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page 1, lignes bzz 18 -t 25 page Il, ligne'$7 et 31 page 12, lignes 9 et 13 page 13, lignes -24 .et Z8
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page T 5, lignes 6 et 1 m page 16,lignes 20 et24 page 18, lignes 3 -et 8 page 19, ligne 20
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lire "novohiocîn-ell au lieu de t1ca.tlwmY-Gim/J page 2. ligne 6,. lire ttnovo.bioclniqueM au lieu de neathomycinique".
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La présente invention est relative, de manière générale, à des procédés pour l'obtention d'un nouvel antibiotioue utile appelé "cathomycine" à partir de ses solutions brutes. Elle concerne plus particulièrement des procédés pour récupérer et concentrer cet antibiotique à partir de solutions brutes contenant des substances à activité cathomycinique y compris lesbouillons de fermentation, les concentrais bruts, les solutions diluées, les extraits et analogues .
La cathomycine est une substance antibiotique possédant un large spectre antibactérien et particulièrement active contre les microorganismes à gram positif formés pendant la culture aérobie, au sein d'un milieu nutritif aqueux approprié et dans des conditions contrôlées, du microorganisme Streptomyces sphéroïdes récemment découvert. Une culture viable de cet' organisme producteur de cathomycine a été déposée et ajoutée à la collection de cultures permanente du Département américain de l'Agriculture, Northern Régional Utilisation.
Research Branch, à Peoria (Illinois) et identifiée sous le n NRRL 2449. Il est à noter que la cathomycine peut aussi être produite par des mutantes de cet organisme ,t elles que celles pouvant être obtenues par sélection naturelle ou par l'emploi d'un agent mutant, l'irradiation par rayons ultra-violets ou rayons X, moutardes azotées et analogues .
Ce nouvel antibiotique se compose des éléments: carbone, hydrogène, azote et oxygène, qui sont combinés en une substance ayant approximativement la formule empirique:
C30-32H34-40N2O10-12 Cette substance réagit comme un composé organique acide vis-à-vis des réactifs alcalins, dans lesquels elle est aisément soluble. Parmi ces réactifs, on peut
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citer les solutions aqueuses de bicarbonates, de carbonates et d'hydroxydes de métaux alcalins. La substance en question pos- sède deux groupes de liaison de bases et peut être précipitée de sa solution dans des alcalis par acidification.
Elle est 'soluble dans les alcanols inférieurs,' .les cétones aliphatiques inférieures, l'acide acétique et le dioxane; elle est insolu- ble ou seulement faiblement soluble dans l'éther, le benzène, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, le tétrachlorure de carbo- ne,, le biçhlorure d'éthylène l'eau et l'acide chlorhydrique.
.De la cathomycine sensiblement pure a été obtenue sous deux variantes cristallines jauges, à savoir une forme de rosettes fondant à environ 152-154 c et une forme.d'aiguil- les plates fondant à environ 170-172 c Chacune de ces formes de l'antibiotique peut être transformée en une forme normali-' sée, qui peut être une forme amorphe ou submicrocristalline, par dissolution des cristaux dans de l'acétone, par addition ranidc à cette solution d'un volume relativement grand d'éther de pétrole, et par récupération de la matière normalisée pré- cipitée par filtration.
Les solutions aqueuses alcalines de cathomycine et les suspensions dans de l'huile'minérale de la forme normali- sée de ltantibiotique révèlent une absorption caractéristique, les premières dans la partie ultra-violette et les dernières dans la partie infra-rouge du spectre.
Une solution de catho- mycine sensiblement pure dans de l'hydroxyde de sodium aqueux 0,1N présente une pointe d'absorption d'ultra-violet caractéris -tique à 3070 #. Cette pointe d'absorption est l'indication d'une matière sensiblement pure ayant une absorbance spécifi- que de 600 mesurée à cette longueur d'onde, en utilisant une solution. .contenant un gramme de cathomycine pure par 100 cc de la solution contenue dans une cellule ayant un trajet d'absor tion de 1 centimètre. Une solution de cathomycine pure dans de
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l'acide chloraydriaue en solution aqueuse méthanolique 0,1N nrésente une nointe d'absorption dfuhra-violet'caractc:ristioue à 340 R. (Elli'' 390).
