<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne un nouvel antibiotique soluble dans l'eau, présentant des propriétés basiques, Qui sera désigné dans ce qui va suivre par la référence 11 7907, ses sels, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composés; l'invention concerne également un procédé de préparation de ces substances et mélanges de substances.
<Desc/Clms Page number 2>
L'antibiotique A 7907 se forme lors de la culture
EMI2.1
d'un actinomycète du genre des Streptomycese souche A 7907.
Cette souche a été isolée à partir d'une prise d'essai faite
EMI2.2
dans le sol de Zuoz, Canton de GraubUnden (Suisse) et a été conservée, sous cette désignation, dans les Laboratoires de la Demanderesse ainsi qu'àd l'Ecole Polytechnique Fédérale de Zurich, Institut de Botanique Spéciale.
EMI2.3
Le Streptoayces A 7907 forme un mycélium aérien brun d'étain à gris-rougeâtre et porte des chaînes de conidies qui constituent une caractéristique typique de la famille des Streptomyces. Le mycélium aérien présente de courtes spirales bien développées, comportant peu de spires. Les spores sont
EMI2.4
lisses. Il ne se forme pour ainsi dire pas doexopîgmerit.
Les milieux peptonéa ne subissent pas de décoloration méla-noMique La croissance dépend relativement peu de la température et le
EMI2.5
champignon se développe aussi bien à 18 qu'à 40 ; toutefois la croissance optimum se situe entre 25 et 32 Suivant la méthode de T.G. Pridham et de Gottlieb (Journal Bacteriology
EMI2.6
6 107 (19481), on observe une assimilation des composés carbonés comme le glucose, le L-arabinose, le L-xylose, le L-rhamnose, le fructose, le saccharose, l'inuline, la Dmannite, la D-sorbite, la taéso-inosite et la salleine, tandis que le raffinose n'est pas exploité.
Les caractéristiques morphologiques et physiolo- giques de la souche A 7907 sont analogues à celles du Strep-
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
tosayces fradiae (a.k3Bisn et OUrtis)o Waksman et Henrioi.
La px'ësent'3 intention ngert pas limitée, en ce qui a trait a la pi?éparation ti= l'antibiotique A 7907, à l'utilisation du SiIreptainyces A 7907 ou d'autres souches correupoiidant à la description mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces ogan1smeE, telles qu'elles sont obte3M'ss par exemple par sélection ou mutation, notamment nous l'influence ultra-vîolet ou des rayons X. ou BOUS l'action de moutarde à l'azote.
Pour la production de 1'antibiotique A 7907, on
EMI3.2
CMli'?c <3'3 manlère aérobie une souche de streptomycètas présentant les Proprlétéa du StroPtom7ces A 7907, par exemple a?:s une colution nutritive aqueuse renterrg-ant des hydrates de carbone, des composés azotés ainsi que des sels inorgani-
EMI3.3
qt;Q1, ju5qu'à ce que cette solution nutritive présente une ' action antibactériel1e notables puis on isole ensuite Ilantl- biotique A 7907.
La culture a lieu de manière aérobies c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, en culture immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans les flacons agités ou dans les fermenteurs connus. Comme température s'avèr appropriée une tem-
EMI3.4
pârature comprise entre 18 et 40 . na solution nutritive accuse, dans ce cas, un effet aiitibactérlal notable en gé- néral au bout d'un jour et demi à cinq jours.
<Desc/Clms Page number 4>
Comme hydrates de carbone assimilables, on envisage, par exemple, le glucose, le saccharose, le lactose, l'amidon ainsi que la glycérine. Comme substances nutritives azotées et, le cas échéant, comme substances favorisant la croissance, on citera les acides aminés, les peptides et les protéines ainsi que leurs produits de dégradation comme le peptone ou le tryptone, ainsi que des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le maïs et le froment, de résidus de distillation provenant de la préparation de l'alcool, de levure, de fèves, notamment du soja, de graines, par exemple de coton, etc., mais aussi des nitrates.
Parmi les autres sels inorganiques, la solu- . tion nutritive peut, par exemple, renfermer des chlorures, des carbonates, des sulfates de métaux alcalins, alcalinoterreux, du magnésium, du fer, du zinc et du manganèse.
L'antibiotique A 7907 préparable suivant la présente invention est une substance soluble dans l'eau qui, d'après des examens chromatographiques sur papier, est constituée par environ quatre composés très voisins. Ce produit est absolument insoluble dans les solvants organiques, surtout dans les solvants lipoïdes. L'antibiotique est basique et forme des sels qui sont en partie solubles, comme par exemple le chlorhydrate, dans certains solvants organiques tels que des alcools aliphatiques inférieurs. L'antibiotique se trouve presque complètement dans la solution
<Desc/Clms Page number 5>
nutritive, lors de la culture dans des milieux aqueux, tandis que le mycélium sékparé de ladite solution nutritive n'accuse pratiquement pas d'activité biologique.
Suivant ces propriétés, on peut, en vue d'obtenir l'antibiotique A 7907 à partir d'une solution de culture, ne pas extraire cet antibiotique avec des solvants organiques.
On peut, par contre, l'extraire de cette solution de culture dans le ces d'une réaction neutre ou faiblement alcaline à l'aide d'agents d'adsorption et l'extraire des adsorbats avec des liquides d'élution acides présentant avantageusement un pH inférieur a 4.Comme agents d'adsorption on envisage d'une part du charbon actif, par exemple de la norite, et d'autre part des échangeurs de cations, notamment ceux renfermant des groupes carboxyliques, comme par exemple la résine échangeuse connue dans le commerce sous le nom d'amberlite IRC-50.
