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La présente invention est relative à la con- version microbiologique de stéroïdes et a pour objet un procédé pour transformer le composé S de Reichstein ou un 21-ester de celui-ci en un dérivé 1,2-déhydro ( par exem- ple, la 3 1,4- prégnadiène-17 c( ,21-diol-3,20-dione ou un 21-ester de celle-ci) à l'aide de certains microorganismes.
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A Le composé S de Reichstein, qui est la 64--pr<égnane -17 c(, 21-diol-3,20-dione sera qualifié ci-après, pour être bref,
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de "composé Star ou "S"¯7 .
Plus spécifiquement, l'invention consiste essen- tiellement à soumettre le compose S ou un 21-ester de ce composé à l'action de fongi (ou d'enzymes de ceux-ci) de
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.'ordre Mouillâtes, famille des Tubervulariaceae, de pré- férence des genres Cylindrocarpon et Fusarium, et à récupé- rer le 1, 2-déhydro-stêroïde ainsi formé.
Aiasi, il a été constaté que les fongi Cylinlrocarpon radicicola ATCC 11011, Fusarium sp ATCC 11599 et Fusarium javanicum , var. ensi- forme QCC 52/).'/Collection de cultures de Quatermasterdes Quatermaster Général Laboratories, Philadelphie , Pennsyl- vanie on tun degré élevé d'activité dans le procédé de déshydrogénation suivant l'invention, chacun de ces orga- nismes forment, entre autres, le stérôïde connu que consti- tue le 1,2-dihydro-S, ce stéroïde présentant une valeur connue comme intermédiaire dans la préparation de 1,2-de- hydrohydrocortisone et d'autres dérivés stéroïdes physio- logiquement actifs.
Les organises forment aussi, dans
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Certaines conditions, de la .enlolactozle et de la /j ' -prcgnadiène-17 c( ,2 ; ,2.-t:riol-3-one , ce dernier composé constituant un nouveau sbérolde, qui peut être oxydé après 21.-mozroacylatiou en un 21-ester de 1,2-dehydro-S.
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Lors de la mise en oeuvre de la présente inven- tion, la déshydrogénation peut s'effectuer dans une culture en développement, soit en ajoutant le composé S ou un 21-- ester de celui-ci à la culture pendant la période d'incu- bation, ou en ,l'incorporant au milieu nutritif avant inoculation- Dans tous les cas, des sources assimilables de matières azotées ( poutpromouvoir la croissance)et des matières carbonées (comme source d'énergie) doivent être présentes dans le milieu de culture. De même, une alimen- tation adéquate en air stérile doit être maintenue pendant l'oxydation, par exemple par les techniques conventionnel- les de (1) l'exposition d'une grande surface du milieu à l'air ou (2) de la culture submergée.
Comme substrat stéroïde,on peut utiliser le com- posé S lui-même ou un 21-ester de celui-ci. Gomme esters appropriés, on peut citer les esters d'acides aliphatiques (par exemple, les esters d'acides alkanoïques et spéciale- ment les esters d'acides alkanoiques inférieurs, tels que l'acétali, le propionate, le butyrate et l'ananthate) , les esters d'acides aromatiques (par exemple, les esters d'aci- des aromatiques d'hydrocarbures, tels que le benzoate), les esters d'acides araliphatiques (par exemple, les esters d'acides aralkanoiques et'hydrocarbures, tels que le phényl- acétate et le ss -phénylpropionate). Les esters particulière- ment préférés sont ceux des acides carboxyliques d'hydro- carbures ayant moins de 10 atomes de carbone.
Les sources de facteurs promoteursde croissance azotés sont celles normalement utilisées dans ces procédés.
Il peut s'agir des produits organiques naturels (tels que farine de grainesde soja, liqueur de macération de mais, extrait de viande et/ou solubles de distillateur) ou de
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produits synthétiques, tela que les nitrates et composés
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.:1:,n,lOlliC] ne s .
