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@
La présente invention a pour objet un nouvel antibio- tique et son procédé de préparation par fermentation microbiolo- gique, concentration et extraction du milieu de culture et puri- fication des concentrats ou extraits ainsi obtenus. L'invention vise donc la préparation du nouvel antibiotique à l'état brut ou purifié; elle est également relative audit antibiotique, à ses sels ainsi qu'au microorganisme nouveau dont il est issu et aux conditions de fermentation dudit microorganisme.
L'antibiotique est obtenu pendant la culture, dans des conditions déterminées, d'un nouvel actinomycète du genre strepto
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myoes auquel on a donné le nom de "Streptomyces paucisporogenes'
Ce microorganisme se trouve, entre autres, dans la terre. On l'i- sole sous forme de culture pure conformément aux procédés cou- rants. Il a été enregistré dans les bureaux de la Société de:nan- deresse sous le n T 4915. Le "Streptomyces paucisporogenes" pousse difficilement sur les milieux de cultures solides habi- tuellement utilisés. Il fournit .des colonies composées de fila- ments dont la partie apicale, plus ou moins ramifiée, ne compor qu'exceptionnellement des chaînes de conidies.
Sur milieux organiques gélosés complexes, le "Strepto- myces paucisporogenes" est caractérisé microscopiquement par un mycélium aérien blanc jaunâtre; le feutrage du mycélium végéta- tif est épais, parfois craquelé: Il secrète parfois une faible quantité d'un pigment soluble brun-jaune. Son développement est particulièrement bon sur un milieu composé comme suit et ajusté à pH 7,5 : décoction dans un litre d'eau distilla de 200 g de graines de soja broyées, 20 g de glucose, 10 g de fécule de pom'. me de terre et 20 g de gélose.
Sur milieux chimiquement définis (Uzapeck, Conn...etc) la pousse est difficile; il y a toutefois solubilisation du mala- te de calcium.
Sur substrat naturel tel que la pomme de terre impré- gnée de tampon.à pH 7, le "Streptomyces paucisporogenes" se dé- veloppe rapidement sous forme d'un enduit épais, cérébroïde, oxa quelé. Le mycélium aérien est alors rare, blanc grisâtre à re- ±lets jaunes.
Si la culture en surface du "Streptomyces paucisporoge nes" est difficile, elle est par contre aisée en profondeur, plue spécialement dans les milieux à base de peptones et accompagna d'une sécrétion plus marquée du pigment soluble. Le lait est ra- pidement coagulé et peptonisé; par contre, la sécrétion de dias- tases gélatinolytiques est très faible..
Le tableau (I) montre les différences caractéristiques entre cet actinomycète nouveau et dtautres actinomycètes produc- teurs d'antibiotiques basiques.
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TABLEAU I
EMI3.1
<tb> mycélium <SEP> aérien
<tb> antibiotique <SEP> gélose <SEP> gélose <SEP> pomme <SEP> de <SEP> gélose <SEP> hyphes <SEP> lait <SEP> réduction <SEP> des
<tb> Actinomyces <SEP> sécrété <SEP> nutritive <SEP> Czapeck <SEP> terre <SEP> à <SEP> l'amidon <SEP> aériennes <SEP> nitrates
<tb> albogriseolus <SEP> complexe <SEP> blanc <SEP> deve- <SEP> hlanc <SEP> à <SEP> blanc <SEP> gris- <SEP> hydrolyse <SEP> vrilles <SEP> +
<tb> néomycine <SEP> nant <SEP> gris <SEP> gris <SEP> sâtre <SEP> à
<tb> cendré <SEP> ce <SEP> ndré <SEP> rose
<tb> fradiae <SEP> néomycine <SEP> rose <SEP> rose <SEP> co- <SEP> peu <SEP> a- <SEP> hydrolyse <SEP> pas <SEP> de
<tb> quille <SEP> bondant <SEP> vrilles
<tb> de <SEP> mer
<tb> roseoflavus <SEP> néomycine <SEP> blanc <SEP> à <SEP> blanc <SEP> à <SEP> néant <SEP> pousse <SEP> vrilles <SEP>
coagulation
<tb> rosé <SEP> jaune <SEP> abondante <SEP> peptonisa- <SEP> +
<tb> rosé <SEP> tion
<tb> 2103 <SEP> framycétine <SEP> rose <SEP> blanc <SEP> hydrolyse <SEP> vrilles <SEP> pas <SEP> de
<tb> violacé <SEP> :rayé <SEP> coagulation <SEP> +
