CH341820A - Procédé de préparation de 3-céto-stéroïdes du groupe du prégnane - Google Patents

Description

  Procédé de     préparation    de     3-céto-stéroïdes    du groupe du     prégnane       L'invention a pour objet un procédé de prépara  tion de     3-céto-stéroïdes    du groupe du     prégnane,     comportant deux doubles liaisons en positions 1(2)  et 4(5) et substitués par une fonction oxygénée dans  au moins l'une des positions 11, 17a, 20 et 21 ;

    parmi ces composés, dont certains sont utiles en  thérapeutique, figurent notamment la 1-     déhydro-          cortisone    (1,4 -     prégnadiène    -17a,21-     diol    -     3,11,20-          trione),    le     1-déhydrocortisol        (1;4-prégnadiène-l1(3,          17a,21-triol-3,20-dione),    leurs     9a-halo-dérivés    et  esters, ainsi que d'autres composés, pouvant être  ultérieurement convertis en les composés susmention  nés, et éventuellement eux-mêmes doués d'activité  thérapeutique.  



  Le procédé selon l'invention est caractérisé en  ce que l'on soumet un dérivé du     prégnane    compor  tant au moins une double liaison en positions 5(6),  une fonction alcool ou ester en position 3 et une  fonction oxygénée au moins dans l'une des positions  11, 17a, 20 et 21, à l'action d'enzymes d'une cul  ture d'un     microorganisme    déshydrogénant, aptes à  former une double liaison en position 1(2), à trans  poser la double liaison de la position 5(6) à la posi  tion 4(5),à oxyder ladite fonction alcool en fonction  cétone, le cas échéant après avoir hydrolysé ladite  fonction ester, sans dégradation du squelette carboné  du     prégnane.     



  Les     enzymes    de cultures de microorganismes  déshydrogénants utilisés dans le procédé ont la pro  priété spécifique d'introduire une double liaison entre  les atomes de carbone 1,2, de transposer en position  4(5) la double liaison présente en position 5(6), et  d'oxyder le groupe alcoolique en position 3, respec  tivement d'hydrolyser le groupe ester en position 3  et d'oxyder le groupe alcoolique résultant, le tout    sans dégradation simultanée du squelette carboné du       prégnane,    comme par exemple la scission de la     chaîne     carbonée latérale en position 17 ou l'ouverture du  noyau D.

   Ces enzymes sont aussi capables dans  certains cas d'hydrolyser des groupes esters ou d'oxy  der des. groupes     alcooliques    dans d'autres positions.  



  Les principaux produits finals dudit procédé sont  représentés en     annexe    par les formules I     (1-déhydro-          cortisone    et ses     21-esters),    II     (1-déhidrocortisol    et  ses     21-esters),    III     (9a-halogéno-1-déhydrocortisones     et leurs     21-esters)    et IV     (9a-halog6no-1-déhydro-          cortisols    et leurs     21-esters),    toutes ces     formules    étant  combinées dans la formule composite V,

   par la for  mule VI qui représente le     11-épi-1-déhydrocortisol     et ses     21-esters,    c'est-à-dire la     1,4-prégnadiène-lla,          17a,21-triol-3,20-dione    et ses     21-esters,    ces derniers  composés pouvant être ultérieurement     transformés    en       1-déhydrocortisone    (I).  



       Les    composés non saturés de départ peuvent  avoir, en plus de la double liaison 5(6), une double  liaison 9(11) et une double     liaison    l6(17).  



  Les microorganismes déshydrogénants opèrent le  mieux sur des substrats.     (c'est-à-dire    le composé sté  roïde à     modifier)    qui contiennent un groupe hy  droxyle qui est relativement stable vis-à-vis de  l'organisme, c'est-à-dire qui n'est pas rapidement  oxydé en oxygène     cétonique,    ou un ester d'un tel  groupe hydroxyle qui est hydrolysé par la culture  du microorganisme.  



  On peut estérifier après coup certains des compo  sés finals des formules II à V. Ces esters se sont  avérés être d'activité plus durable et ainsi     il    faut  une administration et particulièrement une injection  moins fréquente.      Un groupe     9a-halogéno    peut     exister    dans un  composé de départ     11-céto    ou     11(3-hydroxy,    ou on  peut l'introduire par divers procédés     chimiques    dans  des composés     finals    dans lesquels un groupe hy  droxyle 11a ou     11(3    est présent, obtenant dans  chaque cas un composé     9a-halogéno-11(3-hydroxy,

       qui peut être oxydé en composé     9a-halogéno-11-          cétonique.     



  Par des essais cliniques, on a trouvé que les  composés     1-déhydrocortisone,        1-déhydroeortisol        et     leurs 21- esters ont une action physiologique extra  ordinairement améliorée par rapport aux composés       correspondants    une seule fois non saturés (cortisone,  hydrocortisone et leurs     21-esters    respectivement).       Ainsi,    ils présentent plusieurs fois le pouvoir des  hormones correspondantes connues, telles que corti  sone et     hydrocortisone,    dans le traitement de l'ar  thrite rhumatoïde.

   En outre, les réactions secon  daires     indésirables    des hormones     connues    se mani  festent seulement à un degré moindre dans l'emploi  des nouveaux composés ; l'intensité de ces réactions  secondaires est encore réduite davantage par le fait  que l'on peut employer des doses beaucoup plus  basses des nouveaux composés par comparaison aux  composés connus correspondants une seule fois non  saturés. Tant les doses     initiales    que les doses d'en  tretien dans le traitement de     l'arthrite    rhumatoïde  peuvent être fortement réduites par l'emploi des nou  veaux composés, comparativement aux doses requises  avec la cortisone et l'hydrocortisone.

