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La présente invention est relative, de manière générale, à des procédés pour obtenir le nouvel antibiotique utile que constitue la novobiocine à partir de ses solutions brutes en contenant. Plus particulièrement, elle concerne certains procédés perfectionnés pour récupérer cet antibiotique sous forme de cristaux sensiblement purs de solutions con -tenant des substances à activité novobiocinique, telles que les bouillons de fermentation, les concentrats bruts, les solutions diluées, les extraits et analogues.
La novobiocine est une substance antibiotique possé- dant un large spectre antibactérien et une activité particulière vis-à-vis des microorganismes à gram positif, substance qui est formée pendant la'culture aérobie, au sein d'un milieu nutritif aqueux approprié et dans des conditions contrôlées, du microorganisme appelé Streptomyces sphéroïdes récemment découvert.
Une culture viable de cet organisme producteur de novobiocine a été déposée et ajoutée à la collection de cultures permanente du Département Fédéral de l'Agriculture Northern Régional Utilisation Research Branch à Peoria, Illinois, où elle est identifiée par le symbole NRRL 2449. On comprendra que la novobiocine peut aussi être produite par des mutantes dudit microorgan isme, telles qu'elles peuvent être obtenues par sélection naturelle ou.par l'emploi d'un agent de mutation, telle que l'irradiation aux rayons ultra-violets ou aux rayons X, les moutardes azotées et analogues.
Le nouvel antibiotique comprend les éléments suivants : carbone, hydrogène', azote et oxygène combinés en une substance ayant approximativement la formule empirique suivai -te :
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C30-32H34-40N2O10-12. Il réagit comme un composé organique acide avec les réactifs alcalins, dans lesquels il est aisé- ment soluble. Parmi ces réactifs, on peut citer les solu- tions aqueuses d'hydroxyde carbonates et bicarbonates dejmé- taux alcalins; il possède deux groupes de liaison avec des bases et peut être séparé par précipitation de sa solution dans des alcalis, par acidification.
Il est soluble dans les alcanols inférieurs, les cétones aliphatiques inférieures l'acide acétique et le dioxane; il est insoluble ou seule- ment peu soluble dans l'éther, le benzène, l'acétate d'éthy- le, le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, le bichlorure d'éthylène, l'eau et' l'acide chlorhydrique.
De la novobiocine sensiblement pure a été obtenue sous deux formes cristallisées jaunes, à savoir une forme cristallisant sous forme de rosettes. et fondant à environ 152-154 C et une autre forme ayant l'aspect d'aiguilles pla- tes fondant à environ 170-172 C. Chacune de ces.formes cris- tallines de l'antibiotique peut être convertie en une forme normalisée, qui peut être amorphe ou de forme submicrocristal- line, en dissolvant les cristaux dans de l'acétone, en ajou- tant rapidement à cette solution un volume relativement grand d'éther de pétrole et en récupérant la matière précipitée normalisée par filtration.
Les solutions aqueuses alcalines de novobiocine et les suspensions dans de l'huile minérale de la forme normali- sée de l'antibiotique présentent une absorption caractéristi- que, les premières dans la partie de l'ultra-violet et les dernières dans la partie de l'infra-rouge du spectre. Une sol@ -tion de novobiocine sensiblement pure dans de l'hydroxyde de sodium aqueux 0,1N présente une pointe d'absorption carac- @ téristique d'ultra-violet à 3070 A .
Cette pointe d'absorption est lindication d'une matière sensiblement pure ayant une ab- sorbance spécifique de 600, mesurée à cette longueur d'onde;
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en utilisant une solution contenant une gramme de novobiocine pure par 100 ce de la solution contenue dans une cellule à trajet d t absorption de 1 cm Une solution de novobiocine pure dans de l'acide chlorhydrique méthanolique aqueux 0,1N présen.
