<B>Procédé de</B> préparation <B>d'un nouvel</B> antibiotique La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique, appelé ci- après 5278 R.P.
Ce nouveau produit présente un intérêt tout par ticulier à cause de son activité anticancéreuse très prononcée. En outre, il possède un pouvoir anti bactérien important aussi bien sur les germes Gram- positifs que sur les germes Gram-négatifs, cette pro priété étant d'autant plus intéressante qu'il conserve une forte activité sur des germes (et particulièrement des souches de staphylocoques) rendus résistants aux antibiotiques courants.
Ce nouvel antibiotique est produit par culture dans des conditions appropriées d'un micro-orga nisme, identifié plus complètement ci-après, appar tenant au genre streptomyces et désigné par Streptomyces 662 ou Streptomyces rufochro- mogenus .
Le 5278 R.P., qui est de nature acide, a été isolé sous forme d'acide libre et sous forme de sels tels que les sels de sodium, potassium, calcium. L'acide libre et le sel de sodium qui cristallisent en aiguilles sont colorés en brun rouge.
Le 5278 R.P. cristallisé sous forme d'acide libre est soluble dans la pyridine, le diméthylformamide, l'acétone (environ 0,25 g dans 100 cm2 à 250) et l'acétate d'éthyle (environ 0,15 g dans 100 cm3 à 25-), faiblement soluble dans l'alcool méthylique, l'alcool n-butylique, le chloroforme, le benzène, l'éther, l'acide acétique glacial et pratiquement inso luble dans l'eau et l'éther de pétrole,
le sel de sodium est très soluble dans l'eau (plus de 10 g dans 100 cm3 à 25ù), faiblement soluble dans l'alcool méthylique et l'acétone, insoluble dans le chloroforme, l'éther, le benzène. Le sel de calcium est pratiquement insolu ble dans l'eau. L'antibiotique sous forme d'acide libre est formé uniquement de carbone, hydrogène, oxygène et azote.
Sa composition élémentaire est la suivante C % = 59,2-59,6 H % = 4,8- 5,2 O % = 25,0-25,2 N % = 10,8-11,1 L'analyse fonctionnelle montre la présence de groupements O-CH3 O-CH3 % (Zeisel) = 17,7 L'équivalent neutre déterminé par titrage électro- métrique d'une solution dans le diméthylformamide à 66 % au moyen d'une solution de soude titrée est égal à 505. Le pKa correspondant est de 6,9.
La composition élémentaire et l'équivalent neutre sont en accord avec la formule brute (C25H2608NI Calc. : C % = 58,9 H % = 5,1 O % = 25,1 N % = 10,9 Poids moléculaire = (510)n 3 O-CH3 = 18,2 % Le 5278 R.P. sous forme d'acide libre est carac térisé par les propriétés physiques données ci-après Point de fusion = 301-3030 (au bloc Maquenne) Spectre ultraviolet (détermination. effectuée à par tir d'une solution dans le méthanol)
Maximum d'absorption à 382 mu - EII CIm = 322 Minimum d'absorption à 332 m#t- Ei '/m = 133 Maximum d'absorption à 247 m#t - Ei '/m = 750 Le spectre d'absorption infrarouge du 5278 R.P.
sous forme d'acide a été déterminé et est représenté par la figure unique du dessin annexé dans laquelle on a porté en abscisses d'une part les longueurs d'ondes exprimées en microns (échelle inférieure) et d'autre part les nombres d'ondes en cm-' (échelle supérieure) et en ordonnées les transmissions en %.
Dans le tableau 1, on indique les principales bandes d'absorption infrarouge pour ce produit. <I>Tableau 1</I> (Spectre mesuré sur le produit solide en com- primé avec du bromure de potassium.)
3480F 1205 m 3400F 1177 f 3300F 1155 ép 2950 m 1100F 2870f <B>1082F</B> 1743F 1076 ép 1683F 1040 m 1637 ép <B>1006F</B> 1613 tF 960 tf 1594 ép 920<I>m</I> 1568 m<B>8881</B> 1554 ép <I>877 m</I> 1505<I>m</I> 864<I>m</I> 1467F 817 m 1452<I>m</I> 786 f
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<I>Tableau <SEP> II</I>
<tb> Solvant <SEP> de <SEP> développement <SEP> Papier <SEP> Rf
<tb> Chloroforme <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> <B>........................