   Même avec les  doses réduites, les composés nouveaux ne nécessitent  pas l'emploi simultané de codéine ou autre analgé  sique pour soulager la douleur, alors que ces anal  gésiques s'employaient fréquemment conjointement  avec la     cortisone    et le composé F de Kendall (hydro  cortisone).  



  On administre de préférence les diènes     théra-          peutiquement    actifs résultant du procédé de la pré  sente invention par voie buccale sous la     forme    de  tablettes contenant une dose journalière complète,  par exemple 50 mg ou un sous-multiple de cette  dose, c'est-à-dire 25 ou 20 mg, ou même 10 mg,  en mélange avec un     support    pharmaceutique     solide     contenant un ou plusieurs des composants usuels tels  que:     amidon,    sucre, gommes, argiles, etc.

   Cependant,  on peut également les administrer par injection intra  veineuse et intramusculaire, en solution ou en sus  pension dans un véhicule liquide non toxique appro  prié<B>;</B> ou bien on peut les administrer à l'état solide  par implantation sous-cutanée, ou sous la forme de  suppositoires dissous ou en suspension dans un  véhicule gras ou cireux fondant approximativement  à la température du corps. Ces composés, de même  que leurs dérivés     9a-halogénés,    peuvent également  être administrés localement sous la forme d'un on  guent ou crème, en solution dans une base d'onguent  ou de crème de composition connue.  



  On va     maintenant    expliquer de     manière    détaillée  le nouveau procédé d'introduction d'une double liai-    son     Ai    à l'aide d'une culture d'un microorganisme  déshydrogénant.  



  On peut réaliser cette réaction de manière effi  cace et peu coûteuse en mettant incuber ou     fermenter     le stéroïde de     départ    dans un milieu de culture  contenant un microorganisme déshydrogénant qui ne  dégrade pas ou ne scinde pas en même temps  le squelette carboné du     prégnane.    Des     microorga-          nismes    appropriés de ce genre     appartiennent    à la  famille des     Corynebactriacene,    parmi laquelle l'es  pèce     Corynebacterium        simplex        (American    Type Cul  ture Collection 6946)

   et     Corynebacterium        hoagii     (A. T. C. C. 7005) ont donné des résultats très  satisfaisants. Le premier de ceux-ci est une bactérie  du sol, tandis que le second se rencontre dans la  gorge de l'homme (dans laquelle apparemment il ne  produit pas un état pathologique) et parfois comme  un contaminant de cultures exposées à l'atmosphère,  bien que son habitat réel ou original ne soit pas  connu.  



  Les composés de     départ    peuvent avoir des grou  pes hydroxyle,     céto,    halogène et ester dans diverses  positions du noyau ou de la chaîne latérale ; ainsi  les groupes hydroxyles peuvent occuper, outre la po  sition 3, une ou plusieurs des positions 11, 17, 20  et 21 ; les groupes cétoniques peuvent     occuper    l'une  ou l'autre des positions 11 et 20, tandis que l'halo  gène, par exemple du     fluor    ou du brome, peut être  attaché au carbone 9 ou en d'autres points du noyau  ou de la chaîne latérale.

   La présence d'un groupe  hydroxyle libre semble promouvoir la transformation       chimique.    Des groupes esters très divers, et de pré  férence les esters d'acides employés habituellement  dans la synthèse de stéroïdes et dans la préparation  des hormones stéroïdes à usage thérapeutique, parti  culièrement d'acides     alcanoïques    inférieurs tels que  l'acétate, peuvent être situés en une ou plusieurs des  positions 3, 11, 17, 20 et 21.

   Le caractère spécifique  de l'ester n'est pas déterminant dans le présent pro  cédé, et on peut employer d'autres esters, tant       d'acides    organiques que d'acides minéraux, par exem  ple des     cyclopentyl-    et     cyclohexyl-acétates,        propio-          nates    et butyrates, de même que des phosphates,       polyphosphates    et     sulfates    ;

   ce qui est uniquement  nécessaire, c'est que ces esters ne soient pas toxiques  envers le     microorganisme.    Si on le désire, des pro  duits finals     hydroxylés    peuvent être convertis en leurs  esters correspondants par des     procédés        connus,    par  exemple en leurs esters     alcanoïques    inférieurs et plus  particulièrement leurs esters acétiques.  



  Les groupes hydroxyles en positions 3 et 11 peu  vent être les     épimères    a ou     (3.     



  Le groupe ester,     particulièrement    en position 21,  peut être dérivé d'un acide qui agit de manière à  prolonger la durée de l'activité des     composés    théra  peutiques.  



  Par l'emploi d'un microorganisme déshydrogé  nant conformément à l'invention, on peut     convertir     par exemple le     5-prégnène-3(3,20-diol    en     1,4-prégna-          diène-3,20-dione,    le     3,21-diacétate    de 5-prégnène-           3(3,17a,21-triol-20-one    en     1,4-prégnadiène-17a,21-          diol-3,20-dione    et en     21-acétate    de     1,4-prégnadiène-          17a,21-diol-3,20-dione,    la     5-prégnène-3,17a,20,

  21-          tétrol-11-one    et ses esters 3 et/ou 21 en     1,4-prégna-          diène-17a,21-diol-3,11,20-trione    et ses     21-esters,    et  le     5-prégnène-3,11 ,17(x,20,21-pentol    et ses esters 3  et/ou 21 en     1,4-prégnadiène-lla,17a,21-triol-3,20-          dione    et son     21-ester.     