-te une pointe d'absorption d'ultra-violet caractéristique
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à 3240 A: Ecm = 390. Une suspension dans de l'huile miné- rale de novobiocine normalisée sensiblement pure révèle des Jointes d'absorption d'infra-rouge caractéristiques aux longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns : 3,0-6,0
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(large), 6,10, 6;21e 6,30, 6,49, 6e63t 7,4-7,6 (large palier), 7,78, z'6, 8,27 (faible), $,60(palier), ,7 (palier), 9,13, 9,40, 10,0-10,1 (large), 10,20, 10,60 (large), 12,0-12,30 (large), 12,60, 12,75 (large), 13,07 et 13,39.
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La iiovobiocine cristallisée sensiblement pure a une activité microbiologique d'environ 4000 unités à 5. 000 unités par mgr, cette activité étant déterminée par les procédés de diffusion classiques en cuvette et sur plaque, en utilisant
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la Bacillus megatherium ATCC 9885 comme'organisme d'essai. Bit le est optiquement active : (¯ c( 5 C -2? . (C 1 dans l'hydroxyde de sodium vin) et / ( 5 C = -44 (C=l dans cHCZ3).
L'activité de la novobiocine se traduit essentielle- ment par l'inhibition de la croissance des microorganismes à gram positif, bien qu'elle présente aussi une certaine activité vis-à-vis des microorganismes à gram négatif. Elle inhibe notamment la croissance des microorganismes suivants :
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14ï. yymgenes var. albus 'pyogStRss var. aureus Diplococcus pneumoniae Corynebacterium diphtheriae type gravis Cornebacterium diphtheriae type intermedius Corynebacterium diphtheriae type mitis
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Corynebacterium xerose
Corynebacterium rénale
Neisseria meningitidis
Saroina lutea (VD) M.pyogenes var. aureus résistant à l'auréomycine
M. pyogenes var. aureus résistant à la streptomycine-strep- tothricine M.pyogenes var.
aureus résistant à la pénicilline
Les milieux aqueux qui conviennent pour la culture aérobie de souches de Streptomyces sphéroïdes, en vue de produire de la novobiocine, sont, de manière générale, ceux qui conviennent pour la production d'autres antibiotiques par culture d'autres, organismes du genre Streptomyces.
Ces milieux contiennent des sources de carbone assimilables, tel- les qu'un hydrate de carbone, des sources d'azote assimilables, telles que de la liqueur de macération de mais, de l'hydroly- sat caséïnique, des solubles de distillat ou analogues, ainsi que des sels inorganiques, y compris des traces de.métaux nécessaires pour un métabolisme convenable.du microorganisme, - Le milieu est maintenu, de préférence, à une température de
24 à 28 C pendant la période (ordinairement d'environ 1 à
7 jours) de culture du microorganisme et une aération est assurée, afin de fournir une croissance maximum du microor- ganisme et une production maximum de novobiocine.
Les bouil- lons fermentés produits de cette manière ont une activité d'environ 150-2000 unités par ce et les matières solides du bouillon de fermentation ont une activité de l'ordre d'envi- ron 2,25 unités par mgr de matières solides. La matière an- tibioactice peut être purifiée et récupérée sous une forme plus pure par un certain nombre de procédés.
Un de ces procédés est, en substance, le suivant :
Tout le bouillon de fermentation est filtré après a-
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justement de la concentration en ions hydrogène jusqu'à pH 9,0 et au filtrat un adjuvant de filtration sous forme d'une terre à diatomées est ajouté, après quoi le mélange est lentement acidifié par addition d'acide minéral jusqu'à pH de 2,0.
Après filtration, le gâteau est lavé à l'eau, extrait à pH 9,0 à l'aide de méthanol aqueux (85%) et l'extrait est concen- tré par évaporation du méthanol. La concentration en ions hydrogène de la solution aqueuse est ajustée à un pH d'envi- ron 9,0 , après quoi cette solution est extraite à l'aide de n-butanol.
L'extrait butanolique est concentré jusqu'à un dixiè me de son volume originel, ajouté à 15 fois son volume d'eau à pH 9,0 et additionné d'un adjuvant de filtration, après quoi le pH est lentement ajusté à 2,0 par addition d'acide.