Si l'on emploie du charbon actif comme agent d'ad sorption, 11 est approprié d'utiliser comme liquides d'élution aussi bien des solutions aqueuses acides que des solvants miscibles à l'eau renfermant des acides,, comme des alcools aliphatiques inférieurs et des cétones Un mélange à parties égales en volume de méthanol et d'acide formique normal s'est avéré particulièrement avantageux.
Etant donné qu'en dehors de l'antibiotique, le charbon actif adsorbe encore de la solution de cultures des quantités assez grandes
<Desc/Clms Page number 6>
d'impuretés en partie colorées, on lave avant l'élution de l'antibiotique la oolonne d'adsorption avec de l'éthanol, les autres conditions demeurant quant au reste inchangées, ce qui fait qu'on élimine une grande partie des substances accompagnatrices, l'antibiotique n'étant toutefois pas extrait.
A partir de l'éluat acide, on peut obtenir sous la forme d'une poudre blanche une préparation d'antibiotique fortement enrichie, en concentrant l'éluat sous vide à un petit volume, le solvant organique ainsi que la majeure partie de l'acide formique étant élimines, puis on ajoute ensuite de l'acétone au concentrât aqueux, avantageusement après avoir dilué avec 4 à 5 volumes de méthanol, lave le précipité formé avec ce solvant, puis finalement le sèche.
Etant donné que l'éluat obtenu au charbon actif, notamment celui des solutions nutritives renfermant des cultures avec du carbonate de calcium, contient des quantités notables d'ions Ca, on sépare le calcium du concentrât, avant précipitation de l'antibiotique, avantageusement avec de l'acide oxalique.
Pour l'adsorption de l'antibiotique avec un éohangeur de cations, on utilise avantageusement ce dernier sous la forme H. L'élution a lieu avec une solution aqueuse diluée d'acide, le cas échéant après avoir préalablement lavé la colonne à l'eau distillée, les substances accompagnatrices inaotives étant éliminées. Comme agent d'élution, l'acide
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
chlorhydrique O,2-normal est particulièrement apprQP1ê. LOantlblotlque est renrermë dans l'éluat sous la forme d'un sel. les élyats obtenus avec les échangeurs de cations
EMI7.2
peuvent, comme tels ou après concontratlon sous vide, le cas êehdant après avoir été neutralisés, j, servir pour l'obtention <!'autres éparat1ons enrichies de 10antlblotlque.
Pour la préparation à l'état pur de ltant1b1ot1qua A 7907 à partir de p#dparat10na préalablement purifiées par adsorption à l'aide de charbon ou échangeur d'ions, on ajoute
EMI7.3
à leurs solutions aqueuses ajustées à un pH de 6e5 à 7,0, un volume tout juste suffisant pour la précipitation complets
EMI7.4
d'une solution aqueuse du sol d'un colorant asoyque renfermant des groupes sultonlquoop puis isole de l'antibiotique le sel de colorant diffieile!3@nt soluble qui 6@ forme. Si 1 on utilise comme sel de colorant azoxquop le sel de sodium de l'acide 4'-diiùé%hylawino-azobenzèns-4-1Sulfonique connu dans le commerce sous le nom d'Héllanthlne ou dzorange Illo il se sépare alors le sel de colorant (Hélianthate) de l'antibiotique A 7907, sous
EMI7.5
une forme totalement ou partiellement orlotalllsêe.
On peut recristalliser 1lh6llanthate de l'antibiotique dans l'eau ou le méthanol, ou dans des mélanges de ces solvants, mais aussi dans du formamide et de l'eau. Une fois recristallisé, il constitue une poudre brun-rouge Macroscopique. Examine au
EMI7.6
m1roscope# il forme dee paillettes Jaunes empilées ou des bâtonnets qui fondent à 186-1880 en se décomposant.
<Desc/Clms Page number 8>
Pour récupérer l'antibiotique du sel de colorant on fait réagir celui-ci en milieu aqueux ou alcoolique sur le sel d'un acide inorganique ou organique et d'une base organique, ce qui fait qu'il se forme le sel de l'antibiotique de l'acide correspondant et le sel de colorant de la base. Si pour cette récupération on utilise, par exemple., du sulfate de triéthylamine et qu'on effectue ladite réaction avec une suspension aqueuse de l'hélianthate de l'antibiotique, on obtient alors le sulfate de l'antibiotique qui est soluble dans l'eau ainsi que l'hélianthate de triéthylamine insoluble.
En ajoutant suffisamment de méthanol à la solution réactionnelle, cette dernière passe en solution tandis que le sulfate de l'anti- biotique seulement soluble dans l'eau, mais par contre complètement insoluble dans les alcools inférieurs, se sépare et peut être isolé, par exemple par filtration. On peut toutefois entreprendre aussi la réaction en solution alcoolique ou dans une solution formée d'un mélange d'alcool et d'eau, le sulfate précipitant aussitôt et pouvant être séparé de la solution de colorant.
Le sulfate ainsi obtenu de l'antibiotique A 7907 constitue une poudre incolore facilement soluble dans l'eau et le formamide, mais par contre totalement insoluble dans les solvants organiques tels que les alcools et les cétones, poudre qui présente une haute activité antibiotique.
