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La présente invention concerne un procédé d'accroisse-
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ment d'adrânooorticotrophine et plus particulièrement un procédé de aorication d'un produit d'hormone adrénocorticotrophique
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présentant une puissance accrue lors le 1'administration sous-
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cutanée, ainsi que le produit d'adrénocorticotrophine obtenu ;3.r ce procédé.
Liadrénocorticotrophine est la SLi.bs t8.dC<;; sécrétée par 1-es glandes pituitaire de uauuiiiî ères qui stimule la production ue st3ro.de à action biologique par .! substance corticale de la .glande ±::J.rdnale. Au cours des dernières années, l t C!'1X'Gl1ocortico- trophine a été extraite des glandes pituitaires de ma:nn2.:'.res,
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tels que porcs, bovins et moutons et, après épuration., adminis- trée à des animaux domestiques et à des êtres humains, pour le traitement de certaines maladies.
L'activité de produit d'adrénocorticotrophine peut être mesurée par la déplétion dans la teneur d'acide ascorbique de la glande animale dans des rabs hypophysectomisés suivant le mode opératoire d'essai sous-cutané de corticotrophine selon le Codex U.S. Dans les êtres humains, la détermination de -L'activité d'adrénocorticotrophine peut être obtenue en déterminant; la réduction de concentration éosinophile du sang, ensemble avec l'élévation dans le niveau sanguin de stéroïdes et l'accroissement dans l'excrétion de cétostéroïdes.
On a trouvé qu'un extrait d'acétone à 70% acide déshydraté de tissu pituitaire présente une puissance d'adrénocorticotrophine par administration sous- cutanée d'environ 0,3 à 2 unités par mg. Le brevet américain No 2.669.536, déposé le 15 Août 1950 décrit un procédé d'épu- ration d'adrénocorticotrophine, qui consiste à amener un concentré aqueux brut d'adrénocorticotrophine en contact avec une matière cellulosique à un pH d'environ 4,5 pour adsorber l'adrénocorticotrophine sur cette matière et ensuite à séparer par élution l'adrénocorticotrophine de la matière cellulosique avec une solution aqueuse a u.. pH d'environ 1,0 à 1,5.
Le traitement d'un concentré aqueux brut d'adrénocorticotrophine porcine par ce procédé donne un produit ayant une puissance sous-cutanée d'environ 40 unités Codex US. par mg. Ainsi, ce pro- duit montre une puissance sous-cutanée d'environ 20 à 130 fois supérieure à celle de l'extrait d'acétone acide déshydraté prémentionné de tissu pituitaire, mais, d'une manière surprenante, l'épuration sur la base de solides n'est que de l'ordre de 6 à 40 fois.
En conséquence, l'adrénocorticotrophine porcine traitée par le procédé du brevet pr@mentionnée présente une puissance sous-cutanée environ triple de ce que l'on pourrait attendre de la réduction en solides. cependant, un accroisse- ment de la puissance sous-cutanée de cette importance n'est pas obtenu par le traitement d'adrénocorticotrophine bovine ou
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ovine par le procédé de ce brevet. En conséquence, on ne considère actuellement pas possible d'utiliser des glandes pituitaires de ooeufs et de moutons comme source d'adrénocortico- trophine pour des usages pharmaceutiques..
De même, étant donné que le mode d'administration sous-cutané est avantageux dans la pratique médicale et étant donné que les sources de glan- des pituitaires sont insuffisantes pour satisfaire les nécessités un thérapeutiques, il y a/besoin continu de procédés pour accroître la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotrophine dérivée d;une source quelconque.
L'invention crée précisément un procédé renforçant la puissance de préparations d'adrénocorticotrophine. Cet accrois- sement de puissance -se manifeste notamment dans l'administration sous-cutanée. Le produit obtenu par ce procédé est complètement soluble dans l'eau dans la gamme de pH neutres. L'invention ' augmente notamment la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotro- phine porcine dans une plus grande mesure que l'accroissement obtenu par le fractionnement sur une matière cellulosique. Le procédé accroît la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotro- phine bovine et ovine à un niveau au moins comparable à celui d'adrénocorticotrophine porcine obtenu par le procédé du brevet précité.
