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La présente invention est relative à un procédé perfec- tionné pour la préparation d'un dextrane à poids moléculaire relativement peu élevé; en partant d'un dextrane d'un poids moléculaire relativement élevé. Plus particulièrement,l'invention est relative à un procédé perfectionné pour produire le dextrane "clinique" à partir d'un dextrane d'un poids moléculaire plus élevé, soit, d'un dextrane "natif".
Le dextrane pouvant être utilisé dans les liquides pour les injections intraveineuses,administrées en vue d'éliminerrétat de choc,est connu sous la dénomination de dextrane "clinique".
Des spécifications ont été établies pour cette substance clinique par les autorités militaires des Etats-Unis. Une de ces spécifi- cations se rapporte au poids moléculaire, lequel doit être tel que le poids moléculaire de la fraction de 10 % ayant le poids moléculaire le moins élevé ne soit pas inférieur à 25.000 environ;
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que le poids moléculaire de la fraction de 10 % ayant le poids moléculaire le plus élevé ne soit pas supérieur à 200. 000 environ et que le poids moléculaire moyen soit compris entre 50. 000 et 100. 000, de préférence entre 60.000 et 80. 000.
Une autre de ces spécifications concerne la viscosité relative des solutions aqueuses d'injection, laquelle doit être relativement élevée pour la-concentration donnée du dextrane, qui est généralement de 6 % en poids.
Ihns la pratique courante, le dextrane "clinique" est obtenu par une dépolymérisation partielle et contrôlée du dextrane "natif", en utilisant de l'acide comme agent d'hydrolyse.
Le dextrane "natif" peut être obtenu de plusieurs manières différentes. Il peut être produit par synthèse en inoculant, à un milieu nutritif contenant la saccharose, des microorganismes producteurs de dextrane, tels que ceux des types Leuconostoc mes en- té roi des et L. dextranicum, jusqu'à ce que l'on atteigne une production de dextrane maximum, dans lequel cas la synthèse s'effectue par voie enzymique, en présence de bactéries, ou bien, ce dextrane peut être obtenu en cultivant les microorganismes en vue de produire l'enzyme dextrane-sucrase, en'séparant l'enzyme par filtration de la culture, en introduisant le filtrat, ou l'enzyme qui en a été séparée,
dans une solution aqueuse de saccharose et en laissant reposer la masse jusqu'à ce que le dextrane soit produit par synthèse à partir de la saccharose,cette synthèse étant effectuée en l'absence de bactéries, de débris cellulaires, etc..
Dans l'un comme dans l'autre procédé, le dextrane "natif" est précipité à partir du produit de fermentation ou du milieu nutritif par l'addition d'un non-solvant pour le dextrane y contenu.
Le produit natif possède un poids moléculaire très élevé, qui s'élève à plusieurs millions d'après le calcul, et n'est donc pas recommandé pour les injections.
Comme il a été indiqué plus haut, la pratique classique consiste
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à fractionner le dextrane "natif" dans une solution acide,9 afin d'obtenir des fractions ayant le poids moléculaire moyen réduit voulu.
Selon la présente invention, l'hydrolyse acide de la solution aqueuse contenant le dextrane "natif est effectuée en chauffant un milieu acide aqueux contenant, en plus du dextrane et de l'eau, une quantité limitée constante pour chaque charge,d'un alcool aliphatique inférieur miscible à l'eau ou d'une cétone, telle que l'acétone ou la dioxane, au point d'ébullition du mélange eaualcool ou eau-cétone, jusqu'à l'achèvement de l'hydrolyse voulue.
Dans le mode de réalisation préféré, la proportion présente d'alcool ou de cétone est comprise entre 2,5 % et 33 1/3 % du volume de l'eau, l'adjuvant préféré étant l'isopropanol, l'hydrolyse étant effectuée à 85 C environ.
