaleur. Le mélange a alors été laissé au repos pendant 20 heures à 25 C. Il a été ensuite versé dans 50 ce d'acide sulfurique 3 N glacé. Le mélange a été extrait à deux reprises avec deax fractions de 50 oc de chloroforme.
Les extraits combines ont été lavés avec de l'acide sulfurique In, avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de so- dium et ensuite avec de l'eau- La solution chloroformique a alors été filtrée sur un filtre de terre à diatomées et éva.. porée jusqu'à siccité. Le résidu a été trituré avec de l'é- ther et la matière résiduellenon dissoute a été, séchée. Le produit séché à ensuite été purifié par recristallisation dans de l'alcool isopropylique.
Ce produit a- été identifié comme étant de l'ortho-. toluate de delta 1-déhydrohydrocortisone.
Par des procédés analogues, en utilisant le chloru- re d'acide, correspondant dans chaque cas, on a également
<Desc/Clms Page number 26>
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préparé le benzoate, le 1 .c.tty.cycZstzca;trrzf c:,xrtsaf.,a¯etE.i Le cyclohexane carboxylase et le ili-l!léthylcyclopX'opan8 r.:zrhrmyJ.r:- te de delta l-déhydrohydroc<xrci.sotxe. Ces estera cycliques, en particulier ceux formés au. départ d acides, dans l(squ1.:1 l'atome de carbone adjacent au groupe carboxyllqu<: est uu élément d'un noyau hydrocarboné comportant 3 à @ atomes @e carbone, sont particulièrement précieux et présentent dec a-
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vantages par rapport à l'alcool libre, en ce sens ou'Lis unt, une activité thérapeutique prolongée.
EXEMPLE XIII.-
EMI26.3
Une solution de 3 grammes de delta l-dchydrohydro-- cortisone 'dans 12 cc de pyridine a été traitée avec 1,2 gr d'anhydride phtalique. Le mélange a été laissé au repos à température ambiante pendant 18 heures et a ensuite été ver- sé dans 150 cc d'acide sulfurique 2N glacé. Pendant l'ad@i- tion à l'acide sulfurique, le mélange a été agité rapidement.
Il s'est séparé ainsi un produit solide blanc, qui a été iso- lé par filtration de la solution aqueuse. Ce produit a été lavé de manière répétée avec des petites portions d'eau,puis avec une solution de méthanol dans de l'eau. Le produit a finalement été séché sous vide et purifié par recristallisa- tion dans l'éthanol. L'analyse a révélé qu'il s'agissait de
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l'ester acide dénommé hémiphtalate de delta 1-dhyd.rohydro- cortisone. Une solution de 3 gr de delta 1-déiiydroliydrocorti- sone dans 15 ce de quinoléine a été traitée ave.c 1 gr d'anhy- dride succinique. Après agitation pendant une nuit -à tempé- rature ambiante, le mélange a été versé, en agitant, dans 200 ce d'acide sulfurique 2N glacé.
Le précipité a été filtre lavé de manière répétée à l'eau et séché sous vide. Il a été ensuite recristallisé dans l'alcool. L'analyse a révélé
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qu'il s'agissait d'hémisuccinatede delta 1-déhydrohydrocor- tisone. Des résultats identiques ont été obtenus avec la del-
<Desc/Clms Page number 27>
ta 1-déhydrocortisone et les composés 14-hydroxylés corres- pondants.
EXEMPLE XIV.- 1,5 gr de succinate de delta 1-déhydrohydrocortiso. ne ont été dissous dans 15 ce d'eau contenant une quantité équimoléculaire da bicarbonate de sodium. Le mélange a été -agité et modérément chauffé, puis placé sous vide pendant une courte période, pour séparer l'anhydride carbonique. La solu- tion du sel sodique a été congelée et séchée sous vide à partir de l'état congelé. Le produit obtenu , à savoir le sel sodique de succinate de delta 1-déhydrohydrocortisone, était très soluble dans l'eau et convenait pour être utilisé smus forme d'une solution aqueuse à injecter. Ceci constitue un avantage qu'il n'est pas possible d'obtenir avec l'alcool libre ou avec des esters ordinaires.
Une solution saline peut être utilisée pour former une solution isotonique, si on le désire, de même que l'on peut aussi employer à cette fin du glucose. Des résultats identiques ont été obtenus avec de la delta 1-déhydrocortisone et avec les composés 14-hydroxylés correspondants.