  On peut encore partir de la     5-prégnène-3,11(3,          17a,21-tétrol-20-one    et de la     5-prégnène-3,17a,21-          triol-11,20-dione    et de leurs     3-acétates    ou     3,21-di-          acétates,    pour produire les composés finals     3-céto-          diéniques,    le groupe     3-ester    étant hydrolysé et le  groupe     3-hydroxyle    oxydé alors en oxygène céto  nique.

   Les groupes esters dans les positions 11 et 17  ne sont généralement pas hydrolysés, du moins dans  une mesure significative, tandis qu'un groupe ester  en position 21 peut ou non être hydrolysé, suivant  les conditions de réaction. Ainsi, lorsque le composé  de     départ    est un     3,21-diester,    le produit de réaction  peut être un composé     3-céto-21-ester,    ou un composé       3-céto-21-hydroxy.    En même temps que le     3-hy-          droxyle,    un     20-hydroxyle    fréquemment sera oxydé  en un groupe cétonique.

   On verra ainsi que les orga  nismes déshydrogénants employés dans la présente  invention sont sélectifs en ce qui     concerne    le stade  d'oxydation, celui-ci étant limité pratiquement com  plètement aux positions 3 et 20, tandis que l'hydro  lyse     peut    être limitée aux groupes 3 esters.  



  Le procédé est applicable également au traite  ment des     épimères        11a-hydroxy    des composés de  départ     11(3-hydroxy    mentionnés plus haut, par exem  ple la     5-pré,nène-3,11        a,17a,21-tétrol-20-one,    le     5-          prégnène-3,11a,17a,20,21-pentol    et leurs mono- et  polyesters, par exemple les     3-acétates,        3-21-diacétates     et     3,17a,21-triacétates,    ces composés de     départ     fournissant la     1,4-prégnadiène-lla,17a,21-triol-3,

  20-          dione    ou un ester de ce composé.  



  Les     11-épimères    du     1,4-diène    du composé F       (1-déhydrocortisol)    et de ses esters peuvent être  convertis en le     1,4-diène    de     cortisone    et ses esters  par oxydation du groupe     11a-hydroxyle    de manière  connue, par exemple avec la quantité théorique  d'acide chromique, avec ou sans     pyridine    ou acide  acétique, à la température ordinaire ou en dessous  de celle-ci (50 à     15,,    C), de préférence après estéri  fication de l'hydroxyle 21 si celui-ci est libre.

   Les  composés de     départ        lla-hydroxylés    sont préparés de  manière relativement aisée avec un rendement élevé,  chose bien connue dans ce domaine, et ils constituent  par conséquent des composés de départ avantageux  pour la préparation de la     1-déhydrocortison.e    et du       1-déhydrocortisol.     



  En vue d'obtenir la croissance souhaitée du  microorganisme de déshydrogénation, par exemple  le     Corynebacterium        simplex    et C.     hoagii,    on peut  procéder comme suit: on prépare un     milieu    nutritif  approprié contenant un glucide, de l'azote organique,  des coenzymes et des sels minéraux. Il est possible  d'omettre l'emploi de glucide sans arrêter complète-    ment la croissance de l'organisme. Après culture du  microorganisme dans le milieu nutritif, on peut récol  ter la masse cellulaire en essorant le     bouillon    nutritif,  en décantant le liquide surnageant et en mettant en  suspension la masse cellulaire dans une solution  saline à 0,85     m/0,    stérile.

   Un volume approprié de la  suspension de cellules est alors     ensemencé    dans un       milieu    nutritif. Le milieu nutritif employé peut être  un extrait de levure, un     hydrolysat    de caséine, une  liqueur de macération de maïs, un extrait aqueux de  farine de soya, un     hydrolysat    de     lactalbumine,    des  extraits solubles de poissons, etc.  



  Les extraits solubles de poissons peuvent s'obtenir  dans le commerce sous la forme d'un extrait de  hareng, de     menhaden,    et de mélange divers de     ceux-          ci,    qui ont été soumis. à une hydrolyse enzymatique.  On peut ajouter cette matière directement au bouillon  de culture pour fournir la matière nutritive: Lors  qu'on dispose d'extraits solubles de poissons (teneur  en     solides    de 50     11/o)    et que ceux-ci n'ont pas été  soumis à une hydrolyse enzymatique, on doit diluer  de tels extraits avec de l'eau et les traiter à la vapeur  pendant environ dix minutes à 900 C, puis les     filtrer.     



  Le traitement de     déshydrogénation    peut être  effectué comme suit  Le stéroïde sous la forme solide ou en solution  ou en suspension dans de l'éthanol, de l'acétone ou  autre solvant quelconque miscible à l'eau qui est non  toxique envers l'organisme, est ajouté au micro  organisme cultivé dans le milieu de culture dans  des conditions stériles. On agite alors cette culture,  on l'aère, ou bien on l'aère et l'agite simultanément,  en     vue    d'accélérer la croissance du microorganisme  et la conversion biochimique du stéroïde. On. peut  ajouter le stéroïde au milieu de culture et l'inoculer  alors avec le     microorganisme,    ou bien on peut ajouter  au stéroïde le microorganisme cultivé en     milieu    de  culture.

   Dans certains cas, suivant les conditions du  milieu de réaction, il peut être     souhaitable    d'obtenir  une croissance optimum du microorganisme avant  addition du stéroïde. On peut encore utiliser pour  la mise en     oeuvre    du procédé des préparations d'en  zymes obtenues de manière connue à partir de cul  tures des microorganismes.  