Dans ce procédé perfectionné et particulièrement favorable, où la solution aqueuse acide du dextrane "natif", solution conte- ' nant l'isopropanol, est chauffée à environ 85 C et est maintenue à cette température pendant la durée de la réaction d'hydrolyse, l'alcool paraît exercer un effet retardateur ou inhibiteur sur l'allure de l'hydrolyse, ce qui a une influence très favorable sur la viscosité des solutions,laqueuses du dextrane "clinique" séparé de l'hydrolysat. L'isopropanol agit évidemment de façon à inhibiter l'allure de l'hydrolyse,en réduisant l'efficacité de l'acide hydrolysant en raison d'une diminution de l'ionisation, ce qui, par conséquent, réduit la rapidité de l'hydrolyse ou du fractionnement.
Comme indiqué plus haut, le dextrane "natif" soumis à l'hydrolyse possède un poids moléculaire moyen élevé; toutefois, certaines de ses fractions possèdent un poids moléculaire plus relevé que d'autres. Une hydrolyse prématurée des portions ayant le poids moléculaire le plus élevé conduit à une polydispersité accrue- indésirable du produit hydrolysé final en solution aqueuse* D e toute évidence, l'isopropanol empêche de façon sélec-
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tive, pendant les stades initiaux de l'hydrolyse, le .'f rationnement prématuré des portions de dextrane à poids moléculaire plus élevé et influence ainsi favorablement la viscosité des solutions aqueuses du produit clinique final, où le dextrane posséda une monodispe rsité moléculaire améliorée.
On a constaté que, lorsque l'hydrolyse est exécutée en chauffant la solution acide - qui contient l'isopropanol et, initialement, le dextrane natif à fractionner, à poids moléculaire moyen élevé, - à 85 C environ, c'est-à-dire à la température du point d'ébullition du mélange eau-isopropanol, cela jusqu'à l'achèvement de l'hydrolyse, ce qui a généralement lieu au bout de quelques minutes, les solutions aqueuses à 6 % de dextrane clinique, séparées de l'hydrolysat, par exemple par précipitation fractionnée, possèdent une viscosité relative supérieure à celle des solutions à 6 % de dextrane hydrolysé obtenu à partir d'un dextrane natif analogue et qui a été hydrolysé dans un milieu acide, mais en l'absence d'alcool. Cette viscosité relative plus élevée des solutions aqueuses constitue une caractéristique avantageuse.
Il semble que cette viscosité plus grande des solutions aqueuses à 6 % de dextrane hydrolysé dans les conditions décrites ici puisse être attribuée au fait que les molécules de dextrane hydrolyse en présence d'isopropanol, par exemple, sont quelque peu moins ramifiées que le dextrane hydrolysé dans les conditions pratiquées à ce jour. En d'autres termes, l'isopropanol est de nature à augmenter la "déramification" du dextrane au cours de l'hydrolyse acide, ce qui fournit une molécule de dextrane plus linéaire.
Ceci signifie encore qu'une plus grande proportion des liaisons 1, 6 se répétant dans la structure moléculaire du dextrane peuvent être fractionnées lorsque l'hydrolyse est exécutée en présence d'isopropanol.Quelle que soit l'explication de ce fait, les solutions aqueuses possèdent une plus grande viscosité
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que les solutions de concentration équivalente de dextrane hydrolysé en milieu acide, en l'absence d'alcool. Par exemple, le dextrane hydrolysée en milieu aqueux ayant une concentration d'iso, propanol de 33 1/3 % du volume de l'eau, possède, à 25 C, une viscosité relatifs de 5,3, tandis que les solutions aqueuses à 6 % de-dextrane "natif analogue, hydrolysé en l'absence d'isopropanol, n'ont, à 25 C, qu'une viscosité relative de 4,3.
La viscosité accrue des solutions selon la présente invention est nettement avantageuse du point de vue clinique.