<tb> griseus <SEP> streptomy- <SEP> gris <SEP> vert <SEP> gris <SEP> vert <SEP> blanc <SEP> forte <SEP> hy- <SEP> pas <SEP> de <SEP> coagulation
<tb> cine <SEP> drolyse <SEP> vrilles <SEP> peptonisation
<tb> bikiniensis <SEP> streptomy- <SEP> blanc <SEP> gris <SEP> beige <SEP> légère <SEP> pas <SEP> de <SEP> hydrolyse
<tb> @ <SEP> pâle <SEP> ocré <SEP> hydrolyse <SEP> vrilles <SEP> gradue'¯le
<tb> lavendulae <SEP> complexe <SEP> rose <SEP> rose <SEP> noir <SEP> hydrolyse <SEP> vrilles <SEP> pas <SEP> de
<tb> streptomi- <SEP> lavande <SEP> vineux <SEP> coagulation <SEP> +
<tb> cine
<tb> vonaceus <SEP> viomycine <SEP> gris <SEP> =
<SEP> hydrolyse <SEP> pas <SEP> de <SEP>
<tb> gris. <SEP> modérée <SEP> vrilles
<tb> paucisporo- <SEP> antibio- <SEP> blanc <SEP> néant, <SEP> ne <SEP> jaune <SEP> néant, <SEP> ne <SEP> par <SEP> de <SEP> coagulation <SEP>
<tb> genes <SEP> tique <SEP> 4915 <SEP> jaunâtre <SEP> pousse <SEP> pas <SEP> gris <SEP> pousse <SEP> pas <SEP> vrilles <SEP> peptonisation
<tb>
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Le% bouillons de culture du Streptomyces paucisporo- nes montrent une activité antibiotique qui augmente avec le pH de la gélose sur laquelle on effectue le test de contrôle d'activité.
Ceci permet de classer le nouvel antibiotique dans le groupe des antibiotiques basiques : streptomycine,streptothricine, néomycine, framycétine mais les indications fournies par la test de l'anti- biose croisée font ressortir des différences essentielles exis- tant entre le Streptomyces paucisporogenes et les microorganismes producteurs des antibiotiques précités (Tableau II).
TABLEAU II Sensibilité de divers streptomyces aux principaux antibiotiques
0 : non sensible + : moyennement sensible ¯ : très peu sensible ++ : très sensible.
S t r e p t o m y c e s
EMI4.1
<tb> Antibiotiques <SEP> paucispo- <SEP> griseus <SEP> lavandu- <SEP> fradiae <SEP> 2103
<tb>
<tb> rogenes <SEP> lae
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptomycine <SEP> ++ <SEP> 0 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Néomycine <SEP> ¯ <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Viomycine <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Framycétine <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Erythromycine <SEP> ++ <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Auréomycine <SEP> ¯ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Terramycine <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chloramphénicol <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nouvel <SEP> antibiotique
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> l'invention <SEP> 0 <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
La préparation du nouvel antibiotique s'effectue de pré- férence par culture immergée aérobie du Steeptomyces paucisporo- genes, dans des conditions de stérilité et dans l'appareillage habituellement utilisés pour la production des antibiotiques.
On peut, par exemple, opérer selon le principe de la culture dite "en étages" à partir dtune suspension aqueuse de la souche
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EMI5.1
T 4915 obtenue à la surface d'un milieu u," culture solide 4:1.o:,f. un inocule une série de fioles d'grlenmeyur contenait un r.:ilâ.cu approprié, les abandonne à l'incubation sur agitateur fIlif.;;.1'JiqU(: à une température de préférence voisine de 3Q C, récolta axepti- quemant le bouillon de culture, qui sert à ensemencer les fer.men- teurs industriels. La durée de la fermentation proprern.ent aite est comprise entre 48 et 150 heures, de préférence voisine de 70 heures.
L'aération des fermenteurs doit être réglée (lE; façon que 0,5 à 2 volumes d'air par volume de milieu traversent ledit milieu par minute; l'agitation doit permettre une réparti- tion uniforme de l'air insufflé au sein de la masse liquide.