A partir du sulfate, on peut, par exemple, obtenir
<Desc/Clms Page number 9>
le chlorhydrate de l'antibiotique par réaction en solution aqueuse sur du chlorure de baryum et isolement à partir de la solution débarrassée du sulfate de baryum ce chlorhydrate étant obtenu sous forme d'une poudre à peine colorée, facilement soluble dans l'eau ainsi que dans le méthanol, mais plus difficilement soluble dans l'éthanol. Par ailleurs,
il est également possible de préparer un chlorhydrate directement à partir de l'hélianthate de l'antibiotique en ajoutant à une solution ou suspension méthanolique dudit antibiotique un excès d'acide chlorhydrique concentré ou d'une solution d'acide chlorhydrique gazeux dans la méthanol, en précipitant le chlorhydrate forméd avec de l'éther et en isolant..
Pour éliminer de minimes impuretés colorées du chlorhydrate préparé suivant cette méthode, on filtre la solution méthanolique dudit chlorhydrate à travers une colonne de charbon actif, de préférence de noir de gaz,, le chlorhydrate étant obtenu après évaporation du solvant du filtrat sous la forme d'une poudre d'un blanc pur, qui,lors d'une évaporation très lente de sa solution aqueuse ou méthanolique, se sépare en partie sous forme cristalline;
ces cristaux se décomposent à 188 - 190 c
La préparation de l'antibiotique A 7907 sous forme pure peut avoir lieu aussi en précipitant celui-ci de ses solution aqueuses au moyen d'un acide organique par exemple du typa de l'acide picrique, tel que l'acide picrique lui-même
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
ou l'acide et7phnique ou au moyen d'acide pkrolon1que, nous torme d'un sel difficilement soluble.
Tandis que le picrate et le styphnate précipités sont à l'état amorphe et n'ont pas
EMI10.2
pu Otre amenés à l'état cristallin jusqu'à, présent - à tempéra- ture ordinaire, le styphante est liquide - , le picrolonate
EMI10.3
est obtenu à l'état oristallin, sous forme d'aiguilles réunies en faisceaux, de couleur jaune, qui fondent., après suintement, à 213 '- Sl4 Cs avec décomposition. Ces sels peu solubles peuvent être transformas par traitement avec des acides, par exemple avec de l'acide chlorhydrique ou de l'acide sulfurique, en milieu aqueux ou dans un solvant organique
EMI10.4
miscible à l'eau tel que le méthanol ou Itacdtonee en sels correspondants qu'on isole comme tels.
Suivant ce procédé d'enrichissement, on peut obtenir l'antibiotique par exemple
EMI10.5
à partir du sulfate purifia par llintermédlair# de lDhé11anthate., mais aussi à partir des éluats des sdsorbata obtenus avec du charbon et des échangeurs de cations.
D'autres sels cristallins, difficilement solubles
EMI10.6
dans l'eau, de 1'antibiotique A 7907 sont le relneekate* cristallisant en plaques irrégulières et se décomposant à
EMI10.7
1890 01 ainsi que le dili%urate (sel de l'acide 5-nitro- barbiturique). Ce dernier est à l'état de cristaux polyédri-
EMI10.8
ques OU d'aiguilles réunies en falaceauxj ces cristaux chauffes au-dessus de 1900 C Si agglomèrent en suintant et en noircissant peu à peu sans présenter un point de fusion
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
ou Ce déacmpos1tian popms 'Sit.
La blàc@ Ilbeo dO 2.'astiblotlqM's A 7907 est facllement a,cù;5l'ôle à parflxlz. do se3 Gel%, h partir du sulfata pae exemple rm-r rés.ct1ol1 6'11 milieu elueux cirir de 3.hy<rode de baryum. ne1xtPà-lioéàtion de la baryte en exés par du dloxydo de carbone, alial qne séparation du péc1p1t de carbonate et de sulfate do baryump et 1olement de lOantibiot1que= be-3o à l'aide d'un sous un froid poussé. La prépara- tion à partis* des sels avec utilisation d'un êchangour dOan1o ..,.:; baulque a lieu plus faellemontp par exemple en t:tiliàJ<nt la fcrste 1.13.rdloxy]Se du profit connu d8.Ha le com..
ZC'f.';( 1>ou? la dénomination "Dox-8".
LSant1biotlqua A 7907 est une base amorphe incolore iB11 est àc11mant soluble dans l'eau et dans les milieux a.MOx mais par contre est insoluble dans les solvant organlses Ln solution wzueuse de la baBo prdaente une réct1on s1câl1nGw Une solution à 1% d'une préparation obtenue à Icalde dudehanseurs datons prg3nte un pH de 10,5.
Avec les a1deaJl 1 antibiotique A 7907 tozome des a-,Ise parmi lesquels par exemple le sulfate et le chlorhydrate 1ncolorc sont trèm f&cl1emnt solublea dans 1 eau Le chlor-
EMI11.2
hydrate se dissout, en outre, dans les alcools aliphatiques
EMI11.3
1nrériur, notamncnt dn3 le m6thptnol. En espérant très lentement les solutions aqueuses ou méthano11quea, on peut aus8l obtenir, sous forma orlatallinex le chlorhydrate de
<Desc/Clms Page number 12>
l'antibiotique. Ces cristaux se décomposent, après suintement à 188 - 190 C. La chlorhydrate de l'antibiotique A 7907 présente la composition élémentaire suivante : C - 39,5%, H . 7,2% N 15,5%, O 19,8%, cl 17,2%, 20 21 0,8 dans l'eau).