Il est préférable que la température de la masse en hydrolyse soit maintenue de façon sensiblement constante au point d'ébullitiondu mélange eau-isopropanol. L'apport de chaleur étant constant, l'obtention de ce résultat est facilitée par l'effet de refroidissement dû à la vaporisation du mélange isoproponal-eau.
L'hydrolyse peut éventuellement être exécutée à reflux.
Lorsque l'hydrolyse est exécutée par charges successives, la même concentration d'alcool doit exister au début de chaque opération d'hydrolyse., de sorte que le produit de chaque charge possède les mêmes caractéristiques physiques et fournisse des solutions aqueuses ayant la même viscosité et le même degré de monodispersité moléculaire du dextrane.
Bien qu'il soit préférable d'utiliser un acide minéral, tel que l'acide chlorhydrique ou sulfurique, pour la mise en train de l'hydrolyse, il convient de noter que d'autres acides, tels que l'acide phosphorique, ainsi que des acides organiques, tels que l'acide acétique, peuvent également être utilisés. Le pH du milieu acide aqueux peut se situer entre environ 1,20 et 1,26.
La présence de l'alcool dans la solution aqueuse acide a également pour effet d'abaisser la viscosité initiale de la solution, ce qui a pour résultat une transmission de chaleur plus aisée et plus uniforme à travers la masse.
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Lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il est avantageux d'incorporer à la solution alcoolique aqueuse ,et acide (de dextrane mati± une petite quantité, par exemple entre 0,3 et 1 %. d'agent réducteur, ce qui contribue à inhiber le développement, au cours de l'hydrolyse, 'de réactions bxydatives indésirables, qui donnent à la solution une coloration -foncée.
L'acide ascorbique constitue un agent réducteur particulièrement favorable.
La durée de l'hydrolyse dans les conditions optima décrites .ci-dessus .. c'est-à-dire le chauffage à 85 C 'environ, du mélange aqueux contenant l'isopropanol - es% 'de 40 à 50 minutes. A la fin .de cette période de chauffage l'hydrolyse étant achevée, on ajoute immédiatement une solution caustique à la concentration et en la quantité requise pour ajuster le pH 'de l'hydrolysat à 6,8-7,0. La solution peut ensuite être refroidie à une température située entre environ SS à 45 C, après quoi la solution est soumise à une décoloration, à une déionisation età une clarification.
La décoloration s'effectue en faisant passer la solution à travers un lit de charbon de bois. La déionisation peut être réalisée en faisant passer la solution décolorée à travers un lit ;ou une colonne contenait une substance minérale 'ou une résine formant un échangeur efficace d'anions et de cations. La clarification ultérieure est généralement opérée en faisant passer la solution à travers la terre à ,diatomées..
Le dextrane hydrolysé, en solution .aqueuse., peut être soumis à une précipitation fractionnée, en utilisant l'alcool ou l'acétone comme agents de précipitation. On sait qu'en introdui sant des additions répétées et croissantes de quantités d'isopropanol ou d'acétone, capables de produire une précipitation, dans la solution aqueuse du produit de la dégradation partielle, on peut précipiter et isoler, à partir de l'hydrolysat, des fractions de dextrane à poids moléculaire moyen sélectif.
La pratique
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courante consiste Sa à ajouter à la solution, à titre de premier accroissement d'alcool, une quantité d'alcool suffisante pour précipiter sélectivement le dextrane ayant le poids moléculaire le plus élevé et qui ne peut pas être utilisé comme dextrane clini- que; à séparer le précipité ;
età ajouter ensuite une quantité d'alcool suffisante pour précipiter le dextrane clinique, en laissant en solution le dextrane ayant le poids moléculaire le moins élevée Ce traitement peut être suivi de l'isolement de la fraction clinique du dextrane d'avec le produit hydrolysé obtenu dans les conditions d'hydrolyse selon la présente invention. La fraction clinique du dextrane peut être déshydratée, en utilisant l'acétone ou l'alcool isopropylique, et en séchant finalement sous vide à une température de 50 C à 80 C.