<SEP> .....</B> <SEP> Imprégné <SEP> solution <SEP> tampon <SEP> phosphate <SEP> pH <SEP> 4,8 <SEP> 0,70
<tb> Chloroforme <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> <B>..............................</B> <SEP> Imprégné <SEP> solution <SEP> tampon <SEP> phosphate <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> 0,40
<tb> n-butanol <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> <B>................... <SEP> ................</B> <SEP> Imprégné <SEP> solution <SEP> tampon <SEP> phosphate <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> 0,65
<tb> Phase <SEP> légère <SEP> du <SEP> mélange <SEP> benzène-acétate
<tb> d'éthyle-eau <SEP> (75:25:25 <SEP> en <SEP> volume)...... <SEP> Imprégné <SEP> solution <SEP> tampon <SEP> phosphate <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> 0,60
<tb> Phase <SEP> légère <SEP> du <SEP> mélange <SEP> benzène-m6thyl isobutylcétone-eau <SEP> (90:10:
25 <SEP> en <SEP> vo lume) <SEP> <B>........................................ <SEP> ......................</B> <SEP> Imprégné <SEP> solution <SEP> tampon <SEP> phosphate <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> 0,20
<tb> Phase <SEP> légère <SEP> du <SEP> mélange <SEP> benzène-méthyl isobutylcétone-eau <SEP> (70:30:25 <SEP> en <SEP> vo lume) <SEP> ..__ <SEP> <B>-----</B> <SEP> .....<B>----------</B> <SEP> ._._.<B>....</B> <SEP> _<B>......</B> <SEP> .<B>............</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> Imprégné <SEP> solution <SEP> tampon <SEP> phosphate <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> 0,60 Ces chromatographies montrent que le 5278 R.P. ne renferme qu'un seul constituant actif.
La présence d'un seul corps actif dans le 5278 R.P. est confirmée par l'analyse selon la mé thode de distribution à contre-courant. En effet, lorsque le produit est distribué à contre-courant à 250 au moyen d'un appareil de Craig à 30 cellules entre les phases séparées du mélange butanol-solu- tion tampon phosphate à pH 7,5 (1:1 en volume), la courbe de distribution établie d'après l'activité biolo gique est formée d'un seul pic ; cette courbe est superposable à la courbe théorique calculée pour un coefficient de partage égal à 3,14.
Le 5278 R.P. sous forme d'acide libre est très stable, le produit a pu être conservé plusieurs années
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1431 <SEP> <I>m <SEP> 771 <SEP> f</I>
<tb> 1404 <SEP> <I>m <SEP> 752 <SEP> m</I>
<tb> 1380 <SEP> <I>m <SEP> 744 <SEP> ép</I>
<tb> 1348F <SEP> 733 <SEP> f
<tb> <B>1290F</B> <SEP> 704 <SEP> m
<tb> 1278 <SEP> <I>ép</I> <SEP> 684 <SEP> <I>tf</I>
<tb> <B>1233F</B>
<tb> tf <SEP> = <SEP> très <SEP> faible <SEP> F <SEP> = <SEP> forte
<tb> f <SEP> = <SEP> faible <SEP> tF <SEP> = <SEP> très <SEP> forte
<tb> <I>m</I> <SEP> = <SEP> movenne <SEP> <I>ép</I> <SEP> = <SEP> épaulement Le 5278 R.P. peut être identifié d'après la chro matographie sur papier.
L'antibiotique a été chro- matographié sur papier Arches NI, 302, en dévelop pant à 300, dans le sens descendant au moyen de divers solvants ; les chromatogrammes ont été révé lés par bioautographie sur plaques de gélose nutri tive ensemencée par B. subtilis ; les Rf obtenus sont indiqués dans le tableau II. à température ambiante sans que l'on puisse déceler de diminution d'activité.
La solution aqueuse du sel de sodium à un pH compris entre 7 et 8 conserve son activité après chauffage une heure à 560 ou pen dant une courte durée à l'ébullition.
L'activité bactériostatique du 5278 R.P. vis-à-vis d'un certain nombre de germes a été déterminée par une des méthodes de dilution couramment em ployées à cet effet. Pour chaque germe, on a déter miné la plus petite concentration de substance qui empêche tout développement visible dans un bouillon nutritif approprié.
Les résultats des diverses déter- minations sont rassemblés dans le tableau III ci- dessous, où les concentrations bactériostatiques minima sont exprimées en microgrammes de subs tance par cm3 de milieu d'essai.
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<I>Tableau <SEP> III</I>
<tb> Concentration
<tb> Souches <SEP> bactériennes <SEP> essayées <SEP> bactériostatique
<tb> mcg/eml
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus, <SEP> souche
<tb> 209 <SEP> P <SEP> - <SEP> ATCC <SEP> 6538 <SEP> P.... <SEP> 0,45
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus, <SEP> souche
<tb> 133 <SEP> (Institut <SEP> Pasteur)<B>.... <SEP> ....</B> <SEP> 0,7
<tb> Micrococcus <SEP> citreus <SEP> - <SEP> ATCC
<tb> 8411 <SEP> 71
<tb> Gaffkya <SEP> tetragena <SEP> (Fac. <SEP> Phar macie <SEP> de <SEP> Paris)..................... <SEP> 0,6
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> - <SEP> ATCC <SEP> 9341...