  Des sels minéraux sont souhaitables pour main  tenir le pH dans le milieu de réaction entre 6,8 et 7,2.  Cependant, on peut omettre l'emploi de sels minéraux  pour tamponner le mélange de réaction. L'omission  de sels minéraux cause l'élévation du pH depuis une  valeur initiale de 6,8 jusqu'à     environ    7,7-8. Ceci  permet toutefois encore la formation des produits  stéroïdes finals recherchés. La température optimum  pour la croissance du microorganisme est de 370 C,  mais les températures peuvent varier entre 250 et       37o    C, et même entre     20o    et 400 C. La durée de  réaction peut varier depuis un temps aussi petit que  trois heures jusqu'à un temps aussi     grand    que  quarante-huit heures.

   La durée qui sera employée  dépendra du stéroïde à transformer. On peut em  ployer     toua    solvant miscible à l'eau qui est non      toxique pour l'organisme, en vue de dissoudre ou  de mettre en suspension le     stéroïde.    On préfère  l'emploi     d'éthanol    ou d'acétone en quantités telles  que la concentration finale de ces     solvants    dans le       mélange        de        réaction        ne        dépasse        pas    7     %        environ,     et ces solvants peuvent exister seulement à l'état de  traces;

       par    suite de l'évaporation, la     concentration     finale du solvant organique peut même être prati  quement nulle.  



  Après l'achèvement du processus de     déshydro-          génation,    qui est accompagné d'une hydrolyse     totale     ou partielle lorsqu'on     part    d'un mono- ou polyester,  on peut récupérer les produits de réaction à partir  du mélange par extraction avec un solvant approprié  insoluble dans l'eau, par filtration, par adsorption  sur un adsorbant approprié ou par tous autres pro  cédés quelconques utilisés communément dans ce  domaine. Pour l'extraction, les hydrocarbures infé  rieurs chlorés, les cétones et les alcools sont utiles.

    Ces composés comprennent le chloroforme, le chlo  rure de méthylène, le     trichloréthane,    le     dichlorure     d'éthylène, le     butanol,    la     diéthylcétone    et autres  composés. On préfère employer l'extraction     comme     procédé d'isolation des stéroïdes déshydrogénés.  Après extraction, on peut isoler ces produits par  concentration des extraits jusqu'à un faible volume  ou jusqu'à siccité.

   On peut alors purifier les résidus  par de simples recristallisations dans un solvant ou  mélange solvant convenable, par exemple     l'acétone,     le     chlorure    de méthylène, l'éthanol,     l'acétone-hexane,     le     chlorure    de     méthylène-hexane,    etc., ce qui fournit  le diène souhaité avec un excellent rendement et  dans un état de pureté très élevé.  



  Un autre exemple de     microorganisme    déshydro  génant utilisable est le     Bacillus        sphaericus        (American     Type Culture Collection 7055). Les stéroïdes     1,4-          diéniques    résultants sont très stables dans une culture  de ce microorganisme, et il n'est pas     nécessaire    de  prendre des précautions spéciales en vue de prévenir  la destruction du produit final recherché. La durée  d'incubation peut être aussi élevée que     quatre-vingt-          seize    heures et les rendements sont très élevés, fré  quemment presque quantitatifs.  



  Tout comme avec les autres microorganismes  déshydrogénants cités plus haut, on peut employer  à la place d'une culture en croissance<I>de B.</I>     sphaeri-          cus   <I>les</I>     enzymes    séparées de cette culture.  



  En général, le<I>B.</I>     sphaericus        effectuera    la même  transformation chimique dans les     composés        pré-          gnènes    cités plus haut que les organismes     Coryne-          bacterium,    sauf qu'il n'hydrolyse pas aussi facilement,  et dans certains cas pas du tout, un groupe     3-ester,     et c'est pourquoi on recommande qu'avec cet orga  nisme on utilise des     3-hydroxy-prégnènes,    et non  les     3-esters    correspondants.  



  Le mode de culture du<I>B.</I>     sphaericus    et le pro  cédé d'inoculation du milieu nutritif, la nature du  milieu nutritif, la manière de mettre en contact le  substrat stéroïde avec la culture en croissance du       microorganisme    peuvent     être    les mêmes qu'avec les    espèces     Corynebacterium,    sauf que,     comme    déjà  indiqué, la période d'incubation peut être plus longue,  étant en général d'environ vingt-quatre à     quatre-          vingt-seize    heures. Dans tous les cas, la culture  contenant le stéroïde est soumise à une agitation et  à une aération.  



  En plus des milieux nutritifs révélés plus haut,  on peut aussi employer de la       protopeptone      (mar  que de fabrique d'un produit nutritif à base de pep  tones). La croissance du microorganisme est de pré  férence amorcée à un pH d'environ 6,6 à 7,2 ; la  température optimum pour la croissance du B.       sphaericus    est d'environ     28,1    C, mais la température  peut varier entre     191,    et     32,1    C.  



  On récupère de préférence les produits de la  réaction biochimique par extraction avec les solvants  et suivant le procédé décrit précédemment, mais on  peut utiliser tout autre procédé approprié connu des  chimistes.  



       Evidemment,    à la place des microorganismes  déshydrogénants décrits plus haut, on peut employer  leur mutants qui ont une activité déshydrogénante  similaire     sans    exercer une action destructrice sur le  squelette carboné du     prégnane.     



  On va maintenant décrire des synthèses plus  compliquées, comportant, outre le procédé selon  l'invention, des opérations complémentaires, portant,  soit sur la préparation des matières de départ, soit  sur les produits finals du procédé.    <I>A. Préparation de</I>     1-déhydrocortisoue     <I>et de</I>     1-déhydrocortisol     <I>à partir de</I>     5-pi-égnène-3,17a.,diol-20-one       On peut faire suivre ou précéder la     déshydro-          génation    du noyau A, au moyen des     microorganismes     déshydrogénants décrits plus haut, par d'autres  conversions     microbiologiques,    qui sont largement  connues individuellement,

   et par une phase opéra  toire d'oxydation chimique (lorsqu'il est question de  produire de la     1-déhydrocortisone),    pour     convertir     la     5-prégnène-3,17a-diol-20-one    en les dérivés<B>AL</B>       déhydro    beaucoup plus précieux de     cortisone    et  hydrocortisone, ces opérations étant susceptibles  d'être employées dans des séquences     différentes,    sauf  que la phase opératoire d'oxydation chimique est  consécutive au processus biologique qui introduit un  groupe hydroxyle en position 11.