Les exemples ci-après illustrent le procédé d'hydrolyse perfectionné selon l'invention.
EXEMPLE I.
Une solution aqueuse à 10 % de dextrane à poids moléculaire élevé, contenait de l'isopropanol dans une proportion de 7 % du volume de l'eau présente, a été additionnée d'acide chlorhydrique en quantité suffisante pour amener le pH de la solution à environ 1,04. Le dextrane natif demeure en solution à cette concentration d'isopropanolo On a ensuite chauffé la solution lentement jusque 85 C environ et on l'a maintenue à cette température pendant 40-50 minutes environ, après quoi la solution a été neutralisée, refroidie, décolorée, déionisée et clarifiée, ces traitements ayant été suivis par la précipitation de la fraction clinique du dextrane, qui a été récupérée, déshydratée et, finalement, séchée sous vide, Une solution aqueuse à 6 % du dextrane clinique obtenu de cette manière avait, à 85 C,
une viscosité relative d'environ 3,8 et convenait parfaitement pour les injections intraveineuses destinées à éliminer l'état de choc.
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EXEMPLE II.
On a reproduit l'Exemple I, sauf que l'on a remplacé l'isopropanol par l'éthanol et que la solution acidifiée a été chauffée à la température de 78 C et maintenue à cette tempéra- ture pendant 40-50 minutes.
EXEMPLE III.
On a reproduit l'Exemple I, sauf que l'isopropanol a été utilisé en une proportion de 8 % du volume de l'eau présente.
Une solution aqueuse à 6 % du dextrane clinique obtenu en tant que produit final avait, à 85 C une viscosité relative d'environ 4,0.
EXEMPLE IV.
On a reproduit l'Exemple I, sauf que l'isopropanol a été utilisé dans une proportion de 9 % du volume de l'eau présente.
Une solution aqueuse à 6 % du dextrane clinique obtenu avait, à
85 0, une viscosité relative d'environ 4,3.
EXEMPLE V.
On a reproduit l'Exemple I, sauf que l'isopropanol a été utilisé dans la solution aqueuse acide de dextrane natif en une proportion de 10 % du volume de l'eau présente. Une solution aqueuse à 6.% du dextrane clinique obtenu comme produit final avait, à 85 C, une viscosité relative de 4,8.
EXEMPLE VI.
L'Exemple I a été reproduit, sauf que la proportion d'iso- propanol dans la solution aqueuse acide était de 20 % du volume de l'eau.
EXEMPLE VII.
L'Exemple I a été reproduit, sauf que l'on a employé l'éthanol et que l'hydrolyse a été exécutée à 70 C environ.
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EXEMPLE VIII.
Dans le mode opératoire selon l'Exemple I, on a substitué le méthanol à l'isopropanol, dans une proportion de 10 % du volume de l'eau, et l'hydrolyse a été effectuée à environ 65 C, la durée de l'hydrolyse ayant été quelque peu plus longue que dans l'Exemple I, soit de 55-60 minutes environ.
EXEMPLE IX.
La dioxane a été substituée à l'isopropanol dans l'Exemple I et la température de l'hydrolyse a été élevée à environ 100 0, ce qui a quelque peu abrégé le temps requis pour produire la dégradation voulue.
EXEMPLE X.
On a utilisé l'acétone au lieu de l'isopropanol dans l'Exemple I9 l'hydrolyse étant effectuée à 56 0 environ pendant une durée de 60 minutes environ.
L'alcool ou la cétone, présents pendant l'hydrolyse constituent,chacun, comme on le sait, un agent qui précipite le dextrane à partir de la solution aqueuse, lorsqu'il est employé dans des proportions comparativement importantes, généralement supérieures à 35 % en diurne. Dans le procédé selon l'invention, la proportion de cétone ou d'alcool aliphatique, miscible à l'eau, présente au cours de l'hydrolyses soit de-2,5 % à 33 1/3 % du volume de.l'eau, est généralement insuffisante pour précipiter le dextrane à partir de la solution. En tout cas, la proportion d'alcool ou de cétone utilisée est contrôlée dans les limites indiquées, de sorte que le dextrane à hydrolyser demeure dans la solution.