Une suspension dans de l'huile 1cm
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min- raie de cathomycine normalisée sensiblement pure présente
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ces Dointes d'absorption d'infra-rouge caractéristiques aux longue- ur d'ondes suivantes, exprimées en microns : 5,6-6,0 (1r:re;e),0,10, o,21, En,30, 6,49, 6,65, 7,4-7,6(large nalier), 7,7S, 7,96, 8,27(faible), 8,60 (palier), b,7(palier), -,15, V,40, 10,0-10,l(large), 10,28, lO,6ù(large) ,
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12,0-12,30, (large), 12,60-12,75 (large) , 13,07 et 13,39.
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La cathoJUycil1e cristalline sensiblement a une activité microbioloiaue d'environ 40uO unités à 5000 unités par mil-
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ligramme, déterminée par les méthodes de diffusion sandards
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en niaque et en cuvette, en utilisant du Bac il lus mogatherium ATGG 'j2.L5 connue organisme d'essai..Elle est optiquement active et présente des oouvoirs rotatoires: Lé[ 5 = -27e (c=l dans r.aun IN) et /-d., 15 = -44" (c=l dans pyridine).
La cathomycine agit de manière à inhiber principalement la croissance de microor¯:;a11is1aes à gram positif, bien ou'elle: télfloiqne aussi d'une certaine activité vis-à-vis des ,U:l.Cx'OOC'";F.3Il:l.SïïleS à grain négatif. Ainsi, elle inhibe la
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croissance des organismes suivants :
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1".
Dyogen8s var. albus ma. nyo;;elles var9 aureus Dipio coco us puel1Jfioniae (;orynebact;eril11n diphtheriae type gravis GoryncbacteriwJ1 diphtheriae type intormedius G()..!:;Yllobacteriu1 dl.yhtherïae tye mitis porynebacteriutti Kerose C:orynebacteriUt:1 rénale iMoisseria meningitidis Sarcina lutea (VU)
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M. pyogenes var. aureus insistant à l'auréomycine M. pyogene var. aureus résistant à la :streptomycine- streptothricine
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ii. yo;etes var. aureus résistant à la pénicilline Les milieux aqueux convenant pour la culture aérobie -1;. '.,. de souches de Strentomyces sphféroIdes, en'vue de produire de la cathomycine, sont, d'une manière générale, ceux convenant pour"là*production d'autres antibiotiques par culture d'autres 'h organismes du genre Streptomyces.
Ces milieux contiennent des sources de carbone assimilable, telles qu'un hydrate de carbone, des sources dtazote assimilable, telles que liqueur de macération de mais, hydrolysat de caséine, solubles de dis- tillateur et analogues., ainsi que des sels inorganiques et des traces de métaux requis pour le métabolisme voulu du microor- ' ganisme. Le milieu est, de préférence, maintenu à une tempéra-
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ture de ,z- à 28 C pendant la période, ordinairement d'environ 1 à7 jours, de culture du microorganisme.' Par uilleurs, une aération convenable est assurée pour obtenir une croissance
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... . -t optimum de l'organisme et une production optimum de cathomycine.
Les bouillons fermentes produits de cette manière ont une
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'-f : activité d'environ 150 à 2.000 unités par ce et les matières
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<#'# T.f solides de ce bouillon ont une activité de l'ordre d'environ . .' n* au - : ..
5 à 10 unités par mir de matières solides. La matière alltibio- tique peutêtre purifiée et récupérée sous une forme nlus pure
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.'h #*: par un certain nombre de procédés.
Un de ces procédés est le suivant : Tout le bouil-
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lon de fermentation est filtré après ajustement de la concen- tration en ions hydrogène à pH 9,0. Le filtrat est additionna d'une terre à diatomées en tant qu'adjuvant de filtration; après quoi le mélange est lentement acidifié par addition d'a-
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x- - . . cide minéral jusqu'à pH 2,0. Après filtrat Lon, le' gâteau est lavé à l'eau, extrait à pH 9,0 à l'aide de méthanol aqueux
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5 et L'extrait est concentre par évaporation du méthanol.
La concentration en ions hydrogène de la solution aoueuse est ajustée à un pH d'environ 9.0 après quoi cette solution est extraite à l'aide de n-butanol.