   Ces processus       microbiologiques    supplémentaires sont en principe  de deux types ; ce sont les suivants    (1) introduction d'un groupe hydroxyle 11a ou       11(i    par l'action d'un microorganisme     11-hy-          droxylant    du type     Rhizopus        nigricans    et     Cur-          vularia        lunata   <I>;

  </I> et  (2) introduction d'un groupe     21-hydroxyle    par  l'action d'un microorganisme appartenant au  genre     Ophiobolus.         Si on envisage la production de     1-déhydro-          cortisone,    alors, en un point quelconque après l'intro  duction du groupe     11-hydroxyle,    le composé inter  médiaire est oxydé, par exemple avec de l'acide  chromique dans de la     pyridine,    de préférence à la  température ordinaire ou en dessous de celle-ci, pour       convertir    le     11-hydroxyle    en oxygène cétonique.

   Au  cas toutefois où le     11-hydroxyle    a la     configuration        (3,     et qu'on désire obtenir le     1-déhydro-dérivé    d'hydro  cortisone, on omet la phase opératoire d'oxydation.    <I>B.

   Conversion de la</I>     S-prégnène-3,21-diol-20-one     <I>et de ses esters</I>  <I>en</I>     1-déhydrocortisone   <I>et</I>     1-déhydrocortisol       Les produits finals préférés, à savoir la     1-dé-          hydrocortisone    et le     1-déhydrocortisol,    de même que  leurs esters, peuvent s'obtenir également à     partir    de       5-prégnène-3,21-diol-20-one,    et ses esters., par une  combinaison du procédé selon l'invention,

   avec la  phase opératoire supplémentaire d'introduction du       17a-hydroxyle    au moyen d'un microorganisme     17a-          hydroxylant,    par exemple un choisi dans, le genre       Trichothecium,    le processus comprenant également  la phase opératoire supplémentaire d'oxydation d'un  11 a- ou d'un     11(3-hydroxyle,    introduit au cours du  processus, lorsque la     1-déhydrocortisone    est le pro  duit final souhaité.  



  On peut exécuter les diverses phases opératoires  dans une     séquence    quelconque, sauf que la phase  opératoire d'oxydation     chimique    vient à la suite du  processus     microbiologique    qui introduit le     11-hy-          droxyle.     



  Les transformations     microbiologiques    supplémen  taires sont des deux types suivants  (1) introduction d'un groupe 11a- ou     11(3-hy-          droxyle    par l'action d'un organisme du type       Rhizopus        nigricans    ou     Curvularia        lunata   <I>;</I> et  (2) introduction d'un groupe     17a-hydroxyle    par  l'action d'une culture d'un microorganisme       hydroxylant    choisi dans le genre     Trichothe-          cium.     



  Si l'on doit produire la     1-déhydrocortisone    ou  ses esters, alors en un point quelconque après l'in  troduction du groupe     11-hydroxyle,    on oxyde le  composé intermédiaire, de     préférence    sous la forme  de son     21-ester,    par exemple avec du     trioxyde    de  chrome à des températures basses, pour     convertir     le     11-hydroxyle    en oxygène cétonique.

   Au cas toute  fois où le     11-hydroxyle    a la configuration     (3,    et que  l'on désire obtenir le     Al-dérivé        d'hydrocortisone,    on  omet la phase opératoire d'oxydation.  



  Le groupe     17a-hydroxyle    est introduit par un  organisme     hydroxylant    choisi dans le genre     Tricho-          thecium,    et de préférence le<I>T.</I>     roseum,    de la     manière     et avec l'appareillage décrits par     Meystre    et     colt.,          Helvetica        Chim.    Acta,<I>37,</I> 1548 (1954).    <I>C.

   Conversion de la</I>     16-déhydroprégnènolone     <I>et ses esters en</I>     1-déhydrocortisone     <I>et</I>     1-déhydrocortisol       Il est également possible de convertir la     16-          déhydroprégnènolone    et ses esters, relativement peu  coûteux, en     1-déhydrocortisol    et     1-déhydrocortisone     et leurs esters, tels que leurs esters     alcanoïques    infé  rieurs, par un nombre relativement petit d'opérations       chimiques    et biochimiques supplémentaires au cours  desquelles on obtient des composés     intermédiaires     nouveaux.

   Ces opérations sont  a) introduction du     17a-hydroxyle    via le     16,17-          époxyde.     



  Cette introduction peut se faire par pas  sage par le     16-17-époxyde,    et par le composé       16-iodo-17(x-hydroxylé.    On enlève ensuite  l'atome d'iode par réduction.  



  b) introduction d'un groupe     21-hydroxyle    par  l'action d'un microorganisme appartenant au  genre     Ophiobolus,    par exemple O.     herbotri-          chus.     



  c) introduction d'un groupe 11a- ou     11[3-hy-          droxyle    par     l'action    d'un microorganisme  approprié,     comme    décrit plus haut.  



  L'exécution du procédé selon l'invention doit,  dans ce cas, suivre l'addition d'un groupe hydroxyle  en une ou plusieurs des positions 11, 17a et 21, sans  quoi les rendements     seraient    médiocres.  