Le milieu nutritif est composé de sources d'azote telles que le corn steep, les farines, les résidus de distillerie, les levures; de sources de carbone telles que les sucres, les dextri-
EMI5.2
nes, les amidons) et de sels minéraux divers servant d'a.-lent5tam- ponset indispensables à la croissance des cellules. On peut uti- liser des huiles pour empêcher la formation de mousses. Un milieu de culture convenant particulièrement bien à la production du nouvel antibiotique peut être, par exemple, composé comme suit : corn steep sec : 0,8%; farine de tourteaux de soja : 2,5; ; dex-
EMI5.3
trine : 1,3)1; glucose : 1); caroonate de calcium ,.au 94,2%.
L'extraction de l'antibiotique s'effectue sur résine échangeuse de cations. Le filtrat ae la culture est amené à pH
EMI5.4
de préférence voisin de 8 par audition d'acide et --iis en c.;zj::ct avec une résine échangeuse ae cations telle que, par exemple, l'amberlite IRC 50 sous sa forme sodique. Après lavage à l'eau de la résine, on procède à son élution par une solution aqueuse
EMI5.5
basique, par exemple une solution saturée do cxïcthrla7ï.na.
L'éluat est neutralisé, concentré sous vide et précipité par ad-
EMI5.6
jonction d'un solvant approprié dans lequel le Dj'incipe actif est insoluble, par exemple, le méthanol ou l'acétone.
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La purification de l'antibiotique peut être réalises par reprise dans un solvant approprié ou par l'intermédiaire de déri- vés définis d'où l'on repasse aisément au produit purifié. On peut, par exemple, traiter le sulfate brut du nouvel antibioti- que par l'aldéhyde salicylique en présence de carbonate de sodium isoler le dérivé salicylidène insoluble dans l'eau et le retrans- former en sulfate purifié par une hydrolyse appropriée. On peut également purifier le nouvel antibiotique par l'intermédiaire du sel cristallisé qu'il forme avec l'acide p-(p'-hydroxyphéhylazo) benzène sulfonique..
L'antibiotique-nouveau est actif in vitro sur de nombreux germes gram-positifs et gram-négatifs, peu ac- tif ou inactif sur pseudomonas aeruginosa ATCC 10 145, inactif sur candida albicans et divers saccharomyces. Son action sur mycobacterium tuberculosis est très nette. Le tableau III ci- après montre à la fois le spectre antibactérien de l'antibioti- que et les particularités qui le distinguent nettement des au- tres antibiotiques majeurs. Il a été établi en gélose par la mé- thode du gradient de Szybalski. Les valeurs rapportées sont ex- primées en y/cm3 de gélose nutritive.
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TABLEAU III
EMI7.1
llîoroorganisme 4915 Auréomy- Erythromy- Chloram- Framycé- Néomycine Strepto- Viomycine ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ cine cine phénicol tine mycine
EMI7.2
<tb> Bactéries
<tb> St. <SEP> aureus <SEP> Oxford <SEP> 0,3 <SEP> 0,21 <SEP> 0,50 <SEP> 2 <SEP> 0,16 <SEP> 0,21 <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> Atsc <SEP> 6633 <SEP> 0,15 <SEP> 0,20 <SEP> 6,80 <SEP> 10 <SEP> 0,30 <SEP> 0,10 <SEP> 0,20 <SEP> 70
<tb> B.subtilis <SEP> NRRL <SEP> B <SEP> 971 <SEP> 0,15 <SEP> 0,21 <SEP> 0,21 <SEP> 1,8 <SEP> 0,10 <SEP> 0,15 <SEP> 0,20 <SEP> 45
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> NRRL <SEP> B <SEP> 972 <SEP> 1,5 <SEP> 1,30 <SEP> 0,21 <SEP> 1 <SEP> 1,8 <SEP> 1 <SEP> 2,15 <SEP> 90
<tb>
EMI7.3
B.cereus iRRZ I 569 1 2,20 0,21 2,5 1 0,95 4,68 90 B.