Parmi les sources d'énergie appropriées pouvant litre utilisées dansle procédé suivant l'invention, on peut citer (a) les lipides, spécialement (1) les acides gras ayant au moins 14 atomes de carbone, (2) les graisses ou (3) leurs mélanges, tels que, en ce qui concerne les grais- ses, l'huile de lard, l'huile de graines de soja, l'huile de lin, l'huile de grainesde coton, l'huile d'arachide, l'huile de coco, l'huile de mais, l'huile de ricin, l'huile de sésame, l'huile de palme brute, le suif de mouton, l'hui- le de spermaceti, l'huile d'olive, la tristéarine, la fripai*
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mitine, la trioléine et la trilamine, et, en ce qui concer- ne les acides gras, les acides'stéarique, palmitique, oléi- que, linoléique et myrisbique;
et (b) d'autres matières con- tenant du carbone, telles que le glycérol, le glucose, le fructose, le dextrose, la sucrose, le lactose, le maltose, les dextrines, les amidons et le petit lait . Ces matières peuvent être utilisées à l'état purifié ou sous forme de concentrats, tels que le concentrât de petit lait, la li- queur de macération de mais ou les moûts de graines ( par exemple, moûts de mais , de froment ou d'orge). Des mélan- ges de produits mentionnés ci-dessus peuvent évidemment être utilisés. Il est cependant à noter que le substrat stéroïde est ajouté au milieu de fermentation essentielle- ment comme précurseur et non comme source d'énergie .
Les exemples suivants illustrent l'invention,
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celle-ci n'étant ce peiidiiiiltil.1r-,irle lit limitée .
J.:.lÚ,'"l'LI!.: 1. - (a) -Fermentation. -
On prépare un milieu do composition suivante:
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<tb> - <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 6,0 <SEP> g
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<tb> - <SEP> NH4H2PO4 <SEP> 3,0 <SEP> g
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<tb> - <SEP> CaCO3 <SEP> 2,5 <SEP> g <SEP>
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<tb> - <SEP> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> 2,2 <SEP> g
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<tb> - <SEP> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 2,5 <SEP> g
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<tb> - <SEP> Dextrose <SEP> 10,0 <SEP> g
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<tb> - <SEP> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
Le milieu est ajusté à un pH de 7,0 + 0,1.
Puis, des portions de 50 cc du milieu sont réparties dans des flacons d'Erlinmeyer d'une capacité de 250 ce. Les flacons sont bouchés à l'aide d'un tampon de coton et stérélisés de la manière usuélle (par exemple ,par chauffage à l'auto- clave pendant 30 minutes à 120 C). Après refroidissement, chacun des flacons est inocule à l'aide d'une suspension appropriée de spores de Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011 par exemple avec environ 1/5ede la culture en surface sus- ceptible d'être mise en suspension sur gélose inclinée de Sabourand vieille de 7 à 10 jours.
Après 65 heures d'inocu- lation à 25 C sur un agitateur à mouvement de va-et-vient à 280 cycles par minutes, un transfert de 10% en volume est effectué sur un milieu frais présentant la composition sus-indiquée. L'inoculation est poursuivie pendant 48 heu- res. Puis, 1,013 g de composé S dans.40,5 cc de méthanol absolu sont ajoutés à raison de 0,5 ce par flacon. Après une période additionnelle de 47 heures, les cultures sont filtrées sur un tampon de Seitz. Le mycélium est lavé sur ' l'entonnoir avec environ 400 ce d'eau, de façon à donner un volume total de filtrat d'environ 4,1 litres.
(b) Extraction.-
4 litres du filtrat de culture (1 g de composés) sont extraits à l'aide de 4 fractions d'un litre de chlo- roforme. Par évaporation sous vide du chloroforme, on ct- tient environ 596 mgr de résidu cristallin.
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Par trituration de ce résidu avec de l'acétone, on obtient
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environ 4-60 mgr de matière cristalline, qui fô-urnit après recristallisation dans de-l'éthatiol à 95/0, eiiviroll,-320i,mgr. de l'-pre,nadiène-17 c(,21-diol-3,20-diotie pure (1,2-dehy- dro Composé ,8), ayant les propriétés suivantes: P.T'.etmiron 240-242 C; o(T .D3 +57 (c=0,70 dans chloroforme); A alc. 244mu ( L = 16.800); z n â' 1 3 00-3 , 06 t max max />,;.1 ' (OH), 5,1u (20-béto), 6,00 u , 6,18 jxk l'-3-cétone).
Analyse Calculé pour C2lH2804 (344,43): C=73,22;ô; H=8,19% Trouvé : C=73,14%; H=8,08% La substance ne peut pas être distinguée d'un
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échantillon authentique de l,2-deh5rdro-.