Le sulfate de cet antibiotique n'a pas pu être obtenu à l'état cristallin jusqu'à présent
Le sel coloré de la base avec l'acide 4'-diméthyl-d amino-azobenzene-4-sulfonique (Hélianthate) est difficilement soluble, aussi bien dans les milieux aqueux que dans les milieux alcooliques. Ce sel se sépare de telles solutions saturées chaudes en paillettes qui, sous le microscope, ont un aspect stratifié et sont coloria en jauneo après recristalli nations elles se décomposent à 186 - 188 .
D'autres sels de l'antibiotique A 7907 dérivent, pas exemple, des acides acétique, palmitique, succinique, citrique ou pantothénique.
L'antibiotique A 7907 a le caractère d'un polypeptide ainsi que le montrent le spectre infra-rouge, les réactions de coloration ainsi que la composition élémentaire.
Le spectre infra-rouge du chlorhydrate de cet antibiotique, dans le nujol, présente des bandes entre autres à 3,0 , 3,45 4,95 , 5,85 , 6,05 6,40 6,87 7,28 7,65 8,10 , 8,90 9,37 Comme le montre un examen comparatif effectué par chromatographie sur papier, cet antibiotique est différent des antibiotiques incolores, solubles dans l'eau,
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
COMIU3# actifs vis-à-vis def3 bsctdrlea gram-positives et grcm-ngties, tels que la Streptomycine# la Streptothrlolne et la Eéorc1ne.
Malgré Igenalogle de la souche de Strepto- ïsyoes A 7907 qui produit le nouvel antibiotique, avec le Streptomyee xanthophaaut3., Lindssbeia, orfanimme qui forme l'antibiotique dénommé "GéÔwycifl@" @t la composition élémentaire très voisine des chlor-hlrdrates de lgantlblotlque A 7907 et de la Géomyoine (cf. H.. Brockmann et H. Musse "rJa:turw1ssenschaftenSf, Volume 41, page 451 (1954 h "Chcm:1schs Berichte" Voltime 87, page 1779 (1954) ). l'en%1biotique A 7907 n'est pas identique 8 la géoniyolne, car à
EMI13.2
l'encontre de cette dernière, il ne fournit pas de réaction
EMI13.3
à la nlnhydrîne et ne fournit aussi qu'une réaction de coloration 0xtrmement faible suivant Scaguch1. Par ailleurs, a la différence do Géonyoine, il montre une intense réaction au b1uret, qui fait défaut chez cette dernière. La réaction avec le multol est négative.
L'antibiotique A 7907 noect cependant pas non plus identique à la Cimmmicine polypeptide soluble dans l'eau produit par le Streptomyces cinnemoneue, Danodict, Pridham et Llndontelzer, qui est également semblable au Streptomyces A 7907# car la Cinnamyoîne renferme du soufre dans sa molé-
EMI13.4
cule et n'est par ailleurs efficace que contre les bactéries gram-positives, mais pas contre les bactéries grain-négatives.
L'antibiotique A 7907 possède une haute activité
<Desc/Clms Page number 14>
antibiotique vis-à-vis de divers organismes-tests. Si l'on utilise comme méthode-test in-vitro des séries de dilution (par puissance de 10) dans du bouillon glucosé, incubées à 37 pendant 24 heures, on obtient alors les concentrations suivantes qui sont encore inhibantes
<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
Concsntl.'ation
EMI15.2
<tb>
<tb> Organismes-tests <SEP> inhibante <SEP> en
<tb> g/cm3
<tb>
EMI15.3
irococcu3 pyogen@s, varo aureus '],0 ttlcrococcus pjogonoop var. aueU5 100 pdniolllino-réalstant Streptococous pyosenez 100 ï 3t;;X"eptococcus vir1de.nrn 100 i Corynebact0riú'm dipter1ai!t 1 1 Ezcher1ch1a coli 100 1 E,chGI'1chia colle streptomycino- 100 résistant - E.:
Jah"t'ich1a collp chlovomycét1no- 100
EMI15.4
<tb>
<tb> résistant
<tb> Salmonella <SEP> typhose <SEP> 10
<tb>
EMI15.5
. Ba.3.!aonella 6chottmueller1 10 hlgs3.1a. sonnel 100 1 Paeudomonas aeruginosa 100 1 !Clel>sj,e1ls. type A 100
EMI15.6
<tb>
<tb> Pasteurella <SEP> pastis <SEP> 100
<tb> Vibrio <SEP> cholerse <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> megatherlum <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 10
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> ' <SEP> 10
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
L'antibiotique A 7907 est également actif in vivo.
Lors d'une administration sous-cutanée de 50 mg/kg effectuée à 6 reprises sur des souris infeotées à l'Escherichie colle on a observé 100% de survivantes.Lors d'une application identique, on observe le même effet chez des souris infeo- tées au Klebaiella type A, de même qu'un effet chez des souris infectées au Salmonella typhi murium
La toxicité de cet antibiotique est minime. Ainsi par exemple une application sous-cutanée de 50 mg/kg répétée six fois est supportée sans dommages par les souris. Des doses plus élevées n'on pas encore été essayées.
Cet antiblitque ou ses sels peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple soue la forme de préparations pharmaceutiques renfermant les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou Inorganique,, appropriée pour une application entérale, parentérale ou locale. Comme substances pour cette matière de support, on envisage celle ne réagissant pas sur les nouveaux composés, comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliquea, des gommes, des polyalcoylène- glycols, la vaseline, la cholsestérine, ou d'autres excipients connus.