L'invention crée aussi un dérivé d'adrénocorticotro- phine de tissus pituitaires bovins et ovins qui montre une puis- sance sous-cutanée au moins aussi grande que celle de l'adrénocor- ticotrophine porcine obtenue par le procédé du brevet'précité qui est complètement soluble dans l'eau dans la gamme de pH neutres.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention rassortent de la description qui suit.
L'accroissement de puissance d'adrénocorrticitrophine peut être obtenu en faisant incuber un mélange aqueux d'adréno- corticotrophine à un pH rentrant dans la gamme de pH 4,5 à 8.
La durée nécessaire pour obtenir le renforcement maximum de puis- sance d'adrénocorticotrophine est diminuée lorsque la température' du mélange aqueux d'adrénooorticotrophine cet élevée à une
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limite de cempâratiure supérieure au-dessus de laquelle Ita(ir3liocorticotropiiine serait détruite dans ce mélange aqueux.
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Par exemple, à la température ambiante, le temps nécessaire .pour obtenir l'accroissement maximum de puissance d'adrénocorico- trophine peut être de plusieurs mois, tandis qu'à une tempé- rature d'environ 100 C un accroissement équivalent de puissance d'adrénocorticotrophine peut être obtenu en quelques heures. De même, étant donné que la pureté de l'adrénocorticotrophine est augmentée, la durée nécessaire pour l'accroissement maximum de .
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sa puiobaace dans ce procédé est diminuée.
Par exemple, le
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renforcement maximum de la puissance d'un mélange aqueux d'un
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extrait d'acétone acide déshydraté de tissu pitui-caire de boeuf, incubé à uno température de 100 C environ, à un plî rentrant dans la oHJ,le pralüentionnie, peut être obtenu en 18 à 30 heures envi- ron, tandis qu'environ 8 , 12 heures peuvent être nécessaires'
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sous cas conditions d'incubation pour produire un renforcement équivalent de puissance d'adrénocorticotrophine bovine épurée par le procéda du brevet précité.
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Bien que , dans cergains eus, ce procédé puisse avoir pour résultat un accroissements de puissance d'adrénocorticotro-
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phine démonbré par injections intraveineuses, on a trouvé que
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l'augmentation de puissance d'aurénocorticotrophine manifestée par administration sous-cu tc..:.n5e est beaucoup plus poussée et, étant donné Que le mode d1 administration sous-CUtJ.i13 est avantageux dais la ...-Ir.... Gh¯ue ..,:dicale, il est particulièrement désirable.
Par exemple, l'airénocorticotrophine porcine obtenue
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par le procédé du brevet précité,et soumise au traitement prémen-
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tionné, montre un ac,:roi.:e"ent de puissance sous-cutanée de l'or- dre de 20 u 50 , tandis que l'accroissement de puissance sous- cutanée obtenu par l'adr5nocorticotrophine bovine préparée de J.<..çon analogue peut âtre ue ijs à 400 >J et, éventuellement, jusqu'à 500 ;". Ce pout ,3t.r\3 utilisé pour accroître la puiosauce sous-cutdiiôu d'airétiocorbicobrophine dérivée de tissus pituitaires de ::d"u,.isras..
De iueilleures résultats peuvent être obtenus avec de l'a.rno;orticotroi.iine ovine et spécialement
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l'accroissement de.Lraole de puissance sous-cutanée est obtenu avec 11 adrénocorticotrophine bovine Bien que ce procédé soit particulièrement applicable aux produits d'adrénocorticotrophine d'une pureté appropriée pour l'administration parentérale, tels que l'adrénocorticotrophine obtenue par le procédé du brevet précité, il peut être utilisé dans le traitement de préparations
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doadrénocortîco rophine relativement brutes, telles que l'extrait à l'acétone acide déshydraté prémentionné de tissus pituitaires et il peut rationnellement être appliqué directement sur le tissu. pituitaire même.