L'extrait;. butanolique est concentré jusqu'à un dixiè- me de son volume originel, ajouté' à 15 fois son volume d'eau à pH 9,0 additionné d'un adjuvant de filtration et amené len- tement à un pH de 2,0 par addition d'acide. Le mélange est filtré et le gâteau résiduel est séché sous vide, puis malaxé et trituré à l'aide d'éther de pétrole, jusqu'à ce qu'il ne se dissolve plus de matière colorée. Le mélange est filtré et le câteau de filtration est extrait;à l'aide d'éthanol. Ls solu- ! tion obtenue de matière bioactivé est soumise à une purifica- tion chromatograhique sur une colonne d'alumine lavée à l'a- cide.
Les impuretés présentes dans l'extrait éthanolique sont éliminées par adsorption sur alumine. La matière active rési- duelle est retirée tela colonne par lavage à l'éthanol; l'effluent et les liqueurs de lavage combinés sont concentrés jusou'à environ 5% de matières solides et diluées avec un neu plus d'un volume équivalent d'eau, après quoi on laisse l'antibiotique me cristalliser. Le produit ainsi obtenu a une activité de 2500 à 3000 unités par milligramme.
En formant un? .solution acétonique de ce produit, en la traitant avec du charbon de bois activé, en éliminant le charbon de bois et en ajoutant de l'ether de pétrole jusqu'à apparition d'un trouble, on obtient un produit cristallisé ayant une activité de 4500 à 5000 unités par milligramme.
On voit que ce procédé pour l'obtention de cathomy- cine comprend de nombreux stades, notamment des extractions répétées à l'aide de divers solvants préférentiels, des con- centrations ae solutions et la manipulation de formes de plus en plus puissantes des matières actives. Ce procédé a donc pour
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inconvénients de prendre du temps et de nécessiter un travail spécialisé conséquent et l'attention d'un personnel scientifi- quement compétent.
Un des objets de l'invention est constitué par des procédés d'obtention de cathomycine présentant une pureté et une activité biologique élevées,, des procédés, comparés au procédé susdécrit, étant plus direct, nécessitant une moindre manipulation de matière active et exigeant beaucoup moins de temps pour achever la transformation d'un lot de matière en produit final pur.
L'invention a encore pour objets : - un procédé pour obtenir de la cathomycine sensible- ment pure par traitement direct de concentrais bruts en conte- nant, de façon à obtenir une matière sensiblement pure sous forme cristalline ; - un procédé pour concentrer rapidement et efficace- ment la teneur en cathomycine de solutions aoueuses diluées en contenant et, en particulier, de bouillons de fermentation et analogues avant ou après leur filtration; -.un procédé pour obtenir, par des techniques conti- nues d'extraction par solvants, une récupération sensiblement complète de cathomycine dans des solutions aqueuses diluées contenant de.la cathomycine.
D'autres objets de la présente invention ressortiront de la description détaillée suivante.
De manière générale, conformément à l'invention, de la cathomycine est obtenue et récupérée de bouillon de fermen- tation bruts '. avant ou après filtration ou de solutions aqueu- ses contenant de la cathomycine, par extraction de la solution en milieu acide, à l'aide d'un solvant d'extraction organique tel que défini plus loin, de préférence . un ester alcanolique, . inférieur d'un acide alcanoique inférieur, suivie d'une nouvel-
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le extraction dans une solution aqueuse tamnon alcaline, dont l'."ntibiotique peut être récupéré.
Selon certains aspects plus limités, le procédé sui vent l'invention consiste à extraire des solutions diluées brutes contenant de la cathomycune à l'aide d'un solvant organique, tel que défini plus loin, à une concentration en ions hydrogène inférieure à pH 7,0 environ, de préférence à pH 6,5, à extraire à son tour cet extrait organique à l'aide d'une solucion aqueuse tampon de préférence contenant un solvant organique- notaire, miscible à l'eau et de faible poids moléculaire, teloue méthanol, N,N-diméthylformamide ou éthylène glycol, à une concentration en' ions hydrogène ou pH d'au moins 8,5 et, de préférence, à .or 10,
0 De la cathomycin cristalline sensiblement Dure peut être obtenue par concentration de cet extrait aqueux et addition au concentrât d'un alcanol inférieur et d'un acide alcanoïque inférieur, :de préférence du méthanol et de l'acide acétique respectivement.