Ces préparations pharmaceutiques peuvent se présen- ter, par exemple, sous la forme de tablettes, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes de suppositoires, ou sous forme
<Desc/Clms Page number 17>
liquide àd l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsion le cas échéant elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires telles que des agents de consevation de stabilisation, des agents mouillants ou Elles peuvent encore aussi d'autres substandes précieuses en thérapeutique
L'invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.
L'intention est décrite plus en détail dans les exemple non limitatifs qui suivent dans lesquels les tempéra- teres sont indiquées en degrés centigrades.
<Desc/Clms Page number 18>
Exemple 1 ------- --- la culture du Streptomyces A 7907 est effectuée @ vant le procédé de culture immergée On utilise une solution nutritive renfermant par litre d'eau du robinet les substances additionnelles suivantes
EMI18.1
<tb>
<tb> Lactose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
La solution nutritive est stérilisée pendant 20 à 30 minutes sous 1 atmosphère effective dans les récipients d'ensemencement ou dans les fermenteurs.
La solution nutritive stérilisée présente un pH de 75 à 8,0. L'ensemencement a lieu dans une proportion allant jusqu'à 10% d'une culture végétative, partiellement spouelante, de l'organismes envissgé On incube en secouant bien ou en agitant à 27 les cultures étant sérées dans les fermenteurs avec environ un volume d'air stérile par volume de solution et par minute.
Après 70 à 120 heures d'incubation, la solution de culture atteint la valeur d'inhibition maximum par rapport aux organismes-tests (B-Subtilis B.megatherium, Staph.aureus, Esch. coli Candida vulgaris) On interrompt la culture et sépare le mycélium Inactif ainsi que d'autres composantes solides de la solution renfermant l'antibiotique, cela à l'aide d'une filtra-
<Desc/Clms Page number 19>
tion ou d'une centrifugation, en ajoutant; le cas échétant à la, solution de culture, avant la filtration; environ 1% d'un auxi liaire de filtration, par exemple de l'Hyflo Supercel. Le PH eu filtrat de culture est, en général, inchangé ou seulement: peu modifie par rapport à la solution nutritive stérilisée.
Si l'on utilise, à la place de la solution nutritive Indiquée ci-dessus des solutions renfermant par litre d'eau du robinet les Mélanges de substances nutritives sont indiquas ci-après sous a) à f), on obtient alors, après une culture analogue et un traitement analogue; des filtrats de culture présentant une activité antibiotique aussi 41cvée Au lieu d'obtenir une rapide filtration des cultures par additon d'Hyflo-supercel ou d'un autre auxiliaire de iltration on peut ajuster ladite solution de culture avant le filtration à un pH de 5 à l'aide d'acide chlorhydrique et eusuite en ajoutant une solution aqueuse de sulfate l'ajuster à une concentration de 0,5% en ce sel.
Mélanges de substances nutritives renfermant par litre d'eau les substances additionnelles suivantes :
EMI19.1
<tb>
<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
<tb>
<tb> b) <SEP> Glycérine <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> c) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Corn <SEP> Steep <SEP> liquor <SEP> 20g
<tb> (eau <SEP> de <SEP> gonflement
<tb> du <SEP> maïs)
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> d) <SEP> Glucose <SEP> 10g
<tb> Peptone <SEP> 5g
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 3g
<tb> (oxo <SEP> Lab <SEP> Lemoo)
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10g
<tb> e) <SEP> Glucose <SEP> 10g
<tb> Caséine <SEP> 3g
<tb> phosphate <SEP> secondaire <SEP> 2g
<tb> de <SEP> potassium
<tb> f) <SEP> Amidon <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Peptone <SEP> g
<tb> Levure <SEP> séchée <SEP> 1g
<tb> phosphate <SEP> secondaire <SEP> 2g
<tb> de <SEP> potassium
<tb>
Un filtrat ou centrfugat obtenu suivant les in- dications ci-dessus, d'une culture de Streptomyces A 7907 présente, en gênerai, un pH de 7,5 à 8.
Lorsque cela n'est pas
<Desc/Clms Page number 21>
le ces on ajuste le PH à cette valeur à l'aide d'une solution décanormal d'hydroxyde de sodium avant l'enrchisse ment du nouvel antibiotique. On ajoute ensuite au filtrat faiblement alcalin 1% de charbon actif (Norite) en vue de l'adsorption de l'antibiotique, puis agite mécaniquement la masse pendant une heure, la totalité de la substance active du point de vue antibiotique étant adsorbée par le charbon, On débarrasse ce dernier par filtration de la solution complètement inactive ayant presque la limpidité de l'eau, avantageusement en ajoutant un peu d'un auxiliaire de filtration par exemple de l'Hyflo Supercel
En dehors de l'antibiotique,
le charbon adsorbe encore de la solution nutritive de grandes quantités d'autres substances organiques n'ayant pas d'activité antibiotique, surtout des produits de dégradation forement colorés, mais . aussi des sels inorganiques. Ces substances accompagnatrices sont avantageusement éliminées du charbon, avant l'élution de l'antibiotique. A cet effet la niasse de charbon filtrée encore humide est introduite dans une quantité quintuple d'éthanol à 95% et la suspension est agitée pendant une demilieurs. Le charbon ainsi soumis à un lavage préalable peut être facilement sépare par filtration du liquide de lavage.
Le filtrat coloré en brun ne montre pas d'activité antibiotique . l'élution du nouvel antibiotique a lieu avec du
<Desc/Clms Page number 22>
méthanol aqueux acidifia avantageusement avec un mélange à parties égales en volume de méthanol et d'asile formique normal, en utilisant pour 1 g d'agent d'adsorption 2 cm3 de liquide dilution. la suspension est bien agitée mécaniquement pendant une demi-heure, puis filtrée après quoi on sépare encore à trois reprises de la même manière le résidu charbon- neux. Les éluats au nombre desquels seul le premier est faiblement colore en jaunâtre alors que les autres sont incolores, montrent la totalité de l'activité antibiotique.