<SEP> 1,1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> - <SEP> ATCC
<tb> 9790 <SEP> <B>.........</B> <SEP> .......<B>...................</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> 100
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> - <SEP> Insti tut <SEP> Pasteur <SEP> <B>---- <SEP> -------------------- <SEP> ---</B> <SEP> 18,5
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis
<tb> (Fac. <SEP> Pharmacie <SEP> de <SEP> Paris) <SEP> 2,6
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> - <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 0,07
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> NRRL-B-93 <SEP> 8 <SEP> ........................ <SEP> 0,07
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> - <SEP> ATCC <SEP> 6630 <SEP> 0,5
<tb> Mycobacterium <SEP> species <SEP> ATCC <SEP> 607 <SEP> <B>..... <SEP> ...................
<SEP> -</B> <SEP> 0,7
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> - <SEP> ATCC <SEP> 9637 <SEP> 0,25
<tb> Shigella <SEP> dysenteriae <SEP> - <SEP> Shiga <SEP> L
<tb> (Institut <SEP> Pasteur) <SEP> <B>------------------</B> <SEP> 1,3
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> (Ins titut <SEP> Pasteur) <SEP> ........................ <SEP> 3,8
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> (La casse, <SEP> Institut <SEP> Pasteur)..._.. <SEP> 0,35
<tb> Salmonella <SEP> schottmuelleri <SEP> (Pa ratyphi <SEP> B <SEP> - <SEP> Fougenc, <SEP> Ins titut <SEP> Pasteur) <SEP> <B>------------------------</B> <SEP> 1,7
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> - <SEP> ATCC
<tb> 8308 <SEP> .. <SEP> <B>------------------------</B> <SEP> .<B>-------------</B> <SEP> 4,2
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> (Fac. <SEP> Phar macie <SEP> de <SEP> Paris) <SEP> ..................
<SEP> 4
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> ATCC <SEP> 10.031 <SEP> <B>-------------- <SEP> -.</B> <SEP> 0,16
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> (A. <SEP> 476,
<tb> Lausanne) <SEP> <B>---------------- <SEP> .............</B> <SEP> 0,8
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> (sou che <SEP> Bass, <SEP> Institut <SEP> Pasteur) <SEP> 9,4
<tb> Brucella <SEP> bronchiseptica <SEP> (CN
<tb> 387 <SEP> - <SEP> Wellcome <SEP> Institut) <SEP> 1,3 L'ensemble des résultats montre que l'activité antibiotique du 5278 R.P. s'exerce sur de nombreuses bactéries, se situant aussi bien parmi celles qui pren nent la coloration de Gram que parmi celles qui donnent une réponse négative à cette coloration.
En outre, le 5278 R.P. est actif sur des souches de staphylocoques rendues respectivement résistantes à un ou plusieurs des antibiotiques suivants : p6ni- cilline, tétracycline, streptomycine, streptothricine, néomycine, congocidine, érythromycine, carbomy- cine, spiramycine, streptogramine, actinomycine, chloramphénicol, novobiocine.
L'activité anticancéreuse du 5278 R.P. a été dé montrée au laboratoire où il s'est révélé particulière ment actif sur les tumeurs greffables de la souris tumeur ascitique d'Ehrlich, Sarcome 180 (forme solide), adénocarcinome mammaire de la souris (souche RIII), sarcome au benzopyrène, etc.
La toxicité du 5278 R.P. a été étudiée princi palement sur la souris. La dose léthale 50 % (DL-o) a été déterminée en administrant le produit par voie orale, par voie sous-cutanée et par voie intravei neuse Voie orale DL3o comprise entre 4 et 6 mg/kg Voie sous-cutanée DL5o comprise entre 1 et 3 mg/kg Voie intraveineuse DLgo comprise entre 0,
5 et 2 mg/kg L'organisme producteur de l'antibiotique 5278 R.P. appartient au genre Streptomyces et est désigné par l'appellation Streptomyces 662 . Sa souche a été déposée au Northern Regional Research Labo- ratory à Prétoria, Illinois (USA) sous le No NRRL 2816.
Cet organisme a été isolé d'un fragment de terre prélevé au Portugal. La méthode d'isolement est la suivante: le prélèvement de terre est mis en sus pension dans de l'eau distillée stérile, puis la sus pension est diluée à différentes concentrations : un petit volume de chaque dilution est étalé sur la sur face de boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif gélosé. Après une incubation de quelques jours à 260, les colonies de micro-organismes que l'on veut isoler sont repiquées sur des géloses inclinées dans le but d'obtenir des cultures plus abondantes.