Dans le traitement prémentionné, le mélange d'adréno- corticotrophine doit être incubé.à une température d'au moins 15 C. Cependant, pour assurer l'accroissement maximum de puissan- ce dladrénocorticotrophine sous-cutanée en un laps detemps per-
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mettant une exploitation industrielle, la temp0r: ¯: : dlincub"a- tion peu être de 50 à 150 C. Les meilleurs r0suJ..l,,,,t.:; sont obte- nus à une température de 75 à 125 C et un accroissement particu- lièrement désirable de la puissance d'adrénocorticotrophine dans la fabrication sur une grande échelle peut être obtenu à une tem- pérature de 1CO C environ.
Dans la mise en oeuvre préférée de l'invention, on incorpore dans le mélange aqueux, pendant l'incubation, un agent
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réducteur contenant au moins urygroupe su11yéir,yle. On a trouvé que l'activité d'adrénocorticotrophine manifestéelors de l'adminis- tration sous-cutanée a tendance à être réduite ou annihilée aux températures supérieures qui sont désirables pour produire 1'accroissement maximum de cette puissance sous-cutanée en un laps de temps permettant l'application industrielle de ce procédé.
Ainsi, bien qu'il y ait un accroissement total de la puissance, tout l'avantage de ce procédé ne peut pas être obtenu par suite
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de la perte d'une partie de la puissance da crtocortiootrophine sous-cutanée. Cette perte partielle de puissance peut être rédui- te en incluant dans le .élan -. aqueux d'adrénooorticotrophine, au cours de l'incubation, un a,,erib réducteur de la nature prémen- tionn3c, tel qu'acide sulyr7.rïque, bien qu'une meilleure stabi-
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lisation puisse être obtenue avec un agent réducteur organique contenant au moins un groupe sulfydryle, tel que le beta-
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mercapto-éthanol et l'acide thioglycolique, des résultats parti- culièrement bons étant atteints avec la cystiiae.
Cet agent stabilisateur à base de cystéine peut être une base de cystéine-1 ou du chlorhydrure de cystéine -1. Cependant, il semble que le ohlorhydrure de . ey.stéine-1 peut diminuer la réaction dans une certaine Masure par suite de la formation de chlorure de sodium
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co..I,ne sous-produit de réaction.
Cet agent réducteur peut être inclus dans le mélange d'incubation d'àdrénocortiootrophine à une concentration d'au coins ,025 , (poids/volume) et lorsque, par exemple, la cystéine est incorporée dans le mélange, son effet stabilisant peut Être
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plus rationnellement obtenu à une 'concentration de 005 à 5,0 zoo
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(poids/ volume) . Los meilleurs résultats sont obtenus avec c'.. la cystéine à une .concentration entre 0,5 et le5 &. (poids/volume), puis une stabilisation spécialement désirable avec de la cystéine est assurée à une concentration d'environ 1,0 (poids/volume).
Bien que la stabilisation d'activité d'adrénocortico- trophine sous-cutanée nouvellement produite par cet agent réduc- teur puisse être effectuée en faisant incuber le mélange aqueux
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aladrénocorticotroptiine à un pH rantrant dans la gamme de 4,5 à 8 de meilleurs résultats peuvent être obtenus à un pH entre 5,5 et 7,5, puis une stabilisation particulièrement désirable . est obtenue à un pH d'environ 6,5. Le réglage d'un mélange aqueux
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acide d'adrénocorticotrophine à un pH rentrant dans la gaJ1ane critique peut être obtenu avec tout agent alcalinisant, tel que phosphate trisodique, bien qu'un plus haut degré d'accroisse- ment soit, obtenu lorsque cet aent alcalinisant
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est de l'hJtiXoxjQe de sodium.
On a eut outre trouvé que l'inclusion de gélatine dans . le mélange aqueux d'adrénocorticotrophine élève la vitesse à laquelle la puissance d'adrénocorticotrophine sous-cutanée est accrue à toute température d'incubation, bien que le niveau
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maximum d'accroissement puisse être quelque peu inférieur à celui obtenu en faisant incuber un tel mélange aqueux en l'absence de gélatine. Toute gélatine de qualité pharmaceu- tique peut être utilisée dans ce procédé, par exemple de la .gélatine précurseur-acide, bien qu'un plus haut degré d'ac- croissement soit semble-t-il obtenu avec de la gélatine pré- curseur-alcalin.