On réunit ces éluats et les concentre sous vide à basse température de bain, par exemple à 40-60 jusque 1/100 du volume initial, la majeure partie de l'acide formique étant aussi.éliminée en dehors du méthanol et de beaucoup d'eau. la pH du concentrât coloré en Jaunâtre, mais toutefois fluide, se situe en général à 4.
Le concentrât renverme notamment lorsque la culture a été effectuée suivant le premier paragraphe ou suivant b) à d) d'assez grandes quantités de calcium.On élimine ce dernier sous forme de l'oxalate difficilement poluble, en ajoutant au concentrait tout en agitant, une so- lution aqueuse à 10% d'acide oxalique. La quantité de la solution d'acide oxalique qui est nécessaire pour une préoi- pitation complète est exactement déterminéd dans une partie aliquote.
Pour les concentrats à partir des cultures suivant la premier paragraphe ou suivant b)à d), on a en général
<Desc/Clms Page number 23>
besoin de 300 à 500 cm3 de solution d'acide oxalique par litre de concentrat ce qui correspond à 3 à 5 cm3 par litre du filtrat de culture initiale alors que les concentrais obtenus à partir des solution de culture sans addition de carbonate de calcium nécessitont des quantités moindres.
A partir du concentrât débarrassé du calcium on obtient l'antibiotique sous la forme d'une poudre blanche fortement enrichie, en diluant la concentrât aqueux d'abord avec 4 à 5 parties en volume de méthanol et en précipitant ensuite la matière active avec 20 volumes d'acétone. On sépare le précipité par filtratin le lave à deux reprises à , l'acétone et finalement le débarrasse sous vide des restes de solvant. On obtient une poudre d'un blanc pur qui montre pratiquement la totalité de l'activité antibiotique du ' filtrat de culture. la rendement se situe entre 300 à 500 mg par litre de filtrat de culture.
Exemple 2
On peut obtenir un enrichissement de l'antibiotique A 7907 notablement plus fort que dans la cas de la précipi- tation à l'acétone décrite dans l'exemple 1 en préparant son sel d'hélianthine oristallisé. A cet effet, on dilue avec 2 parties en volume d'eau le concentrât exempt de calcium que l'on obtient suivant l'exemple 1 ajuste la solution à un Ph de 6,7 à 7 à l'aide d'une solution déoanormale d'hydroxyde
<Desc/Clms Page number 24>
de sodium, puis tout en agitant vigoureusement, on ajoute en un fin jet le volume, nécessaire pour une précipitation complète, d'une solution aqueuse d'hélianthine pratiquement saturée,.renfermant par litre 3,5 g d'hélianthine (Orange III,
sel de sodium de l'aoide 4-diméthylamino-azobenzène 4-sulfonique), la solution de précipitation étant avantageusement introduite directement dans la solution d'antibiotique.
Le volume de solution d'hélianthine nécessaire pour la précipitation complète est déterminé à l'aide d'une partie aliqucte dans un essai préalable. Ce volume varie, suivant la teneur en antibiotique, en général entre 50 à 150 fois la quantité du concentrât non dilué utilisé, l'hélianthate qui se forme (sel d'hélianthine de l'antibiotique) précipite en majeure partie à l'état cristallin, sous la forme de minces bâtonnets et/ou de paillettes. On laisse la solution de précipitation reposer quelques heures à basse température, à o le précipité se déposant complètement. On sépare ensuite du précipité, par décantation, la majeure partie de la solution limpide qui surnage, et le reste par centrifugation.
En vue d'être lavé, le précipité est agité une fois avec environ la même quantité d'eau glacée, puis il est ensuite isolé sur un entonnoir-séparateur. Le lavage est répété à deux reprises de la même manière, mais toutefois à l'acétone.
L'hlianthate ainsi lavé du nouvel antibiotique est ensuite séché sous vide. Le rendement est compris entre 40 et 70 mg
<Desc/Clms Page number 25>
EMI25.1
d'héllanthate par cm '5 de concn,t #-at, 13* produit Elec constitue une poudre brun-rousc. Il est assez difficilement soluble dans l'eau ainsi que dans le méthanolp mais par contre plus facilement: soluble datis le fonsssl<3<s mais insoluble ou très peu soluble dans les so3"OEaiatiJ lipoÏ-Ses coe-rle Ilacétenop .l'êtherp le benzène, le oialO' oiotùie e'ù analogues. On peut le cristalliser aussi bien Gan l'eau et dans le méthanol que dans des mélanges de ces solvans auquel cas il précipite en paillettes Igches jeunes au mieroncopet qui forant 186--880 en se cosiposat.
Pour*la prépa#a±#nn. tlu sulfate du nouvel antibio%;ique à partir de lUhéliantbute, on met par exemple on Ë;'i\z::'JienSi#i dans 50 (Jm) 3'àau> 10 g de la poudre 6ch0 11 a . 1 t 1, 4t a t e ajoute à la suspension 16 0 M5 dU0 solution a.iùzise à 60% de sulfate de puis agite la 1;:i=sx> 1)el1.6Jan' uns heUl"f.1, ce qui fait qu'elle se colore peu à pcu en par suite de la formation du sel de tri-thYlam1ne; difficilement soluble, de llhélianthate. La réaction peut être notablement acodlérde par chauffage. On ajoute ensuite au mélange réactionnel 20 volumes de méthanol, le sulfate de l'antibiotique prdeipitant sous forme d'un précipité blanc, alors que 11hélianthate de trlêthylamîne passe en solution.