EXEMPLE XV.-
Comme indiqué plus haut, les composés suivant la présente invention peuvent être administrés seuls ou en com- binaison avec d'autres matières compatbles. Le présent exempt ainsi que les exemples suivants illustrent certaines de ces compositions thérapeutiques, dans lesquelles la delta 1-déhy- drohydrocortisone ou la delta 1-déhydrocortisone est l'in- grédient actif principal*
Voici une composition typique d'une tablette conve.. nant pour être administrée par la voie buccale ;
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<tb> Delta <SEP> 1-déhydrohydrocortisone <SEP> 20
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> calcique <SEP> (dibasique), <SEP> 150
<tb>
<tb> Lactose <SEP> 60
<tb>
<tb> Amidon <SEP> de <SEP> pommes <SEP> de <SEP> terre <SEP> ' <SEP> 35 <SEP> ' <SEP>
<tb>
<tb> Stéarate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 5
<tb>
<tb> Trisilicate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 30
<tb>
Des compositions similaires peuvent être également
EMI28.2
utilisées avec de la delta .-déhydrooortisone au lieu de del-., ta 1-déhydrohydrocortisone ou avec les composés 14-hydroxyléa. correspondants.
EXEMPLE XVI.-
A cause de leur activité anti-inflammatoire, les composés suivant la présente invention conviennent pour le t, cernent d'un grand nombre de maladies de la peau. Pour ce type de traitement , un onguent topique est souvent emploi Une composition typique d'un tel onguent est la suivante
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<tb> mg. <SEP> -
<tb>
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> delta <SEP> 1-déhydrohydrocortisone <SEP> 25
<tb>
EMI28.4
Sulfate laurylique de sodium U.S.P* 10
EMI28.5
<tb> Propylèné <SEP> glycol <SEP> U.S.P. <SEP> 115
<tb>
EMI28.6
Alcool stëarylique 80 Alcool cétylique (N.F.) 70 Cholestérol U. S. '.. '' .5 ' Vaseline blanche U.S,P. ' * 190 Huile minérale UÈS.P. 50 '-
EMI28.7
<tb> Eau <SEP> 400.
<tb>
<tb>
Méthyl <SEP> paraban <SEP> 1,0
<tb>
<tb> Propyl <SEP> paraben <SEP> . <SEP> 0,02
<tb>
Des compositions similaires peuvent également êtr@ utilisées avec de¯¯la delta 1-déhydrocortisone au lieu de de! ta 1-déhydrohydrocortisone ou avec les composés hydroxylés correspondants.
<Desc/Clms Page number 29>
EXEMPLE XVII.- Voici une composition typique à base d'acétate de
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delta 1-déhydrohydrooortlsono, utilisée pour les injections intraarticulaires.
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<tb> gr
<tb>
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> delta <SEP> 1-déhydrohydrocortisone <SEP> 25
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> U.S.P. <SEP> 9
<tb>
<tb>
<tb> Carboxyméthyl <SEP> cellulose <SEP> sodique <SEP> 5
<tb>
EMI29.3
Met ho ce 1 15 1 Tween $0. U, S. P. 1,9
EMI29.4
<tb> Méthyl <SEP> paraben <SEP> 1,9
<tb>
<tb> Propyl <SEP> paraben <SEP> 1,9
<tb> Eau <SEP> q.s.ad <SEP> 1000 <SEP> cc
<tb>
Des compositions similaires peuvent également être utilisées avec de la delta 1-déhydrocortisone au lieu de la delta 1-déhydrohydrocortisone ou avec les composés 14... hydroxylés correspondants.
EXEMPLE XVIII.-
A cause de leur activité anti-inflammatoire, les composés suivant la présente invention conviennent pour le traitement d'une grande variété de maladies des yeux. Pour un tel type de traitement, ,on emploie souvent une suspension ophtalmique.Voici ure composition typique d'une telle suspen. sion :
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<tb> gr. <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> delta <SEP> 1-déhydrohydrocortisone <SEP> 25,00..
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Carboxyméthylcellulose <SEP> sodique <SEP> 27,75
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pyrrolidone <SEP> polyvinylique <SEP> 3@00
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Alcool <SEP> benzylique <SEP> U.S.P. <SEP> 9,00
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Polysorbate <SEP> U.S.P. <SEP> 0,46
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> 951,25
<tb>
EMI29.6
Des"compositions similaires peuvent également 8tp
<Desc/Clms Page number 30>
EMI30.1
utilisées avec de la delta 7-.cfi;hydrocort,isotre au lieu de la. delta 1-dc:hydroiydrocartisone au avec les composa 14-h/<lrox/. l@s correspondants.
REVENDICATIONS.-
1... Procédé selon le brevet principal n 538.327
EMI30.2
pour la préparation d'un composé 3-co,t-o-A 1,4-stéroide par contact d'un composé 3-céto- Astéroïde avec l'activité oxydante d'un organisme du genre ycobacterium. caractérisé . en.ce que la matière stérolde de départ est un composé 3-cé- to-@ 4 -stéroïde autre que les composés décrits spécifique- ment dans le brevet précité.