  Au cas où le composé de départ possède un  groupe ester en position 21, ce groupe ester sera  hydrolysé, l'hydrolyse du groupe ester C21 étant gé  néralement favorisée par un pH de 6,8 à 7,1 et une  température d'environ 260 à 290 C.  



  Lorsque le produit final doit être de la     1-dé-          hydrocortisone,    on préfère introduire un groupe     11a-          hydroxyle    plutôt qu'un groupe     11(3-hydroxyle,    étant  donné que le groupe     lla-hydroxyle    peut, en général,  être introduit plus facilement et peut alors par la  suite être oxydé en un groupe     11-cétonique.    Au cas  où on introduit un     11(3-hydroxyle    dans la molécule  du stéroïde,

   on peut conserver ce groupe à l'état  inchangé dans le produit final pour donner le     Al-dé-          hydro-d6rivé        d'hydrocortisone,    qui est de même très  actif.  



  Les composés obtenus à la suite des opérations  décrites ci-dessus, comprenant le     procédé    selon l'in  vention, ont les structures indiquées dans les formules  VII à IX.  Dans ces formules, X est     H2,    O, ou
EMI0005.0099  
    (a ou     (3),    tandis que R représente H, OH ou     0-acyle,     l'une au moins des, positions 11 et 21 comportant  une fonction oxygénée.  



  Dans chaque cas, le reste acyle en position 21  est celui d'un acide     carboxylique    organique, mais  de préférence d'un acide     alcanoïque        inférieur    tel  que les acides     formique,    acétique,     propionique,    bu-           tyrique,        valérique    ou     caproïque,    ou d'autres acides  tels que des acides     alcanoïques    substitués et aroma  tiques comme les acides     cyclohexyl-acétique,        cyclo-          pentyl-propionique    et benzoïque.  



       Les    exemples qui suivent illustrent des modes  de réalisation du procédé selon l'invention.    <I>Exemple 1</I>  <I>Réaction du</I>     5-prégnène-3(3,20-diol       100 cm- de concentré d'extrait de levure à 0,1 %  comprenant 9,0. ce de 0,2M     KH2P04    et 9,0     cm3     de 0,2M     Na2HP04    sont traités en autoclave dans  une fiole     Erlenmeyer    de 300     cm3.    Après     autoclavage     de quinze minutes à 6,795 kg (120  C), on laisse  refroidir la fiole à la température ordinaire.

   On  ensemence alors la fiole avec une suspension de       Corynebacterium        simplex.    On met incuber la fiole  ensemencée et on l'agite (table à secousses) pendant       vingt-quatre    heures à     28o    C.  



  On stérilise une seconde fiole     Erlenmeyer    de  300     cm3,    contenant 150 mg de     5-prégnène-3(3,20-          diol,    dans un autoclave pendant quinze minutes à  6,795 kg (120  C). A cette fiole, on ajoute alors  5,0     em3    d'acétone ou d'éthanol pour dissoudre le  stéroïde. On transfère     aseptiquement    la culture de       Corynebacterium        simplex    âgée de 24 heures, dans  la fiole contenant le stéroïde et on agite le mélange  de réaction (sur table à secousses) pendant     trente-six     heures à 280 C. A la fin de la période de trans  formation, le pH est de 7,1-7,2.  



  On extrait alors à fond le mélange de réaction  avec du chloroforme, on réunit les extraits     chloro-          formiques    et on concentre la solution résultante en  un résidu (0,20 g). On fait     cristalliser    l'extrait brut  à     partir    d'éther sous la forme de prismes allongés  fondant à     135-138o    C. Deux     cristallisations    à     partir     de chlorure de     méthylène-hexane    fournissent 0,06 g  de     1,4-prégnadiène-3,20-dione,    P.

   F. 152-153C,  spectre infrarouge indique la présence d'un système  
EMI0006.0038  
       E24.,-,    15 000     (C2H50H).    Le       Ol@4-diène-3-one,    un autre carbonyle (noyau à 6 élé  ments ou chaîne latérale) et l'absence complète d'hy  droxyle.

      <I>Exemple 2</I>       1,4-prégnadiène-17a,21-diol-3,20-dione       100 ce de bouillon de culture, contenant une  concentration en extrait de levure de 0,1 %, 9,0     cm3     de 0,2M     KH2P04    et 9,0     cm3    de 0,2M     Na2HP04,    sont  ensemencés avec 1     cm3    d'un bouillon de culture de  24 heures de     Corynebacterium        simplex.    On met in  cuber le     flacon    à 280 C pendant     vingt-quatre    heures.  



  On inocule avec la culture de 24 heures 150 mg  de     3,21-diacétate    de     5-prégnène-3(3,17a,21-triol-20-          one    stérile dans 50<I>ce</I> d'acétone, dans une fiole       Erlenmeyer    de 300     cm3,    et on met incuber pendant  quarante-huit heures à une température de     281,    à       30o    C.

      On extrait les produits avec du chloroforme, on  concentre les extraits     chloroformiques    jusqu'à faible  volume et on chromatographie sur     Florisil.    L'ordre       d'élution    est en premier lieu la matière de départ  n'ayant pas réagi (75 mg), ensuite le     21-acétate    du  composé S (15 mg) et finalement la     1,4-prégnadiène-          17a,21-d'iol-3,20-dione    (30 mg). On identifie tous  les produits par comparaison de leur spectre infra  rouge avec ceux d'échantillons authentiques.  