Par "pharmaceutique", on entend que la palatine serait appropriée à l'infection sur des êtres humains lorsque l'adrénocorticotrophine est destinée à l'usage humain et appropriée à l'injection sur des animaux lorsque l'adrénocorticotrophine est destinée à des usages vétérinaires.
La gélatine peut être incluse dans le mélange aqueux d'adréno- corticotrophine à urie concentration entre 8 et 40% (poids/ volume, mais lorsqu'on utilise une gélatine partiellement hydrolysée, une concentration de cette gélatine entre environ 12 et 18% ( poids/ volume) a une fluidité désirable. Cependant lorsqu'une gélatine plus complètement hydrolysée ayant un point de gélification inférieur à 22 C est incorporée dans un mélange aqueux de cette nature, la fluidité désirée peut être obtenue à une concentration d'environ 28% et parfois à une concentration aussi élevée qu'environ 32% (poids/volume)..
Des extraits acides de tissus pituitaires et d'adrénocor- ticotrophine obtenus par le procédé du brevet précité sont relativement insoluoles dans l'eau dans la gamme de pH neutres.
Aussi, une adrénocorticotrophine de ce type lore une suspen- sion ou dispersion lors du mélange avec de l'eau dans le trai; tement de cette invention. L'incubation de cette suspension ou dispersion aqueuse pour 'accroître la puissance sous-cutanée de l'adrénocorticotrrophine qui s'y trouve a pour résultat la solubilisation de la majeure partie de l'élément d'activité d'adrénocorticotrophine, tout en laissant une faible partie d'un résiuu insoluble sensiblement inactif.
Cette fraction soluble d::.ns l'eaupeut être séparée de la fraction insoluble dans l'eau pour donner une adrénocorticotrophine présentant une puissance accrue par rapport à l'élément de
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puissance sous-cutané qui est complètement solubla dans l'eau
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dans la gauiiae de pH neutres. La s5po.rd"tiol1 de cette fraction soluble du résidu insoluble peut être obtenue par filtrage . centrifugation, etc.
On ne comprend pas complètement le mécanisme de ce phénomène d'accroissement de la puissance sous-cutanée, mais on croit que l'on obtient une transforma- tion de la structure moléculaire d'adrénocorticotrophine dans ce traitement et que cela donne un nouveau produit de la
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nature pr5wentionnée. Bien que, COl1Üle on l'a rj,,iiurou6 dans ce qui précède, ce phénomène soit produit dans une certaine mesure avec toute adr6nocorticotro itinee une plus grande modi- fication est obtenue avec de lladrénocorticotrophine ovine et un changement particulièrement désirable est produit avec de 3.'adrénocorticotrophine bovine.
L'effet stabilisant de l'agent réducteur spécial-, par ' exemple la eystéine, sur l'activité d'adrnocort;1cotr J.)üÍne produite par ce procédé peut être obtenu pendant l' (;;l.\lIa;;a8i- nage du produit d'adrénocorticotrophine résultant ..Il incluant
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dans une solution aqueuse de ce dernier la con Dau2ation indiquée dans ce qui précède de cet ajent réducteur li un pli rentrant dans la gamme critique.
Un élément de conservation, tel qu'acide pa.:r:'ab8ÜZoï'lue de méthyle ou d'éthyle, peut aussi être incorpora dans le
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mélange aqueux d'adrénocorticotrophine pendant l'iacuoation ou dans la solution aqueuse du produit d'adrénocorticotrophine résultant, Cependant, des résultats particulièrement d3&!irabl.s sont obtenus avec un agent conservateur ayant une action
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anesthésique locale lors de l'administration parMnt#r ale, tel que phénol. Une concentration convenable de, par exemple, phénol dans la solution aqueuse d'au rnocorticotrophine peut être;d'environ 0,5 4.
ZtadrênocorticotrophinQ à action accrue obtenue par ce procédé peut être épurée par 2n nouveau fractionnement avec, par exemple, des résines d'échange ionique ou elle peut être empaquetée pour l'utilisation comme préparation thérapeutique.