Le mélange est; filtré et le gâteau résiduel est séché sous vide, puis malaxé et trituré avec de .l'éther de pétrole jusqu'à ce qu'il ne se dissolve plus de matière colorée. Le mélange est filtré et le gâteau ré siduel est extrait avec de l'éthanol. La solution de matière bioactivë ainsi obtenue est soumise à une purification chromatographique sur une colonne d'alumine lavée à l'acide.
Les impuretés présentesdans l'extrait éthanolique sont éliminées par adsorption sur l'a- lumitie. La matière active résiduelle est enlevée de la colonne par lavage à l'aide d'éthanol et les liqueurs de lavage combinées à l'effluent sont concentrées jusqu'à présenter une teneur d'environ 5% en matières solides, puis diluées avec un peu plus qu'un volume équivalent d'eau, après quoion laisse l'antibiotique se cristalliser. Le produit ainsi obtenu a une activité de 2500 à 3000 unités par mgr.
En formant une solution acétonique de ce produit, en la traitant avec du charbon de bois activé, en séparant le charbon de bois, en ajoutant lentement de l'éther de pétrole jusqu'à apparition,- d'un trouble et en abandonnant le mélange jusqu'au lendemain
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à température ambiante ordinaire, tout en agitant, on obtient un produit cristallin ayant une activité de 4500 à 5000 unités par mgr.
' Il est clair que ce procédé d'obtention de novobiocine cristalline comprend de nombreux stades, y compris des extractions répétées au moyen de divers solvants préférentiels la concentration de solutions et la manipulation de formes de plus en plus puissantes de la matière active ; procédé a par conséquent pour inconvénients de prendre beaucoup de temps, d'exiger une grande somme de travail spécialisé et l'attention d'un personnel scientifiquement entraîné. Par ailleurs, ce procédé à l'inconvénient de nécessiter une solution relativement concentrée, purifée par chromatographie, en combinaison avec les étapes ou stades précédents, comme matière de départ pour le stade final de production du produit cristallisé.
Aussi longtemps que cette matière de départ n'a pas une teneur en novobiocine d'environ 3000 unités par mgr de matières solides, aucun produit cristallin acceptable n'est obtenable.
La présente invention a notamment pour objets des procédés pour obtenir de la novobiocine cristallisée sous une forme très pure et avec une activité biologique très élevée, ces procédés présentant, vis-à-vis du procédé susdécrit, l'avantage d'être plus directs, de nécessiter moins de manipulation de matière active et de prendre beaucoup moins de temps pour amener un lot de matière au produit cristallisé pur final.
L'invention a encore pour objet un procédé pour obtenir de la novobiocine cristallisée sensiblement pure par traitement direct de concentrats en contenant, y compris des concentrats bruts, à partir desquels ne pourrait être obtenu aucun produit cristallin par les procédés connus susdécrits.
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D'autres'objets de la présents, invention ressortiront de la description suivante des particularités spécifiques du procédé suivant l'invention.
Selon certains aspects généraux de la présente inven. tion, de la novobiocine cristallisée pure est récupérée d'une solution concentrée brute, qui peut être une solution aqueuse alcaline ou une solution dans un alcanol inférieur de matière à activité novobiocinique, en traitant cette solution au moyen d'un acide alcanoïque comportant tout au plus 6 atomes de carbone et au moins un groupe carboxylique par molécule , soluble dans l'eau et dans les solutions aqueuses d'alcanols inférieurs et ayant une constante de dissociation comprise entre 10-3 et 10-6,en présence d'eau ou d'un alcanol monohydrique comportant tout au plus 4 atomes de'carbone par molécule et complètement miscible à l'eau en toutes proportions,
le produit désiré étant ensuite récupéré de la solution ainsi traitée.