Le sulfate d tan:i::lb1ot1Q,Uê obtenu par
EMI25.2
centrifugation ou filtration est, après une double précipitation
EMI25.3
dans l'eau, débarrassé au mdtlîidnol 6u colorant adhérant,,
<Desc/Clms Page number 26>
puis est finalement lave encore avec du méthanol pur, puis est ensuite séché. Il constitue une poudre amorphe d'un bland pur qui est insoluble dans les solvants organiques, mais par contre est facilement soluble dans l'eau. A partir de 10 g d'hdlianthate brut., on obtient environ 1 g de sulfate .
Exemple 3
Dans le but de transformer le sulfate en chlor- hydrate du nouvel antibiotique qui est facilement soluble aussi bien dans l'eau que dans le méthanol, on dissout ledit chlor- hydrate dans une quantité décuple d'eau et traite la solution aqueuse jusqu'à précipitation complète avec une solution à 20% de chlorure de baryum, ce qui fait qu'on a besoin d'environ 2 cm3 par gramme de sulfate. On élimine par centrifugation de précipité de sulfate de baryum et isole le chlorhydrate de la solution incolore qui surnage en procédant à un séchage sous un froid poussa. On obtient ainsi environ 0,8 g de chlorhydrate par gramme de sulfate.
Pour obtenir une autre purification du chlorhydrate, on dissout celui-ci dans peu de méthanol, verse la solution concentrée sur une colonne de chromatographie constituée par de la suie de gaz et lavée au méthanol, puis élue avec le même solvant. Le résidu d'évapo- ration de l'éluat constitue une poudre d'un blanc pur qui est facilement soluble dans le méthanol et dans l'eau et se sépare de ces solvants partiellement sous forme cristalline lorsqu'on
<Desc/Clms Page number 27>
évapore très lentement. Les cristaux se décomposent à 188-190 après avoir suinté.
Au lieu de préparer le chlorhydrate en passant par le sulfate, on peut prépare:? aussi ce dernier directement à partir de l'hélianthate A cet effet on met ce dernier en suspension à l'état sec et finement divisé dans une quantité environ décuple de méthanol absolu, ajoute encore à la sus- pension 2 volumes d'un mélange d'acide chlorhydrique décanorma et de méthanol, puis fait ensuite bouillis? brièvement.
Après décoloration avec un peu de norite on filtras concentre sous vidé le filtrat limpide comem de l'eau Jusqu'au quart environ du volume initiale et précipite le chlorhydrate du conddcodntrat avec 10 à 20 voumes d'éther ou d'acétoe,
Exemple 4
L'antibiictique obtenu suivant l'exemple 2 à l'état de sulfate brut, est purifié davantage comte suit en passant par le picrate ;
A une solution bien agitée de 1 g de sulfate dans 20 cme d'eau, on ajoute lentement 130 cme d'une solution aqueuse saturée d'acide picrique, quantité qui est juste suffisante pour une precipitation complète.
Il se forme un précipité huileux qui est centrifugée lavé une fois avec un peu d'une solution saturée diacide picrique et une fois avec de l'eau, puis séché dans un dessicateur à vide; le picrate
<Desc/Clms Page number 28>
se transforme en une masse solide qui n'est toutefois pas cristallisée. Le rendement est de 1,3 g. Pour transformer le picrate de l'antibiotique en son chlorhydrate, on dissout le premier dans du méthanol chaud acidifia avec de l'acide chlorhydrique concentra et verse la solution dans 10 volumes d'éther le chlorhydrate insoluble précipitant sous la forme d'une masse blanche.
On débarrasse ce chlorhydrate des restes d'acide picrique adhérant encore en le dissolvant dans la quantité de méthanol bouillant nécessaire pour la dissolution et en répétant à nouveau la préoipitation à l'éther. On obtient ainsi environ 0,7 g d'un chlorhydrate pulvérulent, d'un blanc pur.
Exemple 5 @
Le nouvel antibiotique pur peut être obtenu par exemple sous forme de chlorhydrate, en passant par son picro lonate cristalline au lieu de passer par son picrate qui n'a pas pu être cristallisé jusqu'à présenta on opère alors de la manière suivante:
A une solution de 5,0 g du sulfate obtenu selon l'exemple 2, dans 500 car d'eau., on ajoute goutte a goutte en 1 heure, en remuant, 2500 cm3 d'une solution aqueuse à peu près saturée d'aoide picrolonique contenant 2,7 g d'acide picrolonique par litre.
Le précipité amorphe de picrolonate qui s'est séparé est essorée pour le cristalliser,
<Desc/Clms Page number 29>
on le dissout dans 1700 cm3 d'eau bouillante puis on filtre la solution à chaud. Par refroidissement lent jusqu'à la 'température ordinaire, le picrolonate se sépare sous forme en partie cristalline. On essore le précipita sur filtre à plaque perforée, le lave avec un peu d'eau glace puis on la redissout dans 1500 cme d'eau bouillante pour le recristal- liser.
Après avoir filtre la solution chaude, le piorolonate se sépare complètement sous Òrne de fines aiguilles jaunes réunies en durses Aprs avoir été lavds avec un peu d'eau froide et sèches dans le vide sur du pentoxyde de phosphore, ces cristaux montrent un point de décompositin net à 213 à 214 après suintement à 205-208 d On obtient ainsi 5,2 g de picrolonate recristallisé deux fois.
