Procédé de dépolymérisation partielle de la dextrane
La présente invention concerne un nouveau procédé de dépolymérisation partielle de la dextrane.
Ce nouveau procédé s'applique en particulier à la production de dextrane à partir de la dextrane native.
La dextrane utilisable en solutions pour injections intraveineuses dans le cas de commotions est actuellement connue sous le nom de dextrane clinique. Une description précise a été établie pour ce matériel clinique par les autorités militaires des Etats-Unis d'Amérique. L'une des conditions requises est en relation avec le poids moléculaire, qui doit être tel que le poids moléculaire des 10 O/o de la matière de poids moléculaire inférieur ne soit pas au-dessous d'environ 25 000, que le poids moléculaire des 10 O/o de la matière de poids moléculaire le plus élevé ne dépasse pas 200000 et que le poids moléculaire moyen soit de l'ordre de 50 000 à 100 000, de préférence compris entre 60 000 et 80000.
Une autre condition concerne la viscosité relative de la solution aqueuse à injecter, qui doit être relativement élevée en comparaison de la concentration donnée de la dextrane, généralement 6 o/o en poids.
Dans la pratique usuelle, la dextrane est obtenue en dépolymérisant partiellement ou d'une manière contrôlée de la dextrane native, utilisant un acide comme agent hydrolisant.
La dextrane native peut être obtenue de plusieurs manières différentes. On peut l'obtenir synthétique ment en incubant un milieu nourrissant comportant de la polysaccharose avec des microorganismes produisant de la dextrane, tels que ceux du type des leuconostoques mésentéroïdes et dextranes L, jusqu'à obtention d'une quantité maximum de dextrane, dans lequel cas la synthèse s'effectue enzématiquement en présence des bactéries, ou bien elle peut être obtenue par culture de microorganismes produisant une enzyme polysaccharose de dextrane, en séparant l'enzyme par filtration de la culture, en introduisant ensuite le produit filtré ou enzyme ainsi isolée dans une solution aqueuse de polysaccharose, et en conservant la masse jusqu'à ce que la dextrane soit synthétiquement obtenue de la polysaccharose, cette synthèse étant effectuée en l'absence de bactéries, débris cellulaires, etc.
Dans chaque procédé, la dextrane native se précipite du milieu de fermentation ou nourrissant par adjonction d'un corps dans lequel la dextrane est insoluble.
Ce produit natif possède un poids moléculaire très élevé, que le calcul place dans l'ordre de millions et ne peut être injecté en toute sécurité. Comme cela a été dit précédemment, la pratique usuelle implique la division de la dextrane native dans une solution acide, afin d'en obtenir des particules présentant le poids moléculaire moyen inférieur recherché.
Selon la présente invention, on chauffe une solution aqueuse acide de la dextrane contenant de 2,5 0/o à 33 t/s O/o du volume d'eau, d'un alcool aliphatique ou d'une cétone, miscibles à l'eau et non solvants de la dextrane, à la température d'ébullition du mélange que forment l'eau et l'alcool aliphatique ou la cétone.
Selon une forme de réalisation du procédé selon l'invention, on utilise comme alcool aliphatique de l'isopropanol, la température de travail étant d'environ 850 C. Selon cette forme d'exécution, la solution aqueuse acide de dextrane native contenant l'isopropanol est chauffée à environ 850 C et maintenue à cette température durant la dépolymérisation, l'alcool semble exercer un effet retardateur ou d'inhibition sur le cours de la dépolymérisation, dont bénéficie la viscosité de la solution aqueuse de dextrane clinique formée. I1 est évident que l'isopropanol agit comme retardateur de la dépolymérisation en dimi nuant l'efficacité de l'acide hydrolyseur par diminution de l'ionisation. Certaines parties de la dextrane native ont un poids moléculaire plus élevé que d'autres.
Une dépolymérisation prématurée des parties de poids moléculaire le plus élevé conduit à une augmentation indésirable de la polydispersité du produit final en solution aqueuse. L'isopropanol prévient évidemment par sélection, au début de la dépolymérisation, une division prématurée des parties de poids moléculaire plus élevé et influence ainsi favorablement la viscosité de la solution aqueuse du produit clinique final, qui présente une monodispersité moléculaire accrue.
On a observé que, si la dépolymérisation est effectuée en chauffant la solution acide contenant l'isopropanol, à environ 850 C (point d'ébullition du mélange eau-isopropanol), jusqu'à ce que la dépolymérisation soit achevée, soit généralement quelques minutes, le 6 0/o de la solution aqueuse obtenue se sépare du reste sous forme de précipité et présente une viscosité plus élevée que la viscosité du 6 O/o de la solution obtenue par dépolymérisation d'une dextrane native similaire dans un milieu acide, mais en l'absence d'alcool. Cette viscosité plus élevée de la solution aqueuse est désirable.