En suivant la classification du Bergey's manual of determinative Bacteriology , 6me édition (1949) pour le genre Streptomyces, on ne trouve aucune description d'espèce dont les caractères culturaux et les propriétés biochimiques coïncident avec ceux du Streptomyces N 662.
C'est pourquoi cet organisme peut être considéré comme une espèce nouvelle à laquelle la demanderesse a attribué le nom de Streptomyces rufochromogenus , à cause de la propriété qu'il possède de produire un pigment roux sur certains milieux de culture.
La souche de Streptomyces rufochromogenus se présente avec des spores ovales, portées sur des filaments sporifères assez longs, flexueux, se recour bant volontiers à leur extrémité pour former une crosse, ou même s'enroulant pour former un ou deux tours spiralés ; les spires déterminées sont lâches, non compactes. Le mycélium aérien arrivé à maturité de sporulation présente une couleur blanche légère ment crème. Sur un certain nombre de milieux de
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culture, an observe la production d'un pigment roux, allant d'une teinte roux clair à brun roux très foncé suivant les cas.
Les caractères culturaux et les propriétés biochi miques de Streptomyces rufochromogenus ont été exa minés sur les géloses nutritives et sur les bouillons nutritifs habituellement utilisés pour examiner l'aspect des souches de Streptomyces. Les observations effec tuées sont notées dans le tableau IV ci-contre ; elles concernent des cultures de deux à trois semaines, arrivées à un bon stade de développement. La plu part des milieux de culture employés ont été préparés d'après les formules contenues dans The Actino- mycetes , S. A.
Waksman, p. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham Mass. USA,<B>1950;</B> dans ce cas, ils sont indiqués par le numéro qui leur a été attribué dans The Actinomycetes .
<I>(Voir tableau IV ci-contre)</I> Le procédé de préparation de l'antibiotique 5278 R.P. consiste essentiellement à cultiver le Streptomyces 662 ou ses mutants sur un milieu et dans des conditions appropriées et à séparer ensuite l'antibiotique formé au cours de la culture.
La culture du Streptomyces 662 peut être effec tuée par toute méthode de culture aérobie en surface ou en profondeur, mais cette dernière est à préférer pour des raisons de commodité. On utilise à cette fin les différents types d'appareils qui sont mainte nant d'un usage courant dans l'industrie des fer mentations.
On peut en particulier adopter la marche sui vante pour la conduite des opérations
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Streptomyces <SEP> 662 <SEP> - <SEP> stock
<tb> Culture <SEP> sur <SEP> gélose
<tb> Culture <SEP> en <SEP> fiole <SEP> agitée
<tb> Culture <SEP> inoculum <SEP> en <SEP> fermenteur
<tb> Culture <SEP> de <SEP> production <SEP> en <SEP> fermenteur Le milieu de fermentation doit contenir essen tiellement une source de carbone et une source d'azote assimilables, des éléments minéraux et éven tuellement des facteurs de croissance, tous ces élé ments pouvant être apportés sous forme de produits bien définis ou par des mélanges complexes,
tels qu'on en rencontre dans des produits biologiques d'origines diverses.
Comme source de carbone assimilable, on peut utiliser des hydrates de carbone tels que le glucose, le saccharose, le lactose, les dextrines, l'amidon, les mélasses ou d'autres substances hydrocarbonées comme les sucres alcools: glycérol, mannitol, etc., ou comme certains acides organiques : acides lactique, citrique, tartrique, etc. Certaines huiles animales ou végétales comme l'huile de lard ou l'huile de soja peuvent remplacer avantageusement ces différentes sources hydrocarbonées, ou leur être adjointes.
Les sources convenables d'azote assimilable sont extrêmement variées. Elles peuvent être des substan ces chimiques très simples comme les nitrates, les sels minéraux et organiques d'ammonium, l'urée, les acides aminés. Elles peuvent être aussi apportées par des substances complexes contenant principalement l'azote sous forme protidique : caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats, farines de soja, d'ara chide, de poisson, extraits de viande, de levure, distil- lers'solubles, corn-steep.
Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant, comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium et de magnésium.
D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au développement du Streptomyces 662 et à l'éla boration de l'antibiotique, comme les chlorures et sulfates des métaux alcalins et alcalino-terreux. Enfin, certains agissent plus spécialement comme activateurs des réactions métaboliques du Streptomyces 662 : ce sont les sels de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganèse.
Le pH du milieu de fermentation au départ de la culture doit être compris entre 6,0 et 7,5. La tem pérature optimum pour la fermentation est de 26 27o, mais une production satisfaisante est obtenue pour des températures comprises entre 23 et 35 . L'aération de la fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant trouvé que des aérations de 0,5 à 2 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. Le rendement maximum en antibiotique est obtenu après 3 à 5 jours de culture, ce temps dépendant essen tiellement du milieu utilisé.