mycoides 1,8 0,05 9 ' 0,8 0,8 0,45 2,15 70 S6-lutea^ATOC 9341 1,20 0,13 210 0,35 0,8 1 '' 2,15 25 St.faecalis T 4 0,14 120 1 8,15 2,15 8 >100 A.aerogenes 2,4 2,20 200 10 1,60 1 1,6 31 B.Goli ATCC 9627 3,4 2,10 310 4'- 2,8 1,75 3,1 100 ' E.Coli streptomycico-resïst3,l 1,45 68 2 2,8 1,75 >100 100
EMI7.4
<tb> S., <SEP> pullorum <SEP> 4,3 <SEP> 2,10 <SEP> 68 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5 <SEP> 1,75 <SEP> 2,15 <SEP> 35
<tb> S.typhimurium <SEP> 2,5 <SEP> 2,10 <SEP> 66 <SEP> 3,1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 9 <SEP> 100
<tb> S.enteritidis <SEP> Gaertner <SEP> 2,5 <SEP> 2,50 <SEP> 210 <SEP> 3,1 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 3,15 <SEP> 31
<tb> S,para <SEP> B. <SEP> 2,5 <SEP> 1,50 <SEP> 210 <SEP> 0,68 <SEP> 2 <SEP> 1,75 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> E.
<SEP> cyphosa <SEP> 0,6 <SEP> 2,10 <SEP> 250 <SEP> 2,15 <SEP> 0,70 <SEP> 0,40 <SEP> 2,5 <SEP> 25
<tb> S.gallinarum <SEP> 1 <SEP> 2,50 <SEP> 150 <SEP> 4,68 <SEP> 1 <SEP> 0,50 <SEP> 14 <SEP> 31
<tb>
EMI7.5
S.flexneri 3,5 1,75 210 1,20 2,15 1 2,15 30 P.mtt7.tocida 2,8 8,6 210 3,50 2,15 1,8 2,15 100 B.bronchiseptica NRRL B140 3 8,6 315 3,15 2,15 4,75 2,15 100 B.de Bodenheimer NRRL B.962 15 8,6 86 )100 10 30 > 100 )10D
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TABLEAU III (suite)
EMI8.1
<tb> Uioroorganisme <SEP> 4915 <SEP> Auréomy- <SEP> Erythromy- <SEP> Chloram- <SEP> Framycé- <SEP> Néomycine <SEP> Strepto- <SEP> Viomycine
<tb> cine <SEP> cine <SEP> phénicol <SEP> tine <SEP> myoine
<tb>
EMI8.2
Po aeruginosa ATOC 10.145 50 35 210 z100 21,5 20 z100 >100 S.marcescens Martin 3 6 35 315 65 10 20 20 >100 S.marceecens ATOO 5986 a 31 20 46 3,
5 2 16 100 K.pneumoniae Pal G02 0,5 0,20 20 0,30 0,40 1 1 68 K.pneumoniae K 41 0,7 0,25 45 0,25 0,50 1 1,5 35 P. C. I. 4 1 40 95 4,70 4,50 >100 10 Myo.t1.lbercu1osis H37RV. 5,5 - 0 6 0,25 10 Eumyoetes Saccharomyces cerevisiae z100 - - pico )100 lpt3 S.uvarum >100 100 >100 100 Candida albiaans flRRL Y 477 )100 )100 )100 >1(C3 z100 )l00, >ico
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L'activité sur Mycobactérium tuberculosis pathogène H
37 RV montre, les caractères .particuliers du nouvel antibiotique ainsi que le grand avantage de son utilisation clinique. L'absen- ce de résistance croisée vis-à-vis de la framycétine et de la streptomycine est particulièrement importante.
En effet, une pre- mière souche résistant à plus de 250 y /cm3 de sulfate de framy- cétine a été aisément inhibée par 50 Y/cm3 de sulfate de l'anti- biotique la.915; une seconde couche résistant à plus de 100 y /cm3 de sulfate de streptomycine a été inhibée par 4 y /cm3 de sulfate de l'antibiotique 4915.
Le nouvel antibiotique montre une activité particulière- ment marquée in vivo vis-à-vis de la tuberculose. Contrairement à ce qui a été observé in vitro (voir tableau' III), l'antibioti- que 4915 se trouve être pratiquement d'une activité égale à celle de la streptomycine. Il suffit en effet d'une dose de 1 m/jour chez la souris pour obtenir une survie totale et l'arrêt de l'é- volution de toutes, les lésions. Cette propriété. remarquable fait donc du 4915 un antibiotique de choix dans le traitement de la tuberculose puisqu'elle permet son utilisation en remplacement de la streptomycine dans les cds, toujours plus nombreux, de strep- tomycino-résistance. La toxicité de l'antibiotique nouveau peut être comparée à celle des autres antibiotiques.
La toxicité aiguë, c'est-à-dire celle provoquée par une seule injection, a été déter. minée chez la souris par la dose léthale (DL 50), c'est-à-dire la dose provoquant la¯mort de 50% des animaux auxquels on a injecté l'antibiotique.