Du picrolcnate ainsi obtenue,on obtient le chlor hydrate pur en ajoutant par portions 3,5 cm3 d'une solution
10 fois normale de Gaz ohlorhydrique dans du méthanol absolu, à une fine suspension de 5,0 g de picrolonate dans 80 cm3 de méthanol glacé en remuant fortement et, lorsque la réaction est comlète, en précipitant complètement le chlorhydrate de l'antibiotique qui s'est partiellement séparé, par addition de 10 fois \ le volume de mélange réactionnel d'éther absolu.
On essore le chlorhydrate le lave une fois sur le filtre avec un peu d'éther pour éliminer le reste d'acide picolonique adhérant encore, on dissout le chlorhydrate dans 20 cm3 de .méthanol, le reprécipite avec de l'éther, le filtre et le lave.
<Desc/Clms Page number 30>
Le chlorhydrate pur de l'antibiotique ainsi obtenu,séché dans le vide, est une poudre amorphe d'un blanc pur. On obtient ainsi 2,2 g de chlorhydrate.
Exemple 6
La préparation de la base libre du nouvel antibiotique peut avoir lieu aussi bien à partir de son sulfate
EMI30.1
avec de lqhydroxyde de baryum, qu'en utilisant un échangeur dilons faiblement basique. Dans le premier cas, on ajoute, par coumplc à une solution de 1 g du sulfate de l'antibiotique obtenu suivant l'exemple 2 dans 5 cm3 d'eau un excès minime 4'une solution saturée chaude d'hydroxyde de baryun, et est-
EMI30.2
il-6:J.ro juequtà ce que le mélange réectionrtel présente un pH de ? environ. On neutralise ensuite aussitôt l'hydroxyde de baryum en excès en faisant passer du dioxyde de carbone !;.tans la solution.
En vue de transformer le bicarbonate de baryum formé, on maintient ensuite le mélange réactionnel pendant quelques minutes au bain marie à 60 , après quoi on élimine par centrifugation le carbonate de baryum précipité, conjointement avec le sulfate de baryum. A partir de la solution de oentrifugation alcaline, limpide comme de l'eau, qui surnage, on isole la base libre du nouvel antibiotique à l'aide d'un séchage sous un froid poussé. Elle constitue une poudre blanche soluble dans l'eau en donnant une réaction fortement alcaline, mais insoluble dans les solvants organiques.
<Desc/Clms Page number 31>
Le rendement est de 0,4 g.
Pour obtenir la base libre à l'aide d'un échangeur d'ions faiblement; basique, on procède coasse suit
On peroole à travers une colonne d'un éohangeur
EMI31.1
<3'ions faiblement basique constitué par du "Do'tqex-2ft une solution aqueuse, à 20% environ; de 1 g du sulfate brut du nouvel antibiotique obtenu suivant l'exemple 2,, en utilisant environ une quantité trentuple de l'échangeur d'ions préalablement lavé avec de facile chlorhydrique dilué, avec de l'eau, avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium et à nouveau à l'eau, dans cet ordre. La colonne chargée avec une solution de sulfate est ensuite lavée à l'eau, la base étant facilement éluée.
En vue d'obtenir la base, on lyophilise avanta-
EMI31.2
geusement l'éluat comrae précédeIIl1llant. Le rendement est de Cette base est une poudre blanche, amorphe. Exemple 7
EMI31.3
..,n.......... . ....
Une solution de culture de l'antibiotique A 7907 obtenue suivant l'exemple 1 et débarrassée du mycélium est lentement filtrée à travers une colonne d'une résine échan- geuse d'ions faiblement acide renfermant des groupes carboxyliques, comme par exemple de l'Amberlite IRO-50; en utilisant par litre de la solution d'antibiotique 100 g de la forme H de l'échangeur la vitesse de traversée étant réglée à 5-10 litres par heure.
L'antibiotique A 7907 est adsorbé
<Desc/Clms Page number 32>
conjointement avec des substances accompagnatrices inactives partiellement colorées en brun fonc la solution qui s'écoula et qui présente un pH de 3 à 3,5 ne possède qu'une très faible activité antibiotique.. On lave ensuite la colonne d'amberlite avec un volume d'eau distillée égal au cinquième du volume de la solution de culture filtrée, ce qui fait qu'une partie des substances accompagnatrices inactives colorées est éliminée, mais toutefois l'antibiotique formé n'est pas élué. Pour obtenir ce dernier de l'adsorbat on fait passer à travers la colonne préalablement lavée une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,2-normale et à savoir au total 1/4 du volume de la solution de culture utilisée.
On recueille l'éluat en 5 fractions identiques. L'examen de ces fractions indique que la majeure partie de la matière active, notamment 80 à 90% est présente dans les deux premiers éluats, tandis que les autres éluats, encore également colorés,ne présentent qu'une activité antibiotique relativement minime.
On réunit les deux éluats acides, fortement actifs, et les neutralise soit avec une solution concentrée d'hydroxyde de sodium, soit à l'aide d'un échangeur d'ions faiblement basique sous la forme hydroxylée. La solution d'antibiotique ainsi obtenue peut, comme telle ou après concentration sous vide à basse température, être utilisée comme solution de départ pour préparer, par exemple suivant les procédés décrits dans les exemples 2-3 ou 4, d'autres préparations enrichies en antibiotique A 7907.