D'après ce qui précède, on conçoit que les con ditions générales de la culture du Streptomyces 662 pour la production de l'antibiotique peuvent varier dans une assez large mesure et être adaptées à chaque nécessité particulière.
Le 5278 R.P. peut être isolé à partir des moûts de fermentation par différentes méthodes. Le moût de fermentation peut être filtré à un pH compris entre 6 et 9 ; dans ce cas, la majeure partie de l'acti vité est trouvée dans le filtrat ; il est également pos sible au contraire de réaliser la filtration dans un intervalle de pH compris entre 1 et 4, dans ces con ditions l'activité reste dans le gâteau de filtration d'où elle peut être extraite par un solvant du groupe des alcools aliphatiques tels que le méthanol, l'étha nol, les propanols ou les butanols, du groupe des cétones telles que l'acétone ou la méthylisobutyl- cétone,
du groupe des esters tels que l'acétate d'éthyle. L'activité peut également être extraite du gâteau de filtration par de l'eau en alcalinisant pour obtenir un pH compris entre 6 et 9.
Le produit brut peut être isolé directement à partir des solutions aqueuses alcalines obtenues comme indiqué ci-dessus, en provoquant sa préci- pitation par acidification au moyen d'un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique.
On préfère généralement partir du filtrat alcalin ou de l'extrait aqueux du gâteau de filtration acide et soumettre la solution à une extrac tion par un solvant non miscible à l'eau, en acidifiant au moment de l'extraction à un pH compris entre 1 et 4 ; le solvant utilisé peut appartenir au groupe des alcools aliphatiques en C,, C;
comme les alcools butyliques ou un mélange d'alcools amyliques, des cétones comme la méthylisobutylcétone, des esters comme l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'amyle, des solvants chlorés comme le chloroforme ou le dichlo- roéthane, des carbures aromatiques comme le ben zène et des éthers comme l'oxyde d'éthyle ou d'iso- propyle.
Le 5278 R.P. brut peut être obtenu à partir de l'extrait organique par concentration et séchage sous pression réduite ou concentration et précipitation au moyen d'un mauvais solvant tel que l'éther de pétrole ou le cyclohexane. 11 est avantageux pour obtenir un produit brut plus pur de réextraire la substance active de la solution dans le solvant par de l'eau en alcalinisant à un pH compris entre 6 et 9. L'anti biotique est alors isolé par concentration et séchage de la solution aqueuse ou réextraction en milieu acide par un des solvants cités ci-dessus et préci pitation.
Le 5278 R.P. peut alors être cristallisé directe ment sous forme d'acide libre par dissolution à reflux dans un solvant comme l'acétone, l'acétate d'éthyle, le propanol, le butanol, le chloroforme, l'oxyde d'éthyle ou le benzène et refroidissement. La cristallisation est aussi réalisable par dissolution dans l'eau à pH compris entre 8 et 9 suivie d'acidification.
Dans le cas où le produit brut est trop impur pour être directement cristallisé ou si l'on désire obtenir un produit très pur, il est avantageux de soumettre le 5278 R.P. à une chromatographie. Celle-ci peut être réalisée en utilisant une colonne d'alumine sur laquelle on passe une solution du pro duit dans un solvant tel que l'acétone, l'acétate d'éthyle ou le benzène par exemple ; le produit est élué par le même solvant ou par de l'eau alcalinisée à un pH compris entre 8 et 10, la cristallisation est alors conduite comme on l'a déjà indiqué.
Les sels du 5278 R.P. peuvent être préparés par mise en suspension de l'acide libre dans l'eau, sali- fication à pH 8,5 au moyen de la base choisie telle que la soude ou la potasse et lyophilisation de la solution résultante. Le sel de sodium est cristalli- sable dans le méthanol. Le sel de calcium peu soluble dans l'eau peut être obtenu par double décomposi tion entre une solution aqueuse de sel de sodium et un sel soluble de calcium tel que le chlorure.
Il est compréhensible que les différentes méthodes indiquées peuvent être successivement appliquées dans un ordre varié ou répétées plusieurs fois, selon les impératifs de la fabrication, pour obtenir le 5278 R.P. sous une forme convenable aux applica tions envisagées.
Les exemples suivants, à titre non limitatif, mon trent comment l'invention peut être mise en pratique. Dans ce qui suit, l'activité est exprimée en micro grammes de 5278 R.P. pur sous forme d'acide libre ; elle est déterminée biologiquement par la méthode de dosage dite de diffusion en utilisant comme germe sensible B. subtilis ATCC No 6633.