Selon une forme d'exécution plus particulière, le procédé suivant la présente invention consiste à traiter une solution concentrée aqueuse brute de matière à activité novobiocinique contenant un aLcanol monohydrique complètement miscible à l'eau en toutes proportions et comportant tout au plus 4 atomes de carbone par molécule, avec un acide alcanoï-' que comportant tout au plus 6 atomes de carbone et au moins un groupe carboxylique par molécule, soluble dans l'eau et dans les solutions aqueuses d'alcanols inférieurs et ayant une constante de dissociation comprise entre 10-3 et 10 , puis à récupérer la novobiooine cristallisée sensiblement pure désirée de la solution ainsi traitée.
Dans cette forme d'exécution particulière du procédé suivant l'invention, l'alcanol peut être ajouté à la solution brute, si la solution est un concentrât aqueux alcalin, lorsque la solution est
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traitée au moyen de l'acide alcanoique; ou bien, l'alcanol peut servir de véhicule solvant de la solution brute, auquel cas de l'eau est ajoutée à la solution alcanolique, lorsqu'el' le est traitée au moyen de l'acide alcanoique.
Selon une autre forme d'exécution du procédé suivant l'invention, de la novobiocine sensiblement pure est cristallisée dans une solution aqueuse, acide, concentrée et brute d'une matière à activité novobiocinique contenant (1) un alcanol monohydrique comportant tout au plus 4 atomes de carbone par molécule et complètement miscible à l'eau en toutes proportions, et (2) un acide alcanoique comportant tout au plus 6 atomes de.carbone et au moins un groupe carboxylique par molécule, soluble dans l'eau et dans les solutions aqueuses d'alcanols inférieurs et ayant une constante de dissocia. tion comprise entre 10-3 et 10-6.
Plus spécifiquement encore, on préfère que les constituants de la solution à partir de . laquelle le produit cristallisé est obtenu, à savoir l'alca-- nol, l'eau et l'acide alcanoique soient présents dans les proportions volumétriques approximatives de 10:4:1*
Parmi les acides alcanoïques, qui peuvent être utilisés pour la mise en oeuvre du procédé suivant la présente invention, on peut citer les acides monocarboxyliques, tels que les acides formique, acétique, propionique , isobutyrique, valérique et isovalérique et les acides polycarboxyliques tels que les acides citrique, maléique, malonique, succinique et pyrotartrique. Parmi ces acides, l'acide acétique est celui que l'on préfère présentement.
Parmi les alcanols que l'on peut utiliser pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention, on peut citer le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol et le butanol tertiaire. Parmi ces alcools, le méthanol est celui que
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l'on préfère actuellement.
Pour permettre de comprendre plus complètement l'ob- jet de l'invention et la manière dont le procédé suivant l'invention peut être le mieux mis en oeuvre, on en décrira maintenant certaines Normes d'exécution présentement préférée étant entendu que ces formes d'exécution ne sont données qu'à titre illustratif et non à titre limitatif de l'invention définie dans les revendications terminant le présent mémoire.
EXEMPLE 1. -
Une souche productrice de novobiocine de Streptomy- ces sphéroïdes (NRRL aqueux 2449) est cultivée par fermenta- tion aérobie submergée dans un milieu nutritif approprié, pendant une période et dans des conditions propres à assurer la production désirée de novobiocine dans le bo uillon de fer- mentation. Un adjuvant de filtration, tel qu'une terre à dia- tomées ou analogue, est ajoutée à tout le bouillon, qui est alors filtré, à la concentration en ions hydrogène de la ré- colte, soit à pH 7,0-8,0, après quoi on filtré et on lave le gâteau avec de l'eau chaude.
Le volume du filtrat et des liqueurs de lavage combinés est environ de 1/5e supérieur à celui du bouillon avant filtration. le bouillon est extrait dans un appareil d'extrac- tion à contre-courant approprié, -à l'aide d'un volume d'acé- tate d'amyle égal à 1/10e du volume du bouillon filtré; l'ex- traction est répétée avec un autre volume équivalent d'acéta- te d'amyle et les extraits sont combinés.