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La solution aqueuse d'adrénocorticotrophine résultant de ce procéda peut être stérilisée par filtrage ou. traitement à l'autoclave et on peut ensuite la mettre dans des flacons - pharmaceutiques appropries. Lorsque la gélatine est incluse dans le mélange de réaction d'adrénocorticotrophine, la géla- tine aqueuse d'adrénocorticotrophine résultante peut être utilisée directement dans la préparation du produit d'adréno- corticotrophine de puissance accrue.
L'invention peut être en outre illustrée par les exemples particuliers suivants ; Exemple @
2oo mg de base de cystéine,-l furent ajoutés à 20 ml d'une solution aqueuse d'adrénocorticotrophine porcine préparée suivant le brevet précité. La solution, obtenue fut réglée à ' un pH de 7,4 avec une solution à 10% d'hydroxyde de sodium.
Ce réglage de pH eut pour résultat la formation d'un précipité dans la solution. Ce mélange fut versé dans un flacon en verre et le :flacon fut fermé d'une manière étanche aveo un bouchon de caoutonouc et un joint d'aluminium.
Le flacon fermé hermétiquement fut immergé dans l'eau .bouillante pour incubation. Des parties du produit contenu dans le flacon furent retirées à des intervalles de temps déterminés. Ces parties furent combinées avec de la gélatine aqueuse à 16 /J contenant 0,5% de phénol pour l'essai par le mode opératoire de gélatine sous-cutanée Codex US.
La température d'incubation moyenne était de 90 à 100 C. Les résultats d'essai furent les suivants :
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Intervalles de temps Puissance (Unités Codex US par lui) (minutes)
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<tb> 0 <SEP> 252
<tb>
<tb> 15 <SEP> 256
<tb>
<tb> 30 <SEP> 220
<tb>
<tb> 60 <SEP> 176
<tb>
<tb> 120 <SEP> 504
<tb>
<tb> 240 <SEP> 320
<tb>
<tb> 480 <SEP> 260
<tb>
Ces résultats indiquant que l'accroissement maxium de la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotrophine porcine praparée par le procédé du brevet précité peut être produit en deu heures, ehviron à une température de 90 à 100 C et qu'ensuite l'activité tombe très rapidement.
. Exemple 2
200 mg de base 1-cystéine furent ajoutés à 40 ml d'une solution aqueuse d'adrénocorticotrophine porcine préparée sui- vant le brevet précité. La solution résultante fut réglée à un pH de 6,5 avec une solution à 105 d'hydroxyde de sodium, après quoi un précipité fut formé dans la solution.
Une partie de ce mélange, 4 ml, fut versée dans un flacon de verre d'une contenance de 5 m1. L'air contenu, dans le flacon rempli fut refoulé par de l'azote et le flacon fut fermé hermétiquement. Le flacon rempli fut introduit dans un four à une température de 100 C. Des parties , du contenu de ce flacon furent retirées à des intervalles de temps dssirés pendant l'incubation. Ces parties furent combinées avec de la gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,5% de phénol pour essai par le mode opératoire à gélatine sous-cutanée suivant Codex US.
Les résultats furent les suivants Intervalles de temps Puissance (Unités Codex US par ml) (geures)
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<tb> 0 <SEP> 530
<tb>
<tb> 1 <SEP> 545
<tb>
<tb> 2 <SEP> 670
<tb>
<tb> 3 <SEP> 675
<tb>
<tb> 4 <SEP> 450
<tb>
<tb> 20 <SEP> 510
<tb>
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E..d.ple 3 De 1 t adrénücor ticotrclhne porcine brute, par exemple avant épuration, suivant le brevet précité, en une quantité de
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210 m, fut dissoute dans 30 ml d'eau réglée au pH °,0 à l'acide acétique. On additionna à la solution résultante 150 mg d'un chlorhydrure de Cjstéine-1 et cette solution fut rlée au pH 7,3 avec une solution à 10% d'hyiroxyde de sodium. Ensuite un précipité fut formé dans la solution.
Ce mélange fut versé dans un flacon de verre et le flacon rempli fut fermé hermétiquement. Ce flacon fut ensuite placé pour incubation sous une température de 90 à 100 C et des parties de son contenu furent retirées à des intervalles de temps choisis au cours de l'incubation. Ces parties furent com-
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binées avec de la gélatine aqueuse à 16 coa-tenant 0,5 / - de phénol pour essai par le mode opératoire à gélatine sous- cutanée suivant Codex US.