La sélection du solvant organique à utiliser dans l'extraction précédenteest un facteur critique dans le @ nrocédé suivant l'invention. four pouvoir convenir, ce solvant doit. être une substance neutre, faiblement polaire seulement non miscible à l'eau, soluble dans l'acide orthophosphorique concentré et froid et dans l'acide sulfurique concentré, liquide aux températures ambiantes habituelles et choisies dans le groupe comprenant les esters, les cétones et les alcanols supérieurs a.u butanol dans la série des homologues alcanoliques.
Parmi les substances qui se sont avérées satisfaisantes dans cette opération d'extraction, on peut citer l'acétate d'amyle, oui est le solvant préféré, la mthyl-isobutylcétone, l'acétate d'éthyle, l'alcool isoamylique et l'acétate de n-butyle.
Pour-permettre une meilleure compréhension de l'ob , jet de la présente invention et de ses modes de réalisation les
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meilleurs, on en décrira à présent quelques forces drexecution présentement préférés, étant entendu que ces formes d'exécution ne sont données qu'à titre illustratif et non à titre limita- tif.
EXEMPLE 1. -
Une souche productrice de cathomycine de Streptomyces sphéroïdes NRRL aqueux 2449) est cultivée, par fermentation aérobie en immersion dans un milieu nutritif approprié, pendant une période et dans des conditions telles que la production : désirée de cathomcyine se Droduise dans le bouillon de fermen- tation. Un adjuvant de filtration, tel que de la terre à dia- tomées. ou analogue, est ajouté à l'ensemble du bouillon à la concentration en ions hydrogène de la récolte, soit à un pH d'environ 7,0-8,0, après quoi on filtre et on lave le gâteau ' de filtration au moyen d'eau chaude.
Le volume du filtrat et des eaux de lavage combinés est supérieur d'environ 1/5e à ce- lui du bouillon avant fermentation.
Le bouillon est extrait dans un appareil d'extrac tion à contre-courant anproprié, à l'aide d'un volume d'acéta- te d'exyle égal à un dixième du volume du bouillon filtré; lextraction est répétée avec un autre volume équivalent d'acé- tate damyle êt les extraits sont combinés. Il importe que la concentration en ions hydrogène de la phase aqueuse, pendant .cette opération d'extraction, soit réglée à un pH d'environ
6,3 par addition d'un acide minéral approppié, tel que l'aci- de sulfurique.
Le stade suivant du procédé consiste à utiliser un solvant d'extraction aqueux, qualifié dans le présent mémoire, pour la commodité, da "solution tampon alcaline", qui peut être préparée comme suit : environ 10 gr de carbonate de sodium et. 8 gr de bicarbonate de sodium sont dissous dans 950 ce d'eau et 50 cc de méthanol sont ajoutés pour obtenir un volume
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total d'un litre de solution* Les extraits combinés à l'acétate
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d'amyle placés dans l' an!Jà:t'èi 1 d'extraction à contre -courant sont extraits à l'aide de cette solution tampon alcaline, en:
utilisant cette dernière dans la proportion de 1/5e du volume des extraits, puis l'extraction est répétée encore une fois avec un volume équivalent de solvant d'extraction aoeux il est très Important que la concentration eu ions hydrogène de la phase aqueuse soit pendant Cette opération
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tl ipxtrMtiôl1, maintenue à eu au voisinage de pu lu, sans être inférieure à j9I=I ,'3'.3 une quantité plus grande de.laa.li étant, au besoin,
ajoutée à Cette fin* Les extraits aqueux obtenus de cetbe manière sont
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combinés et concentrés par êVapoî'ê.tlt5tl, te oui a aussi pour effet de chasser l'acétate d'ahiylê* On ajoute ensuite un acide minéral, tel gué l'acide è1ïlô:t'hytil'lôUê, jusqu'à ce que la concentration en ions hydrogène atteigne le pH 2,3...2)6.