Les -résultats sont les suivants :
TABLEAU IV ' -
EMI9.1
<tb> Voie <SEP> d'administration <SEP> DL <SEP> 50 <SEP> mg/kg
<tb>
<tb> Injection <SEP> intraveineuse <SEP> 125
<tb>
<tb> intrapéritonéale <SEP> 930
<tb>
<tb> sous-cutanée <SEP> 1.120
<tb>
En injection sous-cutanée chez le rat, la dose journa-
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lière de 120 gm (exprimée en base) par kg d'animal, on n'obser- ve aucune modification de la courbe de croissance pendant 2 mois par rapport aux animaux témoins.
L'antibiotique produit par le Streptomyces paucisporoge- nes est une substance basique contenant du carbone, de l'hydrogè- ne, de l'oxygène et de l'azote et capable de fournir des sels avec les acides.
Les reactions caractéristiques, suivantes ont été étudiées TABLEAU V
Van Slyke +
Ninhydrine +
Fehling -
Tollens -
Benzidine-
Phtalate d'aniline -
Sakaguchi-
Elson Morgan -
Ces résultats ont permis les conclusions préliminaires suivantes quant à la constitution du nouvel antibiotique: Présence de la totalité de l'azote sous forme de groupements ami- nés primaires, absence de groupements réducteurs libres, absence de groupements guanidés.
L'électrophorèse sur papier, la (sépara- tion à contre-courant.dans le système eau-acétone-chloroforme et la chromatographie sur papier Whatman n 1 dans les solvants bu- tanol, eau, acide acétique; butanol, eau, acide para-toluène sul- fonique; butanol, pipéridine, acide para-toluène sulfonique per- mettent d'affirmer la présence d'une seule substance active dans l'antibiotique obtenu selon la présente invention.
Si 1'on sou- met le chlorhydrate de l'antibiotique 4915 à une méthanolyse chlorhydrique, on obtient par simple refroidissenent du mélange réactionnel, la cristallisation d'un produit voisin de celui dé- nommé Fraction A, isolé par méthanolyse chlorhydrique de l'anti-
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EMI11.1
biotique "framycétine" et décrit dans le bulletin ae la Société Chimique de France 1954 page 1458.11 en diffère toutefois es- sentiellement par ses valeurs analytiques qui permettent de lui
EMI11.2
attribuer la formule brute U1T-ïld0.
Son activité antibiotique représente environ 10;.: de celle de l'antibiotique 4915' Si l'on benzoyle l'antlibiotique 4915 dans les''conditions habituelles de la réaction de Schot;ten":Baumimn, 'à' température ambiante, 'on abou- tit aisément à un dérivé 11-benzoyle cristallisé qui fond à :3 C% (sur bloc) / 0< /EO= +30 + 2(c = 0,3iJ, méthanol). On aboutit ê. ce dérivé 1T-benzoylé par id,0-benzoylation totale de l'antibio- tique 4915 suivie d'une méth-.eanolyse alcaline qui a pour effet de libérer les hydroxyles de la molécule.
Les exemples suivants illustrent l'invention. Ils ne doivent pas être cons idérés comme limitatifs ou restrictifs des @ ainsi manières convenant à la mise en oeuvre de l'invention. On peut/ varier la composition des milieux de culture, les temps, appareil lages et température de culture, l'adsorbant, le mode d'adsorp- tion et d'élution ainsi que la nature des sels ou combinaisons de l'antibiotique nouveau sans sortir pour cela du cadre de l'in- vention.
L'activité de l'antibiotique T 4915 est, dans ce qui suit, exprimée en unités, une unité correspondant àlyde base pure.
EXEMPLE 1 : Fermentation sur shaker.
EMI11.3
Un milieu de fermenbati'on est préparé à l'aide des in- grédients suiv&nts : - glycérine 10 g - peptone bactériologique 18 g - corn steep sec - chlorure de sodium 4 g
EMI11.4
- cariJülã de calcium 1 g - eau aisLilIce ;j,rqu'à 1.u30 enu
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Des portions de 200 cm3 uu milieu sont introduites dans des fioles d'Erlenmeyer, (lui sont alors stérilisées à 121 pen- ciant trente minutes, les flacons sont refroiais et inoculas avec une suspension d'une souche n T 4915 du Streptomyces paucisporo- genes obtenue la surface d'un milieu nutritif gélose.