<I>Exemple 1</I> On charge dans un fermenteur de 170 litres Corn-steep <B>(50%</B> extrait sec) .. .. . 4,800 kg Cérélose .. .. . ... ........ 2,400 kg Chlorure de sodium<B>----- 0,600</B> kg Sulfate de magnésium hydraté ......... . 0,120 kg Eau de ville<B>...............</B> ... .... .100 litres Le pH est ajusté à 6,6 avec 500 cm3 de soude 10N.
On ajoute alors Carbonate de calcium précipité 0,600 kg Le milieu est stérilisé par barbotage de vapeur à 120,1 pendant 40 minutes. Après refroidissement à 270, le volume du milieu est de 120 litres et le pH est égal à 6,8. Le milieu est alors ensemencé avec 250 cm3 d'une culture en erlenmeyer agité de la sou che de Streptomyces 662.
La culture en fermenteur est aérée avec un débit d'air stérile de 5 m3/h et agitée par une turbine tour nant à 350 t/min. Le développement du Streptomyces ne commence qu'après une quarantaine d'heures de culture et présente à 52 heures une intensité correcte pour l'ensemencement de la culture productrice.
Cette dernière est effectuée en fermenteur de 800 litres chargé avec les substances suivantes Farine de soja . . . . ..... ._12,000 kg Distillers'solubles .. ............. .. .... 2,000 kg Chlorure de sodium.-.....- 2,000 kg Eau de ville .. . .. . . ... .......... . ...360 litres Le pH est ajusté à 7,45 avec 250 cm3 de soude 10 N. On ajoute ensuite Huile de soja ... .. . 2 litres Le milieu est stérilisé à 120 par barbotage de vapeur pendant 40 minutes.
Après refroidissement, la charge du fermenteur est complétée par 10 litres d'une solution stérile contenant Cérélose .... .... ........ . 4,000 kg Le volume du milieu est ainsi de 400 litres et son pH de 6,85.
Le milieu est alors ensemencé par 40 litres de la culture précédente en fermenteur de 170 litres. Le milieu est agité par une turbine tournant à 205 t/min et aéré avec 15 m3/h d'air stérile et maintenu à 26 .
Après une- quarantaine d'heures au cours des quelles le développement du Streptomyces est abon dant et le pH monte vers des valeurs un peu alca lines : 7,2, il y a une légère baisse du pH vers 6,8, puis une remontée. L'activité maximum est atteinte au moment du passage à pH 7,0 à 70 heures de culture<B>:</B> elle est de 86 mcg par cm3. Les mousses qui sont produites au cours de la culture sont facile ment combattues avec 2 litres d'une solution de Swift dans l'huile minérale.
<I>Exemple 2</I> Un fermenteur de 800 litres est chargé avec les substances suivantes: Corn-steep (50 % extrait sec) 12,000 kg Phosphate monopotassique <B>------------------</B> 0,400 kg Sulfate de magnésium<B>---------------------------</B> 0,400 kg Eau de ville<B>....</B> .<B>.................. .... ...................</B> 360 litres Le pH est ajusté à 6,6 par addition de 1.200 cms d'une solution de soude 10N.
On ajoute ensuite Carbonate de calcium<B>-----------</B> ..<B>--------------</B> 1,000 kg Huile de soja -----------------........ <B>-------------------</B> 2 litres Le milieu est stérilisé à 1200 par barbotage de vapeur pendant 40 minutes. Après refroidissement, la charge du fermenteur est complétée par:
- Cérélose ....... .... .... . .......... ...... 4,000 kg en solution stérile dans 10 litres d'eau, ce qui amène le volume total du milieu à 400 litres.
Le milieu est alors ensemencé et la fermentation conduite comme il est dit dans l'exemple 1.
Au bout de 90 heures de culture, l'activité est de 24 mcg/cm3.
<I>Exemple 3</I> 420 litres de moût de fermentation (titre 86 mcg/ cm3 de l'exemple 1) sont placés dans un réservoir muni d'un dispositif d'agitation; le pH est ajusté à 9 par addition de lessive de soude diluée. La sus pension est agitée 30 minutes puis additionnée de 30 kg d'adjuvant de filtration et filtrée sur filtre presse, le gâteau est lavé par 150 litres d'eau alca linisée à pH 9. Le filtrat et les lavages réunis repré sentent 445 litres de solution ayant une activité égale à 59 microgrammes par centimètre cube.
La solution est acidifiée à pH 2 au moyen d'une solu tion diluée d'acide chlorhydrique et extraite en con tinu, à contre-courant à deux étages, par 30 % de son volume d'acétate d'éthyle en utilisant un groupe de deux centrifugeuses.
L'extrait d'acétate d'éthyle est lavé par 10 % de son volume d'eau et clarifié ; on obtient ainsi 135 litres de solution que l'on concentre sous pres sion réduite à 19 litres en utilisant un appareil continu capable de travailler à une température ne dépassant pas 350. La solution concentrée est extraite par 8,5 litres d'eau en alcalinisant à pH 9 par une solu tion de soude diluée ; après séparation de la phase aqueuse, l'extraction est renouvelée en employant 2 litres d'eau et en ajustant le pH à 9.