Avec une proportion de 33 1/3 % d' isopropanol, par exemple, et à la température de travail de 85 C environ9 le dextrane demeure en solution,. La proportion la plus favorable d'alcool ou de cétone peut se situer entre 2,5 et la % ou, ce qui est encore plus avantageux, entre 7 % et 10 %, du volume de l'eau. A ces
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proportions,ni l'alcool ni la cétone ne forment un mélange azéotropique avec l'eau.
Lorsqu'il s'agit de séparer le dextrane natif, soit le dextrane à poids moléculaire élevé défavorable, d'avec le milieu la dans lequel il est produit par synthèse à partir de/saccharose, la précipitation'du dextrane peut s'effectuer à l'aide d'alcools ou de cétones. Ceci étant réalisé, il sera généralement préféra- ble d'utiliser, lors de*l'hydrolyse du dextrane, le même agent de précipitation, mais dans des proportions non susceptibles de provoquer une précipitation* Toutefois, ceci ne présente pas une importance essentielle, et l'alcool ou la cétone que l'on utilisa lors du fractionnement hydrolytique du dextrane, peuvent être différents de ceux employés pour précipiter le dextrane natif,
à condition que l'agent de précipitation !pour le produit natif soit éliminé aussi complètement que possible de lapasse de dextrane natif avant que ce dernier ne se dissolve dans la solution aqueuse acide et avant l'introduction de l'alcool ou de la cétone que l'on doit utiliser pour l'hydrolyse.
Lors de l'exécution de l'hydrolyse acide du dextrane en présence de quantités limitées d'alcool ou de cétone, à la tempé- rature du point d'ébullition du mélange eau-alcool ou eau-cétone-, ou au voisinage de cette température, on obtient un dextrane hydrolysé qui, en se fractionnant, fournit un dextrane ayant un poids moléculaire compris dans la gamma des poids moléculaires des substances servant à grossir la massa du plasma sanguin, et qui forme des solutions aqueuses d'une viscosité où la monodisper- sité moléculaire de dextrane atteint un haut degré, -qui convient parfaitement pour les injections intraveineuses, avec ceci que, en doses thérapeutiques, le dextrane demeure dans le système pen- dant un temps suffisamment long pour éliminer l'état de choc.
Comme.indiqué plus haut, le dextrane natif, c'est-à-dire à
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poids moléculaire élevé, peut être obtenu de diverses manières, soit, comme il a été décrit ici de façon générale, par conversion bactérienne des liaisons 1, 4 d'une dextrine en liaisons 1,6 de dextrane, ou de toute autre manière où l'on peut obtenir, à titre de produit, un dextrane d'un poids moléculaire moyen plus élevé que le 'dextrane clinique, le dextrane ainsi obtenu pouvant être hydrolyse par un acide afin de fournir une substance servant à grossir la masse du plasma sanguin.
Certaines modifications et variantes peuvent être apportées à la mise en pratique de la présente invention, sans s'écarter de l'esprit ni dépasser le cadre de celle-ci.
Par "substance servant à grossir la masse de plasma sanguin" en entend une substance qui peut être administrée en injections intraveineuses, soit pour compléter, soit pour remplacer les injections de plasma sanguin.
Par le terme "monodispersité" on entend une dispersion uni-.' forme de l'hydrolysat en milieu liquide, lorsque l'hydrolysat a un poids moléculaire uniforme et se disperse dans l'eau d'une manière plus égaler d'où une dispersion monomoléculaire. Par le terme "polydispersité" on entend 'une plus' grande disparité dans les poids moléculaires des fractions de dextrane, qui détermine une dispersion moins uniforme dans l'eau.