Ceci provoque la dét:ol!l1)úf:iti li du sel sodique de èâthÓI11'ßtd.l1è dalla la solution et le précipitation de dâthÓhlydiu!'3 j ee précipité étant récupéré par fiitration Le résidu de ìlbratiod est pesé et dissous dans une Quantité suffisante de méthanol, pour former une solu
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tion contenant environ lU/J en poids de matières solides, anres oua], on ajoute suffisH bllent d'eau et d'acide acétique pour aue, dans la solution finale, les proportions en volume de méthatiôl,
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d'eau et d'acide acétique soient de 10:4:l!.
De la cathomycine cristalline pure se Br'nare de la solution et est récupérée dsï1 l iltratioll les cristaux smit lavés avec Un mélange de 10 parties en volume de méthanol et de t.. parties en volume d'eau, nuis séchés sous vide à des températures inférieures à 45 c environ
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1:i.lifa:-.353L'' .. -..
\.)1.1 rcuùte le mode opératoire décrit dans l'exemple 1
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avec la seule modification suivante : la solution alcaline tampon utilisée est une solution aqueuse d'hydroxyde ammoni- . que contenant 5% en volume de méthanol. La concentration en
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hydroxyde anullolliq,ue,:de -assfctie .solution est ajustée de façon gouraprès extraction de la oolutiool,:!d ';.gc"é."t.at:e udta.nj1, la COl1tr.ation Elfl1ions hydrogène "de l'extrait aqueux n'est pas inférie.are pH *±r5 environ. La cathomycine cristalline obtenue de cet- te manière est identique à celle obtenue de la façon décrite dans l'exemple 1.
EXEMPLE 3.- 'On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 2 jusqu'au stade d'extraction de la solution d'acétate d'amyle à l'aide d'une solution tampon alcaline, après quoi cet extrait est traité comme suit : Les extraits méthanoliques ammonia- caux aqueux combinés' sont extraits au moyen d'acétate d'amyle en une opération à contre-courant en deux stades, en utilisant dans chaoue stade un volume d'acétate d'amyle sensiblement égal à 1/lOe du volume de la solution .aqueuse à extraire et en opérant à un pH de 6,5. Les extraits à l'acétate d'amyle obtenus de cette manière sont combinés et soumis, à leur tour, à une extraction à contrecourant en deux stades,
en faisant usa- ge d'une solution aqueuse d'hydroxyde ammonique contenant 30% en Volume de méthanol et en contrôlant la concentration en ions hydrogène pendant l'extraction, de façon à maintenir un pH de
9,5. Le volume de solvant d'extraction aqueux utilisé dans cha- que stade .de cette opération d'extraction est approximativement égal à 1/5e du volume des extraits combinés à l'acétate d'amyle* On ajoute du méthanol et de l'acide acétique aux extraits a- queux combinés, de manière à produire un mélange contenant du méthanol, de l'eau et de l'acide acétique en proportions volu- métriaues de 10:4:1, en sorte que de la cathomycine cristalline pure se sépare sous forme d'un précipité, qui est récupéré.
Ce
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produit est identique à ceux obtenus de la manière décrite dans les exemples précédents.
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E..G::jP1E 4.-
On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, en utilisant tout le bouillon de fermentation, sans filtration, cornue matière de départ. Dans ce cas, le pH de tout le bouillon, qui au moment de la récolte est d'environ 7,0-8,0, est ajusté à environ 6,5 après quoi. on opère comme décrit dans l'exemple susmentionné.
La cathomycine cristalline ainsi obtenue est identique aux produits obtenus par les modes opératoires décrits dans les exemples précédents.
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i: :.'1: 5.-
Une solution Moyennement alcaline de cathomycine est extraite, dans un appareil d'extraction approprie, à l'aide d'un volume d'acétate d'éthyle approximativement égal à un dixième du volume de la solution, puis l'extraction est répé tée avec un autre volume équivalent d'acétate d'éthyle et les extraits sont. combinés.
Il importe que la concentration en ions hydrogène de la Dhase aqueuse, pendant cette opération d'extraction, soit ajustée et maintenue à environ pH 6,5 par addition à cette phase d'un acide approprié, tel que l'acide sul- furioue ou un autre acide minéral courant.