Il importe que la concentration en ions hydrogène soit réglée, pendant cette opération d'extraction, à un pH d'environ 6,5, par addition d'un acide minéral approprié, tel que l'acide sulfurique*
Le stade suivant du procédé consiste à utiliser un solvant d'extraction aqueux qualifié ci-après, pour la commodj -té, de solution alcaline tampon, qui peut être préparée com-
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me suit : environ 10 gr de carbonate de sodium et $ gr de bicarbonate de sodium sont dissous dans 950 ce d'eau et 50, ce de méthanol sont ajoutés pour obtenir un total de 1 litre de solution.
Les extraits combinés à l'acétate d'amyle sont ex- traits, dans un appareil d'extraction à contre-courant ap- proprié, à l'aide de cette solution alcaline tampon, en uti- lisant cette dernière dans la proportion de 1/5e du. volume des extraits et l'extraction est répétée encore une fois avec un volume équivalent de solvant d'extraction aqueux. Il est très important que la concentration en ions hydrogène de la phase aqueuse soit maintenue, pendant cette opération d'extraction, à un pH. de 10 ou voisin de 10, mais non inféri- eur à 9,5, une quantité plus grande d'alcali étant, au besoin, ajoutée à cette fin.
Les extraits aqueux obtenus, de cette manière, sont. combinés et concentrés par évaporation, cette dernière ayant également pour effet d'éliminer l'acétate d'amyle dissous, et un¯acide minéral, tel que l'acide chlorhydrique', est ajou- té jusqu' à ce que le pH atteigne 2,3 à 2,6. Ceci provoque la décomposition du sel sodique de novobiocine dans la colu- tion et la précipitation de novobiocine, ce précipité étant @ recueilli par filtration.
Le résidu de filtration est pesé et dissous dans une quantité suffisante de méthanol pour former une solution con- tenant environ 10% en poids de matière solide, après quoi on ajoute des quantités suffisantes d'eau et d'acide acétique pour que, dans la solution finale, les proportions en volu- me de méthanol, d'eau et d'acide acétique soient de 10:4:1.
De la novobiocine cristallisée pure se sépare de la solution et est récupérée par filtration; les cristaux sont lavés avec
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un mélange de 10 parties en volume de méthanol et de 4 par- ties en volume d'eau, puis séchés sous vide à des températu- res inférieures à environ 45 C.
EXEMPLE 2. -
Une souche productrice de novobiocine de Streptomy- ces sphéroïdes (NRRL 2449) est cultivée par fermentation aé- robie submergée dans un milieu nutritif approprié, pendant une période et dans des conditions propres à assurer la pro- duction désirée de novobiocine dans le bouillon de fermenta- tion. Un adjuvant de filtration, tel qu'une terre à diatomées ou analogue, est ajoutée à tout le bouillon, qui est alors filtré, à la concentration en ions hydrogène de la récolte, soit à pH 7,0-0,0, après quoi on filtre et on lave le gâteau avec de l'eau chaude. Le volume du filtrat et des liqueurs de lavage combinés-est environ de 1/5e supérieur à celui du bouillon avant filtration.
La concentration en ions hydrogène du bouillon fil- tré est réglée à pH 6,5 par addition d'un.acide minéral ap- proprié, tel que l'acide sulfurique, et le bouillon est ex- trait- à l'aide d'un volume d'acétate d'amyle égal à 1/10e du volume du bouillon filtré. L'extraction est répétée avec un autre volume équivalent d'acétate d'amyle et les extraits sont combinés.
Le stade suivant du procédé consiste à utiliser un alcaline solvant d'extraction aqueux, à savoir une solution /-tampon constituée par une solution aqueuse d'hydrode ammonique contenant environ 5% en volume de méthanol. Les extraits coin- binés à l'acétate d'amyle sont extraits à l'aide de cette'so- lution méthanolique tampon, en utilisant cette dernière dans la proportion de 1/5e du volume des extraits et l'extraction est répétée encore une fois avec un volume équivalent de sol- vant d'extraction aqueux.