Les résultats furent les suivants :
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Intervalle de taups waissance (Unités Codex US par mil) (heures) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 0,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 1,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 1,09
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 1,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> 1,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> 2,2
<tb>
Ces résultais indiquent que l'accroissement maximum de puissance sous-cutanée est obtenu avec de l'adrénocorticotrophine porcine brute en au ,Joins 8 heures à une température d'au moins 90 à 100 C et à un pH de 7,3.
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:8....;,.::pl e 4 De 1 'aarénocoruicotrophine bovine, préparée par le précité procédé du breveta en une quantité de 210 mg fut dissoute dans
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30 Mil d'eau réglée au p73 °,5 . l'acide acétique. On ajouta à la solution ootenue 150 ,..; de chlorhydrure de oystéine-1. Cette solution fut réglée au pi-i 7,2 avec un solution à 10 I d'hydroxycb
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de sod@um, après quoi un précipité se forma dans la solution.
Ce mélange fut versé dans un flacon de verre et le flacon rempli fut fermé hermétiquement. scellé
On plaça le flacon/ pour incubation sous une température de 90 à 100 C et des parties du contenu du flacon furent retirées à des intervalles de temps choisis au cours de l'incubation...
Ces parties furent combinées avec de la gélatine aqueuse à 16% contenant 0,5% de phénol pour essai par le ,mode opéra- toire à gélatine sous-cutanée suivant Codex US. Les résultats furent connue suit : Intervalles de temps Puissance (Unités Codex US par ml) (heures)¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 10
<tb> 2 <SEP> 12
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 15
<tb>
<tb> 6 <SEP> le <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb> 8 <SEP> 22
<tb>
<tb> 16 <SEP> 27
<tb>
Ces résultats indiquent que 1'accroissement Maximum de puissance sous-cutanée peut être obtenu avec de l'adrénocortico- trophine bovine préparée par le procédé du brevet précité en environ 16 heures, à une température de 90 à 100 C et à un pH de 7,2.
Exemple 5 L'adrénocorticotrophine bovine préparée par le procédé du brevet précité en une quantité de 60 mg fut dissoute dans 30 mg d'une solution aqueuse contenant 16% de gëlabine partiel- lement hydrolysée et 0,5% de phénol. On ajouta à la solution résultante 120 mg de chlorydrure de cystéine-1. Cette solution fut réglée au pH 6,5 avec une solution à 10% d'hydroxyde de sodium. Ce mélange lut versé dans des flacons de verre de 5 ml qui lurent fermés hermétiquement.
Les flacons ainsi fermés furent mis pour incubation sous une température de 100 C et des parties de leur contenu furent retirées à des intervalles de temps choisis pour/essai par le mode opératoire à la gélatine
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sous-catanée suivant Jodex US. j-.es rJsulats furent comme suit :
lnterv@@les de temps Puissance (Unités Codex US par ni) (genres) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 10
<tb> 4 <SEP> 19,5
<tb> 8 <SEP> 17
<tb> 16 <SEP> 15,4
<tb> 24 <SEP> 16,1
<tb>
Ces résultats indiquent que lorsque la gélatine et le phénol sont inclus dans le mélange d'incupation, on obtient une élévasion de la vitesse d'accroissement de l'adrénocorticotro- pnine bovine préparée par le procédé du, brevet précité, à une te-pérature particulière.
Exemple 6
De l'adrénocorbicotrophine bovine préparée par le procédé du brevet précité, en une' quantité de 100 mg,fut mise en suspension dans 10 ml d'eau exempte de pyrogène et la suspension résultante fut réglée au pH 4,7. On trouva, par le mode opératoire d'essai à la gélatine sous-cutanée suivant Codex US, que cette solution avait une puissance de 100 unités Codex US par ml.
Cette suspension fut versée dans -un flacon de verre qui fut hermétiquement fermé. Ce flacon fut immergé dans de . l'eau'bouillante pendant 6 heures. Après incubation, on nalysa de nouveau la suspension par le procédé à la gélatine sous-cutanée suivant Codex US et on trouva qu'elle contenait 196,5 unités Codex US par mù.