Il semble que cette viscosité accrue du 6 o/o de la solution aqueuse dans les présentes conditions de travail provient du fait que les molécules obtenues par dépolymérisation de la dextrane en présence, par exemple, d'isopropanol, sont quelque peu moins embranchées que les molécules obtenues par dépolymérisation dans les conditions usuelles. Cela provient de ce que l'isopropanol augmente le désembranchement de la dextrane durant la dépolymérisation acide, ce qui produit une molécule plus linéaire, c'est-à-dire qu'une plus grande proportion du couplage structural moléculaire l : 6, se répétant dans la dextrane, peut être divisée si la dépolymérisation est effectuée en présence d'isopropanol.
Quelle que soit l'explication donnée, les solutions aqueuses ont une viscosité plus élevée que les solutions de concentration équivalente obtenues par dépolymérisation de la dextrane dans un milieu acide exempt d'alcool. La solution obtenue par dépolymérisation de la dextrane dans un milieu aqueux ayant une concentration d'isopropanol de 33 1/3 /o du volume d'eau a, par exemple, une viscosité relative de 5,3 à 250 C, tandis que la solution aqueuse obtenue par dépolymérisation de la dextrane en l'absence d'isopropanol a une viscosité relative de 4,3 seulement, à 250 C. La viscosité accrue des solutions obtenues par le procédé selon l'invention est très avantageuse du point de vue clinique.
Il est indiqué de maintenir la température pendant la dépolymérisation pratiquement constante et au point d'ébullition du mélange eau-isopropanol.
Avec apport constant de chaleur, cela est facilité par l'effet réfrigérant provenant de l'évaporation de l'eau et de l'isopropanol. Si l'on veut, l'hydrolyse peut être effectuée avec réfrigérant à reflux.
Lorsque la dépolymérisation s'effectue par charges successives de produit, la même concentration d alcool doit être observée au début de chaque opération, afin que le produit final ait dans chaque cas les mêmes caractéristiques physiques et donne lieu à une solution aqueuse de même viscosité et de même degré de monodispersion moléculaire.
Quoiqu'il soit préférable d'utiliser l'acide sulfurique ou chlorhydrique pour déclencher la dépolymérisation, d'autres acides peuvent être utilisés, par exemple l'acide phosphorique ou des acides organiques, comme l'acide acétique. Le pH du milieu acide aqueux peut être compris entre 1,20 et 1,26.
Il est quelquefois désirable d'ajouter à la solution aqueuse acide de la dextrane contenant l'isopropanol une faible quantité, par exemple de 0,3 à 1 O/o, d'un agent réducteur destiné à empêcher le développement de réactions oxydantes indésirables troublant la solution durant l'hydrolyse. L'acide ascorbique est un agent réducteur souvent employé.
La durée de la dépolymérisation sera en général, dans le cas où l'on effectue la dépolymérisation en présence d'isopropanol à environ 850 C, entre 40 et 50 minutes. A la fin de cette période de chauffage, la dépolymérisation étant terminée, on ajoutera en général immédiatement une solution caustique en quantité et concentration telles que le pH de la solution soit compris entre 6,8 et 7. La solution peut alors être refroidie à la température de 35o C à 45o C, décolorée, déionisée et clarifiée. La décoloration est effectuée de préférence en passant la solution au travers d'une couche de charbon de bois. La déionisation peut être effectuée en passant la solution décolorée au travers d'une couche ou d'une colonne d'un minéral ou d'une résine anionique ou cationique produisant un échange efficace.
La clarification ultérieure sera obtenue en général en faisant passer la solution par une terre d'infusoires.
La dextrane clinique peut être extraite de la solution aqueuse par précipitation fractionnée en utilisant un alcool ou de l'acétone comme précipitant.
On sait que, en additionnant d'une manière répétée des quantités toujours plus grandes de précipitants tels que l'isopropanol à la solution aqueuse, il est possible de précipiter et d'isoler des fractions de poids moléculaires différents. Il est d'usage d'ajouter à la solution comme première dose d'alcool, une quantité suffisante pour précipiter sélectivement la dextrane native, non utilisable pour des besoins cliniques, de séparer le précipité, puis d'ajouter une dose d'alcool suffisante pour précipiter la dextrane clinique, en abandonnant les substances de poids moléculaires inférieurs dans la solution. Cette manière de procéder peut être appliquée à la séparation de la fraction de dextrane clinique contenue dans le produit obtenu selon le présent procédé.
On peut déshydrater la fraction de dextrane clinique en utilisant de l'acétone ou de l'alcool isopropylique, puis la sécher finalement dans le vide à la température de 50O C à 800 C.