Le stade suivant du procédé consiste à utiliser un solvant d'extraction aqueux, qualifié ci-après de "solution alcaline tampon", et consistant en une solution aqueuse d'hy
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droxyde dmmonique contenant 5; en volume de méthanol. Les ex- traits à l'acétate d'éthyle combinés sont extraits, dans un appareil d'extraction approprié, à l'aide de cette solution alcaline tampon en utilisant cette dernière dans la proportion de 1/5e du-volume desdits extraits et l'extraction est répétée encore une fois avec un volume équivalent du solvant d'ex traction aqueux.
Il est très important que le pH de la nhase
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aqueuse. soit, maintenu à environ 10,0 tout en n'étant pas infé- .rieur à 9,5 pendant cette opération d'extraction, une quantité supplémentaire d'hydroxyde ammonique étant au besoin ajoutée a cette fin.
Les extraits méthanoliques ammoniacaux aqueux combi- nés sont extraits en deux stades à l'aide d'acétate d'éthyle, ,en .utilisant, dans chaque stadeun volume d'acétate d'éthyle approximativement égal à l/lOe du volume de la solution aqueu- se en cours d'extraction. Pendant cette opération d'extraction, la concentration en ions hydrogène est ajustée et maintenue à pH 6,5 environ.
Les extraits-à l'acétate d'éthyle obtenus de cette manière sont combinés eti, à leur tour, soumis à une extraction en deux stages, en faisant usage d'une solution aoueuse d'hydroxyde ammonique contenant environ 30% en volume de méthanol et en contrôlant la concentration en ions hydrogè- ne de la phase aqueuse pendant l'extraction de façon à la main- tenir à pH 9,5. Le volume de solvant d'extraction aqueux uti- lisé dans chaque stade de cette opération d'extraction est ap proximativement égal à 1/5e du volume des extraits combinés à l'acétate d'éthyle.
Du méthanol et de l'acide acétique sont ajoutés aux fractions aqueuses combinées, de manière à produire un mélange contenant du méthanol, de l'eau et de l'acide acé- tique dans les proportions de 10:4:1 en volume, en sorte aue de la cathomycine pure se sépare sous forme d'un précipité et est récupéré. Ce nroduit est identique à ceux décrits dans les exemples précédents.
EXEMPLE 6.-
Une solution moyennement alcaline de cathomycine est extraite, dans un appareil d'extraction approprié, à l'aide d'un volume de méthylisobutylcétone approximativement égal à un dixième du volume de la solution, puis l'extractin est répétée avec un autre volume équivalent de méthylisobutylcéto-
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ne'et les extraits sout combinés; Il importe que la concentration en ions hydrogène de la phase aqueuse, pendant cette- opération d'extraction, soit ajustée et maintenue à environ pH .
6,5, par addition à cette phase d'un acide approprié, tel que l'acide sulfurique ou un autre acide minéral courant.
Le stade suivant du procédé consiste à utiliser un solvant d'extraction aqueux, qualifié ci-après de "solution alcaline tampon et consistant en une solution aqueuse d'hy droxyde ammonique contenant 5% en volume de méthanol. Les ex - traits à la méthylisobutylvétone combinés sont extraits, dans un appareil d'extraction approprié, à l'aide de cette solution alcaline tampon, en utilisant cette dernière dans la proportion de 1/5edu volume desdits extraits et l'extraction est répétée encore une fois avec un volume équivalent du solvant d'extraction aqueux, il est très important que le pH de la nhase aqueuse soit maintenu à environ 10,0, tout en n'étant pas inférieur à 9,5 pendant cette opération d'extraction,
une Quantité supplémentaire d'hydroxyde ammonique étant au besoin ajoutée à cette fin. Les extraits méthanoliques ammoniacaux aqueux-combinés sont extraits en deux stades à l'aide de mé thylisobutylcétone en utilisant dans' chaque stade, un volume de cétone'approximativement égal à l/lOe du volume de la solution aqueuse en cours d'extraction. Pendant cette opération d'extraction, la concentration en ions hydrogène est ajustée et maintenue à pH 6,5 environ.
Les extraits à la méthylisobu tylcétone obtenus de cette manière sont combinés et, à leur tour, soumis à une extraction en deux stades, en faisant usage d'une solution aq ueuse d'hydroxyde ammonique contenant environ 30% en volume de méthanol et en contrôlant la concentration en ions hydrogène de la phase aqueuse pendant l'extraction de façon à la maintenir à pH 9,5.