On obtient ainsi 11 litres de solution aqueuse qui est à nouveau aci difiée à pH 2 et extraite successivement par 3 litres et 1 litre d'acétate d'éthyle. Les extraits sont réunis puis concentrés sous pression réduite à 2 litres et le concentrai coulé dans 20 litres d'éther de pétrole sous agitation. Le précipité formé est filtré, lavé par de l'éther de pétrole et séché.
On obtient ainsi 64 g de 5278 R.P. brut ayant une activité égale à 341 microgrammes par milli gramme.
50 g de 5278 R.P. brut sont mis en contact avec 700 cm-' d'acétone et la suspension portée à reflux. Après 15 minutes, la solution est filtrée puis refroidie à 30 et concentrée sous pression réduite à 200 cm3. La cristallisation commence pendant la concentration, la solution concentrée est refroidie 20 heures à + 5 et les cristaux sont filtrés, lavés par de l'acétone et séchés.
On obtient 18,5 g de 5278 R.P. cristallisé sous forme d'acide libre ayant une activité égale à 780 microgrammes par milligramme.
<I>Exemple 4</I> 10 g de 5278 R.P. cristallisé directement à partir du produit brut comme décrit à l'exemple 3 sont dissous dans 3 litres d'acétate d'éthyle ; la solution est chromatographiée sur une colonne d'alumine d'un diamètre de 40 mm et de 760 mm de hauteur en alimentant à un débit de 0,5 litre/heure ; le chroma togramme est développé et élué par de l'acétate d'éthyle saturé d'eau en conservant le même débit Les fractions suivantes sont recueillies
EMI0008.0021
Volume <SEP> Titre
<tb> Fraction <SEP> I <SEP> : <SEP> 4 <SEP> litres <SEP> inf. <SEP> à <SEP> 50 <SEP> mcg/cm3
<tb> Fraction <SEP> II <SEP> :
<SEP> 1,4 <SEP> litre <SEP> 980 <SEP> mcg/cm3
<tb> Fraction <SEP> III <SEP> : <SEP> 9,3 <SEP> litres <SEP> 580 <SEP> meg/cm3
<tb> Fraction <SEP> IV <SEP> : <SEP> 2 <SEP> litres <SEP> 170 <SEP> mcg/cm3 Les fractions II et III réunies sont concentrées sous pression réduite à 0,3 litre et la suspension de cristaux obtenue refroidie deux heures à + 5,1. Le produit cristallisé est essoré, lavé à l'acétate d'éthyle et séché sous vide.
On obtient 6,8 g de 5278 R.P. cristallisé sous forme d'acide libre ayant une activité de 945 mcg/ mg et un point de fusion de 300-304 (au bloc Maquenne).
Cinq grammes de ce dernier produit sont dissous dans 750 cms d'acétone à ébullition, la solution fil trée, refroidie, additionnée de 2,25 litres d'oxyde d'isopropyle puis abandonnée à la cristallisation 20 heures à + 5o. Les cristaux formés sont essorés, lavés à l'oxyde d'isopropyle et séchés, d'abord 10 heu res à 30 sous 5 mm, puis 2 heures à 100 sous 1 mm.
On obtient 3,8 g de 5278 R.P. cristallisé en aiguilles brunes sous forme d'acide libre ayant les caractéristiques suivantes P. F. (au bloc Maquenne) 301-303 C % = 59,2-59,6 H % = 4,8- 5,2 <B>0</B> % = 25,0-25,2 N % = 10,8-11,1 Le spectre ultraviolet présente deux maximums d'absorption correspondant aux longueurs d'onde de 382 et 247 mu.
3,5 g de 5278 R.P. acide libre sont mis en sus pension dans 70 cm3 d'eau et le pH ajusté à 8,7 par addition de soude diluée. La solution de sel de sodium est filtrée et lyophilisée.
On obtient 3,3 g de sel de sodium ayant une activité de 856 mcg/mg. 3 g de sel de sodium amor phe sont dissous dans 15 cm-3 de méthanol, la solu tion est filtrée rapidement et abandonnée à la cris tallisation pendant 16 heures à - 5 . On obtient 1,6 g de sel de sodium cristallisé ayant une activité de 930 mcg/mg.
<I>Exemple 5</I> 415 litres de moût de fermentation ayant une activité de 8 microgrammes par centimère cube sont acidifiés à pH 2 par de l'acide chlorhydrique dilué et agités 30 minutes avec 21 kg de supercel Hyflo. La suspension est filtrée sur filtre presse et le gâteau lavé par 80 litres d'eau. Le gâteau de filtration est mis en suspension dans 210 litres d'eau, le mélange est agité énergiquement et le pH ajusté à 8 par de la soude. Après 30 minutes d'agitation la suspension est filtrée sur filtre presse et le contenu du filtre lavé par 120 litres d'eau.