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La concentration en hydroxyde ammonique de la solution tampon est réglée de façon qu'après extraction de la solution à l'acétate d'amyle, la concentration en ions hydrogène de l'extrait aqueux ne soit pas inférieure à pH 9,5 environ.
Les extraits méthanoliques ammoniacaux et aqueux combinés sont extraits à l'aide d'acétate d'amyle en deux phases, en utilisant, dans chaque stade, yun volume d'acétate d'amyle approximativement égal à 1/10e du volume de la solution aqueuse soumise à l'extraction et en opérant à un pH contrôlé de 6,5. Les extraits à l'acétate d'amyle obtenus de cette manière sont combinés et soumis, à leur tour, à une extraction en deux stades, en utilisant une solution aqueuse d'hydroxyde ammonique contenant 30% en volume de méthanol et en contrôlant la'concentration en ions hydrogène pendant l'extraction, de façon à maintenir un pH de 9,5. La volume de solvant d'extraction aqueux utilisé dans chaque stade de cette opération d'extraction est approximativement égal à 1/5e du volume des extraits combinés à l'acétate d'amyle.
Ces extraits aqueux contiennent environ 50 mgr de novobiocine par ce.
Du méthanol et de l'acide acétique sont ajoutés aux extraits aqueux combinés de manière à produire un mélange contenant du méthanol, de l'eau et de l'acide acétique dans les proportions volumétriques de 10:4:1, en sorte qu'il se sépare de la novobiocine cristallisée pure sous forme, d'un précipité, qui est récupéré. Ce produit est identique à celui obtenu de la manière décrite dans l'exemple précédent..
EXEMPLE 3 . -
Une souche productrice de novobiocine de Streptomy- ces sphéroïdes est cultivée dans un milieu nutritif approprié
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de la manière décrite dans les exemples précédentes, après quoi la concentration en ions hydrogène de tout le bouillon est ajustée à pH 9,0 et le bouillon est filtré. Le filtrat est additionné d'une terre à.:diatmonées en tant qu'adjuvant de filtration et le mélange est acidifié lentement par addition d'un acide minéral jusqu'à pH 2,0, après quoi le mélange est filtré.
Après filtration, le gâteau est lavé à l'eau, extrait à pH 9,0 à l'aide de méthanol aqueux (5%) et l'extra.1 est concentré par évaporation du méthanol. A la solution alcaline aqueuse obtenue de cette manière, on ajoute un acide minéral, tel que l'acide chlorhydrique, jusqu'à ce que la concentration en ions hydrogène atteigne environ pH 2,3-2,6.
Ceci provoque la décomposition du sel alcalin de novobiocine et la précipitation de novobiocine, qui est récupérée par fil -tration.
Le résidu de filtration est pesé et dissous dans une quantité suffisante de méthanol pqur fournir une solution contenant environ 10% en poids de matière.solide, après quoi on ajoute suffisamment d'eau et d'acide acétique pour que, dans la solution finale, les proportions en volume de métha- nol, d'eau et d'acide acétique soient d'environ 10;4:1. De la novobiocine cristallisée se sépare de la solution et est récupérée par filtration; les cristaux sont lavés avec un mélan- ge de 10 parties en volume de méthanol et 4 parties en volume d'eau, puis séchés sous vide à des températures inférieures à 45 C environ.
EXEMPLE 4.-
Environ 500 ce d'une solution de novobiocine dans l'acétate d'amyle, ayant une activité de 50.000 unités de cathomycine par ce et contenant 10 mgr de novobiocine par ce, sont soumis à une extraction en deux stades, en utilisant, dans chaque stade, 50 ce d'une solution aqueuse 1N d'hydroxy-
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de ammonique contenant 30% en volume de méthanol. Les ex- traits aqueux séparés sont combinas et 94 ce de méthanol ain- si que 14 ce d'acide acétique glacial sont ajoutés, en agi-. tant, pendant cette addition.