Le' volume de solvant d'ex- .traction aoueux utilisé dans chaque stade de cette opération
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d'extraction est approximativement -:al à 1/ , e du volume des extraits combinés à la 1fl0tllylisobutyluétoae. i7unsléthatiol et de -1' acide- acticue sont ajoutés aux fractions aoueuses combinées, de- manière à produire un mélange contenant du méthanol, de 1'("<,\1 .It; de'l'acide" acétique dans les proportions de 10:4:1 en .lfo1:ume:, en..sorte que -de In cathomycine pure se 8.<'nHre sous forme d'un -précipité et. esté, récupéré. Ce produit est identique à ceux décrit dans les exemples précédents.
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BAYP18 7..- 'ne'solution moyennement alcaline de cathomycine est extraite', dans un appareil d'extraction appropriée à l'aide
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d'un volume d'alcool- isoamylique approximativement égal à un dixième du 'volume de la-solution, puis l'extraction est répétée avec- un autre volume équivalent d'alcool isoamylioue et les'extraits sont combines. Il importe oue la concentration en ions hydrogène de la phase aqueuse, pendant cette opération 'd'extraction, soit ajustée et maintenue à environ pH 6,5,par
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addition à cette phase d'un acide ê)D'1roprié, tel que l'acide sulfurioue ou un autre acide minéral courent.
Le stade suivant du procédé consiste à utiliser un solvant d'extraction aaueux, qualifié ci-après de "solution
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alcaline tampon" et consistant en une solution aoae.use d'hy- droxyde ammonioue contenant 5 en volume de méthanol. Les extraits à l'alcool isoamylique combinés sont extraits, dans
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un annare.tl d'extraction am:#o'1rié, à l'aide de cette solution alcaline tampon, en utilisant cette derrière dans la pronortion de 1/5e du volume desdits extraits et l'extraction est répétée encore une fois avec un volume équivalent du solvant d'extraction aqueux.
Il est 'Grès important oue le pH de la. phase aqueuse soit maintenu à environ 10,0 tout en n'étant .pas inférieur à 9,5 pendant cette opération d'extraction, une quantité supplémentaire d'hydroxyde amuonique étant au besoi
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ajoutée à cette fin. lies extraits méthanoliques ammoniacaux aoueux combinés sont extraits en deux stades à l'aide d'alcool isoamylique en utilisant dans chaque stade, un volume d'al-. cool isoamylique approximativement égal à 1/lUe du volume de la solution aoueuse en cours d'extraction.
Pendant cette opé- ration d'extraction, la concentration en ions hydrogène est ajustée et Maintenue à pH 6,5 environ. Les extraits à l'alcool isoamylioue obtenus de cette manière sont combinés et, à leur tour, soumis à une extraction en deux stades, en faisant usage d'une solution aqueuse d'hydroxyde ammonique contenant environ 30% en volume de méthanol et en contrôlant la concentration en ion hydrogène de-la phase aoueuse pendant l'extraction de façon à la maintenir à pH 9,
5 Le volume de solvant d'ex- traction aqueux utilisé dans chaque stade de cette opération d'extraction est approximaativment égal à 1/5e du volume des extraits combinés à l'alcool isoamyliaue . Du méthanol et de l'aciae acétique sont; .ajoutés aux frac Ions aqueuses combi- nées, de manière à produire un mélange contenant du méthanol de l'eau et ue l'acide acétique dans lesproportions de 10:4:1 ,-il volume, en sorte que la cathomycine Dure se sépare sous forme d'un précipité et est récupérée. ce produit est identique à ceux décrits dans les -exemples précédents.
EXEMPLE 8 une solution moyennement alcaline de cathomycine est extraite, dans un appareil d'extraction approprié à l'aide d'un volume d'acétate de n-butyle approximativement égal à un dixième du volume de la solution, nuis l'extraction est répétée avec unautre volume éauivalent d'acétate de n-butyle et les extraits son(. combinés. il importe que la concentration en ions hydrogène de la phase aqueuse, pendant cette opération d'extraction, soit ajustée et maintenue à environ pH 6,5 par addition à cette phase d'un acide approprién tel que l'acide
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sulfurique ou un autre acide minéral courent.