Les fla- cons sont maintenus pencant sept jours à 30 C sur un agitateur alternatif (80 battements par minute. ; 7 cm de course).
EXEMPLE 2 : Fermentation semi-industrielle aérobie.
Un milieu de fermentation est préparé à l'aide des in. grédients suivants : - farine d'arachide 26 g - glucose massé 13 g -dextrine 10 g - chlorure de sodium 5 g - carbonate de calcium 2 g - eau distillée jusqu'à 1.000 cm3 Des portions de 200 cm3 du milieu sont introduites dans des fio- les d'Erlenmeyer qui sont alors stérilisées à 121 .pendant tren- te minutes. Les flacons sont refroidis et inoculés avec une sus- pension d'une souche n T 4915 du Streptomyces paucisporogenes obtenue à la surface d'un milieu nutritif gélosé. Les flacons sont maintenus pendant quarante-huit heures à 30 C sur un agita- teur alternatif comme indiqué à l'exemple 1.
L'ensemble du bouil- lon de fermentation ainsi obtenu est alors transvasé aseptique- ment dans un fermenteur de 300 litres, en acier inoxydable, con- tenant 350 litres du milieu suivant préalablement stérilisé : - graines de saja broyées 2,5% - amidon de mais 1,3% - glucose massé 1 % -carbonate de calcium 0,2% - eau ordinaire 95 %
Le mélange ensemencé est violemment agité, aéré par insulfflation d'air stérile à raison de 350 litres/minute et maintenu pondant
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On centrifuge et filtre 1 litre de bouillon de culture obtenu selon l'exemple 1 ou l'exemple 2, on ajuste le pH à 6 par addition de 1,1 cm3 d'acide sulfurique dilué (1:
1) et !flet en contact avec 25 cm3 d'amberlite IRC 50,préalablement traitée à la soude N et lavée à l'eau distillée jusqu'à neutralité. La ré- sine est lavée par 50 cm3 d'eau puis éluée par 3 volumes d'une solution aqueuse saturée de triéthylamine. L'éluat est neutralisé .par l'acide sulfurique dilué (1:1) et concentré sous vide au
1/500ème de son volume initial. Le concevrai ainsi obtenu est acidifié à pH 3,5 par l'acide sulfurique 2 N et précipité dans
6 volumes de méthanol.
On essore, lave au méthanol, sèche sous vide sulfurique et obtient ainsi 700 mg de sulfate brut de l'an- tibiotique 4,915 , titre =; 400 u/mg./ [alpha] /D20= + 40 à 44 (c 1%; eau).
EXEMPLE 4 : Purification du sulfate.
On dissout 1 g de sulfate brut, obtenu selon l'exemple précédent, dans 4 cm3 d'eau, décolore par 0 g, 8 de charbon actif ; on dilue à 7,5 cm3 et alcalinise par 0g, 75 de bicarbonate de so- dium, ajoute 0,7 cm3 d'aldéhyde salicylique et agite pendant deux heures à température ambiante. On filtre, lave à l'eau et sèche pour obtenir ainsi 1,25 g du dérivé salicylidène insoluble dans l'eau. Ce dernier est mis en suspension' dans 5 cm3 d'eau; on ajoute 2 cm3 d'acide chlorhydrique 2 N et chauffe cinq minutes à 60 C. On refroidit, extrait au chloroforme et amène la phase aqueuse à pH 5 par addition de triéthylamine. On précipite dans
5 volumes de méthanol contenant 2 cm3 d'une solution éthanoli- que à 30% de sulfate de triéthylamine.
On filtre, lave au métha- nol et sèche sous vide pour obtenir Og,6 de sulfate purifié.
Ce produit se présente sous forme d'une poudre blanche amorphe, pratiquement insoluble dans les solvants organiques, / [alpha] /D20= + 50 ¯ 2 ( c = eau) activité : 600 u/mg.
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EMI14.1
On ài;sout 3 g de p-(pf-hydroxyphénylazoibenzène sulfo- nate de sodium dans -00 cia> d'eau à 7U l:, refroidit à 50 C et ajoute une solution de 1,2 g de suinte (fr- l' ax.tiiiot-,i 3e 49let dans 20 cm3 d'eau. On abandonne une nuit à la température am- biante, essore, reprend dans 10 cm3 de méthanol à 50 C, ajoute
EMI14.2
15 cm3 d'eau à 50 0 et laisse cristalliser dea-: heures à la température ambiante. On essore pour obtenir 1,8 g de sel du p-(p'-hydroxy-phénylazo)benzène sulfonate de l'antibiotique 415.