Après environ 10 à 15 minutes, de la novobiocine cristallisée pure commence à se séparer de la solution et la cristallisation est admise à se poursui- vre pendant environ 12 heures, la solution étant agitée pen- dant tout ce temps. Les cristaux sont séparés de la solution par filtration, lavés avec environ 10 ce de méthanol aqueux (33:67% en volume), puis avec environ 10 ce d'éther diéthyli- que et séchés. On obtient environ 4,5 gr de produit cristal- lisé titrant 5000 unités de novobiocine par mgr et ayant, après dissolution dans de l'hydroxyde sodique 0,1 N, une pointe d'absorption d'ultra-violet caractéristique à 3070 A (E1 cm1% = 588).
EXEMPLE 5. -
Envion 124 gr de novobiocine cristallisée bruie, ob- tenue par précipitation de l'antibiotique de sa solution acé- tonique par addition à celle-ci d'éther de' pétrole, sont dis- sous dans environ 1350 ce d'éthanol absolu et 1300 ce de cette solution sont traités avec 500 ce d'eau et 13 ce d'aci- de acétique glacial en agitant, après quoi on abandonne le mélange jusqu'au lendemain en poursuivant l'agitation pen- dant cette période. Le produit cristallin qui se sépare est récupéré par filtration, lavé avec 100 ce d'éthanol aqueux (71% en volume) et séché sous vide à 45 C. On obtient ,100 gr de produit titrant 4040 unités de novobiocine par mgr.
EXEMPLE 6. -
Environ 50 ce d'une solution acétonique concentrée de novobiocine, titrant 2200 unités de novobiocine par mgr de produits solides et contenant au total 10 x 106 unités de
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novobiocine sont traités avec 1 ce d'eau et 50 ce d'éther de
6 pétrole. Environ 5 ce d'une huile, contenant environ 2 x 10 unités de novobiocine, se séparent et sont éliminés. On ajou- te de l'éther de pétrole à la couche de solvant séparée' jus- qu'à ce qu'un léger trouble apparaisse sous forme d'un voile dans la solution précédemment claire, puis le mélange est laissé an repos et les cristaux séparés de novobiocine bru- te sont récupérés, lavés et séchés. On constate que la matiè- re titre 2600 unités par mgr et pèse environ 0,55 gr.
Envi- ron 0,5 gr de ce produit brut sont dissous dans 5 ce dtétha- nol, après quoi on ajoute 2 ce d'eau et une goutte d'acide acétique glacial. La solution est soumise ensuite à une agi- tation continue pendant environ 17 heures, ce qui provoque une cristallisation. Les cristaux sont séparés par filtration'; lavés et séchés. Le.produit ainsi obtenu titrant 3680 unités de novobiocine par mgr, pèse environ 0,45 gr.
EXEMPLE 7.-
Un litre de bouillon de fermentation filtré, obtenu de la manière décrite dans l'exemple 1 et contenant 1190 unités de novobiocine par ce (détermination faite par bioes- sai) est soumis à une extraction en 2 stades'à un pH d'envi- ron 6,5, en utilisant dans chaque stade 100 ce d'acétate d'a- myle. Les extraits sont combinés, puis extraits par une opé- ration en deux stades, en utilisant dans chaque stade 40 ce de solution aqueuse alcaline tampon contenant 5% en volume de méthanol et préparée de la manière décrite dans l'exemple 1.
Les extraits aqueux combinés sont concentrés pour éliminer l'acétate d'amyle, puis acidifiés par addition d'acide chlor- hydrique aqueux jusqu'à un pH de 2,5, ce qui provoque la précipitation de novobiocine brute, qui est récupérée par filtration. Le gâteau semi-humide de matière brute est dissous dans 5 ce de méthanol et 2 ce d'eau contenant 0,5 ce d'acide
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acétique glacial sont ajoutés. Le mélange est agité pendant environ 17 heures, puis la novobiocine cristallisée pure qui s'est séparée est filtrée, lavée à l'aide de méthanol aqueux (70% en volume) et séchée. Ce produit titre 4800 unités de novobiocine par mgr.