Le stade suivant du procédé consiste à utiliser un solvant d'extraction aqueux, qualifié ci-après de "solution' alcaline tampon" et consistant en une solution aqueuse d'hy droxyde ammonique contenant 5% en volume de méthanol Les extraits d'acétate de n-butyle combinés sont extraits, dans un anpareil d'extraction approprié, à l'aide de cette solution alcaline tampon, en utilisant cet'ce dernière dans la proportion de 1/5e du volume desdits extraits'et l'extraction est répétée encore une fois avec un volume équivalent du solvant d'extraction aoueux.
Il est très important que le pH de la phase aoueuse soit maintenu à environ 10,0 tout en n'étant pas inférieur à 9,5 pendant cete opératin d'extraction, une quantité supplémentaire d'hydroxyde ammonique étant au besoin ajoutée à cette fin..Les extraits méthanoliques ammoniacaux aoueux combinés sont extraits en deux stages à l'aide d'acétate de n-butyle en utilisant, dans chaoue. stade, un volume de l'ester approximativement égal à 1/10:
' du volume de la solution aqueuse en cours d'extraction. Pendant cet ce opération d'extraction, la concentration en ions hydrogène est ajustée et maintenue à pH 6,5 environ. les extraits à l'acétate de n-bu tyle obtenus de cette manière sont combinés et, à leur tour, soumis à une extraction en deux stades, en faisant usage d'une solution aquuse d'hydroxyde ammonique contenant environ 30% en volume de méthanol et en contrôlant la concentration en ions hydrogène de la phase aqueuse pendant l'extraction de façon à la maintenir à pH 9,
5 le volume de solvant d'extraction a- queux utilisé dans chaque stade de cette opération d'extraction est approximativement égal à 1/5e du volume tes extraits combinés à l'acétate de n-butyle. Du méthanol et de l'acide acétique sont ajoutés aux fractions aqueuses combinées, de manière
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à nroduire un mélange contenant du ucthanol, de l'eau et de l'acide acétique dans les proportions de lu:4:l'en volume, en sorte que de la cathomycine 'Jure se sépare sous forns d'un .
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précipité et est récupérée.
Ce produit est identiques à ceux décrits dans les exemples précédents.
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.tü::V±;:01G,d.'ÚU1S. -
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1. - Procédé dans lequel on soumet une solution aqueuse de cathomycine, dans des conditions acides, à une extrac-
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tison l'aide d'un solvant organique, on traite l' extrait au
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solvant organique à L'aide d'une solution aqueuse alcaline
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bc.i.tou et on récupère l'antibiotioue de la solution aqueuse
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résultante.
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-<:.- Procédé suivent la revendicaton 1, dons lequel le solv&nt orO;8uiC'ue d'extraction est choisi dans le groupe des esters, cétones et alcanols supérieurs au butanol dans le série des honolocùes butanoliques.
3.- Procède suivant la revendication 1, di .18 lequel le solvant organique d'extraction est l'acétate d t r.^, IT1P. lu. - Procédé suivant la revendication 1., l1<;iH3 Ir-ouel le solvant or::;ll1Í('ue d'extraction est la u'tl1ylÜwbutylc,:colle. j.- Procédé suivant la rcvf.tlcïicui;.LOt1 1, don;.; lequel -#* le solvent organique d'extraction est lq:,c:t:,tc. ,:i't:1rlE'.
Y;pC: d(- suivant la revendication 1, dans 1r?(llC'l' le solvant organique d'extraction est l'alcool i:JOa1.ly1.iC'u,.
7.- Procédé suivant 1s revendication 1, 6; a a lequel le solvant O1'.T;:I.l.LC)11P d'extraction est .LtaC't7tC-' de n-butyle. i .- procédé suivant la revendication 1, d:118 f.E.C'L1C'1. l'extraction de la solution Boueuse Le 1'["id0 du ,.oT.vr'.1:, organique est exécutée à une concentration en ion.:: hyoro -jtie de pF-1 joz< y -- 2roc6d,' suivant la revendication 7., d-.ns lequel la solution arueu.se tatitoon est une solution aqueuse de carbol1Btc- de sodium et de bicarbonate de sodium cont-. nrnt un $olv;:lt