  Le composé obtenu peut être     acétylé    comme suit  A une solution de 0,25 g de     1,4-prégnadiène-          17a,21-diol-3,20-dione    dans 2<I>ce</I> de     pyridine,    on  ajoute 1     cm3    d'anhydride acétique. On laisse reposer  le mélange réactionnel à la température ordinaire  pendant une nuit, puis on le dilue avec de la glace  et de l'eau. On filtre le précipité résultant et on le  recristallise à partir de chlorure de     méthylène-hexane,     obtenant 0,20 g de     21-acétate    de     1,4-prégnadiène-          17a,21-diol-3,20-dione,    P. F. 226,5-228 C.  



  Il est possible de préparer de même d'autres  esters des composés     diéniques    par réaction avec  l'anhydride de l'acide ou avec son chlorure de ma  nière connue. Par exemple les formiates,     propionates,     butyrates et     valérates,    de même que les esters d'autres  acides non toxiques tels que les     benzoates,    et aussi  les esters neutres et acides d'acides     polybasiques    tels  que les acides succinique, maléique, malique, citrique,       tartrique,    phtalique et     hexahydrophtalique    peuvent  être ainsi obtenus.

   Dans le cas des esters acides, on  peut former des sels métalliques de la manière cou  rante par réaction avec l'hydroxyde, le carbonate ou  bicarbonate du métal, par exemple des métaux alca  lins et alcalino-terreux.    <I>Exemple 3 :</I>  <I>Conversion</I>  <I>de la</I>     5-prégnène-3,17a,21-triol-11,20-dione     <I>en</I>     1-déhydrocortisone       On met incuber le     Bacillus        sphaericus    (A. T. C. C.

    7055) sur un     agar    nutritif     composé    d'extrait       Bacto-          beef      (marque de fabrique d'un extrait d'infusion  aqueuse de viande), 3g ;       Bacto-peptone      (marque  de fabrique d'un produit à base de peptones), 5 g ;  chlorure de sodium, 8 g ;     agar,    15 g ; eau de  conduite, 1 litre, pendant vingt-quatre heures à 28- C.  



  A 100 ce d'un bouillon nutritif stérile (composé  d'extrait       Bacto-beef         ,    3 g ;       Bacto-peptone     , 5 g ;  et complété à 1 litre avec de l'eau de conduite) dans  une fiole de 300     cm3,    on ajoute une cuillerée de la  culture incubée et on met incuber le milieu de culture  de nouveau pendant     vingt-quatre    heures à     28     C sur  une machine à secouer dans des conditions d'aéro  biose.

   On utilise le bouillon de culture ainsi obtenu  comme     inoculum    à 1  /o  Dans chacune des 10 fioles contenant<B>100</B>     cm@     de bouillon nutritif stérile, on ajoute 1 ce     d'ino-          culum.    On agite les fioles sur un appareil à agitation  rotatif faisant 240 tours/min., dans des     conditions     d'aérobiose pendant huit heures à 280 C.

   Après cette      période de croissance, on ajoute     aseptiquement    à  chaque fiole une solution de 25 mg de     5-prégnène-          3,17a,21-triol-11,20-dione    dans 0,5     cm3    de     méthanol;     on agite de nouveau et on met incuber pendant  vingt-quatre heures en plus. Le pH final est voisin  de 7,8. On combine le contenu des fioles, on extrait  au     chloroforme    et on traite de la manière     habituelle,     obtenant de la     1-déhydrocortisone.     



  Au lieu de la     5-prégnène-3,17a,21-triol-11,20-          dione,    on peut employer comme matière de     départ     la     5-prégnène-3,17a,20,21-tétrol-11-one    ou son     3-          acétate    ou autre ester non toxique envers le micro  organisme ou qui n'inhibe pas son enzyme.

      <I>Exemple 4:</I>  <I>Conversion</I>  <I>de la</I>     5-prégnène-3,11(1,17a,21-tétrol-20-one     <I>eh</I>     1-déhydrocortisol       A partir d'une solution de 0,5 g de       Basamin     Busch   (marque de fabrique d'un extrait hydro  soluble de levure     autolysée)    dans 1 litre d'eau de  conduite, on prélève 10 portions de 100 ce chacune,  on les     place    dans des fioles     Erlenmeyer    de 300     cm3     et on les stérilise par     autoclavage    de quinze minutes  sous une pression de vapeur d'eau de 6,795 kg       (120o    C).

   Après     autoclavage    et refroidissement du  bouillon, on introduit dans chaque fiole 1     cm3    d'une  suspension de     Corynebacterium        simplex.    On agite  alors les fioles sur une table à agitation faisant  220 tours par minute à 280 C pendant vingt-quatre  heures.  



  Dans chacune des 10 fioles     Erlenmeyer,    on  ajoute     aseptiquement    50 mg de     5-prégnène-3,    l l     (3,          17a,21-tétrol-20-one    en solution dans 0,8     cm3    de  méthanol absolu. On replace les fioles sur l'appareil  à agiter et on les met incuber pendant de nouveau  quatre à sept heures. Le pH à la fin de la période  d'agitation est de 7,2-7,6.  



  On combine le contenu de toutes les fioles et on  extrait l'ensemble avec un total de 3 litres de chloro  forme en trois portions égales. On     concentre    les  extraits combinés en un résidu de 490 mg. La cris  tallisation du résidu à partir d'acétone fournit la     1,4-          prégnadiène-ll(3,17a,21-triol-3,20-dione,    P. F. 238  240o C     (déc.),   
EMI0007.0038  
       (dioxane),        E243    14500  (méthanol).  



  Au lieu de la     5-prégnène-3,11(3,17a,21-tétrol-          20-one,    on peut employer comme matière de     départ     son     3-acétate    ou autre ester, le     5-prégnène-3,11(3,          17a,20,21-pentoi    ou son     3-acétate    ou autre ester.  Comme mentionné, le groupe     20-hydroxy    est oxydé  en groupe cétonique.