EXÓ1'1I>LE 2.-. ,
Le stade (a) de l'exemple 1 est répété en utili- sant du 21-acétate du composé S au lieu du composé S. Par extraction du filtrat de la culture selon le mode opératoi- re du stade (b) de l'exemple 1, on obtient de la # 1,4 -pré-
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gnadiène-17 ci ,21-diol-3,20-dione, que -l'on ne peut pas distinguer du produit formé dans l'exemple 1 ou d'un échan- tillon authentique.
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E);};.1P.LE 3. - (a) Fermentation.- On prépare un milieu de composition suivante:
- matières solides de liqueur de macération
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<tb> de <SEP> maïs <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb>
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- NH4-H2P 4- 3,0 g
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<tb> - <SEP> CaCO3 <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb>
<tb> - <SEP> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> 2,2 <SEP> g <SEP>
<tb>
<tb> - <SEP> Composé <SEP> S <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>
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- Eau distillée q. sr ad 1 litre
Le milieu est ajuste à un pH de 7,0 + 0,1. Des fractions de 100 ce du milieu sont nlors reparties dans
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des flacons dt'Lrlenmeyer d'une capacité de 5UU ce et les
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flacons sont bouchés à l'aide de coton et stérilisés de la manière habituelle (par exemple, par chauffage en auto- clave pendant 30 minutes à 120 C).
Après refroidissement, chacun des flacons est inoculé à l'aide d'un inoculum végé- tatif à 5-10% de Cytindrocarpon radicicola ATCC 11011, l'inoculum végétatif provenant de cultures (ampoule lyophi- lisée ou culture inclinée sur gélose) de 48 à 72 heures dans un milieu de composition suivante:
- Matières solides de liqueur de macération
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<tb> de <SEP> mais <SEP> 15 <SEP> g
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<tb> - <SEP> Sucre <SEP> brun <SEP> 10 <SEP> g
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<tb> - <SEP> NaNO3 <SEP> 6 <SEP> g <SEP>
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<tb> - <SEP> ZnSO4 <SEP> 0,001 <SEP> g
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<tb> - <SEP> CH2S04 <SEP> 1,5 <SEP> g
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<tb> - <SEP> Mg <SEP> S047 <SEP> H20 <SEP> 0,5 <SEP> g
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<tb> CaCO3 <SEP> 5 <SEP> g
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<tb> - <SEP> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> 2 <SEP> g
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> - <SEP> Eau <SEP> distilléd <SEP> q.s.ad <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
Les flacons sont alors placés sur un agitateur à mouvement de va-et-vient (120,5 cycles d'un pouce par minu- te)
et agité mécaniouement à 25 C pendant 3 jours. Le con- tenu des flacons est alors refroidi et , après ajustement du pH de la culture à environ 4¯ 0,2 à l'aide d'acide sul- furique, filtré sur un filtre Seltz, pour séparer le mycé- lium du milieu fermenté.
(b) Extraction.-
Le filtrat de la culture (4 litres) obtenu dans (a) cet extrait à l'aide de fractions de 4 litres de chlo- roforme et l'extrait chloroformique résultant ont évaporé jusdu'à siccité sous vide. Le résidu (environ 1,5 g) est dissous dans @u benzène, après quoi on ajoute de l'hexane jusqu'à début de trouble. La solution résultante est chroma- tographiée sur 30 gr de gel de silice.
Les premiers éluate @
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donnent de la # -testololactone, P.F.: environ 216-218 , ayant un spectre infra-rouge identique à celui d'un échan- tillon authentique L'élution subséquente à l'aide de chloroforme donne, cornue produit principal, de la # 1,4¯ pré- gnadiène-17 c( ,21-diol-3, 20-dione;
P.F. environ 242-244 ; [[alpha]] D 23 + 57 (chloroforme)
EXEMPLE 4. - (a) Fermentation.-
On opère cornue dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise comme organisme du Fusarium javanicum var. ensiforme QM 524 , que n'incubation additionnelle après l'addition du stéroïde est de 26 heures et que le volume y compris les liqueurs de lavage est de 3,45 litre s .
(b) Extraction.-
Le filtrat de la culture obtenue dans (a) .est ex- trait comme dans l'exemple 3 et le résidu provenant de l'é- vaporation du chloroforme (environ 822 mgr) est soumis à une cristallisation fractionnée dans de l'éthenol à 95% Ceci donne un total d'environ 438 mgr de # ' -prégnadiàue-17 d 21-diol-3,20-dione ; P.F. environ 242-244 ; identique à un échantillon authentique. Les liqueurs-mères provenant de la cristallisation en question sont évaporées jusqu'à siccité sous vide (environ 320 mgr). On dissout le résidu dans 3 @c de chloroforme et 15 ce de benzène et on chromatographie sur 7 gr de gel de silice .