Le filtrat et les lavages réunis représentent<B>310</B> litres de solution aqueuse ayant une activité de 8,6 microgrammes par centimètre cube. La solution aqueuse est acidifiée à pH 2 et extraite deux fois par 57 litres à chaque fois d'alcool buty- lique normal. Les extraits butyliques réunis sont con centrés sous pression réduite et à une température ne dépassant pas 350 jusqu'à un volume de 2,5 litres. La solution butylique est filtrée et extraite trois fois par 1,25 litre d'eau à chaque fois, en alcalinisant à pH 9 avec de la soude.
Les solutions aqueuses réunies sont acidifiées à pH 2 et extraites deux fois par 3,9 litres d'acétate d'éthyle. Les extraits acétate d'éthyle sont réunis et concentrés sous pression ré duite à 0,25 litre. La solution est alors coulée sous agitation dans 2,5 litres d'éther de pétrole puis le précipité est essoré, lavé à l'éther de pétrole et séché. On obtient 16 g de 5278 R.P. brut ayant une acti vité de<B>138</B> microgrammes par milligramme.
Le produit brut est dissous dans 1 litre d'acétate d'éthyle et la solution chromatographiée sur une colonne d'alumine ayant un diamètre de 50 mm et une hauteur de 500 mm. Après développement par 2 litres d'acétate d'éthyle saturé d'eau, on observe au milieu de la colonne un anneau rouge brun de 100 mm de hauteur surmonté d'une zone brun foncé. On laisse sécher partiellement la colonne puis la vide par portions en isolant la zone de l'anneau rouge brun.
La fraction d'alumine correspondant à cette bande est éluée par agitation avec 0,35 litre d'eau alcalinisée à pH 9 ; le même traitement est répété jusqu'à ce que l'alumine soit pratiquement décolorée, ce qui exige cinq extractions fournissant 1,7 litre de solution aqueuse.
Cette solution est acidifiée à pH 2 et extraite une première fois par 0,6 litre puis une seconde et une troisième fois par 0,3 litre de butanol. Les extraits butyliques sont réunis et concentrés sous pression réduite à 100 cmf3, la cristallisation qui s'amorce spontanément est complétée en refroidissant 4 heures à + 5 . Le produit cristallisé est essoré, lavé à l'éther et séché d'abord 10 heures à 30,) sous 5 mm de mercure, puis 2 heures à 100,) sous 1 mm de mercure.
On obtient 1,3 g de 5278 R.P. cristallisé sous forme d'acide libre ayant une activité égale à 731 mcg/mg.
<I>Exemple 6</I> 220 litres de moût de culture filtrés comme indi qué dans l'exemple 3, fournissent 255 litres de solu tion ayant une activité de 26 microgrammes par centimètre cube. La solution est acidifiée à pH 2, puis agitée avec<B>2 kg</B> de supercel Hyflo et la sus pension filtrée. Le gâteau de filtration est agité avec 50 litres d'eau alcalinisée à pH 9 pendant une heure et la suspension filtrée à nouveau. Le gâteau est lavé par 20 litres d'eau ; le filtrat et les lavages réunis représentent 65 litres.
La solution aqueuse aci difiée à pH 2 est extraite deux fois par 12 litres de butanol. Les extraits butyliques sont réunis, la solu tion obtenue clarifiée et concentrée sous pression ré duite à un litre. Le concentrat est coulé sous agitation dans 5 litres d'éther de pétrole, le précipité formé est essoré, lavé à l'éther de pétrole et séché.
On obtient<B>12,5</B> g de 5278 R.P. brut ayant une activité de 210 microgrammes par milligramme. <I>Exemple 7</I> 200 litres de filtrat de culture obtenus comme indiqué dans l'exemple 1 et ayant une activité égale à 59 microgrammes par centimètre cube sont extraits à l'acétate d'éthyle puis à l'eau, comme on l'a fait au cours de l'exemple mentionné.
Les traitements successifs fournissent 6 litres de solution aqueuse ayant une activité de 1510 microgrammes par centi mètre cube. La solution est acidifiée à pH 2 par de l'acide phosphorique puis extraite 2 fois par 3 litres à chaque fois de dichloréthane. L'extrait clarifié est concentré sous pression réduite à 0,2 litre et le con- centrat coulé sous agitation dans 1,2 litre d'éther de pétrole. Le précipité formé est essoré, lavé à l'éther de pétrole.
On obtient 23 g de 5278 R.P. brut ayant une activité égale à 300 mcg/mg.