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Ce produit, qui est nouveau,se décompose vers ;4uU'C, f /U - + 57" + 5 (2 = 0,5J, méthanol).
Analyse : Ce Qà,3 hl; 5,0 ïi"(j 9,6 SI,] é. , 0 1 g de ce sel est mis en solution dans 12 cm3 de méthanol. On ajoute 4 cm3 d'acide chlorhydrique 2 N puis une solution de 4 cm3 de sulfate de triéthylamine dans 4 cm3 de méthanol. On essore lave au méthanol et sèche sous vide pour obtenir Og,4 de sulfate purifié de l'antibiodique 4915. L'amélioration,d'activité du pro- duit ainsi obtenu, par rapport au sulfate initial, se chiffre aux environs de 30%. Ainsi, au départ d'un sulfate de l'antibiotique 4915, préparé selon l'exemple 3, et titrant 400 u/mg, on obtient un sulfate ayant un titre de 600 u/mg.
Une nouvelle purification fait atteindre la valeur de 750 u/mg, qui ne peut être depassée
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/0( IbO= + 50 à + 5; Analyse : 0 jazz 3 1e,> 6,0 1>4; 6, 0-,, in.5 , 7 S,:; 5,1 EE#LE 6 : Préparation du chlorhydrate.
On dissout 1 g du surate pur.irié.seion 1'exer.iple précé- dent dans 2 cm3 d'eau, ajoute une solution de chlorure de baryum
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à jO contenant la quantité stoechiométriqu de ce sel, filtre, concentre sous vide à 0,5 cm3, ajoute 5 en'-) de méthanol à 20% et précipite dans 5 cm3 d'acétone. On filtre, lave à l'acctone et sèche sous vide pour obtenir 0,8 g de chlorhydrate de l'anti-
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biotique 4915, F ldéc.)"20Û , /oC /U= +5N (c = l;,eaui. Le
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produit se présente sous forme d'une poudre amorphe blanche,
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soluble dans 1' eau e t le méthanol aqueux, insoluble 1E-,s sol- , vants organiques.
EXEMPLE 7 : Préparation de la base.
On dissout 1 g du sulfate purifie selon l'exemple 5 dans
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b cm3 d'eau, ajoute, à la température de BOOO, la quantité stoe- chiométrique d'uneaolution à 10p de baryte, refroiuit .0 C, filtre et concentre la solution obtenue z 5 em3. ". ajoute 1 volume de méthanol et précipite dans 15 volumes d'acétone. On filtre, lave à l'acétone et sèche sous vide pour obtenir 0,6 g
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de l'antibiotique 4915, F (déc.) = 200 , pas de fusion franche instantanée jusqu'à 300 , / 0( /O = +63 + 2 ( c = 1;1, eau), activité de l'ordre de 950-1000 u/mg. Le produit se prébente 82US forme d'une poudre amorphe blanche, soluble dans l'eau et le . méthanol aqueux, insoluble dans les solvants organiques.
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Analyse : UJ 48, S H5; ', 3 IJ5 10,1 0; t,.,1 E:Bl,iPLE ES : J3réparation du dérivé méthylène iminé total.
On dissout 1 g de la base antibiotique décrite à l'exem-
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ple précédent dans 2,5 5 cm3 ajoute 214 mg de formol et a.ßite pen- dant une heure à la température ambiante. On filtre, lave à l'eau et sèche sous vide pour obtenir 0,7 g du dérivé méthylène iminé
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total de .l'antibiotique 4915. :F'(déc.) = vers 0 eX /"0 dosage formol Z3p. Le produit se PL'8S'llte SOlE forme c1 'ur-C- poudra blanche insoluble dans l'eau et les solvants. i,i.=PLV 9 : Préparation du dérivé méthylène iminé partiel.