Exemple I
A une solution aqueuse à 10 O/o de dextrane, contenant de l'isopropanol dans la proportion de 7 /o du volume d'eau, on ajoute une quantité d'acide chlorhydrique suffisante à amener le pH de la solution à la valeur de 1,04. On échauffe alors la solution lentement jusqu'à approximativement 850 C et la maintient à cette température durant environ 40 à 50 minutes, après quoi on la neutralise, la refroi dit, la décolore, la déionise et la clarifie, ces traitements étant suivis de la précipitation de la fraction clinique de dextrane que l'on recueille, déshydrate et sèche finalement dans le vide.
La solution aqueuse à 6 /o de dextrane clinique obtenue de cette façon présente une viscosité relative de 3,8 à 850 C et se prête très bien à des injections intraveineuses dans le traitement des commotions.
Exemple 2
I1 est identique à l'exemple 1, à l'exception du fait que l'on remplace l'isopropanol par de l'éthanol et que la solution acidifiée est chauffée à 780 C durant 40 à 50 minutes.
Exemple 3
Il est identique à l'exemple 1, à l'exception du fait que l'isopropanol y est employé jusqu'à concurrence de 8 0/o du volume de l'eau présente dans la solution. La solution aqueuse à 6 0/o de dextrane clinique obtenue comme produit final a une viscosité relative d'environ 4 à 850 C.
Exemple 4
Il est identique à l'exemple 1, à l'exception du fait que l'isopropanol est utilisé jusqu'à concurrence de 9 /o en volume de l'eau présente. La solution aqueuse à 6 o/o de dextrane clinique obtenue a une viscosité relative d'environ 4,3 à 850 C.
Exemple 5
Il est identique à l'exemple 1, à l'exception du fait que la solution aqueuse contient de l'isopropanol jusqu'à concurrence de 10 o/o du volume de l'eau présente. Une solution aqueuse à 6 O/o de dextrane clinique finalement obtenue présente une viscosité de 4,8 à 850 C.
Exemple 6
Il est identique à l'exemple 1, à l'exception de la quantité d'isopropanol, dont la solution acide aqueuse contient 20 O/o par rapport au volume d'eau.
Exemple 7
I1 diffère de l'exemple 1, par l'emploi d'éthanol et une température d'hydrolyse de 780 C.
Exemple 8
On substitue du méthanol à l'isopropanol de l'exemple 1 à raison de 10 o/o du volume de l'eau et
I'hydrolyse s'effectue à environ 650 C, sa durée étant un peu plus longue que dans l'exemple 1, soit environ 55 à 60 minutes.
Exemple 9
L'isopropanol de l'exemple 1 est remplacé par du dioxane et l'on élève la température d'hydrolyse à 1000 C, le temps nécessaire à l'obtention de la dégradation voulue étant un peu plus court.
Exemple 10
L'isopropanol de l'exemple 1 est remplacé par de l'acétone et l'hydrolyse effectuée à 560 C durant environ 60 minutes.
L'alcool aliphatique ou la cétone présent durant la dépolymérisation de la dextrane sont des nonsolvants de la dextrane. Dans le présent procédé, la quantité d'alcool aliphatique ou cétone miscible à l'eau, soit de 2,5 O/o à 31 1/3 O/o du volume de l'eau, ne suffit généralement pas à précipiter la dextrane de la solution. De toute façon, on veillera à maintenir la quantité d'alcool ou de cétone utilisée dans les limites indiquées, de façon que la dextrane à hydrolyser reste dans la solution. Avec 33 1/3 o/o d'isopropanol, par exemple, et à une température de travail de 850 C environ, la dextrane reste dans la solution.
La quantité préférée d'alcool ou de cétone sera comprise entre 2,5 et 10 o/o ou mieux entre 7 et 10 O/o du volume de l'eau. Dans ces proportions, l'alcool ou la cétone ne forme pas de mélange azéotropique avec l'eau.
En séparant la dextrane native d'un milieu dans lequel on la produit synthétiquement à partir de la polysaccharose, la précipitation de la dextrane peut être obtenue par des alcools ou des cétones. On préférera généralement utiliser le même alcool ou cétone, mais en quantités ne produisant pas la précipitation durant la dépolymérisation de la dextrane.
Ceci n'est toutefois pas essentiel et l'alcool ou la cétone présent durant la dépolymérisation de la dextrane peut être différent du produit utilisé à précipiter la dextrane native, à condition que le précipitant du produit natif soit aussi complètement que possible éliminé de la masse de dextrane native avant que cette dernière soit dissoute dans la solution aqueuse acide et que soit additionné l'alcool ou la cétone devant être présent durant la dépolymérisation.
En effectuant ladite dépolymérisation de la dextrane en présence d'alcool ou de cétone, à la température d'ébullition du mélange eau-alcool ou eaucétone, on obtient une substance ayant un poids moléculaire de l'ordre de grandeur de celui du plasma sanguin et qui forme des solutions aqueuses d'une viscosité élevée très bien utilisable pour des injections intraveineuses.