La matière cristalline (environ 59 mgr) est éluée à l'aide de chloroforme (1050 ce); elle est identifiée comme étant de la # 1,4 -prégnadiène-17 d ,21-diol -3,20-dione par son point de fusion (environ 242-244 ) et son spectre infra-rouge.
En poursuivant l'élution avec de l'acétone à 5 dans du chloroforme (300 cc) et rie l'acétone à 100% dans du
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chloroforme (700 cc) on obtient un second composé qui, après cristallisation dans l'acétone, possède les proprié- tés suivantes:
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P.F. environ 193-194 ; c( 123 + 27o ( c= 0,40 dans chlo- roforme); ' ' a ax 245 T( t = 17 ioo) Nujol 2 85 T, 3 tt (OH), 6,olu, zou, 6,26 yu( /\ 1)4-3-cétone).
Analyse Calculé pour C21H3004 (346,.5): C=72,80fo N =8,73,,, Trouvé . C=72,66%; N=F,5$i Ces propriétés montrent qu'il s'agit de la 3 1'4-prE:gnadiène 17 c( , 203, 21-triol-3-one.
( c ) Acylation de l' 4-prégnadiène-17 c , 20/3, 21-triol-3- ,one.- 3 8 mg de 1' 4-prégnadiène-17 0( , 20/3, 21-triol-3- one sont acétylés avec 1 ce de pyridine et 1 cc d'anhydri- de acétique. Le diacétate résultant a les propriétés sui-
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vantes: P.F. environ 174-176 ; ±"(-7D + 1010 (c= 0,43 dans chloroforme); z max 244 jx ( = 17200); i 14 "j 01 Z 85 Al (OH), 5,75i(acétyle), 6,02i , 6,,15 f ,6,23u ( '-3-céto).
Analyse Calculé pour C25H3406 (430,52); C=69,74;0; H=7,96j Trouvé : C=69,49;,-; H=7,7zi La /\ 1A-Prégnadiène-17 c( ,20À21-triol-3-one peut être convertie en 21-acétate de ' l'4-prégnadiëne-17 d,21-diol- 3,20-dione par acétylation avec une mole d'anhydride acé- tique de manière à former le 21-monoacétate, suivie d'une oxydation à l'aide d'acide chronique dans l'acide acétique Le groupe 21-acétyle peut alors être enlevé par hydrolyse à l'aide de carbonate de potassium dans du méthanol pour donner le 1,2-dehydro-S.
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D'une manière similaire la l' 4-prC:; ;nacüètle--l'
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o( 20/fel- trio 1-3 -one peut être mono et/ou diacylée en utili- saut des anhydrides d'acides ou des halosanures d'acyle.
EXEMPLE 5. -
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(a) Fermentétion.-
On opère comme dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise du Fusarium@sp ATCC 11.599 comme organisme, que la période d'incubation après addition de stéroide est de 46 heures, que 0,513 g de composé S sont fermentes et que le volwne final est de 1,974 litres.
(b) Extraction.- Le. filtrat est extrait comme dans l'exemple 3 et le résidu provenant de l'extrait chloroformique (environ 2o9 ragr) est cristallisé dans de l'alcool à 95%. Ou isole
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ainsi environ 210 Mgr de /d l'':-préracJ.r.rle-17 d,?1.-diol3,CL dione, P. F. environ 244-246 , ayant un spectreinfra-rouge .identique à celui d'un échantillon authentique.
L'invention peut être mise en oeuvre de diverses autres manières sans sortir du cadre des revendications suivantes:
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.tCVLIiDICl1t.0lS . .- 1.- Procédé dans lequel on soumet un storoxde choisi dans le groupe comprenant le bzz 4 ¯pré-iiùiie-17 c{ ,2.1- diol-3,1C-dione et ses 21-esters à l'action cire ;.' enzymes de fongi de la famille des Tuberculariaceae dans un milieu aqueux/contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, et on récupère le 7., -d:hydrastrozde forme du ;:t:.lieu.
2.- Procédé suivant la r evr-alicction 1, dans le- quel les fongi a ont choisis parmi les gom-fis CO;i:ii.i.ï.:.¯.