On dissout 1 g de lbase antibiotique décrite à If e::12;,,- ple dans 2,5 5 crn:, d'eau, ajoute 86 ra; de formol et aeite pendant une heure à la température ambiante. La solution résultante est précipitée dans 35 em3 d'une solution métlanolique à o,.. de sulfate ue triéthylamine. un filtre, lave au methanol et si.che sous vide pour obtenir 1, 1 g du sulfate cfu dérivé 1:lUthylt-11C iminé partiel de l'antibiotique 4911). 1 0( IU= +5,' D 1 2 1;, eau). Le produit se présent,',) nouj for :c' d'une pou"
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Un dissout 1 s de la base antibiotique ci c.; (,,;'.1 te al' eX01:,- ple 6 dans 20 cm3 d'eau conteh.:mt 4 g de bicai%1> nali de potassium, ajoute progressivement 3,6 ciii3 de chlorure de benzoyle et a::ilj0 pendant deux heures à 'la température ambiante. On -filtre, lave à l'eau et sèche.
Le produit brut ainsi obtenu est -en solu- tion dans 5 parties de méthanol et abandonné une nuit à 0 C. On
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filtre, lave à l'eau et sèche pour obtenir le dérivé ;-b'3r..zoylb cristallisé de l'antibiotique 4915 avec un rendement de 55%. Le produit se présente sous forme d'aiguilles blanches solubles dans le méthanol, le méthylcellosolve, insolubles dans l'eauet la plupart des autres solvants. Il présente les caractéristiques
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suivantes : F (déc.) = .2j C, 0( /O = + 6 + (c = ü,:J5, méthanol). Indice d'acétyle exprimé en OH% = 11; dosage des grou- pes benzoyles = 40,1%, réaction à la ninhydrine : négative.
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Analyse : cj.1 61,2 h, 5,5 1,j 6,3 0 27,0 EXE#LE Il : Préparation du dérivé N-benzoylé par iJ,0-b0nzovlation totale de l'antibiotique 4-,15 suivie de nstha- nolyse alcaline.
On introduit g de chlorhydrate de l'antibiotique 4915
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dans 15 cm3 de pyridine, ajoute 6,5 cm3 de chlorure '-' - --nzoyie, refroidit, ajoute 50 cm3 de chloroforme et .extrait Tur .,'.:.is fois 25 em3 d'acide chlorhydrique 2if, 10 c:n3 d'eau, trois ,- o-s 5 cm3 d'U8 solution a-queuse à 10',, de bicarbonate de sodium et trois fois z5 cm3 d'eau. L'extrait chlorofornique ainsi obtenu est séché sur sulfate de sodium anhydre, concentré sous viae à 30 cm3 et précipité dans 200 cm3 d'éther de pétrole. On essore, sèche
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et obtient 4,7 g de dérivé u,0-benzo-lé total, qui se présente nous forme d'une poudre blanche amorphe.
On traite 1 g de ce produit par un mélange constitué par 2 cm3 de lessive de soude, 2 cm3 d'eau et 16 ci,13 de métha-
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nol. Après neutralisation par l'acide acétique dilué, on précipi- te dans 500 cm3 d'eau, essore et sèche pour obtenir 0,76 g d'un produit qui, après recristallisation dans 5 volumes de méthanol,
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s'avère en tous points identique au dérivé 11-benzoylé de l'anti- biotique 4@15 décrit dans l'exemple précédent. F (déc.) = 232 C,
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/ C>( /O = +36 + 2 ( c = O,'3b méthanol).
ElïEizl-d 12 : Méthanolyse chlorhydrique de e I'artibiot:i.rue 4S 15.
On dissout 5 g de chlorhydrate de l'antibiotique 4915 dans 550 cm3 de méthanol,: ajoute 98 cm3 de méthanol chlorhydrique 1,97 N et chauffe au reflux pendant trois heures. On abandonne une nuit à température ambiante et essore 2 g de produit cristal lisé. On recristallise deux fois dans l'alcool aqueux pour obte-
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nir un chlorhydrate, F(déc.) = environ 250'01 /0(/D +740 + 2 ( c = 1%; eau), dont l'activité biologique représente environ le dixième de celle de l'antibiotique de départ. On reprend ce chlorhydrate dans le méthanol et fait barboter de 1'ammoniac dans la solution jusqu'à température constante et fin de cristallisa- tion.
On essore, recristallise la base dans l'alcool aqueux et
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essore des aiguilles blanches, F'=;6uoC, /0( /t =::: +100 5 (ç = 015>oi eau).
Analyse : 1 C%.> l.ylp,9 FÎ)1 7 s ' i 1;:;,7 Ô),< 5,2 Calculé pour : Ciziiz5'3 7 Ci, 44,6 Hli! 7,8 xj,1 1 j , U OiJ je.., 7
Ce produit, ainsi que son chlorhydrate précité, est nouveau.