EXEMPLE 8.-
Un litre d'une solution éthanolique de novobiocine, titrant 1260 unités de novobiocine par mgr de matières solides, est mélangé à deux litres d'eau et on ajoute de l'acide chlorhydrique jusqu'à un pH d'environ 2,0, ce qui provoque la séparation de novobiocine brute qui, après addition de 15 gr de terre à diatomées, est récupérée par filtration. Le gâteau de filtration est empâté dans une solution aqueuse d'hydroxyde ammonique à une concentration en ions hydrogène cor- ' respondant à un pH d'environ 10, après quoi on filtre, en sorte qu'on obtient 600 ce de filtrat.
On fait passer environ 400 ce de ce filtrat dans une colonne contenant 150 ce de résine Amberlite XE-98 (cycle chlorure); la résine est ensuite lavée an moyen de méthanol (85%) et la novobiocine est éluée à l'aide d'une solution contenant 85% en volume de méthanol et 15% en volume d'acide chlorhydrique concentré.
La novobiocine brute contenue dans cet éluat, qui titre 3700 unités de novobiocine par mgr de matières solides, est précipitée par addition à 1'éluat de deux fois son volume d'eau.
Le précipité est récupéré par filtration, dissous dans de l'éthanol et chromatographié sur 20 gr d'alumine lavée à l'acide. L'effluent, ayant un volume de 25 ce environ, est recueilli et additionné de 0,5 ce d'acide acétique glacial, puis lentement d'eau. Des cristaux de novobiocine pure se séparent et sont récupérés par filtration.
EXEMPLE 9. -
On répète le mode opératoire de l'exemple 7, si ce
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n'est qu'on utilise de l'isopropanol au lieu de méthanol. Le produit obtenu est identique à celui obtenu de la manière décrite dans l'exemple 4.
EXEMPLE 10.-
On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 3, si ce n'est qu'on utilise du n-propanol au lieu de méthanol. Le produit obtenu est identique à celui obtenu de la manière décrite dans l'exemple 3.
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exEx-iPjlu; 11.-
On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 7, si ce n'est qu'on utilise du butanol tertiaire au lieu de méthanol. Le produit obtenu est identique à celui obtenu de la manière décrite dans l'exemple 4.
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EXBLPLË 12.- On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 3, si ce n'est qu'on utilise de l'éthanol au lieu de méthanol. Le produit obtenu est identique à celui obtenu de la manière décrite dans Texemple 3.
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E,.:3ar 13. - On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, si ce n'est que l'acide acétique utilisé dans le stade final de cristallisation du produit pur est remplacé par un équivalent stoechiométrique d'acide citrique. Le produit ainsi obtenu est identique à celui obtenu de la manière décrite dans l'exemple 1.
EXEMPLE 14.-.
Le procédé décrit dans l'exemple 1 est modifié, comme dans l'exemple 13, en remplaçant l'acide acétique par de l'acide propionique. Le résultat est le même.
EXEMPLE 15.-
Le procédé décrit dans l'exemple 1 est modifié, comme dans l'exemple 13, en remplaçant l'acide acétique par de l'acide butyrique. Le résultat est le même/
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EXEMPLE 16.-
Le procédé décrit dans l'exemple 1 est modifié, comme dans l'exemple 13, en remplaçant l'acide acétique par- de l'acide formique. Le résultat est le même.
EXEMPLE 17.-
Le procédé décrit dans l'exemple 1 est modifié, com-
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me dans ,U exemple 13, en remplaçant l'acide acétique par de l'acide isobutyrique. Le résultat est le même.
RE'VEIduICAi'IOIZ. ¯ .
1.- Procédé pour récupérer de la novobiocine cristalline sensiblement pure d'une solution concentrée de matière à activité novobiocinique, dans lequel procédé on traite
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ladite solution au moyen d'en acide alcanoique dans un milieu