      <I>Exemple 5:</I>  <I>Conversion du</I>     5-prégnène-3p,20-diol     <I>en</I>     1,4-prégnadiène-3,20-dione       On prépare un milieu de croissance à     partir     de 30 g d'extraits solubles de poissons (traités  aux enzymes), 4,49 g de     KHZP04    et 8,83 g de         N%HP04.        7H20,    que l'on dilue à 1 litre avec de  l'eau de conduite (le pH de ce milieu est voisin  de 6,8). Dans chacune de 10 fioles de 300     cm3,    on  introduit 100     cm3    du milieu de     croissance    et on traite  en autoclave les fioles et leur contenu pendant quinze  minutes sous une pression de vapeur d'eau de  6,795 kg.

   On inocule chaque fiole avec 1     cm3    de  culture de     Bacillus        sphaericus    incubée     comme    dans  l'exemple 3, et on laisse     croitre    pendant douze heures.  A chaque fiole, on ajoute ensuite     aseptiquement    une  solution de 50 mg de     5-prégnène-3(3,20-diol    dans  1 ce de méthanol, puis on continue l'agitation et  l'incubation pendant vingt-quatre heures supplémen  taires.  



  On combine le contenu des fioles et on l'extrait  3 fois avec 2 litres de     chloroforme.    On évapore à  siccité les extraits     chloroformiques    réunis, et on  obtient un produit brut qui, après recristallisation  dans de l'éther, donne la     1,4-prégnadiène-3,2.0-dionc,     fondant à     152-153o    C.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation de 3-céto-stéroïdes du groupe du prégnane, comportant deux doubles liai sons en positions 1(2) et. 4(5) et substitués par une fonction oxygénée dans au moins l'une des positions 11, 17a, 20 et 2:

   1, caractérisé en ce que l'on soumet un dérivé du prégnane comportant au moins une double liaison en position 5(6), une fonction alcool ou ester en position 3 et une fonction oxygénée au moins dans l'une des positions 11, 17a, 20 et 21, à l'action d'enzymes d'une culture d'un microorganisme déshydrogénant, aptes à former une double liaison en position 1(2), à transposer la double liaison de la position 5(6) à la position 4(5),à oxyder ladite fonction alcool en fonction cétone, le cas échéant après avoir hydrolysé ladite fonction ester, sans dé gradation du squelette carboné du prégnane. SOUS-REVENDICATIONS 1.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le microorganisme fait partie du genre Coryne- bacterium. 2. Procédé selon la sous-revendication 1, carac térisé en ce que le microorganisme est le Coryne- bacterium simplex. 3. Procédé selon la sous-revendication 1, carac térisé en ce que le microorganisme est le Coryhe- bacterium hoagii. 4.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le microorganisme est le Bacillus sphaericus. 5. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action est un ester alcanoïque inférieur de la 5-prégnène- 3,17a,21-triol-11,20-dione, le stéroïde obtenu étant un ester alcanoïque inférieur de la 1,4-prégnadiène- 17a,21-diol-3,11,20-trione. 6.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action est un ester alcanoïque inférieur de la 5-prégnène- 3,17a,21-triol-11,20-dione, le stéroïde obtenu étant la 1,4-prégnadiène-17a,21-diol-3,11,20 trione. 7.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action est la 5-prégnène-3,17a,21-triol-11,20-dione, le sté roïde obtenu étant la 1,4-prégnadiène-17a,21-diol- 3,11,20-trione. 8. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action est la 5-prégnène-3,17a,20,21-tétrol-11-one, le sté roïde obtenu étant la 1,4-prégnadiène-17a,21-diol- 3,11,20-trione. 9.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action est un 3,21-diester alcanoïque inférieur de la 5-pré- gnène-3,17a,21-triol-11,20-dione, le stéroïde obtenu étant un 21-ester alcanoïque inférieur de la 1,4- prégnadiène-17a,21-diol-3,11,20-trione. 10.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action est un ester alcanoïque inférieur de la 5-prégnène- 3,11p,17a,21-tétrol-20-one, le stéroïde obtenu étant un ester alcanoïque inférieur de la 1,4-prégnadiène- l 1P,17a,21-triol-3,20-dione. 11.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action est un ester alcanoïque inférieur de la 5-prégnène- 3,llp,17a,21-tétrol-20-one, le stéroïde obtenu étant la 1,4-prégnadiène-llp,17a,21-triol-3,20-dione. 12.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action est le 5-prégnène-3,11(3,17a,20,21-pentol, le stéroïde obtenu étant la 1,4-prégnadiène-11(3,17a,21-triol- 3,20-dione. 13.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé soumis à ladite action est un 3,21 diester alcanoïque inférieur de la 5-prégnène-3,11(3, 17a,21-tétrol-20-one, le stéroïde obtenu étant un 21-ester alcanoïque inférieur de la 1,4-pr6gnadiène- 11. (3,17a,21-triol-3,20-dione. 14.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action est la 5-prégnène-3,11(3,17a,21-tétrol-20-one, le sté roïde obtenu étant la 1,4-prégnadiène-11p,17a,21- triol-3,20-dione. 15.

   Procédé selon la revendication, de prépara tion de stéroïdes de formule EMI0008.0061 dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un radical alcanoyle inférieur, de préférence acétyle, W est un atome d'hydrogène, de fluor, de chlore ou de brome et X signifie = O ou EMI0008.0064 , caractérisé en ce que le dérivé du prégnane soumis à ladite action présente la formule EMI0008.0066 dans laquelle R, W et X ont les mêmes significations. 16. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le produit de départ est traité dans une culture du microorganisme, la concentration dudit dérivé dans le milieu de culture étant comprise entre 0,5 et 1,5 g/1.