Ces résultats indiquent qu'un accroissement apparent à 100% de la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotrophine bovine prépe @e par le procédé dudit brevet pe@t être obtenu en 6 heures environ.
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-Exemple I
De l'adrénocorticotrophine bovine préparée par ledit rocédé fut dissoute dans une solution d'acide acétique à 0,1 pour obtenir une solution aqueuse contenant 10 mg par cm3 d'adré- nocorticotrophine. On ajouta à cette solution 0,5% de chlorhy- drure de cystéine-1 et la solution résultante .¯fut réglée à un pH de 6,9 avec une solution il 10 .; d'hydroxyde de sodium.
On versa la solution obtenue dans un flacon de verre et l'air qu'il contenait fut chassé par de l'azote. Le flacon rempli fut formé hermétiquement et placé pour incubation sous une température de 90 à 100 C pendant 11 heures.
La suspension incubée fut refroidie à une température de 30 à 50 C et ensuite filtrée à travers une toile de nylon. Le filtrat fut combiné avec une solution de gélatine aqueuse à ' 16 contenant 0,5 de phénol. On ajouta à cette solution de gélatine 0,1 de chlorhydrure de cystéine-1.
La solution de gélatine fut clarifiée par filtrage, mise en flacon sous azote et chauffée à l'autoclave pendant 20 minutes sous pression, à une température de 120 C.
Au cours de la préparation de ce produit, on obtint une courbe pilote en retirant des parties du contenu du flacon à des intervalles de temps choisis pendant l'incubation. Ces parties furent essayées par le mode opératoire à la gélatine sous-cutanée suivant Codex US. Les résultats de cette courbe pilote furent comme suit : Intervalles de temps Puissance (Unités Codex US par ml) (heures) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 10 <SEP> ¯ <SEP> 20%
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 20 <SEP> essai <SEP> à <SEP> un <SEP> niveau
<tb>
<tb>
<tb> 31 <SEP> (essai <SEP> à <SEP> un <SEP> niveau.)
<tb>
<tb>
<tb> 12 <SEP> 3,11 <SEP> 4,5 <SEP> (essai <SEP> à <SEP> trois <SEP> niveaux)
<tb>
<tb> 16 <SEP> 21 <SEP> (essai <SEP> à <SEP> un <SEP> niveau).
<tb>
Sur la base de cette courbe pilote, un intervalle de temps de 11 heures fut choisi pour l'incubation de la masse principale. Le produit fini fut essayé par le ..iode opératoire à la gélatine sous-cutanée suivant Codes US et, dans un essai
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à trois niveaux, on trouva qu'il contenait 30,0 t 2,7 unités par mg ou ml.
Le précipité séparé fut obtenu en un rendement de.
40 mg et l'on trouva par le ,iode opératoire à la gélatine sous- cutanée suivant Codex US qu'il contenait moins de 5 unités Codex US par mg.
Ces résultats indiquent qu'une adrénocorticotrophine bovine complètement soluble dans l'eau à une gamme de pH neutres peut être obtenue avec une puissance sous-cutanée accrue. Le résidu insoluble séparé par le procédé fut trouvé contenir une activité d'adrénocorticotrophine négligeable.
L'expression "activité" utilisée ici se réfère à un effet physiologique .pouvant être démontré obtenu avec de l'adré- nocorticotrophine sous des conditions courantes, tandis que l'expression "puissance" se réfère à l'activité d'une prépara- tion d'adrénocorticotrophine par unités de poids ou volume. De même, "puissance accr..e" signifie une augmentation manifeste d' activité pour une préparation d'adrénocorticotrophine, qui' est supérieure à ce que l'on pourrait attendre sur la base du en contenu/solides. De plus, 1'expression "gamme de pH neutres" se réfère à la ga-ae de pH physiologique qui est d'environ 6,2 à 7,5.
Bien que divers modes de réalisation du procédé de l'invention aient @té exposés et décrits en détail dans ce qui précède, il est bien évident que de nombreuses modifications peuvent y être apportées et diverses variantes peuvent être réalisée.:, sans sortir du cdre de l'invention.